PT91570B

PT91570B - Metodo para a obtencao de uma proteina receptor de rinoviros humano que inibe ainfecciosidade viral

Info

Publication number: PT91570B
Application number: PT91570A
Authority: PT
Inventors: Alan Mcclelland; Jeffrey Greve; Gary Davis
Original assignee: Molecular Therapeutics Inc
Priority date: 1988-09-01
Filing date: 1989-08-30
Publication date: 1995-05-31
Also published as: DE68929096T2; AU4027189A; JP3253064B2; CA1339193C; DE68929096D1; EP0362531A1; NO893373D0; NZ230474A; DK431289A; DK174095B1; IL91454A0; US7132395B1; JPH02238892A; GR3032456T3; DK431289D0; IL91454A; ES2141076T3; EP0362531B1; FI894065A; NO893373L

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 91 570

REQUERENTE:

EPÍGRAFE:

MOLECULAR THERAPEUTICS INCnorte-americana, industrial,com sede em West Haven.Connecti cut, Estados Unidos da América do Norte.

MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UMA PROTElNA RE CEPTOR DE RINOVlRUS HUMANO QUE INIBE A IN FECCIOSIDADE VIRAL .

INVENTORES: Jeffrey Greve, Alan McClelland e Gary Davis.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte,em 01 de Setembro de 1988 sob o n^s. 239.571 e em 25 de Outubro de 1988 sob o n³ 262.428 e 10 de Agosto de 1989 sob o n³. 390.662.

INP1. MOD. 113 RF 1«732

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um método para a obtenção de uma preparação do principal receptor de rinovirus humano (HRV) solúvel em água compreendendo uma glicoproteina complexada com detergente isolada a partir de células animais, de preferência células de mamífero, as guais expressam o principal receptor de HRV e que apresenta a capacidade de se ligar a cápsides de HRV reduzindo substanciaimente a infecciosidade do virus.

MOLECULAR THERAPEUTICS INC.,

MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UMA PROTEINA RECEPTOR DE RINO VlRUS HUMANO QUE INIBE A INFECCIOSIDADE VIRAL

receptor purificado solúvel em água é obtido por extracção das células que expressam o receptor com detergente e isolamento dos complexos detergente-glicoproteina solubilizados através da ligação a anticorpo monoclonal selectivo para a proteina receptor de HRV.

O presente invento está relacionado com o isolamento de proteínas a partir de células animais, particularmente células de mamífero, que se ligam a rinovirus (HRV). Mais particularmente, o invento relaciona-se com o isolamento de proteínas do receptor de HRV que se podem ligar a HRV e assim bloquear a infecciosidade do virus. Esta propriedade pode servir como base para a inibição da iniciação ou do alastramento de infecções por HRV, mais conhecidas como a constipação comum.

Para infectar células hospedeiras, os virus devem ligar-se às células e depois entrar nelas para iniciar uma infecção. Desde 19 59 , têm-se acumulado dados na literatur-a indicando que a presença de sítios de ligação específicos (receptores) nas células hospedeiras poderá um determinante essencial do tropismo de tecidos para certos virus. /Holland, J.J., e McLaren, L.C., The mammalian cell-virus relationship II. Absorption, reception and eclipse of poliovirus by HeLa cells, J. Exp. med. 109 487-504 (19 59 ). Holland , J.J., Receptor affinities as major determinants of enterovirus tissue tropisms in humans Virology 15 , 312-326 (19 61) 7. Entre os picornavirus tais como poliovirus, vírus coxsacchic e rinovirus, foi demonstrada a ligação especifica a células hospedeiras. Através de experiências de competição foi demonstrado que alguns destes receptores são distintos uns dos outros pelo facto de a saturação do receptor de um vírus não ter efeito na ligação de um segundo virus / Lonberg-Holm, K,

Crowell, R.L. e Philipson, L. Unrelated animal viruses share receptors , nature 259 , 699 -681 (19 76).

Os rinovirus formam a maior familia dos picornavirus, tendo sido identificados até agora 115 serotipos distintos. Uma grande fracção dos rinovirus (calculada em 80%) parece ligar-se a um receptor comum

-4nas células humanas. /'Abraham, G. e Colinno, R.J. Many chinovirus serotypes share the same cellular receptor,

J. of Virology, 51 , 340-345 (19 84)_7- Em 1985, foi descrito o isolamento de um anticorpo monoclonal dirigido contra o principal receptor de rinovirus. / Colonno, R.J. Callaham, P.L. and Long, W. J., Isolation of a monoclonal antibody that blocks attachment of the major group of human rinovirus, J. of Virology 5 7, 7-12 (19 86)_7. Ele inibia a infecção de células com os serotipos de rinovirus adeguados e inibia a ligação de rinovirus marcado radioactivamente às células. Este grupo subsequentemente divulgou gue o anticorpo monoclonal se ligava a uma proteína com um peso molecular aparente de 90 000 daltons. Tomassini , J.E. e Colonno, R.J., Isolation of a receptor protein involved in attachment of human rhinoviruses, J. of Virology £8, 290-29 5 (19 86) 7. Este anticorpo monoclonal foi utilizado em ensaios clínicos com primatas e humanos e verificou-se conferir alguma protecção contra a infecção por rinovirus.

Existem várias outras publicações de tentativas a nivel de intervenção terapêutica em infecções com rinovirus. Foi tentada a aplicação intranasal de interferão em humanos. /'Douglas, R.M. et al., Prophylatic efficacy of intranasal alpha 2-interferon against rhinovirus infections in the family setting, The New England J. of Medicine, 314 , (5-75 (19 86)_7. Neste caso observou-se redução significativa da gravidade da infecção se bem que se tenha observado como efeito secundário algumas hemorrogias do nariz. Também, vários análogos de disoxaril (compostos WIN) que reduzem a infecciosidade de uma série de picornavírus (com uma variação muito grande da eficácia dependendo do sorotipo) foram testados em cultura de tecidos e nalguns modelos animais. /' Fox, M.P. Otto, M.J., e Mckinlay, M.A., Anti-microb. Ag. and Chemotherapy 30,

110-116 (1986)_7. Estes compostos parecem inibir a replicação num passo subsequente à ligação de receptor, provavelmente nalgum passo de descapsodação virai. As coordenadas atómicas dos sitios de ligação destes compostos dentro da cápoide virai do serotipo. HRV14 foram determinadas por cristalografia de raios X e estão situadas numa bolsa hidrofóbica presente em cada unidade protomérica da cápside. / Smith, T.J., et al., The site of attachements in human rhinovirus 14 for antiviral agents that inhibit uncoating , Science 233 , 1286-129 3 (19 86) 7A função especifica da bolsa de ligação, se tiver alguma, é desconhecida nas mutantes resistentes a drogas com alterações num único aminoácido nesta região surgem com elevada frequência e são viáveis.

/ Badger, J., et al., Structural analysis of a series of antiviral agents complexed with human rhinovirus 14 , PHNAs 85 , 3304-3308 (19 88) 7. Este resultado chama a atenção para a questão da eficácia de tais compostos como fármacos. A peodução de anticorpos anti-peptides em coelhos foi descrita usando peptídeos derivados da sequência de aminoácidos das proteinas da cpside virai que forram o desfiladeiro do receptor de HRV14. /^-McCray, J., e \Warner, G., Different rhinovirus serotypes neutralized by anti peptide antibodies , Nature 329 : 736-738 (19 8 7) 7 ·

Se bem que os títulos destes soros sejam muito baixos foi demonstrada a protecção cruzada de serotipos de células em cultura de tecidos contra a infecção por rinovirus , levantando a possibilidade de uma vacina.

Constitui um objectivo do presente invento isolar uma proteina receptor do HRV a partir de células tendo a propriedade de bloquear a infecção por HRV. ©ada a elevada afinidade do virus para o seu receptor, pôs-se a hipótese de um agente terpêutico eficaz contra a infecção por HRV poder ser o próprio receptor ou mais

especificamente, o dominio de ligação ao virus do receptor. Uma proteína, fragmento de proteína ou peptideo que inclua o dominio de ligação ao virus poderá bloquear a capacidade da virus para se ligar às células hospedeiras através da ocupação (bloqueamento) do sitio de ligação ao receptor no virus. Ainda, uma vez que tal molécula faria alguns ou todos os contactos moleculares com a cápside virai que o receptor faz, as mutações do virus que afectam adversamente a ligação da molécula afectariam adversamente a ligação do receptor e seriam assim prejudiciais ou letais para o virus; portanto, a probabilidade de aparecimento de mutantes, resistentes a drogas seria muito baixa. Ainda tal molécula seria humana baixando a probabilidade de ser antigénica em humanos.

Sumário do Invento

Encontrou-se que o principal receptor de rinovirus humanos (HRV) pode ser isolado como uma preparação solúvel em água que apresenta a propriedade desejada de ligação a càpsides de HRV reduzindo substancialmente a infecciosidade do virus. A preparação è na forma de glicoproteina complexada com detergente isolada a partir de células animais, de preferência células de mamífero, que expressam o principal receptor de HRV. A proteína do receptor purificada foi caracterizada como se segue. È uma glicoproteina com um peso molecular aparente de 95 000 daltons e inclui o sitio de ligação ao HRV. A glicoproteina contem 6-7 cadeias de oligossacàridos ligadas a asparagina e existe na preparação na forma de uma proteína ligada a micelas de detergente.

Descrição das execuções preferidas

Em termos gerais , a preparação do principal receptor de HRV do presente invento pode ser obtida por extracção de células animais adequadas que se sabe expressarem o principal receptor de HRV com um detergente não iónico, seguido de imunopurificação. Muitas linhas de células humanas expressam o receptor, por exemplo He La e Wi 38. Qualquer uma destas fontes humanas do receptor HRV pode ser extraida. São particularmente úteis as células He La. Ainda, são conhecidas ou podem ser preparadas linhas de células transfectantes de mamíferos não humanas que expressam o receptor de HRV, as quais proporcionam uma outra fonte útil do receptor. Em particular, linhas de células transfectantes como as descritas no Pedido de Patente Europeia Publicação No.O 319 815 proporcionam uma fonte boa do receptor, particularmente os transfectantes secundários que foram seleccionados em função de niveis elevados de expressão do receptor. São conhecidas da literatura e aqui desenvolvidas outras células animais, tais como células de culturas de tecidos de insectos que foram transfectadas com o gene e expressam o receptor, que também podem ser usadas.

Essencialmente pode ser usado qualquer detergente não iónico para a extracção desde que não seja destruída a conformação nativa do receptor. A desnaturação do receptor pode ser determinada controlando a capacidade de proteina extraida em inibir a infecciosidade virai ou pela sensibilidade à proteolise. Foi determinado que o receptor pode ser desnaturado por aquecimento a 602C durante 30 minutos ou por tratamento com 1% SDS indicando que se deve tomar cuidado para manter a conformação nativa do sitio de ligação de HRV. São exemplos de detergentes não iónicos úteis os éteres alquilicos de polioxietileno

(por exemplo Brij), éteres alquilfenilicos de polioxietileno (por exemplo Triton X-100 e Nonidet P-40) , ésteres acilicos de polioxietilenossorbitano (por exemplo Tween) e beta-D-alquilglucosidos, sendo Triton X-100 considerado particularmente preferido.

O passo chave na purificação do receptor ê o fraccionamento comanticorpos altamente selectivos anti-receptor. O meio mais fácil de obter tal anticorpo é por técnicas de monoclonais. Ê particularmente preferido produzir anticorpos monoclonais de ratinho gerando linhas celulares de hibridomas a partir da fusão de células de mieloma murino e células transfectantes de ratinho expressando o receptor de HRV. Outros detalhes estão disponíveis no Pedido de Patente Europeia Publicação No.

319 815. Após ligação dos complexos detergente-glicoproteina obtidos a partir do extracto celular do anticorpo monoclonal seleccionado, os complexos ligados ao anticorpo foram separados da restante mistura. A seguir, os complexos detergente-receptor ligados ao anticorpo foram dissociados, providenciando para evitar desnaturação e isolada apreparação resultante do receptor solúvel em água. As condiçpoês adequadas para a dissociação dos complexos detergente-receptor do anticorpo podem ser determinadas empiricamente e pode-se esperar que variem ligeiramente de anticorpo para anticorpo. A dissociação aumentando o pH verificou-se nalguns casos ser a mais eficaz sendo as condições de pH baixo as concentrações salina elevada operacional mas produzindo rendimentos de proteina mais baixos.

É preferível efectuar uma purificação intermédia antes da purificação com o anticorpo. Tais passos intermédios compreendem adsorção dos complexos de proteina extraida com detergente a uma lectina capaz de se ligar ao receptor de HRV, separação dos complexos adsor vidos da restante mistura e dissociação de tais complexos para subsequente tratamento com anticorpo. A selecção da lectina e condições de dissociação é geralmente empírica. Encontrou-se que o receptor HRV se liga adequadamente à lectina aglutinina de gérmen de trigo e quer se dissocia eficazmente por lavagem com uma solução de N-acetilglucosamina. Devido aos oligossacáridos da proteina receptor não estarem completamente earacterizados e devido à proteina receptor poder ser glicosilada demodo diverso em diferentes tipos celulares (eg. transfectantes de células de ratinho) pode-se esperar que outras lectinas sejam também adequadas. A selecção de uma alternativa adequada à aglutinina de gérmen de trigo e/ou agente de eluição pode ser deixada à escolha de alguém familiarizado com esta área.

A preparação resultante pode ser tratada com agentes proteoliticos, tais como proteases, e.g., tripsina, para produzir fragmentosmais pequenos de glicoproteina que retêm a capacidade de ligar o HRV e reduzir a sua infecciosidade. Por exemplo, podem ser clivados fragmentos peptídicos de uma região terminal de glicoproteina, e ,g , o extremo C para dar fragmentos de glicoproteina que mantêm a ligação a HRV. Tais fragmentos de glicoproteina podem, por exemplo ter pesos moleculares aparentes entrecerca de 80 000 daltons e cerca de 95 000 daltons. Os fragmentos mais pequenos que retêm o domínio de ligação a HRV do receptor estão também considerados dentro do âmbito do presente invento.

A preparação de receptores do presente invento inibe a infecciosidade do virus , presumivelmente através da'ligação à cápside de HRV para bloquear a sua capacidade para se ligar e infectar células humanas. Tal observação indica que a preparação de receptores será

útil na redução de infecção in vivo de células humanas hospedeiras através do contacto do virus com a preparação em condições favoráveis de ligação ao virus. Uma forma terapêutica será a de uma solução aquosa do receptor na presença de detergente não iónico para manter o receptor em solução e na sua conformação nativa. Os detergentes com concentrações micelares criticas mais baixas, como seja o éter alquilico de polixoxietileno Buj 58, serão preferidos para reduzir a concentração do detergente na solução terapêutica. A preparação do receptor pode ser administrada in vivo pelo contacto apropriado com as áreas do corpo susceptiveis à infecção por HRV e,g, por vaporização intranasal.

O presente invento será agora ilustrado pelos exemplos que se seguem sem que seja limitado por eles . .

-11Preparação da proteína receptor de rinovirus humano (HRR) purificada (1) Células humanas (por exemplo HeLa) ou transfectantes de células L de ratinho (por exemplo, as linhas celulares descritas no Pedido de Patente Europeia Publicação No.

319 815, Transfectant cell lines which express the major human rhinovirus receptor ) foram cultivadas em grandes quantidades como monocamadas de células em meio para cultura de tecidos convencional (meio essencial modificação de Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino as células transfectantes foram mantidas no mesmo meio contendo HAT (hipoxantina /aminopterina /timidina) para manter a pressão selectiva da marca seleciconável (herpes TK). As células foram solubilizadas durante 1 hora a 4°C num tampão fisiológico (soro fisiológico tamponado com fosfatos) contendo um detergente não iónico (por exem pio Triton X-100) (tampão T) e um cocktail de inibidores de proteases (aprotinina, leupeptina a 10 çg/ml,

EDTA a lmM) para evitar a degradação proteolitica do receptor. O material insolúvel foi removido por filtração através de um filtro de 0,22 ç.

(2) O extracto foi adsorvido a uma resina de afinidade contendo Wheat Germ Agglutinin (WGA) (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO, USA) ligada a Sepharose durante 18 horas a 42C com mistura suave (2 ml de resina sedimentada, q contendo 5 mg WGA/ml, por 10 células). A resina de afinidade foi então lavada exaustivamente com tampão para remover as glicoproteinas não ligadas e eluidas com o monossacárido competidor N-acetilglucosamina (N-acetilgluicosamina 0,3 M em tampão T) durante 1 hora à temperatura ambiente.

-ΙΣ-

Ο) Ο eluente de WGA-Sepharose foi então adsorvido a uma resina de afinidade à qual foi acoplada o anticorpo monoclonal purificado contra o HRR (e,g, ATCC HB 9 a 59 4 , referido no Pedido de Patente Europeia Publicação No.

319 815). A IgG do anticorpo monoclonal foi purificada por precipitação com sulfato de amónio /Parham, P.,

Meth. Enzymol. 9 2 ; 110-138 (19 83)_7, seguido de comatografia de afinidade em proteina A-Sepharose /~Ey, P.L. et al . , Immunochem. 15 , 429 -436 (19 78) 7 ou numa coluna Abx / J.T. Baker Co., Phillipsburg, NJ, USA 7 seguindo o processo descrito pelo fabricante. A resina de afinidade com a IgG do monoclonal foi preparada acoplando IgG a Sepharose activada com brometo de cianogénio / Parham, Ρ., supra 7.

Após adição de 10 yg/ml de transferrina humana para bloquear a adsorção do receptor da transferrina à resina, o eluente foi incubado a 42C durante horas com a resina com agitação (40-200 yl de resina 9 contendo 5 mg de IGG/ml por 10 células), lavado extensivamente com tampão T para remover as proteinas não ligadas e depois eluido em condições não desnaturantes com um tampão de pH alto (dietanolamina 0,05 M (pH 11,5) com 0 ,1% triton X-100) durante 1 hora à temperatura ambiente. O eluente foi removido, neutralizado pela adição de 0 ,2 volumes de HEPES 1M (pH 7,2) e dialisado contra três mudas de um tampão fisiológico contendo uma pequena quantidade de detergente não iónico para manter a sokubilidade do receptor (0,01 M HEPES, 0,150 M NaCl, 0,001 M CaCl₂, 0,1% Triton X-100, pH 7,5).

O receptor foi ainda purificado por sedimentação através de gradientes de sacrose para remover um grupo de contaminantes de alto peso molecular (y 200 000 daltons). A preparação de receptores foi colocada no topo de um gradiente de 15-35% de sacrose (volu-13-

me total de aproximadamente 4,5 ml e centrifugado a 300 000 xg durante 18 horas a 4QC. Colheram-se as fracções do gradiente e as que continham o receptor do rinovirus, que'sedimentam a cerca de V3 do fundo do gradiente foram reunidas, concentradas (se necessário) e dialisadas.

(4) A preparação resultante derivada de células HeLa continha uma glicoproteina com um peso molecular aparente de 95 000 daltons. A partir das células transfectantes de ratinho isolou-se uma proteína do mesmo peso molecular mas com mais homogeneidade (quando da análise por SDS-PAGE. Demonstraou-se que a preoteina isolada comparando o receptor de rinovirus por:

(a) Imunopreceipitação a partir de células HeLa marcadas 125 na superfície com I e de transfectantes , de ratinho expressando o receptor de rinovirus humano marcadas do mesmo modo, com um anticorpo monoclonal que inibe a ligação de rinovirus às células.

(b) Imunoprecipitação de receptor purificado e marcado 125 com I com o anticorpo monoclonal ATCC HB 9 59 4 (5) Preparou-se um fragmento triptico por digestão do receptor com 1% (p E/p receptor) tripsina durante 1 hora a 37SC. A mistura de reacção foi aplicada a uma coluna de filtração em gel GF-450 (Dupont) equilibrada em tampão N e o fragmento proteolitico foi separado do enzima. A análise dos fragmentos resultantes por SDS-PAGE indicou uma mistura de fragmentos de 90 000 daltons e de 83 000 daltons do receptor.

Estes fragmentos eluiram na mesma posição numa coluna de filtração em gel como receptor intacto, sugerindo que está ligado a uma micela de detergente. A sequenciação de aminoácidos dos fragmentos não deu qualquer sequência indicando que eles, tal como o receptor intacto, tem um extremo N bloqueado e indicando ainda que os peptídeos perdidos dos fragmentos de 90 000 e 83 000 daltons são do extremo C da proteína.

Caracterização da Preparação (1) A pureza da preparação do receptor foi avaliada por SDS-PAGE seguido de coloração com prata. A quantificação da proteína foi determinada por comparação da proteína corada com prata com uma série de proteínas padrão de quantidade conhecida em SDS-PAGE e confirmado por análise deaminoàcidos , assumindo um peso molecular de 50 000 daltons para a proteína (determinado por determinação do peso molecular aparente em SDS-PAGE do receptor deglicosilado).

(2 ) Verificou-se que a proteína é uma glicoproteina contendo 6-7 cadeias de oligossacrideos ligadas a asparagina por digestão do receptor glicosilado com endoglicosidase H. Quando da filtração em gel o receptor eluiu com um volume consistente com uma proteína tendo um peso molecular de 250 000 daltons. Estes resultados juntamente com a evidência das experiências de ligação quimica cruzada indicando que o receptor é um monómero são consistentes com um receptor que se comporta como uma proteína ligada a uma micela de detergente.

(3) A proteina receptor purificada liga-se a rinovirus in vitro. Quando incubada durante 30 minutos a 34°C com 125 çg/ml de HRV14 ou HRV3, não marcado, marcado com I e 25

HRR marcado metabólicamente com S-cisteina associa-se ao virus conforme demonstrado por sedimentação em gradientes de sacrose ou por sedimentação numa centrífuga de alta velocidade. Consegiu-se demonstrar que estaligação é especifica por competição de ligação do receptor marcado radioactivamente com receptor não marcado. A reacção in vitro tinha a mesma dependência da temperatura da reacção in vivo o receptor liga-se ao virus a 37°C mas não a 4SC.

(4) Demonstrou-se que o receptor inibe a infecciosidade do rinovirus por incubação de HRR com o virus (nas mesmas condições descritas atrás em que foi demonstrada ligação) e depois testando as misturas resultantes quanto à infecciosidade atravées de um ensaio de infecciosidade convencional por diluição limite. Preparou-se uma suspensão de células

HeLa descolando-as com 0 ,03% EDTA/PBS durante 10 minutos e lavaram-se as células em 2% FBS/DMEM (meio I) com 10 mM 7

HEPES e ajustado a uma concentração de 1,1 χ 10 células/ / ml. Virus ou misturas do receptor-virus foram seriadamente diluídos em meio I e 20 çl de virus foi misturado com 180 çl de células e incubado durante 60 minutos à temperatura ambiente. A mistura foi então diluida com 9 volumes de meio I e semeada em 8-10 cavidades de placas de cultura de tecidos de 96 cavidades (aproximadamente 200 çl/cavidade) e cultivada a 34°C durante 5 dias. As culturas foram então avaliadas quanto ao efeito citopático (CPE) e o titulo do stock original determinado pela seguinte fórmula:

cavidades mortas / 10 χ 50 χ factor de diluição = = PFU/ml

Os resultados estão apresentados na Tabela abaixo

TABELA

V írus

Vírus.	HRR (M/L)	Título (PFU/ml)
HRV 14		0	2 x 10⁷
	6.6	x 10~⁹	3.5 x 10⁶
ff	2	x 10“⁸	4.5 x 10⁶
ff	6.6	x 10~⁸	2 x 10⁶
II	2	x 10⁷	3 x IO⁴
HRV 3		0	2.5 x 10⁶
«1	6.6	x IO^-9	3 x IO⁵
«f	2	x 10~⁸	3.5 x 10
«1.	6.6	x 10~⁸	3.5 x IO⁴
«4	2	x 10⁷	5 x 10³

-17Foram também testados outros serotipos de HRV. Os serotipos 4, 11, 17 e 89 do HRV (classe principal) foram, inibidos pelo virus , enquanto que HRV la e 2 (classe menor) não foram.

Os resultados descritos atrás indicam que o HRR purificado pode bloquear a infecciosidade de rino virus pertencentes à principal classe de receptores de rino virus. A propriedade de inibição da infecciosidade da proteina receptor está relacionada directamente com a sua capacidade de ligação ao virus e presume-se actuar por bloqueamento do sitio de ligação ao receptor no virus.

Esta propriedade do receptor manifesta-se em concentrações baixas da proteina receptor e indica uma elevada afinidade do receptor para o virus. O significado destes resultados é que o receptor purificado solúvel poderá ser usado para inibir a iniciação ou o alastramento das infecções por rinovirus in vivo. A proteina purificada também proporciona uma fonte de material a partir do qual fragmentos de protei na mais pequenos e peptideos podem ser obtidos tendo a mesma actividade do receptor intacto.

Figura 1

Sequência de aminoácidos de ICAM (sequência sinal menos). As sequências obtidas a partir de fragmentos peptídicos de HRR estão indicadas como linhas a ponteado ou a tracejado sob a correspondente sequência de ICAM; As linhas a tracejado significam sequências peptidicas assinaladas como certas, ponteado significa identificações ambíguas e x significacfeterminações incorrectas de identificação ambiguas. Os numeros sob as sequências

peptidicas indicam o nome de código da experiência de sequenciação da proteina.

A proteina purificada foi então sujeita a degradação proteolitica limitada ou completa, os peptideos foram purificados por cromatografia de fase reversa, filtração em gel ou SDS-PAGE e depois sujeitas a sequenciação de proteina automatizada. Estas sequências foram usadas na pesquisa de bancos de dados de sequências de proteina (NRFB e MIPSX) e de sequências de DNA (Genbank).

Fez-se uma equiparação de todas as sequências peptidicas conhecidas determinadas a partir da proteina HRR. (Molécula de adesão intercelular-1 Simmons et al., ICAM, An Adhesin Ligand of LFA-1, Is Homologosus to the Neural Cell Adhesion Molecule of NCAM4 , Nature 331, 624-627 (1988)). ICAM foi estudada por outros investigadores devido ao seu papel na adesão de linfócitos T a uma variedade de diferentes tipos celulares. Colocou-se a hipótese de que ICAM (presente em fibroblastos, células epiteliais , leucócitos e células endoteliais)interactua com uma estrutura chamada LFA-1 (antigénio associado à função de linfécito-1) presente na superficie de linfócitos Te é portanto responsável pela adesão a estes tipos de células .

Determinados a sequência de 106 aminoácidos do receptor de rinovirus e todos os 106 correspondem exactamente à sequência de ICAM (de um total de 507 aminoácidos previstos para a sequência ICAM). Outra informação bioquímica apoia a identidade de HRR com ICAM. Primeiro o produto primário da tradução de mRNA sintetizado num sistema de tradução in vitro tem um peso molecular aparente de 55 000 daltons que é o mesmo de ICAM. Em segundo lugar a espécie de proteina HRR encontrada em células tratadas com tunicamicina, um inibidor especifico da glicosilação ligada à asparagina, tem um peso molecular aparente de

000 daltons, consistente com a remoção de uma sequência sinal do extremo N da proteina. Terceiro, a digestão parcial da proteina HRR glicosilada indica a presença de sete grupos de açúcar ligados a asparagina, consistente com a presença de oito potenciais sequências aceitadoras de açúcar (N-S/T) na sequência de aminoácidos de ICAM. Finalmente a posição de HRR no mapa cromossòmico foi determinada como sendo no cromossoma humano 19 idêntico ao determinado para ICAM.

Uma vez foi determinada toda a sequência de nucleotideos e de aminoácidos de ICAM e por haver evidência substancial, se não mesmo concludente de ICAM e HRR serem a mesma moleécula ou moléculas muito semelhantes não é conhecida, a sequência de aminoácidos completa do receptor de rinovirus. A determinação destas sequências de aminoácidos, que é uma estrutura química parcial desta molécula, proporciona a capacidade de projectar e produzir grande quantidade de proteina receptor, fragmentos, domínios funcionais e versões truncadas e análogos da proteina receptor e peptídeos que possuem actividade inibidora contra a infecção por rinovirus e virus coxacchie. A sequência de aminoácidos completa também proporciona informação necessária aos estudos biofísicos e bioquímicos da interacção rinovirus-receptor que conduzirão à identificação dos contactos moleculares cruciais que podem ser usados na projecção de novas moléculas inibidoras.

Uma vez que a molécula ICAM é um membro da super-familia de genes da imunoglobulina situada no cromossoma 19 , (Eur. J. Immunol,, 15, 10 3-10 6 (19 84) e uma vez que outros picornavirus, tais como poliovirus e virus coxacchie se ligam a receptores cujos genes estão situados no cromossoma 19 , é possivel que ICAM possa ser usado como base para o desenvolvimento de terapêutica con-20 -

tra infecções provocadas por outros picornavirus. É possível que ICAM ou seus fragmentos sejam directamente úteis como terapêutica para outras doenças provocadas por virus ou doenças inflamatórias. Como alternativa o conhecimento da estrutura ICAM será útil na identificação dos receptores daqueles virus. Ainda, ICAM-1 está estreitamente relacionado com duas proteinas de adesão do sistema nervoso de adultos, molécula de adesão aos neucónios (NCAM) e glicoproteina associada à mielina (MAG) e uma familia de moléculas de células epiteliais incluindo CEA, NCA, TM-CEA e glicoproteinas BI especificas da gravidez. NCAM, MAG e ICAM-1 têm cada uma cinco domínios do tipo imunoglobulina, ver Dustin et al Supergene Families Meet in The Immune System Commentary Elsevier Publications, Cambridge, 1988. A relação entre os picornavirus e a superfamilia de genes de ICAM, NCAM e MAG proporciona a base do desenvolvimento de proteinas, fragmentos de proteinas, domínios funcionais, análogos e suas misturas para inibição da infecciosidade desta classe de virus.

O conhecimento da sequência de aminoácidos e a informação acerca da proteina ICAM acoplado ao conhecimento de HHR e do rinovirus proporciona a base das abordagens que se seguem para projectar os fragmentos de proteina e análogos para o tratamento de infecções por rinovirus e para o tratamento de inflamações.

As formas solúveis da proteina biologicamente activa da célula hospedeira poderão ser usadas para inibir a infecção virai ao contrário da proteina receptor ligada à membrana celular que normalmente facilita a infecção. As formas solúveis da proteina receptor biologicamente activa, fragmentos de proteina, domínios funcionais ou análogos poderão incluir a utilização de detergentes como descrito atrás. Como alternativa, a eliminação

do extremo C poderá tornar a(s) proteina(s) solúvel(eis ) .

Um fragmento triptico biologicamente activo é uma mistura de duas espécies, uma com um peso molecular aparente de 83 000 daltons e outra de 90 000 daltons (relativo a HRR de 95 kd). O extremo N de ambas as espécies está bloqueado indicando que começam no resíduo 1 da molécula de HRR intacta e os peptideos são removidos do extremo C o fragmento maior possível seria do residuc 1 ao residuo 486 .

Os desvios para baixo no peso molecular aparente em relação ao HRR intacto indica uma perda de 5000 daltons , ou 45 resíduos de aminoácidos, que colocaria os novos extremos C dos fragmentos em posições próximas (extremo N) do segmento transmembranar.

Exemplos de fragmentos solúveis poderão incluir todo o domínio extracelular (até ao aa.

480) ou poderão incluir uma ou ambas as partes distintas do domínio extracelular (a.a. 1-200; 200-460) da sequência de aminoácidos da proteina receptor. Foi ainda previsto que fragmentos peptidicos mais pequenos poderão proporcionar análogos biologicamente activos para a inibição da infecção virai.

Um clone de cDNA de tamanho completo do HRR será isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de células HeLa ou de outras células expressando o receptor através do despiste com oligonucleotideos feitos a partir da sequência de ICAM-1 publicada. A construção e expressão de fragmentos de domínios do HRR será conseguida usando metodologia estabelecida para DNA recombinante (Fisher et al_. , Nature 331, 76-78 (19 88) ; Hussey et al. , Nature 331 , 78-81 (19 88); Deen et al , Nature , 331 , 82-86 (19 88).

Um dominio extracelular solúvel será feito por clivagem de um clone de cDNA da sequência codificadora de HRR com Tcha I que corta na posição 37 na região do peptídeo sinal

e na posição 1415 , 12 aminoácidos antes do inicio do dominio transmembranar. Os oligonucleotideos adaptadores sintéticos serão adicionados passo a passo aos extremos 5' e 3' da molécula para restaurar o peptideo sinal e o ATG iniciador no extremo N e para introduzir um codão de paragem da tradução na mesma grelha de leitura no extremo C. A posição do codão de paragem poderá variar para produzir formas truncadas alternativas da molécula. De modo semelhante, diferentes enzimas de restrição que cortam com pouca frequência serão usadas para inserir codões de paragem noutras regiões da molécula. Nos extremos dos adaptadores serão incluídos sitios para enzimas de restrição para permitir a clonagem direccional numa variedade de vectores de expressão. A mutagénese dirigida com oligonucleotideos , usando métodos convencionais, será usada para introduzir sitios para enzimas de restrição onde não existirem sitios naturais convenientes. Ainda, a técnica de reacção de cadeias com polimerase (PCR) será usada para produzir fragmentos de DNA específicos codificadores de domínios e de outras sub-regiões da molécula.

A abordagem atrás descrita também será usada para produzir outros subfragmentos do receptor tais como os cinco domínios tipo imunoglobulina (resíduos 1-88, 89-185, 186-284, 285-385, 386-493, Stanton et al,

Cell 52 , 9 25-9 33 (19 88). Nestecaso serão incluídas sequências sinal adequadas para dirigir a secreção de proteina no sistema de expressão a ser usado. Serão usados vários sistemas de expressão incluindo promotores virais em células de mamífero (Cate et al , Cell 45, 685-69 8 )(19 86) células de insecto (Smith et al proc. Acad. Sei. USA, 82, 8404-840 8 (19 85 ); e E. coli CSkerra and Pluck Thum, Science 240 , 1038-1041 (19 88). Subf ragmentos do receptor produzido como atrás descrito serão testados quanto à capacidade para ligar os principais serotipos de rinovirus e para

reduzir a infecciosidade virai. A expressão do dominio extracelular como descrito atrás também será usado para derivar quantidades suficientes do receptor solúvel para estudos estruturais tais como cristalografia de raios X.

os estudos estruturais utilizando fragmentação enzimática e quimica de ICAM-1 não reduzida permitiram mapear três pontes dissulfureto num total de 7 pares potenciais e ainda mais duas pontes dissulfureto potenciais. Estes resultados indicam pontes dissulfureto entre CIO 8 e C159 , entre C210 e C263 e entre C305 e C344 , a clivagem em M64 com CNBr indica que o par C21 e C25 com C65 e C69 e a construção de um modelo baseado no enrolamento tipo iG indica o emparelhamento de C21 e C65 e C25 e C69. Estes dados proporcionam evidência que suporta um modelo estrutural de ICAM-1 com três domínios N-terminais do tipo Ig (ver figuras 2).

Uma série de cDNA's (t ICAM's ou ICAM's truncados) foi construida a partir de cDNA de ICAM-1 para conter codões de paragem prematuros nas posições de aminoácidos 454, 284 ou 185 da proteína madura para se produzir proteinas secretadas progressivamente truncadas a partir do extremo C. As posições das mutilações foram seleccionadas com base nos extremos previstos para o dominio transmembranar (tICAM (1-453), dominio tipo imunoglobulina 123 (tICAM (1-283)) e domínios tipo imunoglobulina 1 2 (tICAM (1-183)) e dominio tipo imunoglobulina 1 (tICAM (1-88). As proteinas produto destes genes estão esquematizados na figura 2. Eles foram construídos por reacção de cadeias com polimerase PCR usando oligonucleotideos iniciadores 5' e 3' que se sobrepoem à sequência codificadora de ICAM-2 e contêm sitios para enzimas de restrição , o inivciador 5' continha um sitio EcoRI adicional e os iniciadores 3' continham mais um codão de

paragem da tradução e um sitio Bam HI. Estes DNA's foram cionados direccionalmente no vector Bluescript-SK (Strategene) digerido com HindIII/Xbal. Estes genes e um cDNA de ICAM-1 testemunha de tamanho complete foram então cionados direcionalmente no vector de expressão CDM8 (Sced, et al) usando o sitio HindIII no extremo 5' e o sitio Xba no extremo 3' do gene. Estes plasmídeos foram usados para transfectar células SDS usando a técnica do DEAE-dextrano e as células foram cultivadas durante 72 h antes do ensaio. A expressão na superfície foi controlada por FACS usando imunofluorescência indirecta e um anticorpo monoclonal especifico para ICAM-1. A secreção de

ICAM-1 para o meio foi controlada por maracação metabólica „ 35 de células durante 7 h com S-cisteina seguido de imunoadsorção dos sobrenadantes de cultura ou uma resina monoclonal anti-ICAM-l-sefarose. A análise por FACS mostrou claramente a expressão de ICAM-1 na superfície de células transfectadas com ICAM-1 de tamanho completo, as células transfectadas com o vector CMS8 sozinho ou com tICAM (1-453) não mostrou expressão à superfície. Quando o material isolado a partir dos sobrenadantes de cultura marcadas metabólicamente foi analisado por SDS-PAGE seguido de fluorografia, não se observou ICAM-1 na testemunha ou nos transfectantes ICAM-1 de tamanho completo, enquanto a especie de 80 000 daltons foi secretada por transfectantes tICAM (1-453) uma proteína de 65 000 daltons foi secretada por transformantes tICAM (1-283) e uma proteína de 43 000 daltons foi secretada por transfectantes tICAM (1-184). Quando o mesmo material foi corado por coloração de proteínas com prata, observou-se tICAM (1-453) substanci mente pura. Obtiveram-se transfectantes estáveis atravérs da transfecção do mesmo cDNA misturado com o gene de uma marca seleccionável (timidina-cinase para células L de ratinho e di-hidrofolato-redutase para células CHO) em células L tK de ratinho ou em células CHO (dhfr) de cobaia

e submeteu-se à selecção com drogas (selecção com HAT para células LtK~ e metotrexato para células CHO (dhfr ). As células sobreviventes foram clonadas e os sobrenadantes de cultura destas células foram despistadas por ensaio radioimune em que o MAb C78,5 foi adsorvido a placas de microtitulação, incubou-se ICAM-1 purificada ou sobrenadantes de cultura com as placas revestidas com Mab e depois

ICAM-1 ligada foi detectada por incubação com MAb C78.4 125 marcado com I. Obtiveram-se vários transfectantes de células L e eum transfectante de células CHO secretando tICAM (1-453) e células L expressando tICAM (1-183). A expressão foi confirmada por marcação metabólica das células seguido de imunoadsorção dos sobrenadantes de cultura como descrito atrás.

tICAM (1-88) foi expressa em

E. coli usando o vector de secreção OmpA do Inone. Neste sistema o peptídeo sinal OmpA foi fundido com o extremo N da proteína ICAM-1 madura. tICAM (1-88) e tICAM (1-183) foram colocados no vector OmpA; E. coli transformada com estes vectores expressa produtos proteicos do tamanho esperado conforme detectado por transferência Western de géis SFDS-PAGE dos extractos celulares com anticorpos anti-peptideo contra uma sequência dentro do domínio 1 de ICAM-1.

Estudos de bloqueamento como painel de 6MAbs contra ICAM-1 (todos eles inibem a ligação do virus a ICAM-1) indicam que existem dois epitopos distintos definidos por estes anticorpos, um definido por C78.4 (contendo C78.1, C78.2, C92.1 e C9 2.5 ) . Os estudos de imunoprecipitados com fragmentos proteoliticos de ICAM-1 e com traduções in vitro de cDNA's truncados de ICAM-1 indicam que ambos os epitopos estão contidos no primeiro domínio tipo Ig.

Os estudos in vitro de ligação ao virus utilizando tICAM (1-453) marcado radioactivamente e rinovirus purificado indicaram que ele se pode ligar a rinovirus em solução.

Outros fragmentos biologicamente activos serão avaliados utilizando séries sobreponiveis de peptídeos sintéticos de 10-20 resíduos correspondendo a parte da proteína HRR ou à sua totalidade. Os peptídeos serão feitos e testados individualmente quanto à capacidade em inibir a ligação do virus ao receptor.

Estes fragmentos peptidicos podem ser cópias directas de uma fracção do receptor de rinovirus ou podem conter sequências de regiões não contíguas do receptor.

Com base na homologia com NcAM previu-se que ICAM seja um membro da superfamilia de genes das imunoglobulinas. È de esperar que os domínios tipo imunoglobulina em ICAM possuam o enrolamento das imunoglobulinas , como foi mostrado para dois outros membros desta família, beta-2-microglobulina e o domínio alfa-3 de HLA-A2. Este enrolamento consiste numa conformação beta-barril consttiuida por duas folhas beta dobradas antiparalelas, uma composta por tr?es cadeias beta e uma composta por quatro; uma ligação dissulfureto entre dois resíduos císteina (separados por aproximadamente 60 aminoãci dos ao longo da cadeia) liga as duas folhas (Williams,

A . F. , Immun . Today 29 8-30 3 (19 8 7) . Duas das ligações dissulfureto, as correspondentes aos domínios 2 (C110-C161) e 3 (C212-C265), foram determinadas experimentalmente por nós dando assim apoio ao modelo. Este modelo para a estrutura proporciona uma base para a projecção de análogos únicos que poderão imitar o sitio de ligação do virus e serão uteis como bloqueadores dos receptores. Cada par de cadeias beta antiparalelas no beta-barril està ligado por uma volta de ansa em gancho de tamanho variável; tais voltas ou ansas que saem para fora das estruturas secundárias são muitas vezes consideradas como desempenhado papeis importantes no reconhecimento de ligandos (LezCzyhski e Rose; Science 224 , 849 -855 (19 86). Tais estruturas proeminentes podem ser particularmente interessantes para o receptor do rinovirus , uma vez que o sitio de ligação ao recep tor na cápside virai é proposta como sendo uma cavidade escondida. CJsando-a sequência do HRR, tais voltas e ansas podem ser previstas com base numa estrutura beta-barril e produzidas como peptídeos sintéticos com adição de novos resíduos cisteina no extremo N e C dos peptídeos; uma ponte dissulfureto formar-se-ia então entre tais resíduos no mesmo peptideo para fechar a ansa covalentemente (ao contrário da proteína nativa, em que a ansa seria fechada por interacções não covalentes entre as cadeias beta adjacentes). Tais peptídeos teriam uma conformação mais análoga à conformação na proteína nativa do que um peptideo linear simples e seriam testados quanto à actividade de ligação ao virus.

Método para a localização da região ou dominio da molécula responsável pela actividade de 1 gação ao virus. Anticorpos dirigidos contra fracções especificas do HRR (previsto a partir de um modelo de trabalho baseado num enrolamento de imunoglobulina) poderiam ser produzidos fazendo peptídeos sintéticos correspondendo a regiões seleccionadas da proteína, acoplando tais peptideos a proteínas veiculo maiores e imunizando coelhos ou outros animais com tais conjugados através de metodologia convencional. Tais anticorpos poderiam ser testados quanto à capacidade para inibir a ligação de virus; a inibição com uma subsérie de tais anticorpos dirigiria a atenção para domínios específicos ou partes de domínios.

Grupos reactivos específicos nalguns resíduos de aminoácidoq na proteina receptor podem ser modificados quimicamente em condições não desnaturantes.

Como consequência da modificação de alguns resíduos a capacidade de ligação ao virus pode perder-se. Através da utilização de marcadores reactivos no reagente de modificação a modificação de alguns resíduos de aminoácidos pode ser correlacionada com a perda de actividade de ligação, implicando assim aqueles grupos no reconhecimento. Isto dirigiria a atenção para uma parte especifica da molécula ou para um residuo de aminoácido especifico como desempenhando um papel especifico na ligação do virus. Tais resíduos poderiam então ser modificados experimentalmente em experiências de mutagénese in vitro. Como exemplo enconttrou-se que a marcação de HRR com o reagente radioactivo de Bolton/Hunter (um éster de N-hidirxissucinimida, o qual modifica especificamente os extremos Ν' e resíduos lisina) reduz substancialmente a sua capacidade de ligação a rinovirus .

Determinação da estrutura tridimensional do dominio de ligação ao virus do HRR por cristalografia de raios X e/ou ressonância magnética linear.

Usando as coordenadas tridimensionais de HRV14 (do Banco de Dados Brookhaven) encontra-se o docking (encaixe) óptimo das duas moléculas por metodologia de gráficos com computadores. A estrutura do complexo encaixado poderia então ser usada para refinar e aumentar as propriedades da proteina ou fragmento peptídico do receptor. Seriam exemplos de tais melhoramentos:

(1) aumento da afinidade da reacção de ligação ao virus;

(2) produção de uma molécula mais pequena; e

(3) delecção ou destruição de outras regiões da molécula, como sejam as necessárias para a ligação a LFA-1. Se o sitie de ligação a LFA-1 fôr num dominio diferente, o dominio poderá ser eliminado. Como alternativa, se o sitio de ligação a LFA-1 fôr no dominio de ligação ao virus, a mutagenese· dirigida de aminoácidos específicos poderá ser usada para inibir a capacidade de ligação.

Os resíduos chave do receptor envolvidos na ligação ao virus serão determinados por mutagenese dirigida com oligonucleotideos. Por exemplo, conjunte de mutantes produzidos por mutagénese de saturação serão despistados pelo método de Peterson e Seed (Cell, 54 65-72 (1988) usando HRV14 ou corte com anticorpo monoclonal, /complemento como selecção negativa e um anticorpo policlonal de coelho como selecção positiva. Os peptideos sintéticos correspondendo a regiões da molécula identificadas deste modo serão feitos e testados quanto à ligação a virus e capacidade para reduzir a infecciosidade.

Preparações farmacêuticas de proteinas, fragmentos de proteinas, domínios funcionais e análogos têm aplicação numa variedade de doenças. Com o conhecimento de que HRV e LFA-1 se ligam ambos a ICAM pode-se prever que análogos de ICAM projectados especificamente se ligarão a rinovirus e assim inibirão a infecção por rinovirus mas sem destruir a interaeção de ICAM e LFA-1. Como alternativa, a mutagénese de resíduos seleccionados (aminoácidos) será feita com base nas previsões estruturais e estrutura bioquimica.

Novamente com o conhecimento de que ICAM e HRR são a mesma molécula pode-se antecipar que fragmentos, domínios funcionais ou análogos de LFA-1 poderão ser utilizados para destruir interacções entre HRR e

rinovirus e assim tratar infecções por rinovirus.

HRR ou seus fragmentos poderão ter aplicação na destruição de interaeções entre ICAM e LFA-1 as quais poderão ser uteis no tratamento de inflamações.

Peptideos derivados de proteinas conhecidas da cápside de rinovirus poderão ser uteis no tratamento de inflamação, os grupos de açúcar não necessá rios à actividade biológica serão removidos para aumentar a produção de peptideos em bactérias.

A mutagénese dirigida de cisteinas pode ser util para limitar o reenrolamento de conformaçõe biologicamente activas.

Claims

REIVINDICAÇÕES:

lê. -Método para a obtenção de uma preparação do principal receptor de rinovirus humano (HRV) solúvel em égua compreendendo uma glicoproteina complexada com detergente isolada a partir de células animais que expressam o receptor principal de HRV e que apresentam a capacidade de ligação a cápsides de HRV reduzindo substancialmente a infecciosidade do virus, caracterizado por compreender os passos de:

a) extracção de células animais que expressem o principal receptor de HRV com um detergente não iónico.

b) ligação dos complexos de detergente-glicoproteina resultantes com um anticorpo selectivo para a ligação à proteina receptor do HRV.

c) separação dos complexos ligados ao anticorpo da mistura.

d) dissociação dos complexos detergente-glicopeptideo HRV do anticorpo e,

e) isolamento da preparação resultante solúvel em água do principal receptor de HRV.
2â. - Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os complexos detergente-glicoproteina solubilizados a partir das células de mamifero no passo a) serem adsorvidos e por os complexos detergente-glicoproteina HRV dissociado da lectina serem aplicados ao anticorpo do passo b).

35. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a preparação ser isolada a partir de células de mamifero que expressam o receptor principal de HRV.

45. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3, caracterizado por a glicoproteina ter um peso molecular aparente de cerca de 95 000 daltons ou menos.

55. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a preparação ser obtida por extracção com detergente de células He La.

65. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado por a preparação ser obtida por extracção com detergente de células transfectantes não humanas expressando o principal receptor de HRV.

75. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteina receptor de rinovirus ser seleccionada do grupo constituído por fragmentos biologicamente activos da proteina receptor domínios funcionais e seus análogos que apresentem a capacidade de ligação à cápside de rinovirus humano da principal classe de receptores e inibam a infecciosidade.

85. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para usar no tratamento de

-33rinovirus humano caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade eficaz da proteina da Reivindicação 7 misturada com um excipiente farmacêuticamente aceitável.

Lisboa, 30 de Agosto de 19 89

J. PEREIRA DA CRUZ Ajenís Cficiírf da Fraprisdsds Industrial *UA VICTOft CORO®N, 10-A, 1.·

1200 USBOA