JPH04502859A - 内皮細胞―白血球付着分子（ｅｌａｍ）および白血球付着に関与する分子（ｍｉｌａ） - Google Patents

内皮細胞―白血球付着分子（ｅｌａｍ）および白血球付着に関与する分子（ｍｉｌａ）

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JPH04502859A JP2510560A JP51056090A JPH04502859A JP H04502859 A JPH04502859 A JP H04502859A JP 2510560 A JP2510560 A JP 2510560A JP 51056090 A JP51056090 A JP 51056090A JP H04502859 A JPH04502859 A JP H04502859A
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デー ベンジャミン，クリストファー
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２６、ＭＩＬＡがＥＬＡＭＩリガンドである請求の範囲第２４項に記載の単細胞 宿主。
２７、　イー・コリ、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、Ｃ ＨＯ，Ｒ１，１、Ｂ−ＷＳＬ−Ｍ。
ＣＯ８１、ＣＯ３７、Ｂ５Ｃｌ、Ｂ５Ｃ４０、ＢＭＴ１０細胞、組織培養におけ る植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞よりなる群から選択される請求の範囲第２ ４項に記載の単細胞宿主。
２８、常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＥＬＡＭｌもしくはその断片の ためのＭＩＬＡ０２９、　ＣＤＩからなる請求の範囲第２８項に記載のＭＩＬＡ 。
３０、第９図に示したアミノ酸配列を有する請求の範囲第２８項に記載のＭＩＬ Ａ。
３１、　ＥＬＡＭＩに結合する請求の範囲第２８項に記載のＭＩＬＡの断片。
３２、前記断片が可溶性ポリペプチドである請求の範囲第３１項に記載の？１Ｉ ＬＡ断片。
３３、ハイブリッドーマ５ＧＢ３Ｂ４゜３４、ハイブリッドーマ５Ｇ８３Ｂ４に より産生されるモノクローナル抗体。
３５、　ＥＬＡＭＩのためのＭＩＬＡに対し反応性であるが、白血球細胞表面に おける他の蛋白には反応性でない抗体調製物。
３６、ＭＩＬＡがＣＤＸである請求の範囲第３５項に記載の抗体調製物。
３７、　実質的にモノクローナル抗体よりなる請求の範囲第３５項に記載の抗体 調製物。
３８、生物をＣＤＩもしくはその抗原性断片で免疫化することを特徴とするＥＬ ＡＭＩのためのＭＩＬＡに対し反応性の抗体調製物の製造方法。
３９、　（ａ）ヌクレオチド番号１０７から番号２ｏ４７までの第３図における ＶＣＡＭＩ　ＤＮＡ配列、（ｂ）ヌクレオチド番号１１０から番号２ｏ４７まで の第３図にお＋するＶＣＡＭＩ　ＤＮＡ配列、（Ｃ）成熟ＶＣＡＭＩのアミノ酸 配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号１７９〜２０４７の、必要に応じその５′末端にＡＴＧ 開始コドンを含む第３図のＶＣＡＭＩ　ＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＶＣＡＭＩをコードするＤＮＡ配列、（ｆ）ヌクレオチド番号１０ ０〜番号２３１６の第４図におけるＶＣＡＭｌｂ　ＤＮＡ配列、 （ｇ）ヌクレオチド番号１０３〜番号２３１６までの第４図におけるＶＣＡＭｌ ｂ　ＤＮＡ配列、（ｈ）成熟ＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配 列、 （ｉ）　可溶性ＶＣＡＭＩｂを：ｌ−ドするＤＮＡ配列、（Ｄヌクレオチド番号 １７２〜番号２３１６までの、必要に応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含 む第４図のＶＣＡＭｌｂ　ＤＮＡ配列、 （ｋ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化 するＤＮＡ配列、（１）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸 配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択される内皮細胞−白 血球付着分子もしくはその断片をコードするＤＮＡ配列。
４０、内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）もしくはその断片をコードするＤ ＮＡ配列からなり、前記ＤＮＡ配列は （ａ）ヌクレオチド番号１０７から番号２０４７までの第３図１：おけるＶｃＡ ＭＩ　ＤＮＡ配列、（ｂ）ヌクレオチド番号１】０から番号２０４７までの第３ 図１：おｌするＶｃＡＭＩ　ＤＮＡ配列、（Ｃ）成熟ＶＣＡＭＩのアミノ酸配列 をコードするＤＮＡ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号１７９〜２３１６の、必要に応じその５′末端にＡＴＧ 開始コドンを含む第４図のＶＣＡＭＩ　ＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＶＣＡＭＩをコードするＤＮＡ配列、（ｆ）ヌクレオチド番号１０ ０〜番号２３１６の第４図に図におけるＶＣＡＭｌｂ　ＤＮＡ配列、（ｈ）成熟 ＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｉ）可溶性ＶＣＡＭ１ｂをコードするＤＮＡ配列、（Ｄヌクレオチド番号１７ ２〜番号２３１６までの、必要に応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む第 ４図のＶＣＡＭｌｂ　ＤＮＡ配列、 （ｋ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化 するＤＮＡ配列、（１）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸 配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択される組換ＤＮＡ分 子。
４１、　前記ＤＮＡ配列が発現制御配列に作用結合されてなる請求の範囲第４０ 項に記載の組換ＤＮＡ分子。
４２、　前記発現制御配列がＳＶ４０もしくはアデノウィルスの早期もしくは後 期プロモータ、よ土工系、上二之系、リセレートキナーゼのプロモータ、酸ホス ファターゼのプロモータおよび酵母α−接合因子のプロモータよりなる群から選 択される請求の範囲第４１項に記載の組換ＤＮＡ分子。
４３、プラスミドＡＭ　ｐＣＤＭ８ＣＤ−ン４１またはプラスミドＶＣＡＭ１ｂ りｏ−ンＩＥＩＩ　ｐＣＤＭ８からなる請求の範囲第４１項に記載の組換ＤＮＡ 分子。
４４、　内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）もしくはそは （ａ）ヌクレオチド番号１０７から番号２０４７までの第３図におけるＶＣＡＭ Ｉ　ＤＮＡ配列、（ｂ）ヌクレオチド番号１１０から番号２０４７までの第３図 におけるｖＣＡＭＩ　ＤＮＡ配列、（ｃ）成熟ＶＣＡＭＩのアミノ酸配列をコー ドするＤＮＡ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号１７９〜２３１６の、必要に応じその５′末端にＡＴＧ 開始コドンを含む第４図のＶＣＡＭＩ　ＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＶＣＡＭＩをコードするＤＮＡ配列、（ｆ）ヌクレオチド番号１０ ０〜番号２３１６の第４図におけるＶｃＡＭｌｂ　ＤＮＡ配列、 （ｇ）ヌクレオチド番号１０３〜番号２３１６までの第４図におけるＶＣＡＭｌ ｂ　ＤＮＡ配列、（ｈ）成熟ＶＣＡＭＩｂのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配 列、 （ｉ）可溶性ＶＣＡＭ１ｂをコードす６ＤＮＡ配列、（ｊ）ヌクレオチド番号１ ７２〜番号２３１６までの、必要に応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む 第４図のＶＣＡＭｌｂ　ＤＮＡ配列、 （ｋ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化 するＤＮＡ配列、（１）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸 配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択され、しかも前記Ｄ ＮＡ配列が発現制御配列に作用結合されてなる組換ＤＮＡ分子により形質転換さ れた単細胞宿主。
４５、組換ＤＮＡ分子がプラスミドＡＭ　ｐＣＤＭ８クロー：ｚ４１＊たｌｔり ｏ−ンＶＣＡＭ１ｂ　ｐＣＤＭ８ＣＤ−ンＩＥ１１からなる請求の範囲第４４項 に記載の単細胞宿主。
４６、イー・コリ、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、ＣＨ Ｏ，Ｒ１，１、Ｂ−ＷＸＬ−Ｍ。
ＣＯ８１、ＣＯＳ　７、Ｂ５Ｃｌ、Ｂ５Ｃ４０およびＢＭＴＩＯ１組織培養にお ける植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞よりなる群から選択される請求の範囲第 ４４項に記載の単細胞宿主。
４７、請求の範囲第４４項に記載の単細胞宿主を培養することを特徴とするＶＣ ＡＭＩの産生方法。
４８、常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＶＣＡＭｌもしくはＶＣＡＭｌ ｂまたはその断片。
４９、ＶＣＡＭＩのドメイン１、ＶＣＡＭｌのドメイン２、Ｖ　ＣＡ　Ｍ　１（ ７）ドメイン３、ＶＣＡＭ１ｆ７）ドメイン４、ＶＣＡＭｌのドメイン５、ＶＣ ＡＭＩ（７）ドメイン６、ＶＣＡＭｌｂのドメイン３、ＶＣＡＭｌｂ（７）ドメ イン３Ｂ１ＶＣＡＭ１ｂのドメイン４およびその組合せよりなる群からから選択 されるＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭＩｂポリペプチド。
５０、アミノ酸番号２５からアミノ酸番号６４７までの、必要に応じＮ−末端メ チオニン残基を含む第３図のアミノ酸配列からなる請求の範囲第４８項に記載の ＶＣＡＭＩ。
５１、ＶＣＡＭＩもＬ＜ＧｔＶＣＡＭｌｂｌ、：対し反応性テするが、内皮細胞 表面上で発現される他の付着分子に対し反応性でない抗体調製物。
５２、前記抗体調製物が実質的にモノクローナル抗体よりなる請求の範囲第５１ 項に記載の抗体調製物。
５３、ＶＣＡＭＩを認識するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ。
５４、　生物をＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭｌｂまたはその抗原性断片で免疫化 することを特徴とするＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭｌｂを認識する抗体の産生方 法。
５５、　（ａ）分子をＥＬＡＭまたはＥＬＡＭ発現性細胞と接触させて第１混合 物を作成し、 （ｂ）前記第１混合物をＥＬＡＭリガンドまたはＭＩＬＡ発現性細胞と接触させ て第２混合物を作成し、（Ｃ）前記第２混合物を、前記ＥＬＡＭリガンドもしく はＭＩＬＡ−発現性細胞に結合した前記ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ発現性細胞の 量につき試験することを特徴とする内皮細胞に対する白血球の結合を阻止する分 子の同定方法。
５６、　（ａ）分子をＥＬＡＭリガンドまたはＭＩＬＡ発現性細胞と接触させて 第１混合物を作成し、（ｂ）前記第１混合物をＥＬＡＭまたはＥＬＡＭ発現性細 胞と接触させて第２混合物を作成し、（Ｃ）前記第２混合物を、前記ＥＬＡＭも しくはＥＬＡＭ発現性細胞に結合した前記ＥＬＡＭリガンドもしくはＥＬＡＭ発 現性細胞の量につき試験することを特徴とする内皮細胞に対する白血球の結合を 阻止する分子の同定方法。
５７、　ＥＬＡＭがＥＬＡＭＩである請求の範囲第５５項または第５６項に記載 の方法。
５８、　ＥＬＡＭリガンドがＥＬＡＭＩリガンドである請求の範囲第５５項また は第５６項に記載の方法。
５９、ＭＩＬＡがＣＤＸである請求の範囲第５５項または第５６項に記載の方法 。
６０、ＥＬＡＭがＶＣＡＭＩもしくはＶｃＡＭｌｂである請求の範囲第５５項ま たは第５６項に記載の方法。
６１、ＭＩＬＡがＶＣＡＭｌもり、＜はＶｃＡＭ１ｂリガンドである請求の範囲 第５５項または第５６項に記載の方法。
６２、ＭＩＬＡがＶＬＡ４である請求の範囲第５５項または第５６項に記載の方 法。
６３、　白血球と内皮細胞との間の付着をこれらを含有する系にて阻止するに際 し、有効量の阻止剤を前記系に導入し、前記阻止剤をＥＬＡＭリガンドに結合し うるＥＬＡＭもしくはその断片、ＭＩＬＡを認識する抗体、ＥＬＡＭに結合しう るＥＬＡＭリガンドもしくはその断片、ＥＬＡＭに結合する炭水化物、およびＥ ＬＡＭを認識する抗体よりなる群から選択する白血球と内皮細胞との間の付着の 阻止方法。
６４、　阻止剤が、ＥＬＡＭＩのレクチン状ドメイン、ＥＬＡＭＩのＥＧＦ状ド メイン、ＥＬＡＭＩの一致システィン反復単位、および可溶性ＥＬＡＭＩよりな る群から選択されるＥＬＡＭＩもしくはＥ　Ｌ　Ａ　Ｍの断片である請求の範囲 第６３項に記載の方法。
６５、阻止剤が、ＥＬＡＭＩリガンドを認識するモノクローナル抗体の調製物で ある請求の範囲第６３項に記載の方法。
６６、阻止剤が、ＣＤＩを認識するモノクローナル抗体である請求の範囲第６３ 項に記載の方法。
６７、モノクローナル抗体がハイブリドーマ５Ｇ８３Ｂ４により産生されるもの である請求の範囲第６６項に記載の方法。
６８、前記阻止剤が、ＥＬＡＭＩに結合しうるＥＬＡＭＩリガンドもしくはその 断片である請求の範囲第６３項に記載の方法。
６９、阻止剤が、ＥＬＡＭＩを認識するモノクローナル抗体である請求の範囲第 ６３項に記載の方法。
７０８　モノクローナル抗体がハイブリドーマＣＤＢ、ＢＢ１１、ＢＯ２抗−Ｅ ＬＡＭＩにより産生されるものである請求の範囲第６９項に記載の方法。
７１　前記阻止剤をＶＬＡ４に結合するＶＣＡＭＩ、ＶＣＡＭｌｂおよびその断 片よりなる群から選択する請求の範囲第６３項に記載の方法。
７２、前記阻止剤が、ＶＣＡＭＩリガンドを認識するモノクローナル抗体である 請求の範囲第６３項に記載の方法。
７３、前記阻止剤が、ＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭｌｂに結合するＶＣＡＭＩリ ガンドもしくはその断片である請求の範囲第６３項に記載の方法。
７４、　ＶＣＡＭＩリガンドがＶＬＡ４である請求の範囲第７３項に記載の方法 。
７５、前記阻止剤が、ＶＣＡＭＩもしくはＶｃＡＭｌｂを認識するモノクローナ ル抗体である請求の範囲第６３項に記載の方法。
７６、　ＥＬＡＭリガンド、ＥＬＡＭリガンドのＥＬＡＭ結合性断片、およびＥ ＬＡＭを認識する抗体よりなる群から選択される検出自在に標識された化合物を 投与することを特徴とする炎症の検出方法。
７７、　（ａ）血液、血清もしくは他の体液の試料を検出自在に標識されたＥＬ ＡＭリガンド、ＥＬＡＭリガンドのＥＬＡＭ結合性断片またはＥＬＡＭを認識す る抗体と接触させて混合物を作成し、 （ｂ）前記混合物をＥＬＡＭリガンド、ＥＬＡＭリガンドのＥＬＡＭ結合性断片 もしくはＥＬＡＭに結合した抗体の量につき試験する ことを特徴とする炎症の検出方法。
７８、　ＥＬＡＭリガンドがＥＬＡＭＩリガンドである請求の範囲第７６項また は第７７項に記載の方法。
７９、　ＥＬＡＭリガンドがＶＣＡＭ１ｂリガンドもしくはＶＣＡＭ１ｂリガン ドである請求の範囲第７６項または第７７項に記載の方法。
３Ｑ、ＶＣＡＭＩリガンドがＶＬＡ４である請求の範囲第７９項に記載の方法。
８１、抗体がハイブリドーマＣＤＢ、Ｂｌｌ、ＢＣ６抗−ＥＬＡＭＩにより産生 されたものである請求の範囲第７６項または第７７項に記載の方法。
８２、　ＥＬＡＭもしくはその断片を発現に際しコーするＤＮＡ配列、および免 疫グロブリン分子の一定領域を発現に際しコードするＤＮＡ配列からなることを 特徴とするＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白を発現に際しコードする組換ＤＮ Ａ分子。
８３、ＥＬＡＭがＥＬＡＭＩ、ＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭｌｂである請求の範 囲第８２項に記載のＤＮＡ配列。
８４、　ＶＣＡＭＩドメイン１−３およびヒト免疫グロブリンＣ−γ−１の一定 領域からなる請求の範囲第８２項に記載の組換ＤＮＡ分子。
８５、ｍＲＮＡにハイブリッド化する核酸配列からなるＥＬＡＭもしくはＭＩＬ Ａ　ｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸。
８６０．前記ｍＲＮＡの開始コドンに結合する請求の範囲第８５項に記載のアン チセンスオリゴヌクレオチド。
８７、ＥＬＡＭがＥＬＡＭＩ、ＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭｌｂである請求の範 囲第８５項に記載のアンチセンス核酸。
８８、ＭＩＬＡがＥＬＡＭＩリガンドである請求の範囲第８５項に記載のアンチ センス核酸。
８９、ＭＩＬＡがＣＤＸである請求の範囲第８５項に記載のアンチセンス拡散。
９０、ＭＩＬＡがＶＬＡ４である請求の範囲第８５項に記載のアンチセンス核酸 。
９１、ＤＮＡを含む請求の範囲第８５項に記載のアンチセンス核酸。
９２、ＲＮＡを含む請求の範囲第８５項に記載のアンチセンス核酸。
９３、ＤＮＡ配列５’　ＣＣＣＡＧＧ　ＣＡＴ　ＴＴＴＡＡＧを有する請求の範 囲第８５項に記載のアンチセンス核酸。
９４、ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ　ｍＲＮＡに対するアンチセンスリボ核酸を転 写に際し産生ずるＤＮＡ配列を有し、前記アンチセンスリボ核酸が前記ｍＲＮＡ にハイブリッド化する核酸配列からなることを特徴とする組換ＤＮＡ分子。
９５、　ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ　ｍＲＮＡに対するアンチセンスリボ核酸を 転写に際し産生ずるＤＮＡ配列を有し、前記アンチセンスリボ核酸が前記ｍＲＮ Ａにハイブリッド化する核酸配列からなる組換ＤＮＡ分子によりトランスフェク トされたＥＬＡＭ生産性もしくはＭＩＬＡ−生産性細胞ライン。
９６、ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ　ｍＲＮＡに対するアンチセンスリボ核酸を転 写に際し産生ずるＤＮＡ配列を有し、前記アンチセンスリボ核酸が前記ｍＲＮＡ にハイブリッド化する核酸配列からなる組換ＤＮＡ分子によりＥＬＡＭ−生産性 もしくはＭＩＬＡ−生産性細胞ラインをトランスフェクトすることを特徴とする ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡの減少した発現を示す細胞ラインの作成方法。
９７、　ＩＮもしくはそれ以上のＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡの産生を減少させる のに有効な量の請求の範囲第８２項に記載のアンチセンス核酸を投与することを 特徴とする炎症の処置方法。
９８、　ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ　ｍＲＮＡを切断するリボチーム。
９９、　ＥＬＡＭｌ、ＶＣＡＭＩもしくｌｔＶｃＡＭｌｂｍＲＮＡを切断する請 求の範囲第９８項に記載のリボチーム。
１００、　ＥＬＡＭリガンドｍＲＮＡを切断する請求の範囲第９８項に記載のリ ボチーム。
１０１、　ＣＤＸ　ｍＲＮＡを切断する請求の範囲第９８項に記載のリボチーム 。
１０２、ＶＬＡ４　ｍＲＮＡを切断する請求の範囲第９８項に記載のリボチーム 。
１０３、　テトラヒメナ型リボチームをさらに含む請求の範囲第９８項に記載の りボチーム。
１０４、　ハンマーヘッド型リボチームをさらに含む請求の範囲第９８項に記載 のりボチーム。
１０５、　ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ　ｍＲＮＡを切断する゛リボチームを転写 に際し産生ずるＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡ分子。
１０６、ＲＮＡ配列５’　ＡＡＧＧＡＵＣＡＣＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡ ＧＧＡＣＧＡ　ＡＡＣＣＡＵＣＵＵからなる請求の範囲第９８項に記載のリボチ ーム。
１０７、　ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ　ｍＲＮＡを切断するリボチームを転写に 際し産生ずるＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトされた ＥＬＡＭ生産性もしくはＭＩＬＡ　ｍＲＮＡ生産性細胞ライン。
１０８、　ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ　ｍＲＮＡを切断するリボチームを転写に 際し産生ずる組換ＤＮＡ分子によりＥＬＡＭ−生産性もしくはＭＩＬＡ−生産性 細胞ラインをトランスフェクトすることを特徴とするＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ の減少した発現を示す細胞ラインの作成方法。
１０９、２ＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドの産生を減少させるのに有効な量の ＥＬＡＭ　ｍＲＮＡもしくはＥＬＡＭリガンド　ｍＲＮＡを切断するリボチーム を投与することを特徴とする炎症の処置方法。
１１０、　ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡに対し反応性である抗−イディオタイプ抗 体調製物。
１１１、ＥＬＡＭＩ、ＶＣＡＭｌもＬ＜はＶＣＡＭ１ｂｌニ一対し反応性である 請求の範囲第１１０項に記載の抗−イディオタイプ抗体調製物。
１１２、　ＥＬＡＭＩリガンドに対し反応性である請求の範囲第１１０項に記載 の抗−イディオタイプ抗体調製物。
１’１３．　ＶＬＡ４に対し反応性である請求の範囲第１１０項に記載の抗−イ ディオタイプ抗体調製物。
１１４、ＣＤＩに対し反応性である請求の範囲第１１０項に記載の抗−イディオ タイプ抗体調製物。
１１５、ＶＣＡＭＩのドメイン１．２．３．４．５もしくは６またはＶＣＡＭｌ ｂのドメイン３．３Ｂもしくは４に対し反応性である請求の範囲第１１０項に記 載の抗−イディオタイプ抗体調製物。
１１６、　（ａ）ＥＬＡＭＩ、ＣＤＸ、ＶＣＡＭＩ、ＶＣＡＭｌｂもしくはＶＬ Ａ４のいずれか１種を認識する抗体を認識する抗−イディオタイプ抗体に対し結 合する蛋白につき蛋白混合物をスクリーニングし、（ｂ）前記抗−イディオタイ プ抗体に結合する分子を分離し、 （ｃ）ＥＬＡＭＩ、ＣＤＸ、ＶＣＡＭＩ、ＶＣＡＭｌｂもしくはＶＬＡ４に結合 する蛋白の能力を試験する ことを特徴とするＥＬＡＭＩ、ＣＤＸ、ＶＣＡＭＩ、ＶＣＡＭＩ　ｂもしくはＶ ＬＡ４のいずれか１種に結合するＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドの同定方法 。
１１７、　（ａ）ＶＣＡＭＩもしく　ハＶ　ＣＡＭ　１　ｂ　（７）前記ドメイ ンのすいずれかを認識する抗体を認識する抗−イディオタイプ抗体に対し結合す る蛋白につき蛋白混合物をスクリーニングし、 （ｂ）前記抗−イディオタイプ抗体に結合する蛋白を分離し、 （ｃ）ＶＣＡＭＩもＬ＜はＶｃＡＭｌｂ（７）前記ドメインのいずれかに結合す る蛋白の能力を試験することを特徴とするＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭＩｂのド メインのいずれかに結合するＥＬＡＭリガンドの同定方法。
１１８、１Ｌ−１、ＴＮＦもしくはＩＦＮ−γを認識する抗体の有効量を投与す ることを特徴とするＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭ１ｂ発現の阻止方法。
１１９、　核種に結合し？＝ＶＣＡＭ１もしくｊｔＶｃＡＭｌｂを認識する抗体 からなる放射線免疫結合体。
１２０、　核種がＩ　、Ｙ　およびＲｅ１８６よりなる群から選択される請求の 範囲第１１９項に記載の放射線免疫結合体。
１２１、　細胞毒素に結合したＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭｌｂを認識する抗体 からなる免疫毒素。
１２２、　細胞毒素がシニードモナス外生毒素である請求の範囲第１２１項に記 載の免疫毒素。
１２３、ＶＣＡＭＩもｔ、ｌＶｃＡＭｌｂを認識する抗体を持った放射線免疫結 合体を投与することを特徴とするＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭｌｂ−生産性癌細 胞の検出方法。
１２４、ＶＣＡＭＩもＬ＜ｌｔＶｃＡＭｌｂを認識する抗体を持った放射線免疫 結合体もしくは免疫毒素の有効量を投与することを特徴とする癌の処置方法。
１２５、ＶＣＡＭＩＩＪガントを結合するＶＣＡＭｌも［、＜はＶＣＡＭ１ｂド メインおよびＩＣＡＭｒリガンドを結合するＩＣＡＭＩドメインに関するＤＮＡ 配列からなる、Ｖ　ＣＡＭ／　Ｉ　ＣＡＭ融合蛋白をコードするＤＮＡ配列。
１２６、　ＶＣＡＭ１’ＪガントがｖＬＡ４であり、Ｉ　ＣＡＭ１リガンドガＬ ＰＡＩである請求の範囲第１２５項に記載のＤＮＡ配列。
１２７．　ＶＣＡＭＩリガンドを結合するＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭＩｂドメ インおよびＩＣＡＭＩリガンドを結合するＩＣＡＭ１ドメインからなるＶＣＡＭ ／Ｉ　ＣＡＭ融合蛋白。
１２８、　ＶＣＡＭＩリガンドがＶｌ、Ａ４であり、ＩＣＡＭ１リガンドがＬＦ Ａｌである請求の範囲第１２７項に記載の融合蛋白。
１２９、　（１）腫瘍組織の試料を、この種の腫瘍を有する哺乳動物から副出し 、 （２）腫瘍組織に浸潤した１個もしくはそれ以上の白血球を前記試料から分離し 、 （３）殺腫瘍剤をコードする遺伝子を含むと共に殺腫瘍性遺伝子生産物を前記白 血球内に発現しうる組換発現ベクターにより前記１個もしくはそれ以上の浸潤性 白血球をトランスフェクトし、 （４）トランスフェクトされた白血球を前記哺乳動物に導入する ことを特徴とするＥＬＡＭＩ、Ｖ　ＣＡ　Ｍ　１、ＶＣＡＭｌｂもしくはそのリ ガンドを発現する腫瘍の処置方法。
１３０、　殺腫瘍性遺伝子生産物がＴＮＦもしくはリンパ性毒素である請求の範 囲第１２９項に記載の方法。
１３１、哺乳動物がヒトである請求の範囲第１３０項に記載の方法。
１３２、　組換発現ベクターがレトロウィルスベクターである請求の範囲第１２ ９項に記載の方法。
１３３、トランスフェクトされた白血球を哺乳動物に導入する前に、前記トラン スフェクトされた白血球をＩ　Ｌ−２で拡充させる請求の範囲第１２９項に記載 の方法。
１３４、　腫瘍が悪性腫瘍である請求の範囲第１２９項に記載の方法。
１３５、　腫瘍がＶＬＡ４もしくはＣＤＩを発現する請求の範囲第１２９項に記 載の方法。
１３６、　腫瘍が黒色腫もしくは結腸癌である請求の範囲第１３５項に記載の方 法。
１３７、　ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡを発現する標的細胞に対し白血球の細胞融 解特性を向上させるに際し、前記標的細胞により発現されたＥＬＡＭもしくはＭ ＩＬＡに結合するＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ分子をコードする遺伝子を備え、さ らに前記白血球内に前記遺伝子を発現しうる組換発現ベクターにより前記白血球 をトランスフェクトすることを特徴とする白血球の細胞融解特性の向上方法。
１３８、　標的細胞が黒色腫もしくは結腸癌である請求の範囲第１３７項に記載 の方法。
１３９、　遺伝子がＶＣＡＭＩもしくはＶｃＡＭｌｂをコー・ドし、またはＥＬ ＡＭＩを特徴とする請求の範囲第１３８項に記載の方法。
１４０、　組換発現ベクターがレトロウィルスベクターである請求の範囲第１３ ７項に記載の方法。
１４１、　組換発現ベクターが殺腫瘍剤をコードする遺伝子をさらに含む請求の 範囲第１４０項に記載の方法。
１４２、　白血球が腫瘍浸潤性白血球である請求の範囲第１４０項に記載の方法 。
明細書 内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）および白血球付着に関与する分子（ＭＩ ＬＡ）発明の技術分野 本発明は、炎症の際の内皮細胞に対する白血球の付着に関与する分子、およびこ れらを発現に際しコードするＤＮＡ配列に関するものである。より詳細には本発 明は、ＥＬＡＭＩ並びに血管細胞付着分子１およびｌｂ　（ＶＣＡＭＩおよびＶ ＣＡＭｌｂ）を包含する内皮細胞付着分子（ＥＬＡＭ）に関するものである。さ らに本発明は、内皮細胞に対する白血球付着に関与する白血球の表面における分 子（ＭＩＬＡ）に関するものである。これらはＣＤＩ、すなわちＥＬＡＭＩ付着 経路に関与する分子、並びにＶＬＡ４、すなわちＶＣＡＭｌおよびＶＣＡＭＩｂ のリガンドを包含する。さらに本発明は、これら付着分子を認識する抗体、並び にこれら抗体と付着分子のためのリガンドもしくはリセブタとの両者を認識する 抗−イディオタイプ抗体に関するものである。さらに本発明は、この種の付着分 子のためのｍＲＮＡに対し相補的なアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ分子に関し 、さらにこの種の分子のためのｍ、　ＲＮ　Ａを認識するりボチームに関する。
さらに本発明は、たとえば内皮細胞に対する白血球付着を検出し或いは阻止する ための診断剤および治療剤を開発する際の上記分子、ＤＮＡ配列、抗体、抗−イ ディオタイプ抗体、アンチセンス分子およびリボチームの使用方法に関するもの である。
発明の背景 炎症ば、感染もしくは外傷に対する血管組織の反応である。
臨床上、これは４種類の徴候を伴う二すなわち発赤、発熱、疼痛および浮腫。そ の経過は急性もしくは慢性のいずれかである。
細胞レベルにて、炎症は血管の内皮壁に対する白血球の付着および周囲組織中へ のその浸潤を伴う［バーラン、１９８５］。
急性炎症は多形核白血球（ＰＭＮ）の付着および浸潤を特徴とする［バーラン、 １９８７並びにマレヒおよびガリン、１９ｇ？］。
組織内のＰＭＮ蓄積は炎症刺戟の２．５〜４時間後にそのピークに達し、約２８ 時間で止まる〔ベビラッカおよびギンブロン、１９８７］。これに対し、慢性炎 症は他の白血球、特に単核細胞およびリンパ球の付着および、浸潤を特徴とする 。
一般的な炎症において、浸潤性白血球は侵入生物もしくは死滅細胞を食菌すると 共に、組織修復および免疫反応に役割を演する。しかしながら病理学的炎症にお いては、浸潤性白血球が重大かつしばしば致命的な損傷をもたらしうる。関節リ ウマチ症およびアテローム性硬化症が慢性炎症病の例であり、単核白血球が組織 に浸潤して損傷をもたらす［ツーおよびソコロフ、１９８５並びにロス、１９８ ６］。多器官不全症候群、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）および虚血性再潅流 障害は急性炎症であって、浸潤性ＰＭＮが損傷をもたらす［バーラン、１９Ｂ？ 並びにマレヒおよびガリン、１９８７］。たとえば重症火傷に伴うショックを受 けた後に生じうる多器官不全症候群においては、ＰＭＮ媒介の損傷が外傷を悪化 させる。
ＡＲＤＳにおいては、ＰＭＮが肺に液体を充満させて犠牲者を溺死させることが ある。血液の供給が遮断された組織に突然に血液が潅流された際に生ずる虚血性 再潅流障害（たとえば心臓発作または脚部再結合の後）において、ＰＭＮ付着は 重大な組織損傷をもたらす［バーラン、１９８７］。
白血球浸潤が多くの炎症関連病理学の原因であり、かつ白血球付着が浸潤の第１ 過程であることを認識して、最近研究者は内皮細胞表面に結合する白血球のメカ ニズムに注意を集中している。研究が示したところでは、結合はリセブタおよび リガンドとして作用する内皮細胞と白血球との両者における細胞表面分子により 媒介される［バーラン等、１９８７　；ダナ等、１９８６　；およびベビラッ力 等、１９８７　ａコ。
炎症の経過に際し、成る種の炎症剤は白血球に対し作用して、これらを内皮に対 し高付着性にする。公知の炎症剤はロイコトリエン−８４（ＬＴＢ４）　、相補 因子５ａ（Ｃ５ａ）およびホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン （ＦＭＬＰ）を包含する。これらの薬剤は、ＬｅｕＣＡＭと呼ばれる１群の蛋白 を活性化させる。Ｌ　ｅ　ｕ　ＣＡＭはＣＤ１１およびＣＤ１８蛋白の二量体で ある。ＬｅｕＣＡＭの１種、すなわちＣＤ１１ａ／ＣＤ１８　（ＬＦＡＩとも呼 ばれる）は、ＩＣＡＭＩ（細胞間付着分子１）とも呼ばれる内皮細胞上のリセブ タに結合する［バーラン、１９８５およびダナ等、１９８６１゜研究者等が示し たところでは、ＬｅｕＣＡＭに対するモノクローナル抗体（Ｍｏａｂｓ）はイン ビトロおよびインビボの両者にて内皮に対するＰＭＮ付着を阻止する［アルフォ ルス、１９８７　、ベダー等、１９１１１１　；およびトッド、１９８９コ。
他の炎症剤は内皮細胞に直接作用して、実質的に白血球付着を開始させる。これ らの薬剤はサイドキン類、すなわちインクロイキン−１（ＩＬ−１）、リンパ性 毒素（ＬＴ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）　、並びに細菌内生毒素、リボ多糖 類（ＬＰＳ）を包含する。たとえばＩ　Ｌ、−１は、ヒト内皮細胞の単層に対す るＰＭＮ、単核細胞および関連細胞ラインＨＬ−６０（ＰＭＮ状）およびＵ９３ ７　（単核細胞状）の付着を刺戟することが示されている。作用は時間依存性で あると共に蛋白合成依存性である［ベビラッカ等、１９１１７ａ　；ベビラッ力 等、１９８７ｂ　、およびベビラッ力等、１９８５］。
現在の証拠が示すように、これらの薬剤は内皮細胞表面に対するＥＬＡＭ　（内 皮細胞−白血球付着分子）と呼ばれる１群の分子を誘発させる。現在まで研究者 は２種のこれら分子、すなわち細胞間付着分子１　（ＩＣＡＭＩ）および内皮細 胞−血球付着分子１　（ＥＬＡＭＩ）を同定している［シモンス等、１９１１１ １　；スタウントン等、１９８８　；およびベビラッカ等、１９ｇ７ｂ］。
ＩＣＡＭＩは多くの細胞型で見出だされ、さらに血管内皮上でのその発現は炎症 性サイドキン、すなわちインタロイキン−１（Ｉ　Ｌ−１）　、腫瘍壊死因子− α（ＴＮＦ）およびγインタフェロン（ＩＦＮ−γ）によりインビトロおよびイ ンビボの両者にて強力に増大される［ホバー等、１９８６；ダスチンおよびスブ リンガー、１９８８；並びにコトランおよびホバー、１９８８］。
ＥＬＡＭＩは最初に検出され、かつサイドキン処理されたヒト謄静脈内皮細胞（ Ｉ（ＵＶＥＣ）に対するＰＭＮ付着を部分的に阻止するモノクローナル抗体（Ｍ ｏａｂ）を特徴とする。ＥＬＡＭＩは、炎症性サイトキンＩＬ−１もしくはＴＮ Ｆに反応するがＩＦＮ−γには反応せずにＨＵＶＥＣにより急速に合成される１ １６ｋＤの細胞表面グリコ蛋白である［ベビラッ力等、１９１１７ｂｌ。ＩＣＡ ＭＩとは異なり、ＥＬＡＭｌは内皮においてのみ発現されると思われ、その発現 は継続したサイトキンの存在下においてさえ一時的である。
Ｉ　ＣＡＭｌと同様に、ＥＬＡＭＩもインビボにて炎症部位に存在する。免疫組 織学の研究は、これが急性炎症部位には存在するが慢性炎症部位には存在せず、 非炎症血管壁にも存在しないことを示している［コトラン等、１９８６、並びに コトランおよびホバー、１９８Ｂ］。したがって、ＥＬＡＭｌはインビボにおけ る炎症血管壁に対するＰＭＮ付着の主たる媒体であると思われる。重要なことに 、細胞表面におけるＥＬＡＭＩの存在は急性炎症の自然経過を辿り、刺戟の数時 間後に出現すると共に１日以内に徐々に消失する［ベビラツカ等、１９ｇ？ｂ］ 。
間接的証拠は、他のＥＬＡＭが存在することを示唆する。
炎症剤はインビトロにて内皮に対するＰＭＮ、単核細胞およびリンパ球の結合を 誘発するが、ＥＬＡＭＩに対するＭｏａｂｓはＰＭＮおよび関連細胞の結合のみ を阻止する［ベビラッ力およびギンブロン、１９ｇ？］。さらに、インビボにお ける炎症部位でのリンパ球および単核細胞の最大蓄積は、ＥＬＡＭＩ発現が基礎 レベルまで復帰した際に約２４時間にて生ずる。この情報に基づき研究者は、こ れらリンパ球および単核細胞の結合を媒介する他のＥＬＡＭの存在を想定した［ ベビラッカ等、１９Ｂ７ｂ］。以下詳細に説明するように、本発明者等はさらに ２種のＶＣＡＭＩおよびＶＣＡＭｌｂと称するＥＬＡＭを特性化すると共にクロ ーン化し、これらは内皮細胞に対するリンパ球の結合を媒介する。したがって、 ＥＬＡＭは１群の分子と見なすことができる。
多くの証拠が示すように、ＥＬＡＭは腫瘍侵蝕、転移およびウィルス感染を包含 する細胞−細胞認識を含む広範囲の病理学的状態にて重要な役割を演する［バー ラン、１９８５　；ワリスおよびバーラン、＋９１１６　、ベビラツカ等、１９ ８７ａ　；並びにコトランおよびホバー、］９８８］。
ＥＬＡＭを発現する細胞に対する白血球の付着は、白血球上にＥＬＡＭリガンド が存在することを示唆する。この種の分子の１種はＩ　ＣＡＭＩリガンド、すな わちリンパ球機能に関連した抗原１　（ＬＦＡＩ）である。ＬＰＡＩは、β２イ ンテグリンもしくはＣＤ　１１／１８属として知られた３種のへテロダイマー分 子の１種である［ダスチン等、＋９８６．ロスライン等、＋９８６　、並びにマ ーリンおよびスプリンガー、１９８７］。
最近の研究が示すところでは、Ｉ　ＣＡＭＩ／ＬＦＡＩ経路はインビトロにて内 皮細胞に対するリンパ球および多形核白血球（ＰＭＮ）の両者の付着に役割を演 する［ダスチンおよびスブリンガー、１９１１８；スミス等、１９８９］。本明 細書では、ＥＬＡＭＩリガンドであると証明しうる、内皮細胞に対する白血球付 着に関与する分子（ＭＩＬＡ）の分離につき説明する。ＣＤＩと称する分子は約 １５０ｋＤの蛋白であって、Ｈし一６０細胞から分離された。ＣＤＩを認識する モノクローナル抗体は、ＥＬＡＭＩ−発現性細胞に対するＰＭＮおよびＨＬ−６ ０細胞の結合を阻止する。さらに、ＣＤＸはＥＬＡＭＩに付着することが知られ た種類の白血球細胞に存在し、ＥＬＡＭＩに付着しない種類の白血球細胞および その他の細胞には存在しない。したがってＣＤＩは成る種の白血球で発現される 分子であって、ＥＬＡＭＩ−媒介の白血球−内皮細胞付着において重要な役割を 演する。さらに、ＣＤＸをコードするｃＤＮＡの分離および配列決定についても 説明する。
さらに、ＶＣＡＭＩおよびＶＣＡＭ１ｂリガンド、すなわちＶＬＡ４の同定につ いても説明する［ヘルマーおよびタカダ、ＥＰ３３Ｇ５０６号コ。ＶＬＡ４のα 　およびβ１サブ単位に特異性の抗体は、ＶＣＡＭＩに対するＶＬＡ４−発現性 細胞の結合を完全に排除する。
血管壁に対する白血球付着は炎症における第１過程であるため、この過程を防止 することに向けられる治療は病理学的炎症の処置に関し魅力的である。臨床医は 成る程度の成功を以て白血球媒介付着の阻止に基づく治療につき既に試験してい る。この種の対策の１つは、ＰＭＮ付着を阻止するための白血球細胞表面複合体 （ＣＤ　１１／ＣＤ　１８）に対するＭｏ　ａ　ｂ　ｓ結合を含む（アルフォル ス等、１９ｇ７；ベダー等、１９８ｇ　、およびトッド等、＋９８９）。
内皮細胞媒介の結合、並びにＥＬＡＭおよびＭＩＬＡ（ＥＬＡＭリガンドを含む ）に基づく白血球付着を防止するための代案治療は特に一層有望であると思われ る。ＥＬＡＭ系は２つの理由から特に魅力的である：第１に、内皮細胞における ＥＬＡＭ発現は構成的でなく誘発されるので、ＥＬＡＭは炎症の部位に集中する と共に数が制限される。このことは付着阻止剤が局部的にのみ作用すればよく、 したがって構成的に発現される分子に向けられた阻止剤よりも少なくい投与量に て効果的であることを意味する。第２に、ＥＬＡＭ結合は種々異なる種類の白血 球に対し選択的である。
たとえばＥＬＡＭＩはＰＭＮを結合するのに対し、ＶＣＡＭｌはリンパ球を結合 する。したがって、これらの治療は所定の種類の白血球に対し特異性であると共 に、他の種類の白血球の循環もしくは移動に影響を与えない。さらに上記の理由 から、この種の治療は安価かつ毒性が低いと判明した。
ＥＬＡＭに基づく治療に対する対策は、常態結合した動物蛋白を含まない高度精 製型におけるＥＬＡＭおよびＭＩＬＡの両者を出発物質として必要とする。さら に、これら分子を生産する方法も必要とされる。これらおよびその他の必要性は 、特定付着分子を発現に際しコードするＤＮＡ配列を分離すると共に、その生産 のための組換ＤＮＡ分子および発現ビークルを作成することにより、本明細書中 に説明するように解決される。
発明の要点 本発明の主たる目的は炎症を検討し、診断し、予防しかつ処置するための新規な 手段を提供することにある。より詳細には本発明の目的は、内皮細胞に対する白 血球結合に関与する分子を提供すると共に、白血球の内皮細胞結合を阻止するの に自体有用である他の分子を分離することにある。
本発明は、内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）を発現に際しコードするＤＮ Ａ配列、ＥＬＡＭのためのゲノムＤＮＡ配列（Ｅ　Ｌ　ＡＭ発現制御配列を包含 する）、これらＤＮＡ配列を有する組換ＤＮＡ分子、これらＤＮＡ分子により形 質転換された単細胞宿主、ＥＬＡＭの産生方法、並びに常態結合した動物蛋白を 実質的に含まないＥＬＡＭ蛋白を提供する。さらに本発明は、ＥＬＡＭに対し反 応性の抗体調製物をも提供する。
さらに本発明は、内皮細胞に対する白血球付着に関与した分子（ＭＩＬＡ）を発 現に際しコードするＤＮＡ配列をも提供する。ＭＩＬＡは、ＥＬＡＭに直接結合 する白血球表面分子、すなわちＥＬＡＭリガンドを包含する。ＥＬＡＭリガンド を認識するモノクローナル抗体は、ＥＬＡＭ／ＥＬＡＭリガンド結合を直接に阻 止することができる。さらにＭＩＬＡはく付着に間接的に関与する白血球表面分 子、たとえばモノクローナル抗体のような第３の分子と相互作用することにより Ｅ　Ｌ　ＡＭ／Ｅ　Ｌ　ＡＭリガンド結合を阻止する分子を包含する。この種の 分子は、たとえばＥＬＡＭに対する親和性を低下させるようＥＬＡＭリガンドの 表面構成を変化することにより作用することができる。さらに本発明は、ＭＩＬ ＡＤＮＡ配列を有する組換ＤＮＡ分子、およびこれらにより形質転換された単細 胞宿主をも提供する。さらに常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＭＩＬＡ 蛋白、ＭＩＬＡの生産方法、並びにＭＩＬＡ（特にＣＤＩ）を認識するモノクロ ーナル抗体をも提供する。特に本発明は、さらにＣＤＩをコードするＤＮＡ配列 を持った組換ＤＮＡ分子を提供し、さらにこれらにより形質転換された単細胞宿 主を提供する。
さらに本発明はＥＬＡＭＳＥＬＡＭリガンドを包含するＭＩＬＡ、またはこれら 分子の１部をリセブタもしくはリガンドを阻止するため使用することを含む内皮 細胞に対するＰＭＮ結合の阻止方法をも提供する。さらに、ＥＬＡＭ発現を阻止 するためのアンチセンス核酸およびリボチームの使用にも関する。さらに本発明 は、ＥＬＡＭのそのリガンドに対する結合を阻止する能力につき分子をスクリー ニングすることによる結合阻止剤の同定方法にも関する。さらに本発明は、ＥＬ ＡＭおよびそのリガンドの同定方法をも提供する。この種の１つの方法は、ＥＬ ＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドを認識する抗体に対する抗−イディオタイプ抗体 を使用する。
図面の簡単な説明 第１図はＥＬＡＭ　ｐＣＤＭ８ＣＤ−ン６、ｐＳＱ１４８およびｐｓＱ１４９の ＤＮＡ配列から誘導された複合ＥＬＡＭＩ　ｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配 列を示し、ヌクレオチドは１〜３８６３の番号を有する。本明細書の全体にわた り、この図面のコード化ＤＮＡ配列をＥＬＡＭＩのためのＤＮＡ配列と称する。
さらに、この図面に示したアミノ酸配列からなる分子をＥＬＡＭＩと称する。
第２図はｐＮＮｌｌの合成ポリリンカーのＤＮＡ配列を示す。
第３図はＡＭ　ｐＣＤＭ８ＣＤ−ン４１から誘導されたＶＣＡＭＩをコードする ｃＤＮＡの配列およびＶＣＡＭＩの推定アミノ酸配列を示し、ヌクレオチドは１ 〜２８１１の番号を有する。本明細書において、この図面のコード化ＤＮＡ配列 をＶＣＡＭＩのためのＤＮＡ配列と称する。さらに、この図面に示したアミノ酸 配列からなる分子をＶＣＡＭＩと称する。
第４図１！ＶＣＡＭ１ｂ　ｐｃＤＭ８りｏ−：／ＩＥＩＩから誘導されたＶＣＡ ＭｌｂをコードするｃＤＮＡの配列およびＶＣＡＭｌｂの推定アミノ酸配列を示 し、ヌクレオチドは１〜３０８０の数で示す。本明細書において、この図面のコ ード化ＤＮＡ配列をＶＣＡＭｌｂのためのＤＮＡ配列と称する。さらに、この図 面に示したアミノ酸配列からなる分子をＶＣＡＭｌｂと称する。
第５図はＶＣＡＭＩのドメイン構造を示し、アミノ酸はライスコンシン大学のジ エネティックス・コンピュータ・グループにより使用される一文字コードによっ て示される［デブロー等、！９８４］。
第６図はＶＣＡＭＩｂのドメイン構造を示し、アミノ酸はライスコンシン大学の ジエネティックス・コンピュータ・グループにより使用される一文字コードによ って示される［デブロー等、１９８４］。
第７図はクローンＥＬＬ−０７から誘導されたＥＬＡＭＩの５′未翻訳および未 転写領域における部分のＤＮＡ配列を示す。
第８図はクローンＭＣｌ−１６から誘導されたＶＣＡＭＩの５′未翻訳および未 転写領域における部分のＤＮＡ配列を示す。
第９図はｐｓＱ２１９およびＣＤＸ　ｐＣＤＭ８ＣＤ−ン７．２から誘導された ＣＤＩをコードするｃＤＮＡの配列および推定アミノ酸配列を示し、ヌクレオチ ドは１〜２１７５の番号を有する。本明細書において、この図面のコード化ＤＮ Ａ配列をＣＤＸ用のＤＮＡ配列と称する。さらに、この図面に示したアミノ酸配 列からなるポリペプチドをＣＤＩと称する。
発明の詳細な説明 以下の詳細な説明には次の定義を用いる：発現制御配列：他のＤＮＡ配列の転写 および翻訳を制御かつ調整するＤＮＡ配列。
作用結合二発現制御配列がＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御かつ調整する際に 前記ＤＮＡ配列が発現制御配列に作用結合する。「作用結合」という用語は、発 現すべきＤＮＡ配列の前側に適当な出発信号（たとえばＡＴＧ）を有し、かつ正 確な読枠を維持して発現制御配列の制御下におけるＤＮＡ配列の発現とＤＮＡ配 列によりコードされた所望生産物の産生とを可能にすることを含む。組換ＤＮＡ 分子中に挿入することを所望する遺伝子が適当に出発信号を持たなければ、この 種の出発信号を遺伝子の前側に挿入することができる。
抗体：免疫グロブリン分子またはその機能的断片、たとえばＦ　ａ　ｂｓ　Ｆ　 （ａ　ｂ’　）　２もしくはｄＡｂ、抗体調製物は、この調製物における個々の 免疫グロブリン分子の少なくとも１部が抗原を認識する際（すなわち、これに結 合する際）、特定抗原に対し反応性である。抗体調製物は、抗原に対する調製物 における個々の免疫グロブリン分子の結合が慣用の方法により検出しえない場合 、抗原に対し非反応性である。
標準ハイブリッド化条件：ハイブリッド化と洗浄との両者につき５ｘＳＳＣおよ び６５℃に実質的に等しい塩および温度の条件。
ＤＮＡ配列：本発明のＤＮＡ配列は、組換ＤＮＡ技術を用いて作成され或いは分 離されたＤＮＡ配列を意味する。これらはｃＤＮＡ配列、その天然ゲノムから分 離されたＤＮＡ配列、および合成りＮＡ配列を特徴する請求の範囲に用いる用語 は、天然に存在する場合にも天然ＤＮＡ配列を包含することを意図しない。
ＥＬＡＭ：内皮細胞に対する白血球の付着を媒介する、内皮細胞の表面で発現さ れる分子。
ＭＩＬＡ：内皮細胞に対するＥＬＡＭ−媒介結合に関与する、白血球の表面で発 現される分子。これはＥＬＡＭリガンド、すなわちＥＬＡＭに直接結合する分子 を包含する。
以下に説明するように、本発明者等はｃＤＮＡをＥＬＡＭｍ　ＲＮ　Ａから分離 すると共に配列決定し、ＥＬＡＭ分子を適当な宿主にて発現させ、ＭＩＬＡをコ ードするｃＤＮＡを分離すると共に配列決定し、さらにＭＩＬＡ用のＤＮＡ配列 を分離しかつ発現させた。
本発明による組換ＤＮＡ分子の発現は、宿主細胞による得られたポリペプチドの 翻訳後の改変を包含する。たとえば哺乳動物細胞において、発現は特にポリペプ チドのグリコジル化、リピド化もしくはホスホリル化、或いは「成熟」蛋白を産 生ずるための信号配列の切断を包含する。したがって、ここで用いるＥＬＡＭお よびＭＩＬＡという用語は、全長ポリペプチドおよびその改変物もしくは誘導体 、たとえばこの種のポリペプチド、成熟蛋白、信号ペプチドを保持するポリペプ チド、匹敵した生物活性を有する切断ポリペプチドなどのグリコジル化物を包含 する。
ＥＬＡＭは、炎症時にのみ内皮細胞の表面で発現される。
この現象を利用してＥＬＡＭ　ｃＤＮＡを分離した。本発明のｃＤＮＡ分離物Ｅ ＬＡＭＩによりコードされたポリペプチドをＶＣＡＭＩおよびＶＣＡＭｌｂと命 名した。この分離に関与する第１工程は、ＥＬＡＭ分子を種々異なって発現する 細胞の選択である。ヒトの謄静脈内皮細胞を選択した。何故なら、これらは炎症 性サイトキシンＩＬ−１βにより誘発された際にＥＬＡＭを産生ずるからである 。しかしながら実際には、このサイドキン、この細胞型、または特にヒト細胞の みに限定されない。他の哺乳動物細胞、たとえばヒト内皮細胞もＥＬＡＭを産生 ずることが知られている［コトランおよびホバー、１９８８］。
次の工程は、ＥＬＡＭを発現する細胞（この場合にはＩＬ−１β−誘発ＨＵＶＥ Ｃ）からｍＲＮＡを分離すると共にそれらからｃＤＮＡ保存物を作成することで ある。ｍＲＮＡを分離しかつそれからｃＤＮＡを作成するには、多くの方法が知 られている［たとえばグブラーおよびホフマン、１９１１３、並びにマニアチス 等、１９８２参照］。
次いで、ｃＤＮＡを適当なベクターに挿入した。ブライアン・シードにより記載 されたように真核性発現ベクターｐＣＤＭ８を選択した［シード、＋９８７］。
このプラスミドはイー・コリにおける高コピー数と、真核性プロモータと、たと えばＣ０８７細胞のような一時的発現系における高レベルの発現とを含む幾つか の利点を有する。しかしながら、他の数種のベクター系も可能である［たとえば ケート等、１９８６参照コ。
ｃＤＮＡ保存物を作成した後、次の工程はそれからＥＬＡＭ　ｃＤＮＡ配列を持 ったクローンを分離することであった。種々異なって発現されたｍＲＮＡにっき ｃＤＮＡを分離するには現在多くの方法がある。これらはたとえば（１）標識さ れたｃＤＮＡによる＋／−スクリーニング；　（２）抜取ｃＤＮＡ保存物の作成 ：および（３）抜取ｃＤＮＡプローブによるスクリーニング［デービス、１９８ ６　；サージェント、１９８７　、デービス等、１９８５、ヘトリック等、１９ ８４　；およびヅギド等、１９８８］。第３の技術、すなわち抜取ｃＤＮＡプロ ーブによるスクリーニングを選択すると共に、ＥＬＡＭ配列を豊富化させたｃＤ ＮＡサブ保存物を作成した。
以下、一層詳細に説明するように、サイドキン誘発細胞により産生されるが未誘 発細胞では産生されないｍＲＮＡを豊富化させた抜取ｃＤＮＡプローブを作成し た。次いで、当業界で周知された技術を用いて、抜取ｃＤＮＡプローブにより、 サイトキン誘発ｃＤＮＡ保存物を試験した。これにより、ＥＬＡＭ配列を豊富化 したサブ保存物を形成するクローンを分離することができた。
この時点で、２つの技術を用いてＥＬＡＭ配列に関するｃＤＮＡを持ったクロー ンを同定した。第１方法においては、適する真核性発現系にてＥＬＡＭ活性を発 現するクローンを試験した。λＧＴ１１でクローン化されるｃＤＮＡによってコ ードされた融合蛋白の抗体スクリーニングを含む各種の直接的発現技術を用いる ことができ［ヤングおよびデービス、１９８３　；ヤングおよびデービス、１９ ８４］　；またはクローン化されたｃＤＮＡ、或いはＳＰ６／Ｔ７プロモータを 有するプラスミドもしくはファージＤＮＡからのｍＲＮＡを注射した後に卵母細 胞調節媒体の活性分析を用いることができる。或いは、各種のプロモータ、選択 素子および複製素子を有するプラスミド、ファージおよびコスミドベクターにて 保存物を作成することもできる。動物細胞を、一時的もしくは安定な発現のため 保存物でトランスフェクトすることができる。トランスフェクションは各種の方 法で行なうことができる。一時的な発現につき、研究者はスフ二ロプラスト融合 、ＤＥＡＥデキストランおよびエレクトロポレーションを用いている。
安定な発現については、燐酸カルシウム、スフ二ロプラスト融合およびエレクト ロポレーションを用いている。本発明者等は、スフ二〇プラスト融合によりトラ ンスフェクトされたＣ０８７細胞、すなわち一時的な発現系を用いた［アルッフ ォおよびシード、２９８７］。
最近まで、直接発現によるクローン化分子の同定は鋭敏な分析を必要とし、リン ホキンのみに制限されていた。しかしながら、抗体「パニング」技術［ラインッ キおよびサトウ、１９７８］による或いはＦＡＣＳでの機能分子の同定［ヤマサ キ等、１９８１１］による効率的な一時的発現ベクターにおける一本鎖細胞一表 面分子のｃＤＮＡクローン化［たとえばシードおよびアルッフォ、１９８７並び にシード、１９８７参照コは、直接的発現により同定しうるクローン化分子の範 囲を拡大した。本発明者等は、クローン化分子につきリガンドを発現する適当な 細胞種類を用いてこの分子を同定するという付着分析を用いることにより技術を 拡大した。
ヒト好中球状細胞ラインＨＬ−６０［ベビラッ力等、１９８５］またはヒトＢ− リンパ球状細胞ラインＲＡＭ０Ｃ［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ　１５９６、ヒト・パーキット・リンパ腫］のい ずれかを結合するトランスフェクト細胞の能力を試験することにより、ＥＬＡＭ 発現を検出した。これにつき以下詳細に説明する。
トランスフェクト細胞はヒト細胞でないため、ヒトＥＬＡＭポリペプチドを産生 ずるものは実質的に精製された形態であって、常態結合した動物蛋白を実質的に 含まない。この分析にて陽性の試験結果を得た細胞を釣り上げ、プラスミドＤＮ Ａを回収し、さらにそれらから挿入物を分離した。これら挿入物は、ＥＬＡＭＩ 　（ＨＬ−６０細胞に対する付着により選択）およびＶＣＡＭＩ　（ＲＡＭＯ３ 細胞に対する付着により選択）をコードするＤＮＡ配列を有した。
第２の方法においては、誘発されたｍＲＮＡ　（未誘発のｍＲＮＡでない）の４ ｋｂバンドに対しノーザン・プロットでハイブリッド化した豊富化サブ保存物か らｃＤＮＡ挿入物を同定した。これら挿入物の２種は、ＥＬＡＭＩに関するＤＮ Ａ配列を有した。サブ保存物からの他の挿入物は、異なる誘発ｍＲＮＡをコード する。
ＩＬ−ＩＪ−誘発ＨＵＶＥＣｃＤＮＡ保存物をＶＣＡＭｌ　ｃＤＮＡ配列から誘 導されたランダム処理のオレゴヌクレオチドＰ３２標識プローブで試験すること により、他のＶＣＡＭ、ＶＣＡＭｌｂに関するｃＤＮＡを分離した。
ＶＣＡＭｌｂはＶＣＡＭＩより大である。
これら３種の方法により同定されたクローンを用いて、ＥＬＡＭＩ並びにＶＣＡ ＭＩおよび１ｂにっきｃＤＮＡの配列を決定した。遺伝子コードの縮退に基づき 、これら配列の多くのヌクレオチドを変化させると共に第１．３および４図に示 したＤＮＡ配列によりコードされるものと同一のアミノ酸配列を発現に際しコー ドするＤＮＡ配列を保持し得ることに注目すべきである。さらに、ＥＬＡＭ　ｃ ＤＮＡ配列の断片に関するＤＮＡ配列（すなわちＥＬＡＭ　ｃＤＮＡ配列に対し 実質的に相同であって、それ自身でＥＬＡＭポリペプチドをコードするＤＮＡ配 列）は標準ハイブリッド化条件下で上記ＥＬＡＭ　ｃＤＮＡ配列にハイブリッド 化する。
上記ＤＮＡ配列からＥＬＡＭＩ、ＶＣＡＭＩおよびＶＣＡＭｌｂのアミノ酸配列 を推定した。蛋白処理技術の現状に鑑み、当業者はこれらアミノ酸配列における 合理的な改変、挿入および欠失を行なって、ここに開示した分子と実質的に同じ 生物学的もしくは免疫学的活性を有する各種の分子を明らかに得ることができる 。
さらにＥＬＡＭＩ並びにＶＣＡＭＩおよび１ｂ遺伝子につき、転写プロモータを 含むゲノムＤＮＡ配列を分離した。ヒトゲノム保存物をＥＬＡＭＩまたはＶＣＡ ＭＩ　ＤＮＡ配列のコード化領域から誘導されたＰ３２標識プローブでスクリー ニングした。これにより、ＥＬＡＭｌおよびＶＣＡＭＩの両遺伝子の５′未転写 および未翻訳領域の部分を有するクローンを得た。
ＥＬＡＭＩおよびＶＣＡＭ１転写プロモータは多数の用途を有する。第１に、こ れらはサイドキン（たとえばＴＮＦもしくはＩＬ−１）および細菌性リボ多糖類 （Ｌ　Ｐ　Ｓ）または内皮細胞にてＥＬＡＭの発現を誘発することが知られた他 の薬剤によって誘発しうるベクターを作成するのに有用である。
この種のベクターはたとえば遺伝子転移分析に有用であり、たとえばクロラムフ エニフールアセチルトランスフエラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラー ゼなどのリポータ遺伝子の転写を開始させるよう、誘発性プロモータを位置せし める。次いで、この作成物を一時的に或いは安定的に適当な哺乳動物細胞ライン に導入する。誘発の有力な阻止剤もしくは刺激剤を、次いで上記誘発剤のいずれ か或いは全てによる誘発に対する作用を測定して分析することができる。
さらに、ＢＢＩＩと称するＥＬＡＭＩを認識するモノクローナル抗体を産生ずる ハイブリドーマを分離した。後記実施例Ｖにその生産につき説明する。
ＶＣＡＭＩは、内皮細胞に結合するＴおよびＢ細胞に関与する。レクチン刺激も しくは特定抗原により活性化されたＴ細胞は、インビトロにてＨＵＶＥＣに結合 する。この結合は部分的にＩＣＡＭ／ＬＦＡＩ経路によって媒介される。何故な ら、ＣＤ１８における阻止性エピトープ（Ｉ、ＦＡＩの共通β連鎖）に結合する モノクローナル抗体がＴ細胞結合を部分的に阻止するからである。さらに、抗− ＣＤ１８および抗−ＶＣＡＭＩモノクローナル抗体は結合を完全に阻止すること も判明した。ＣＤ１８が欠損した人間は炎症部位に対するリンパ球の正常な修復 を示すと共に、活性化されたＴ細胞はリンパ系を介して循環しない（すなわち、 これらは炎症部位以外には血流から流出しない）という観察と組合わせて、これ はＶＣＡＭＩがインビボにおける活性化Ｔ細胞移動に対し重要であることを意味 する。すなわち、ＶＣＡＭＩは全活性化Ｔ細胞を炎症部位に集中させるよう作用 する。活性化Ｔ細胞の存在が多くの炎症および自己免疫病の特徴であるため、こ れはＶＣＡＭＩの不適切な発現がこの種の病気の基本的な病理化学的特徴である ことを意味する。したがって、ＶＣＡＭ１経路は活性化Ｔ細胞修復が関与する病 気（たとえば関節炎、狼癒、多発性硬化症など）に対する重要な介入点を与える 。
したがって、ＶＣＡＭＩ結合経路を阻止することにより内皮に対するＴ細胞結合 を阻止するための治療処置につき開示する。これは、本明細書中に記載するいず れかの手段により行なうことができる。
ＶＣＡＭＩのＤＮＡ配列は分子がＥＬＡＭＩに対し構造類似性を持たず、免疫ク ロプリン超遺伝子群の一員であることを示す。免疫グロブリン超遺伝子群のうち ３種は細胞−細胞付着分子であると確認される。これらはＮＣＡＭ、ＣＥＡおよ びＩＣＡＭＩである。ＮＣＡＭはそれ自身で他の細胞の表面にて結合しくホモタ イプ付着）、かくして同種類の細胞間の付着を促進する。ＣＥＡの機能は最近ま で未知であったが、付着分子として機能することにより結腸腫瘍細胞およびＣＥ Ａに関するｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のホモタイプ凝集を媒介する ことが見出された［ベンチモル等、１９１１９］。Ｉ　ＣＡＭＩは白血球表面蛋 白ＬＦＡＩのリガンドであって、白血球−白血球付着および白血球−内皮細胞付 着の両者を媒介する［スタウントン等、１９８８］。ＩＣＡＭＩおよびＶＣＡＭ Ｉは成る程度の機能的類似性を有し、たとえば両者はサイドキンで処理した後に 内皮細胞内で誘発され、さらに両者はリンパ球と関連細胞ラインとの付着を媒介 する。
ＩＣＡＭＩのリガンド（すなわちＬＦＡ−４）は充分特性化されている。ＶＣＡ ＭＩのリガンドはＶＬＡ４として同定されている（後記参照）。ＩＣＡＭＩは、 インビボにおける炎症部位までのリンパ球の移動だけでなく免疫反応に関する多 くのリンパ球機能にも役割を演すると思われる。さらに、ＩＣＡＭＩは多くのリ ノウィルスのためのリセブタとなることも最近示された。他のウィルス（たとえ ばポリオ、ＨＩ　Ｖ）のリセプタもＩｇ上科のメンバーである［ホワイトおよび すットマン、１９８９］。たとえば、ＶＣＡＭＩは免疫調節およびウィルス感染 の両者において重要な役割を演する。
ＣＥＡとＩ　ＣＡＭＩとの両者は腫瘍細胞で発現される。
ＣＥＡは、結腸癌のための診断標識として永年にわたり使用されている。最近の 診断技術は放射線免疫結合体の使用を含み、抗−ＣＥＡ抗体を放射性標識に結合 させると共に患者中に導入する。この方法により、臨床医は３ｍｍ程度に小さい 腫瘍を同定することができる［ゴールデンベルク、１９８９］。
研究者等は、さらに放射線免疫治療および免疫毒素治療を開発している。放射線 免疫治療は放射線免疫結合体の使用を含み、たとえばｌ１２５、Ｙ２Ｏ、Ｒｅ１ ８６などの核種を特定の表面抗原を認識する抗体に結合させる。免疫毒素は、た とえばシュードモナス外生毒素などの細胞毒素と結合した抗体である。注射に際 し、これらの結合した抗体は、抗原を発現する細胞に対し毒性剤を指向させる。
本発明によれば、放射性標識、核種および細胞毒素をＶＣＡＭＩおよび１ｂ或い はこれらを認識する抗体と結合させて、ＶＣＡＭＩリガンド（たとえばＶＬＡ４ ）もしくはＶＣＡＭＩを発現する細胞を標的とすることができる。
新規なＥＬＡＭの発見、またはたとえば腫瘍細胞のような他の細胞で発現される ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡの将来の発見も、新規なＴＩＬ治療を可能にする。た とえばＥＬＡＭを表面上で発現する腫瘍が見出だされた場合、この腫瘍を生検し て浸潤リンパ球を除去することができる。たとえばレトロウィルス発現ベクター におけるＴＮＦのような殺腫瘍剤のための遺伝子を用いて、腫瘍浸潤性リンパ球 （Ｔ　Ｉ　Ｌ）をトランスフェクトし、次いでこれをＩＬ−２で拡充させる。ト ランスフェクトされたＴＩＬを患者中に注射すれば、ＴＩＬは初期の腫瘍に特異 的に指向すると共に腫瘍中に移動して、ここで殺腫瘍遺伝子生産物が局部作用の ため放出される［トーマスおよびシコラ、１９８９参照］。ＥＬＡＭは全て成る 種の白血球を結合することにより浸潤を媒介するので、浸潤白血球を分離し、特 定の所望遺伝子生産物の発現につきトランスフェクトし、増量させ、かつ患者に 再導入するという改変ＴＩＬ治療も考えられる。
代案のＴＩＬ治療は、成る種の細胞型（特に成る種の癌細胞）がＥＬＡＭもしく はＭＩＬＡを発現するという事実を利用する。たとえば、結腸癌はＣＤＩを発現 するのに対し、黒色腫はＶＬＡ４を発現することが知られている。
ここに開示するＤＮＡ配列を用いて、白血球をトランスフェクトすることにより 表面ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡを発現させて白血球の細胞融解活性を向上させ、 対応リガンドを発現する標的細胞に対し結合を向上させるよう、治療を設計する ことができる。白血球型の細胞融解活性がより強い細胞−細胞付着の関数として 増大する場合、この種の方法は白血球が標的細胞を破壊する能力を向上させる。
たとえば、結腸癌または黒色腫の場合、白血球（好ましくは既に標的癌細胞に対 し親和性を持った浸潤性白血球）をＥＬＡＭＩの遺伝子（結腸癌の場合）または ＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭｌｂの遺伝子（黒色腫の場合）を含む発現ベクター でトランスフェクトすることができる。この種の白血球を患者中に導入すれば、 それぞれ癌細胞もしくは黒色腫細胞に留まり得る白血球の群が得られる。これら 白血球は、腫瘍細胞に付着して所望の細胞融解作用を発生する向上した能力を有 する。
ＨＵＶＥＣをＴＮＦおよびＩＦＮ−７と一緒に培養すれば、ＶＣＡＭ１発現がＴ ＮＦ単独での培養よりも約１００％増大することが判明した。活性化Ｔ細胞はＩ ＦＮ−γを分泌し、したがって積極的なフィードバック系を介し炎症部位に対す るそれ自身の補充を促進することができる。ＶＣＡＭはＴ細胞結合を生ぜしめ、 Ｔ細胞はさらにＩＦＮ−γ分泌を介しＶＣＡＭ生産をさらに刺戟する。したがっ て、このフィードバックメカニズムの阻害を含むＶＣＡＭ依存性病理学につき新 たな処置を考案した。この処置はたとえばＩ　Ｌ−１、ＴＮＦもしくはＩＦＮ− γのようなサイトキンをたとえばモノクローナル抗体で阻止して、サイドキン刺 戟されたＶＣＡＭの生産を阻止することからなっている。
さらにＥＬＡＭＩ−媒介付着に関与し、事実恐らく極く最近の本発明者等の証拠 が示すように、ＥＬＡＭＩリガンドに関与するＭＩＬＡ、ＣＤＩを分離した。分 離は第１工程としてＣＤＩ分子に対するモノクローナル抗体の生産を含んだ。
マウスに対し、ＥＬＡＭＩに結合することが知られた全ＨＬ−６０細胞、すなわ ちＰＭＮ−関連細胞ラインで免疫化した。
或いは、ＰＭＮ自身および本発明が示すＵ９３７細胞を包含するＥＬＡＭＩに結 合する細胞ラインで免疫化することもできる。さらに、他のＥＬＡＭに対する付 着に関与するＭＩＬＡを分離するため、適するＥＬＡＭに結合する任意の細胞ラ インで免疫化することもできる。たとえばＶＣＡＭＩを分離する際、これら２種 の細胞ライン、すなわちＢ−リンパ球状細胞ライン（ＲＡＭＯＳ）およびＴ−リ ンパ球状細胞ライン（ＪＵＲＫＡＴ）を同定した。
免疫化されたマウスからの免疫血清が付着分析にてＨＵＶＥＣに対するＨＬ−６ ０細胞の結合を阻止したことを知った後、当業界で周知された方法にて牌細胞か らハイブリドーマを作成した［ゴジング、１９８３］。次いで、ＣＤＩに対する モノクローナル抗体（Ｍｏａｂｓ）を産生ずるハイブリドーマを、付着分析にて 誘発ＨＵＶＥＣに対するＨＬ−６（ｌ細胞の結合を阻止する能力につき試験する ことにより同定した。
これらハイブリドーマの数種を用いて、モノクローナル抗体を含有する腹水液を 作成した。
さらに、ヒューゼ等（１９８９）の技術を用いて、これら抗原を認識するモノク ローナルＦａｂ断片を生ぜしめこともできる（さらにスケラおよびプリュックス ン、１９８８参照）。或いは、ワード等（１９８９）により記載されたように、 単一ドメインの抗体を産生させることもできる。
ＣＤＩに対する本発明のモノクローナル抗体は次の特徴を有する：第１に、これ らはＥＬＡＭＩを発現する細胞に対するＨＬ−６０細胞もしくはＰＭＮの結合を 阻止する。第２に、これら抗体は特異的な細胞結合パターンを示し、すなわちこ れらはＥＬＡＭＩに結合する細胞を認識するが、ＥＬＡＭＩに結合しない細胞は 認識しない。第３に、これらはヒト細胞ラインに関し他の細胞−表面分子（たと えば抗−ＬＦＡ−１、抗−ＬＦＡ−３１，抗−ＣＤ４４、抗−ＩＣＡＭ、抗−Ｃ Ｄ４および抗−Ｌ　ｅ　ｕ　８）に対する抗体のパターンとは異なる認識パター ンを有する。
これらＭｏａｂｓを用いてＣＤＩを分離した。ＨＬ−６（１表面蛋白および好中 球（ヒト血液から分離）からの表面蛋白をクルチンガーにより記載された方法〔 クルチンガー等、１９８１］の変法より沃素で放射能標識し、或いは５３５−メ チオニンで代謝的に標識した。膜蛋白を可溶化させると共に、これらを蛋白Ａセ ファロース（Ａ　ＲＸ）に対しμ鎖−特異性ウサギ抗−マウスＩｇＧを介し結合 された抗−ＣＤＸモノクローナル抗体（α−ＣＤＸ　Ｍｏ　ａ　ｂ　ｓ）と共に 培養し、次いで抗体結合した蛋白を分離した。この蛋白は、約１５１１ｋＤの単 一の核酸バンドとして５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に出現する。しばしば、９０ｋＤ蛋白 バンドがＨＬ−６１１細胞からの結合蛋白および常に好中球からの蛋白に観察さ れた。この９０ｋＤバンドはＣＤＸ分解生成物を示すと思われる。さらに、しば しば一層高い分子量のバンド（すなわち約１５０ｋＤ）も観察された。これらは 非特異性バンドである。分離した１５０ｋＤ蛋白をＮ−グリカナーゼで処理した 場合、分子量が約７０ｋＤまで低下した。
１５０ｋＤバンドをＮ−グリカナーゼおよびＯ−グリカナーゼで処理した場合、 分子量はさらに約４５ｋＤまで減少した。これは極めて重度にグリコジル化した 蛋白の蛋白コアを示すと思われる。この蛋白は、常態結合した動物蛋白を実質的 に含まない分離ＣＤＩである。
さらに当業界で知られた技術を用いて、ＣＤＸを発現に際しコードするＤＮＡ配 列を分離した。幾つかの実際的技術は、クローン化ＤＮＡを発現するための発現 系を使用する。上記したように、各種の真核性発現系を用いることができる。
ＣＤＩを発現する細胞ラインＨＬ−６０のｍＲＮＡからｃＤＮＡ保存物を作成し た。この保存物を上記したような抜取技術によりＣＤＩを発現しない細胞ライン （この場合はヘラ細胞）でＣＤＩ　ＤＮＡ配列につき豊富化させた。細胞ライン ＣＯ３７を抜取保存物でトランスフェクトすると共に約２１００種のクローンを 得、これらからＣＤＸを発現する細胞を多数の方法で検査した。
トランスフェクト細胞をα−ＣＤＸ　Ｍｏａｂｓと共に培養し、かつこれらを抗 −マウスＩｇＧもしくはＩｇＭで被覆されたプレートに塗抹し、プレートに結合 する細胞はＣＤＩを発現する細胞である。このようにして、ＣＤＩをコードする ２、ｌｋｂのＤＮＡ挿入体を同定し、配列決定用ベクターにサブクローン化させ 、これをｐ　ＳＱ２１９と称する。
ＣＤＩ　（または他のＭＩＬＡ）を分離する他の方法は、蛍光性抗体標識を用い る。この方法においては、ＣＤＩ発現性細胞をα−ＣＤＸ　Ｍｏａｂｓと共に培 養し、次いでＭＯａｂＳをたとえば蛍光標識された抗−マウス抗体で標識する。
蛍光性抗体を結合する細胞を、次いで蛍光活性化細胞分類器（Ｆ　Ａ　ＣＳ）で 分類した。分類された細胞からのＤＮＡを用いて、たとえばイー・コリのような 細菌宿主を形質転換させた。次いで、得られたコロニーからのＤＮＡを用いてＣ Ｏ３７細胞をトランスフェクトし、この手順を単一のＣＤｌ−発現性クローンが 確認されるまで反復することができる。
第３の方法は、上記したようにトランスフェクトされた細胞を組換可溶性ＥＬＡ ＭＩ　（ｒ　ｓＥＬＡＭＩ）で被覆されたプレート上に塗沫することである。実 施例■においてはプレートをｒｓＥＬＡＭｌで被覆する方法を説明する。これら プレートに結合する細胞は、ＣＤＸを発現するものである。同様に、他の可溶性 ＥＬＡＭを用いて、その付着経路に関与するリガンドもしくはＭＩＬＡを発現す る細胞を分離することができる。
さらに、発現保存物をイー・コリで作成することもできる。
たとえば、λＺＡＰ　（登録商標）（ストラタジーン）／ＨＬ−６０保存物を作 成すると共にこれを用いて、イー・コリで挿入ＤＮＡを発現させることができる 。塗沫した後、プラークをたとえば放射能標識されたα−ＣＤＩモノクローナル 抗体で直接にスクリーニングすることができる［ヤングおよびデービス、１９８ ３、並びにヤングおよびデービス、１９８４］。モノクローナル抗体が結合する プラークを釣り上げて、ＤＮＡ挿入物をこれらから分離することができる。
抗体認識に基づかずにＥＬＡＭリガンドを同定すべく使用する他の方法は、Ｃ０ ８７細胞を適当な保存物（抜取ることができる）でトランスフェクトし、次いで これらをＥＬＡＭ発現性細胞（たとえば誘発ＨＵＶＥＣＳＥＬＡＭ−発現性Ｃ０ ８７細胞、またはＥＬＡＭ−発現性ＣＨＯ細胞）に直接載せることである。この 場合も、適切なりローンを分離するよう充分に保存物を豊富化するには、複数回 の処理が必要である。
ＣＤＩ　（または他のＭＩＬＡ）をコードするＤＮＡ配列を分離するための他の 技術は、オリゴヌクレオチドプローブによるｃＤＮＡ保存物のスクリーニングを 含む。たとえばＣＤＩに対する固定化抗体または固定化ＥＬＡＭＩを用いる親和 性クロマトグラフィーにより充分量のＣＤＩ蛋白を精製すれば、部分アミノ酸配 列を決定して、ＣＤＸ遺伝子の少なくとも１部に対応するオリゴヌクレオチドプ ローブを合成することができる。次いで、これらプローブを用いてｃＤＮＡ保存 物をスクリーニングすることができる。或いは、オリゴヌクレオチドをプライマ ーとして使用することにより、ＣＤＩ　（ＭＩ　ＬＡ）遺伝子用の保存物をスク リーニングする際に使用すべき長いプローブを生ぜしめることができる。
ＣＤＩのためのコード化配列を含むｃＤＮＡ挿入物を分離した後、ＣＤＩがＥＬ ＡＭｌ用のリガンド（または少なくとも１種のりガント）であるという証拠をさ らに蓄積した。
ＣＤＸ挿入物でトランスフェクトされたＣ０Ｓ７細胞は、ｒｓＥＬＡＭｌで被覆 されたビーズに付着した。この相互作用は陽イオン依存性であって、ＢＢＩＩ　 （すなわちＥＬＡＭｌを認識するモノクローナル抗体と共に事前培養して阻止さ れた。さらに、ＣＤＸ挿入物でトランスフェクトされたＣ０Ｓ７細胞は、蛍光標 識されたａ−ＣＤＸ　Ｍｏａｂｓと共に培養した後にＦＡＣ３上で陽性分析を示 した。さらにＣＤＸ）ランスフエクトされたＣ０Ｓ７細胞は、α−ＣＤＩ被覆さ れたセファロースビーズによりロゼツトを形成する［シードおよびアルッフォ、 １９８７］。さらに、約１２０ｋＤの蛋白を沃素化すると共に、ＡＲＸビーズ（ すなわち蛋白Ａセファロースに対しμ連鎖−特異性つサギ抗−マウスＩｇＧを介 し結合したα−ＣＤＩ）を用いてＣＤＸ　Ｃ０Ｓ７細胞から免疫沈殿させること ができる。
重質炭水化物成分が天然産ＣＤＩと明らかに結合することに鑑み、さらにシアリ ダーゼによるＨＬ−６０細胞（ＣＤＸ−発現性）の処理がＥＬＡＭＩに対する結 合のロスをもたらすことも明らかに観察した。これは、たとえばＣＤＩ糖におけ るシアル酸成分がＥＬＡＭＩ結合に直接関与するという直接作用である。或いは 、これはたとえばシアル酸成分の開裂がＣＤＩの電荷における急激な変化をもた らして、ＥＬＡＭＩに対する結合を阻止しつるという間接的効果でもある。
さらに、ＶＣＡＭＩおよびＶＣＡＭｌｂに関するリガンドを同定した。これはイ ンテグリンＶ　Ｌ　Ａ、　４である［ヘムラー、１９８８；ヘムラー等、１９８ ７ａ、；およびヘムラー等、１９８７ｂ］。インテグリンは細胞−細胞外マトリ ックスおよびα、β−へテロダイマー構造を示す細胞−細胞付着リセプタの１群 である［ハイネス、１９８７；マルカントニオおよびハイネス、１９８８］。
研究者等は、β−サブ単位によって分類される３種のサブ群のインテグリンを確 認した。ＶＬＡ　（極後期の抗原）蛋白はβ１サブ群に属し、これらの多くは細 胞−細胞外マトリックス付着に対し特異的である［ハイネス、１９８７およびル オスラーチ、１９８ｇ］。ＶＬＡ４はリンパ性細胞（たとえばＢおよびＴ細胞） 、並びに骨髄性細胞にて比較的高レベルで発現されるが、他の細胞では検出困難 である［ヘムラー等、上記］。
細胞外マトリックスに対するＢおよびＴ細胞の結合は、ＶＬＡ４およびそのリガ ンド、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）によって媒介される［ウニイナー等、１９ ８９］。ＶＬＡ４がＶＣＡＭＩのためのリガンドであるという知見は、これが活 性化内皮細胞に対するＢおよびＴリンパ球の１つの結合経路を規定するので重要 である。したがって、下記する方法におけるリガンドおよびリセプタとしてのＶ ＬＡ４並びにＶＣＡＭＩおよび１ｂの使用につき説明する。
本発明では、ＥＬＡＭおよびＭＩＬＡ　ＤＮＡ配列および分子に関する幾つかの 用途が考えられる。第１に、ＥＬＡＭおよびＭＩＬＡを用いて、これら分子に対 し反応性のモノクローナル抗体調製物を作成することができる。次いで、Ｍ　ｏ 　ａ　ｂ　ｓを治療剤として使用することにより、内皮細胞に対する白血球結合 を阻止することができる。
第２に、可溶型ＥＬ八へ１可溶性ＥＬＡＭリガンドまたはそのいずれかの断片を 結合阻止剤として使用することができる。ＥＬＡＭペプチドは白血球上のＥＬＡ Ｍリガンドに結合し、ＥＬＡＭリガンドは内皮細胞上のＥＬＡＭに結合する。
両方法は、内皮細胞に対する白血球結合を阻止する。組換可溶性ＥＬＡＭ　（ｒ ｓＥＬＡＭ）またはｒｓＥＬＡＭリガンドを作成するため、好ましくは経膜領域 を除去するよう分子をコードするＤＮＡを変化させる。かくして、可溶性分子の ためのＤＮＡは、恐らく細胞質ドメインに付着した細胞外ドメインの全部または １部を含む。この対策は、可溶性ＣＤ４、すなわちＡＩＤＳウィルスに結合する Ｔ細胞における表面蛋白を用いて既に証明されている［フィッシャー等、＋９８ ８］。
この対策はさらに抗体治療の問題を回避する。何故なら、用いるポリペプチドが 免疫反応を殆んど誘発しないからである。
可溶性組換分子につき研究者等が遭遇した１つの問題は、短いインビボの血漿半 減期である〔カボン等、１９０］。この種の分子は系から急速に除去されるので 、治療効果を得るには大投与量もしくは頻繁な注射が必要である。したがって、 研究者等は可溶性分子の半減期を増大させる方法を探求した。
有力な解決策は、可溶性分子を血流中における長い半減期を持つことが知られた 他の分子に結合させることである。その長い半減期により、免疫グロブリン分子 は有力な候補となる。
カボン等（１９８９）は、組換ＤＮＡ技術を用いた免疫グロブリン分子に対する 可溶性ＣＤ４の結合を記載している。この対策においては、免疫グロブリン分子 の可変領域の代りに可溶性蛋白を用いて蛋白／免疫グロブリン融合蛋白を形成さ せる。
ｒｓＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白は、ｒ　ｓ　ＥＬＡＭ単独よりも長い血 漿半減期を有することが予想される。この種の融合蛋白は好ましくは組換作成物 で製造され、その際可溶性分子をコードするＤＮＡ配列を免疫グロブリン分子の 一定ドメインをコード化するＤＮＡ配列に融合させる。次いで、組換ＤＮＡを適 当な宿主細胞、好ましくは動物細胞で発現させて、融合蛋白を産生させる。
ＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白は他の利点を有すると思われる。免疫グロブ リン分子は一般に二価であるため（すなわち、これらは２個の結合部位を有する ため）、ＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白は２個のＥＬＡＭを有し、したがっ て２個のＥＬＡＭリガンド結合部位を有する。したがって、これらはＥＬＡＭリ ガンドを示す細胞に対し大きい親和性もしくは親和力を有すると思われる。
第３に、ＥＬＡＭに結合する分子（たとえば抗−ＥＬＡＭ抗体または標識、たと えばリガンドもしくはその断片）を用いて、炎症を検出することができる。これ は、たとえば蛍光性もしくは放射能により分子を検出可能にし、これを患者に投 与すると共に人体のどこにそれが蓄積したかを決定する。
このようにして、炎症の種類を確認することもできる。たとえば、ＥＬＡＭＩに 対する結合は慢性炎症でなく急性炎症を示す。
第４に、ＥＬＡＭが炭水化物成分または他の翻訳後の改変を介しリガンドに結合 すれば、ＥＬＡＭを用いてこれが結合したＥＬＡＭリガンドにおける炭水化物を 確認することもできる。
第５に、ＥＬＡＭおよびＭＩＬＡを系の１部として用いることにより、付着阻止 剤のための小分子をスクリーニングすることができる。たとえば、小分子をＣＤ ＸとＥ　Ｌ　Ａ　Ｍ　１との間の相互作用を阻止する能力につき試験するような 分析系を作成することができる。この方法で同定された小分子阻止剤は、抗炎症 剤の候補となる。
第６に、これら分子を用いて、ＥＬＡＭに対する白血球結合を阻止するような内 生蛋白を確認することもできる。研究者は、この種の１つの分子、すなわち内皮 から結合ＰＭＮを脱着させる際に関与する白血球付着阻止剤（ＬＡＩ）を一時的 に確認した［ホイーラー等、＋９８８］。
第７に、’ＶＣＡＭ／ＩＣＡＭ融合蛋白を生ぜしめることができる。両蛋白は数 種の構造ドメインで構成されることが知られている［シモンス等、１９８８］。
各蛋白の各種ドメインをコードするＤＮＡ配列を、たとえばＥＬＡＭ／免疫グロ ブリン融合蛋白の作成につき説明した遺伝子融合技術を用いて融合させる。選択 されるドメインは、それぞれＶＣＡＭＩもしくはＶＣＡＭ１ｂリガンドおよびＩ 　ＣＡＭＩリガンドを結合する能力を持ったものである。ＶＬＡ４およびＬＦＡ Ｉ　（公知のリガンド）を結合するドメインが好適である。これらＤＮＡ配列の 発現に際し産生されるポリペプチドは、リガンドを有する細胞がＶＣＡＭＩもし くはＶＣＡＭＩｂまたはＩＣＡＭＩもしくはその両者のいずれかに付着するのを 阻止するため有用である。
最後に、ＥＬＡＭおよびＥＬＡＭリガンドＤＮＡ配列を用いて、ＥＬＡＭもしく はＥＬＡＭリガンドの発現を翻訳レベルで介入する核酸分子を生成させることが できる。この手段は、特定ｍＲＮＡの翻訳をこのｍＲＮＡをアンチセンス核酸で 遮蔽し或いはこれをリボチームで切断することにより阻止するためのアンチセン ス核酸およびリボチームを利用する。
これらの方法は炎症状態を処置する際に有用である。
アンチセンス核酸は、特定ｍＲＮＡ分子の少なくとも１部に対し相補的なりＮＡ もしくはＲＮＡ分子である［ワイントララブ、１９９０；マルクスーセクラ、１ ９Ｈ］。細胞において、これらは前記ｍＲＮＡにハイブリッド化して二本鎖分子 を形成する。細胞はこの二本鎖形態でｍＲＮＡを翻訳しない。したがって、アン チセンス核酸はｍＲＮＡから蛋白への発現を妨げる。約１５個のヌクレオチドの オリゴマーおよびＡＵＧ開始コドンにハイブリッド化する分子は特に効果的であ る。何故なら、これらは合成が容易であると共に、これらをＥＬＡＭ生産性細胞 に導入する際に大分子よりも少ない問題しか提起しないからである。アンチセン ス法を用いて、インビトロにおける多くの遺伝子の発現を阻止した［マルクスー セクラ、１９８１１　、バンパー等、１９８１１］。
リボチームは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと若干類似した方法で他の一本鎖 ＲＮＡ分子を特異的に切断する能力を備えたＲＮＡ分子である。リボチームは、 成る種のｍＲＮＡがそれ自身のイントロンを切除する能力を有するという観察か ら見出された。これらＲＮＡのヌクレオチド配列を改変することにより、研究者 等はＲＮＡ分子内の特定ヌクレオチド配列を認識して切断する分子を処理するこ とができた［セッチζ１９１１ｇ］。これらは配列特異性であるため、特定配列 を持ったｍＲＮＡのみが失活される。
研究者等は２種類のリボチーム、すなわちテトラヒメナ（Ｔｅｊｒａｈ７ｍ亡ｎ ｘ　）−型および「ハンマーへラド」−型を同定した［ハーゼルホッフおよびゲ ルラッハ、１９８ｇ］。テトラヒメナー型リボチームは４−塩基の配列を認識す る一方、「ハンマーへラド」−型は１１〜１８−塩基配列を認識する。認識配列 が長いほど、標的ｍＲＮＡ種類においてのみ生ずる傾向が大となる。したがって 、ハンマーヘッド型リボチームは、特定ｍＲＮＡ種類を失活させるのにテトラヒ メナ型リボチームより好ましく、１８−塩基認識配列はより短い認識配列よりも 好適である。
ここに説明したＤＮＡ配列は、したがってＥＬＡＭＩ、ＶＣＡＭＩおよびＶＣＡ ＭｌｂＳＣＤＸおよびＶＬＡ４のためのｍＲＮＡに対するアンチセンス分子を作 成し、これらを切断するリボチームを作成するのに用いることができる。
アンチセンス分子およびリボチームは、付着分子の発現を妨げる細胞分子中に導 入することにより、炎症を処置する方法に使用することができる。ＥＬＡＭは炎 症の症状発生の間に内皮細胞で誘発され、さらに治療剤が静脈内注射により容易 に血管内皮細胞に供給され得るので、内皮細胞はこの種の治療に魅力的な標的で あり、ただしアンチセンス分子もしくはリボチームは適切な細胞に効果的に供給 され得るものとする。
研究者等は、これら分子を標的細胞に供給すべく使用しうる２つの手段を示唆し ている。第１は、抗−ＥＬＡＭアンチセンス核酸またはＥＬＡＭ−特異性リボチ ームをｍＲＮＡ分子として発現するベクターにより標的細胞をトランスフェクト することである［バンパー等、上記］。この手段はインビトロにて細胞ラインで 処理する際に極めて有用であるが、インビボでは効果的でないと思われる。イン ビボ供給につき一層有望である第２の手段は、リポソームに抗−ＥＬＡＭアンチ センス分子、ＥＬＡＭ−特異性リボチーム、またはこれらを発現するベクターを 充填することである。これらリポソームは、リポソームを炎症部位に指向させる 抗−ＥＬＡＭモノクローナル抗体を含有することもできる。この供給形態は、マ イナスフィードバック系を与える。何故なら、細胞上のＥＬＡＭの出現はこの細 胞を抑制の標的にするからである。
さらにアンチセンス成分またはリボチーム成分の浸透が成功すれば、ＥＬＡＭ産 生を停止させることにより標的としての細胞を除去する。
本発明の他の特徴は、ここに説明したＥＬＡＭおよびＭＩＬＡ　ＤＮＡ配列の発 現である。当業界で周知されているように、ＤＮＡ配列は、これらを適切な発現 ベクターにて発現制御配列に作用結合させると共にこの発現ベクターを用いて適 切な単細胞宿主を形質転換させることにより発現させることができる。
発現制御配列に対する本発明のＤＮＡ配列の作用結合は、勿論、既にＤＮＡ配列 の１部でなくてもＤＮＡ配列の上流における正確な読枠に開始コドンＡＴＧを与 える。
本発明のＤＮＡ配列を発現させるには、広範な種類の宿主／発現ベクター組合せ を用いることができる。たとえば、有用な発現ベクターは染色体、非染色体およ び合成りＮＡ配列の断片で構成することができる。適するベクターはＳＶ４０お よび公知の細菌プラスミドの誘導体、たとえばイー・コリプラスミドｃｏｌ　Ｅ ｌ、ｐｃＲｌ、ｐＢＰ３２２、ｐＭＢ９およびその誘導体、たとえばＲＰ４のよ うなプラスミド；ファージＤＮＡ、たとえば多数のファージλの誘導体、たとえ ばＮＭ９８９、並びに他のファージＤＮＡ、たとえばＭ１３およびフィラメント 状−末鎖ファージＤＮＡ　、酵母プラスミド、たとえば２μプラスミドもしくは その誘導体；真核性細胞に有用なベクター、たとえば昆虫もしくは哺乳動物細胞 に有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから誘導されるベク ター、たとえばファージＤ　Ｎ　Ａもしくは他の発現制御配列を用いるよう改変 されたプラスミドなどを包含する。
広範な種類の発現制御配列（作用結合されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列） をこれらベクターで用いて、本発明のＤＮＡ配列を発現させることができる。こ の種の有用な発現制御配列は、たとえばＳＶ４０もしくはアデノウィルスの早期 および後期プロモータ、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣもしくはＴＲＣ系、ファー ジλの主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、３−ホ スホグリセレートキナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファタ ーゼのプロモータ（たとえばＰｂｏ２）、酵母α−接合因子のプロモータ、並び に原核性もしくは真核性細胞またはそのウィルスの遺伝子の発現を制御すること が知られた他の配列、並びにその種々の組合せを包含する。
本発明のＤＮＡ配列を発現するには、広範な種類の単細胞宿主細胞も有用である 。これらの宿主は周知の真核性および原核性宿主、たとえばイー・コリ、シュー ドモナス、バチルス、ストレプトミセス、真菌類（たとえば酵母）の菌株、並び に動物細胞、たとえばＣＨＯ，Ｒ１，１、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、アフリカミ ドリザル腎臓細胞（たとえばＣ０３Ｉ、Ｃ０８７、Ｂ５Ｃｌ、Ｂ５Ｃ４０および ＢＭＴＩＯ）、並びに組織培養における昆虫細胞（たとえばＳ　ｆ　９）　、ヒ ト細胞および植物細胞を包含する。
必ずしも全てのベクター、発現制御配列および宿主が本発明のＤＮＡ配列を同等 に充分発現するよう機能するとは限らないことが了解されよう。さらに、必ずし も全ての宿主が同じ発現系により同等に機能するとき限らない。しかしながら当 業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、所望の発現を達成するよう無駄な実 験なしに適切なベクター、発現制御配列および宿主を選択することができる。た とえば、ベクターを選択する際、ベクターが宿主中で機能せねばならないので、 この宿主を考慮せねばならない。ベクターのコピー数、このコピー数を制御する 能力、およびベクターによりコードされる任意の他の蛋白（たとえば抗生物質マ ーカー）の発現も考慮される。
発現制御配列を選択する際は、各種の因子が一般に考慮される。これらは、たと えば系の相対強度、その制御性および発現すべき特定のＤＮＡ配列もしくは遺伝 子との適合性を包含し、特に有力な二次構造を考慮せねばならない。適する単細 胞宿主は、たとえば選択されたベクターに対する相容性、分泌特性、蛋白を正確 に折重ねる能力、およびその発酵要求性、並びに発現すべきＤＮＡ配列によりコ ードされる生産物の主宿に対する毒性、さらに発現生産物の精製容易さを考慮し て選択される。
これらおよび他の因子を考慮して、当業者は発酵または大規模の動物培養に際し 本発明のＤＮＡ配列を発現する各種のベクター／発現制御配列／宿主の組合せを 作成することができる。
ＥＬＡＭＩ、ＶＣＡＭＩおよび１ｂＳＣＤＸおよびＶＬＡ４に対する抗体の存在 は、他のＥＬＡＭおよびＥＬＡＭリガンドに関する他の分離方法を可能にする。
この方法は、イディオタイプとして知られた抗体特性を利用する。各抗体は、抗 原に対し特異性の独特な領域を有する。この領域をイディオタイプと称する。抗 体自身は抗原決定子を有し、抗体のイディオタイプはその分子に独特な抗原決定 子である。抗体で生物を免疫化することにより、イディオタイプを認識する抗体 を含め、これらを認識する「抗−抗体」を生ぜしめることができる。他の抗体の イディオタイプを認識する抗体を抗−イジイオタイプ抗体と称する。成る種の抗 −イディオタイプ抗体は、抗体が認識する初期抗原の形状に類似すると共に、抗 原の「内部イメージ」を有すると言われる［ケネディー、＋９８６］。抗原がリ ガンドである場合、成る種の抗−イディオタイプはそのリガンドリセプタに結合 することができる。研究者等は、インシュリン、アンギオテンシン■、アデノシ ン１１β−アドレナリンおよびラット脳ニコチンのためのリセプタ並びに麻酔性 リセブタに結合する抗−イディオタイプを包含するこれら数種を同定した［カー ルソンおよびブラッド、１９８９］。
この現象を利用して、抗−イディオタイプ抗体を用いることにより他のＥＬＡＭ およびＥＬＡＭリガンドを分離することができる。抗−イディオタイプを用いて 、初期抗原に結合する分子をスクリーニングすることができる。たとえば、この 技術を用いて他のＥＬＡＭリガンドを同定することができる。
同様なドメイン構造を有する関連ＥＬＡＭが存在することを突き止めた（すなわ ちＶＣＡＭＩおよびＶＣＡＭｌｂ）。
遺伝子組換の結果、１個もしくはそれ以上のドメインを有する数種の付着分子を 細胞表面上に存在させることができる。
任意の共有ドメインを認識する抗−イディオタイプ抗体は、ビオアッセイにより 同定されないＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドを免疫化学的に分離するのに有 用であり、これは構造でなく蛋白の機能に依存する。
本発明を一層良好に理解しつるよう、以下に実施例を示す。
これら実施例は例示の目的であって、決して本発明の範囲を去ｌ自Ｉ工 ＥＬＡＭ　Ｉについ　たｃＤＮＡ　ブーイブ　ｉの。
次のようにして、ＥＬＡＭ配列について富化したｃＤＮＡサブライブラリを調製 した： 膜帯からヒト膀静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を単離し、この細胞を予備培養で 生育させ、ギムブロン（１９７６）に記載されたようにこれらを継代した。ライ ブラリ作成のため、４ｍ５継代のＨＵＶＥＣｓを使用した。＋ｍ胞を誘導してＥ 　ＬＡＭ　ｓについてのｍＲＮＡを生産するため、群集モルイヤを３７℃で２． ５時間、組換えヒトＩＬ−１β（１０単位／　ｍ　１　）を用いてインキュベー トした。これらの細胞からｍＲＮＡを単離し、当業界で周知の技術を使用してこ れをｃＤＮＡに逆転写させた（グブラーとホフマン、１９８３）、標準的手順を 使用し、次の配列を有するＮｏｔＩ−ＢｓｔＸＩリンカ／アダプタに二本ｆｊｉ 　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを連Ｍした： ５−　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＣＡＣＡ　３−３−　ＣＧＣＣ ＧＧ　ＣＧＡ　ＡＡＴ　ＣＴＣ５−その後、ブリアン・シードの手順により、ベ ックマン（登録間１）ＳＷ６０ｏ−ター中で３時間５０．ＯＯＯｒｐｍで２２℃ にて、４．２ｍ１５〜２０％酢酸カリウムグラジェント、２ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ 　Ａ、１μｇ　／　ｍ　！エチジウムプロミドによりｃＤＮＡを大きさにより選 択した（同様にマニアティスら、１９８２、第２７８頁参照）、５００塩基対よ り大きいｃＤＮＡ断片をプールした。その後ベクタ、ｐＣＤＭ８　（ブリアン・ シードより贈呈）を調製した。このプラスミドをＢｓｔＸＩにより消化した。４ ００塩基対の近接断片を除去するため、この混合物を前記したように酢酸カリウ ムグラジェントにより遠心し、大きな断片を単離した。アガロースゲル電気泳動 によりこの断片を更に精製した後、このｃＤＮＡをベクタと連結した。このよう にして、誘導ＨＵＶＥＣｓ中で発現されるｍＲＮＡについてのＤＮＡ配列を含有 する組換えＤＮＡ分子を創製した。これらのプラスミドを使用してイー・コリＭ Ｃ１０６１Ｐ３を形質転換した。この結果、ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｍＲＮＡ についてのｃＤＮＡライブラリからなる７Ｘ１０６組換えクローンのコレクショ ンを得た。
このｃＤＮＡライブラリからＥＬＡＭｃＤＮＡ配列について富化したサブライブ ラリを調製するため、最初にＥＬＡＭ配列富化減算プローブを調製した。前記し たように、ＩＬ−１βにより誘導したＨＵＶＥＣｓからｃＤＮＡを調製し、これ を３２ｐによりラベルした（デービス、１９８６）、その後、誘導されなかった ＨＵＶＥＣｓからｍＲＮＡを単離した。未誘導ｃＤＮＡ配列を誘導配列から減算 するため、ｍＲＮＡとｃＤＮＡとをハイブリダイズさせ、デービス＜１９８６） により記載されたようにして、ｍＲＮＡにハイブリダイズしなかったｃＤＮＡを 単離した。単離したｃＤＮＡを他のラウンドの減算に供し、富化のレベルを増加 させた。結局、ＥＬＡＭ配列について富化された減算プローブの３つのバッチを 調製した。
ノーザンプロットによりプローブの精製のレベルを試験した（レーサーら、１９ ７７）、誘導および未誘導ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃｓ　ニ由来するポリＡ　＋　ｍ　Ｒ Ｎ　Ａの平行レーンによりゲルを走らせ、これをジーン・スクリーン（登録商標 ）　（二ニー・イングランド・ヌクレア）にプロットした。ハイブリダイゼーシ ョンおよび続くオートラジオグラフィにより、プローブは誘導レーン中で４ｋｂ のバンドに強固に結合したが、未誘導レーンではバックグラウンドを越えた結合 はしないことが明らかとなった。場合により、誘導レーン中の他のメツセージよ り弱いハイブリダイゼーションバンドを認めた。
減算プローブを使用し、ｒＬ−１β誘導配列について富化されたイー・コリＭＣ １０６１Ｐ３中でｃＤＮＡライブラリを作成した。ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｃ ＤＮＡライブラリの百万のクローンをプレートアウトすることにより開始した。
１２．５ｔｔｇ／ｍｌアンピシリンおよび７．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを 含有するＬＢ寒天上で、ジーン・スクリーン・プラス（登録商標）フィルタ（二 ニー・イングランド・ヌクレア）上に百万のコロニーをプレートし、これらを３ ７℃で１２時間生育させた。それぞれのマスターから２つのレプリカフィルタ（ リフト）を作成した。１２．５μｇ／ｍ　Ｉアンピシリンおよび７，５μｇ／ｍ ｌテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天上でこれらを４時間生育させ、２５０μ ｇ　／　ｍ　ｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上でこれらを１６時時 間幅した。
製造業者の仕様書に従ってフィルタを溶解し、その後これらをプラーク・スクリ ーン（登録商標）緩衝液（０，０５Ｍトリス−ＭＣＩｐＨ７，５、ＩＭＮａＣｌ 、１％ＳＤＳ、０．１％ビロリン酸ナトリウム、０．２％ポリビニルピロリドン （ＰＶＰ）、０．２％フィコール−４００，０，２％ＢＳＡ）中で予備ハイブリ ダイズした。１０％硫酸デキストランおよび１００μｇ／ｍ　Ｉ　＃ｆ！ｋｔ　 ＲＮＡ並びに約ｌＸ１０’ｃｐｍの減算ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｃＤＮＡを含 有する５０ｍ１のプラーク・スクリーン（登録商標）Ｍ荷液中で、フィルタを６ ５℃で４０時間ハイブリダイズさせた。その後、６５℃にてプラーク・スクリー ン（登録商標）Ｍａｒ液で２回、２ｘｓｓｃ、１％ＳＤＳで２回、そして１ｘｓ ｓｃ、１％ＳＤＳで２回フィルタを洗浄しな、その後このフィルタを５日間フィ ルムに露呈した。
オートラジオグラフを用いてマスターフィルタをアニールし、滅菌した楊枝を用 いてコロニーをフィルタから掻き取ることによりグローブにハイブリダイズする コロニーを選択した。それぞれの掻き取り物を９６六マイクロタイタブレートの １つの穴に入れ、７．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび１２．５μｇ／ｍＩ アンピシリンを含有するＬＢブロスで満たした。接種後、マイクロタイタブレー トを３７℃で一夜インキユベートしな、４ｆｆｌ胞が成育したならば、それぞれ の穴に対し、最終濃度。
２０％でグリセリンを添加し、プレートを一７０℃で保存した。
このようにして、マスターライブラリフィルタから８６４のＥＬＡＭ配列につい て富化したｃＤＮＡサブライブラリからなるコロニーを単離した。プレートする 密度のため、富化したサブライブラリの全てのコロニーが純粋ではないことを銘 記する。
富化したｃＤＮＡサブライブラリを用いて並列に２つのセットの手順を行った。
衷豊ヱ１ ＥＬＡＭＩを　るクローンの　よ 第１の手順で、富化したサブライブラリからＥＬＡＭＩを発現するクローンを単 離した。このサブライブラリを選択して、高レベルの過渡的発現についてコンピ テントなセルライン、アフリカミドリザルのセルラインＣＯ３７に感染させた。
この細胞をプレートし、スフェロプラスト融合（サンドリーゴールディンら、１ ９８１）によりサブライブラリを感染させた。感染後４８時間に、ＨＬ−６０４ １３胞（炎症剤により刺激された内皮細胞に結合することが知られたセルライン ）に結合する能力により、ＥＬＡＭｌの発現についてＣＯ３７セルラインをアッ セイした。
次のようにしてアッセイを行った：ブリーサンとバリブシュ法（ブリーサンとパ リッシュ、１９８４）により、カルボキシフルオロセインニ酢酸を用いてＨＬ− ６０４１１１胞をラベルした。
すなわち、ＭＬ−６０細胞をｌＸｌ０’細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ／１０％Ｆ ＣＳに再懸濁し、アセトン中の１０ｍｇ／ｍｌの保存溶液から０．１ｍｇ／ｍ＋ の最終濃度でカルボキシフルオロセインニ酢酸を添加した。室温で１５分間ラベ ルしたＨＬ−６０細胞と共にＣＯ３７細胞をインキュベートした。
ＲＰＭＩ／１％ＦＣ８により細胞を３〜４回洗浄した。蛍光顕微鏡により付着性 ＨＬ−６０！胞の群集についてペトリ皿を検取り上げ、０．６％ＳＤＳ、１０ｍ ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８中で溶解させた後、ヒルト（ヒルト、１９６７）の方法によ りプラスミドを遊離させた。これらのプールしたプラスミドを使用してイー・コ リＭＣ１０６１Ｐ３を形質転換した。これらの形質転換体からコロニーを生育さ せ、ＣＯ３７細胞を用い、続いてＨＬ−６０付着についてのアッセイを用いて第 ２回のスフェロプラスト融合を行った。付着について陽性であった細胞の中から １つを選択し、これから１ラスミドを単離した。このプラスミドＥＬＡＭｐＣＤ Ｍ８クローン６を含有する培養物を選定した。このプラスミドを、ブタベスト条 約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、６１１ビー・ハモンド ・フェリー・アールディ、リンチカム、Ｍｄ、２１０９０　（米国）に対し、１ ９８９年４月２０日に寄託した。これは次のように同定される： ＥＬＡＭＰＣＤＭ８クローン６／イー・コリＭＣ１０６１Ｐ３受託番号ＩＶＩ− １０２０４゜ １１且Ｉ ＥＬＡＭＩ　についてのｃ　ＤＮＡ　の第２の手順で、ＩＬ−１β誘導ｃＤＮＡ 配列についてのｃＤＮＡ挿入物を単離した。富化したライブラリの８６４のコロ ニーから２４を無作為に選択し、マニアティスのアルカリ性ミニ調製手順を使用 してこれらからプラスミドを単離したくマニアティス、１９８２）、Ｘｈｏｌま たはＮｏｔ工によりプラスミドを消化し、１％アガロースゲル上で断片を単離し た。３ｋｂを越える大きさの挿入物を有する２つのプラスミドをこのゲルから同 定し、これらの挿入物を単離し、ｓａｐによりこれらをラベルした（フエインバ ーグとボーゲルスタイン、１９８３および１９８４参照）。
その後これらの挿入物を用いてノーサンプロットを前記したようにして行った０ 両者の挿入物は、誘導ＨＩＪＶＥＣｍＲＮＡレーン中で４ｋｂのバンドにハイブ リダイズしたが、未誘導ＨＵＶＥＣｍＲＮＡレーンにはハイブリダイズしなかっ た。また、この挿入物は、ＥＬＡＭ１発現プラスミドＥＬＡＭｐＣＤＭ８クロー ン６（前記）に交叉ハイブリダイズした。これらの挿入物を、ウシ腸アルカリ性 ホスファターゼにより処理したＮｏｔＩ消化ｐＮＮ１１に挿入した。制限消化お よび新しい合成断片による置換により、市販のプラスミドｐＵＣ８（ファルマシ アＰＬパイオゲミカルス）から合成ポリリンカを除去することにより、配列法定 プラスミドｐＮＮ１１を作成した。複製開始点を与えアンピシリン耐性を与える ｐＵＣグラスミドに共通の２．５ｋｂ骨格はそのまま残しな。
ｐＮＮｌｌの新しい合成部分を第２図に示す、これらの新しい構成物をそれぞれ ｐｓＱ１４８およびＰＳＱ１４９と呼ぶ。
ｍユ ＥＬＡＭｌのＤＮＡ　ｌ プラスミドｐｓＱ１４８およびＰＳＱ１４９の挿入物の全ＤＮＡ配列、およびＥ ＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６の挿入物の５−末端の配列の６２４ヌクレオチドを 決定した。マキサム−ギルバート法（マキサムとギルバート、１９８０）を使用 した。
これらの配列は顕著な重複を有するため、ＢＬＡＭｃＤＮＡの複合配列、３８６ ３ヌクレオチドの配列を得た。この配列は、５−非翻訳領域の１４０ヌクレオチ ド、６１０アミノ酸をコードする１８３０ヌクレオチド、並びに３−非翻訳領域 の１８９３ヌクレオチド（翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む ）よりなる、推論されたアミノ酸配列から誘導された成熟蛋白質をＥＬＡＭｌと し、コード領域をＥＬＡＭＩＤＮＡ配列とした。ＥＬＡＭｌのｃＤＮＡ配列を第 １図に示す。
シーンバンク・データベース（＃放５８．１９８８年１２月）の検索により、Ｅ ＬＡＭｌのＤＮＡ配列は、公知のＤＮＡ配列とは顕著な相同性を有さないことが 明らかになった。
このｃＤＮＡ配列を使用してＥＬＡＭ１アミノ酸配列を推論した。これも第１図 に示す、この配列の解析により、次の特性が明らかになった。この蛋白質は、シ グナル配列に特徴的な疎水性Ｎ−末端配列を有する（７オン・ヘイジン、１９８ ６）。
蛋白質配列決定では、シグナル開裂部位および成熟Ｎ−末端は決定しなかったが 、７オン・ヘイジンによれば、成熟Ｎ−末端アミノ酸はトリプトファン、第１図 のヌクレオチド番号２０４であると考えられる。ポリペプチドの外部ドメインは 、シグナル配列を含む約５５４アミノ酸であり、この後に２４アミノ酸の疎水性 Ｈａ所領域が続く、この蛋白質は、３２アミノ酸の短い、荷電したサイトプラズ ム尾部を有する。この蛋白質はシスティンに富み、１１の可能なＮ−グリコジル 化部位を含むことを銘記する。
ＥＬＡＭｌのアミノ酸配列とＭＢＲＦおよびＮＥＷ蛋白質データベースの他の蛋 白質とを比較し、相補的Ｃ２前駆体、β−２糖蛋白質ＬＣ４ｂ結合蛋白質、相補 的因子Ｂ、相補的因子Ｈ、ドロソフイラのノツチ蛋白質、ＩｇＥレセプタへバチ ツクレクチン、並びに凝集因子■およびＸ前駆体を含む幾つかの蛋白質との相同 性を認めた。よって、前記した蛋白質との相同性に基き、ＥＬＡＭｌを少なくと も３つのドメインに分割することができる：（１）レクチン様ドメイン（第１図 のヌクレオチド２０４〜５６３）、（２）ＥＧＦ様ドノドメインクレオチド５６ ４〜６６８）、並びに（３）リピート当り６のシスティン残基を含有する５９〜 ６３アミノ酸のコンセンサスシスティンリピート単位（ヌクレオチド６６９〜１ ７９３）、それぞれのリピート中の他の変化しないアミノ酸は、プロリン、グリ シン並びにトリプトファンである。
Ｘ豊■ヱ ＥＬＡＭＩ　’−モノ　ローナル ＥＬＡＭ１を認識するモノクローナル抗体を作成するため、実施例Ｘ（後記）で 行ったものと主として同様にしてバイブリドーマを調製した。ただし、ＩＬ−１ β誘導Ｈ１ＪＶＥＣｓに対するＭＬ−６０ｍ胞付着合遮断する能力について抗血 清を試験することにより抗ＥＬＡＭ１抗体を生産するマウスを同定しな。
幾つかのアッセイを使用し、これらの抗ＥＬＡＭ１モノクローナルを生産するも のにつきこの様式で産生じたハイブリドーマを検索した。第１に、ＢＬＡＭｌを 安定に発現するセルラインに結合する能力を有する抗体について、培養上澄を試 験した。
このセルラインは、ＥＬＡＭ１動物細胞発現ベクタ、ｐＢＧ３４１　Ｊ　ｏｄ、 ＥＬＡＭにより感染したＣＨＯ−ＤＨＰＲ−のラインとした。ＥＬＡＭＩをコー ドするＤＮＡ配列をｐＣＤＭ８ＣＤ−ン６からｐＢＧ３４１．ｊ　ｏｄのＮｏｔ Ｉ部位（実施例■、後記に記載）に導入することによりこのプラスミドを創製し た。ＥＬＡＭＩ発現ＣＨＯ−ＤＨＰＲ−誘導セルラインは、ＨＬ−６０細胞に対 する付着アッセイを使用して検出した。
第２に、サイトカイン誘導ＨＵＶＥＣｓに結合する能力（コントロールには結合 しない）についてハイブリドーマ培養上澄を検索した。
第３に、サイトカイン誘導Ｈ１ＪＶＥＣモルイヤに対するＭＬ−６０ｍ胞付着合 阻害するこれらの能力につきこれらを試験した。
３つの全てのアッセイで陽性の結果を与えた１つのハイブリドーマクローン、Ｂ ＢＩＩを同定した。ＢＢＩＩ免疫沈殿蛋白質は、ＥＬＡＭ１発現ＨＩＪＶＥＣｓ およびＣＯ８細胞に由来する約１１０ｋＤおよび９６ｋＤの分子量を有し、ＥＬ ＡＭｌの種々のグリコジル化形態を示す（ベビラッ力ら、１９８９）。
またこれは、ＥＬＡＭＩ発現ＣＯＳおよびＣＨＯ＃胞に対するＨＬ−６０細胞の 付着を完全に遮断した。これはＩｇＧ２ｂクラスのイムノグロブリンを生産した 。ブタペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、６１１ ビー・ハモンド・フェリー・アールディ、リンチカム、Ｍｄ、２Ｉ０９０（米国 ）に対し、１９８９年１２月１３日に寄託した。これは次のように同定される： モノクローナル抗体ＣＤＢ、ＢＢＩ　１．ＢＣ６受託番号ＩＶＩ−１０２２０゜ Ｋ１医ユ ＶＣＡＭＩおよびＶＣＡＭｌ　ｂを　るクローンの更に、リンパ球およびリンパ 球様セルラインに結合する２つの興なるＢＬＡＭｓの特徴を調ベクローン化した 。第１の工程として、４．２４、または４８時間、ＩＬ−１βまたはＴＮＦによ り誘導したＨＵＶＥＣｓに対し、ＲＡＭＯ３，Ｂ−リンパ球様ライン、ＪｔＪＲ ＫＡＴ、Ｔ−リンパ球様ラインの結合経路の特徴を調べた。ＲＡＭＯ３およびＪ ＵＲＫＡＴ結合の両者は、ＩＬ−１βまたはＴＮＦによる誘発の４時間後に最大 となり、結合は２４時間、誘発後４８時間維持されることを認めた。
ＲＡＭＯ３結合は温度感受性であり、室温では進行するが４℃では進行しなかっ た。ＪｔＪＲＫＡＴ結合は４℃で減少したが、完全には除去されなかったため、 ＪＵＲＫＡＴは、温度感受性および温度非感受性の両者の成分を示した。ＪＵＲ ＫＡＴ細胞により免疫したマウス由来の抗血清は、ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃｓに対する ＪＵＲＫＡＴおよびＲＡＭ０５Ｍ胞の両者の結合を阻害し、ＲＡＭＯ３およびＪ ＵＲＫＡＴがＭＩＬＡを共有することを示した。誘発後４〜４８時間で、ＲＡ　 Ｍ　ＯＳおよびＪＵＲＫＡＴの両者は、ＥＬＡＭｌを発現するＣＯＳまたはＣＨ Ｏｍ胞に結合せず、ＨＵＶＥＣｓ上の少なくとも１つの他の誘導性ＥＬＡＭの存 在を示した。
ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃｓ　ニ結合ｔ６ＲＡＭＯｓおよ’１ＦＪＵＦＬＫＡＴＬ含まれ るＥ　Ｌ　Ａ　Ｍ　ｓを発現するクローンを単離するため、実施例■、前記に記 載した方法により、先に記載しなＥＬＡＭ富化ＨＵＶＥＣｃＤＮＡサブライブラ リを検索しな、サブライブラリ感染ＣＯ３７４１１１胞と共に、カルボキシフル オレセインニ＃酸ラベルしたＲＡＭＯ３およびＪＵＲＫＡＴ［胞をインキュベー トした。結合細胞の群集を有する＃ｌ胞プレートの領域を取り出して溶解し、１ ラスミドを得、イー・コリに形質転換し、先に記載したようにＣＯ５７ＡＩＩＩ Ｊｌｌ中で再アッセイした。再アッセイで陽性であった形質転換体に由来する個 々の細菌コロニーからプラスミドを単離しな、これらの１ラスミドをＣＯ３７Ｍ 胞に個々に感染させ、ＲＡＭＯ８およびＪＵＲＫＡＴへの付着についての試験で 陽性の１ラスミドを同定した。このプラスミドからｃＤＮＡ挿入物を摘出し、放 射能ラベルし、レーラ＜１９７９）の手Ｈに従ってノーサンプロットのプローブ として使用した。このグローブは、長さ約３．４ｋｂのＲＮＡ分子種にハイブリ ダイズした。このＲＮＡは、未誘導ＨＵＶＥＣＲＮＡにおいては検出できず、Ｉ Ｌ−１βによる処理の５．１０．３０または６０分後にかろうじて検出すること ができたが、ＩＬ−１βによる処理の２．２４．４８並びに７２時間後には十分 に存在した。
プラスミドＡＭｐＣＤＭ８クローン４１を作成した。このプラスミドを、ブタベ スト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、リンチカム、Ｍ ｄ（米ＩＩ］）に対し、１９８９年５月２４日に寄託した。これは次のように同 定される： ＡＭＰＣＤＭ８クローン４１／イー・コリＭＣ１０６１Ｐ３受託番号ＩＶＩ−１ ０２０６゜ また、他のＶＣＡＭからｃＤＮＡを単離した。
Ａ　Ｍ　ｐ　ＣＤ　Ｍ　８クローン４１からラベルしたＶＣＡＭ１コード挿入物 を用いてＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリ（実施例Ｉ）を検索した 。これらのクローンの１つである１Ｅ１１を配列決定した。ＸｂａＩによる制限 マツピングによる分析により、クローン４１挿入物より長い幾つかのクローンを 認めた。これらの１つのクローンであるＩＥｌｌを配列決定した。これを、ブタ ペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・イン；、リンチヵム、 Ｍｄ（米国）に対し、１９８９年１２月７日に寄託した。これは次のように同定 される： ＶＣＡＭＩ　ＢりＤ−ンＩＥ１１　ｐＣＤＭ８／イー・コリＭＣ１０６１ｐ３ 受託番号ＩＶＩ−１０２１６゜ また、他のＥＬＡＭｓについてのＤＮＡ配列を単離しな。
ＩＬ−１ｔ誘発後４８時間に渡りＨＵＶＥＣｓからｍ　ＲＮ　Ａを集めた。ＥＬ ＡＭＩおよびＶＣＡＭＩおよび１ｂについてｃＤＮＡ配列を単離するのに使用し たものと同様にしてＥ　Ｌ　Ａ　Ｍ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を単離し得る。
また、ＴＮＦ、ＬＴ、ＬＰＳ、インターフェロンのような他。
の炎症剤、またはこの種の薬剤の組合せを用いて誘発することにより他のＥＬＡ Ｍｓを同定し得る。
衷農亘ｌ ＶＣＡＭｌおよびＶＣＡＭＩｂのＤＮＡマキサムとギルバート（１９８０）の方 法により、プラスミドＡＭｐＣＤＭ８クローン４１の挿入物の全ＤＮＡ配列を決 定した。この配列は、１０６ヌクレオチドの５゛非翻訳領域、１９４１ヌクレオ チドをコードする６４７アミノ酸、並びに翻訳停止コドンを含む７６４ヌクレオ チドの３−非翻訳領域よりなる。このｃＤＮＡ配列から誘導した蛋白質をＶＣＡ Ｍｌとし、コード配列をＶＣＡＭＩＤＮＡ配列とした。第３図にＶＣＡＭｌのｃ ＤＮＡ配列を示す、ＶＣＡＭｌの推定されるアミノ酸配列を同様に第３図に示す 。
また、マキサムとギルバート（１９８０）の方法により、１ラスミドＶＣＡＭ１ ｂｐＣＤＭ８１Ｅ１１の挿入物のＤＮＡ配列を決定した。この配列は、９９ヌク レオチドの５゛非翻訳領域、２２１７ヌクレオチドをコードする７３９アミノ酸 、並びに翻訳停止コドンを含む７６４ヌクレオチドの３−非翻訳領域よりなる。
ｃＤＮＡ配列から誘導された成熟蛋白質をＶＣＡＭｌｂとし、コード配列をＶＣ ＡＭｌ　ｂＤＮＡ配列とした。ｃＤＮＡ配列および推定されたＶＣＡＭｌｂのア ミノ酸配列を第４図に示した。
ＶＣＡＭｌおよびＶＣＡＭＩ　Ｍ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列の比較により、１ つの有意な基以外は、これらは実質的に同一であることが明らかとなった。すな わち、ＶＣＡＭｌ　ｂは、コ。
−ド領域の中間付近に２７６ヌクレオチドの挿入を含む、これらのヌクレオチド は、ＶＣＡＭ１ドメイン３の末端とＶＣＡＭＩドメイン４の開始部との間に位置 する８４アミノ酸の余分なドメインを形成する９２の付加的なアミノ酸をコード する。ＶＣＡＭＩドメイン３Ｂとしたこのドメインの意義を以下に論する。
配列の解析により次の特性が明らかとなった：　ＶＣＡＭ１ポリペプチドは、シ グナル配列（７オン・ヘイジン、１９８６）を特徴とする疎水性Ｎ−末端配列を 有する。蛋白質配列決定では、シグナル開裂部位および成熟Ｎ−末端を決定しな かったが、ヘイジンにより、成熟蛋白質のＮ−末端アミノ酸は、第３図のヌクレ オチド番号１７９のフェニルアラニンと推定される。このポリペプチドの細胞外 ドメインは、シグナル配列を含む約６０６アミノ酸であり、その後に２２アミノ 酸の疎水性膜横断領域が続く、この蛋白質は、１９アミノ酸からなる短い荷電し たサイトプラズム尾部を有する。この蛋白質は、６の可能なＮ−グリコジル化部 位を含有することを銘記する。
同様に、成熟ＶＣＡＭ１ｂ蛋白質のＮ−末端アミノ酸はフェニルアラニンの筈で あり、これは第４図のヌクレオチド番号１７２である。このポリペプチドの細胞 外ドメインはＶＣＡＭｌより長く、シグナル配列を含む約６９８アミノ酸であり 、この後に２２アミノ酸の疎水性膜横断領域が続く、この蛋白質は、１９アミノ 酸の短い荷電したサイトグラズム尾部を有する。この蛋白質は７の可能なＮ−グ ルコシル化部位を含有することを銘記する。
ＶＣＡＭｌ　およびＶＣＡＭＩ　Ｍ）アミノ酸配列とＮＢＲＦおよびＮＥＷ蛋白 質データベース中の他の蛋白質とを比較することにより、非特異的交叉反応抗原 （ＮＣＡ）　、胆汁糖蛋白質１（ＢＧＩ）、神経細胞付着分子（ＮＣＡＭ）　、 発癌胚抗原（ＣＦ、Ａ）　、免疫グロブリンα鎖一定領域、Ｔ細胞レセプタ（Ｔ ＣＲ）αおよびβ鎖変動領域、並びにミニリン関連糖蛋白質（ＭＡＧ＞を含む幾 つかの蛋白質との顕著な相同性が明らかとなった。より少ない相同性が、ミオシ ン軽鎖キナーゼ、リブロースニリン酸カルボキシラーゼ、アデノウィルスＥＩＡ ２８に蛋白質、シラドウリジン合成酵素、並びにキシルロキナーゼについて認め られる。ＶＣＡＭＩおよび１ｂ並びにＶＣＡＭｌおよび１ｂＤＮＡ配列は、先に 記載したＥ　ＬＡＭ　１（前記）と全く相同性を示さず、これとは異なるもので ある。
重要なことは、ＮＣＡ、ＢＧＩ、ＮＣＡＭ、ＣＥＡ、ＭＡＧ並びにＴＣＲが免疫 グロブリンスーパーファミリーの一員であることである（ウィリアムスとバーク レイ、１９８８、フン力ビラーとフッド、１９８９）、このファミリーの構成員 は、イムノグロブリン（Ｉｇ）分子の基本ｉ遺単位、Ｉｇ相同単位に対して相同 な１以上の領域の存在により特定される（フン力ピラーとフッド、１９８９）、 これらの単位は、長さ約７０〜１１０残基の一次アミノ酸配列を特徴とし、５０ 〜７０残基に及ぶ実質的に変動しないジスルフィド架橋を有し、「抗体の折り畳 み」と呼ばれる三次構造を確立する際に包含される幾つかの他の比較的保存され た残基を有する。これらの単位は、更に３つの群に分割することができる。すな わち、Ｖ、Ｃ１およびＣ２（ウィリアムスとパークレイ、１９８８）　、または Ｖ、ＣおよびＨ（フン力ピラーとフッド、１９８９）であり、内部システィン離 間、β鎖の数、並びに保存残基の種類を含む種々の基準に基く、これらの基準を 推論されたＶＣＡＭｌの一次配列に適用すると、この配列を６のＩｇ単位に分割 することができ、これをドメイン１〜６とすると、その全てはＣ２ｔたはＨサブ セットとなり、それぞれ約１００アミノ酸の長さである。第３図に示すように、 ６のドメインの変動しないジスルフィド架橋は、システィン４７および９５（ド メイン１）、１３７および１９５（ドメイン２）、２４６および２９１（ドメイ ン３）、３３３および３９１（ドメイン４）、４４２および４８７（ドメイン５ ）並びに５３１および５７６（ドメイン６）の間に存在する。
前記したように、ＶＣＡＭｌ　ｂは７のドメインを有する。付加的なドメインを ドメイン３Ｂとした。このドメインは、第４図のヌクレオチド１０２７で開始し ヌクレオチド１３０５で終了するＶＣＡＭｌｂの付加的な２７６ヌクレオチドに 含まれる。
ドメイン１〜３に及ぶＤＮＡ配列は、ドメイン３Ｂ〜５に及ぶＤＮＡ配列に対し ７２％相同である。ポリペプチドレベルでは、それぞれドメイン１および３Ｂ、 ２および４、並びに３および５の間に順著な相同性がある。第５図および第６図 に、ＶＣＡＭｌおよびＶＣＡＭｌｂのドメイン構造を示す。
ＶＣＡＭｌおよびＶＣＡＭｌｂのｍＲＮＡは２つの機構により生成し得る。これ らは同一の遺伝子生成物の交互にスプライスされた形態を与えることができるか 、別のＶＣＡＭ対立遺伝子の生成物たり得る。これらの可能性の区別に供すべく 、サイトカイン誘発後の異なる時点で、３つの個体からのＶ　ＣＡ　Ｍ　１およ びｍＲＮＡを試験した。３つの異なる＠体に由来する腰帯からＨＵＶＥＣｓを調 製し、緒のサンプルを＃１、＃２、並びに＃３とラベルした。それぞれの調製物 を４つの別のフラスコに分け、ＴＮＦによる０（未処理）、２．５．２４並びに ４８時間の処理に供した。ＶＣＡＭＩおよびＶＣＡＭｌ　ｂｍＲＮＡの相対量は 、ノーサンプロットおよびそれぞれの形態について特異的な合成オリゴヌクレオ チドによるプローブによって決定した。ＶＣＡＭｌｂは、３つ、の腰帯調製物の 全てにおいて、明らかに主要な存在するｍＲＮＡであった。ＶＣＡＭＩは緒＃１ および＃３に存在し、２．５時間の誘発時点で最も優勢であワたが、緒＃３ＶＣ ＡＭ１も２４および４８時間において存在した。緒＃２細胞は殆どまたは全（Ｖ ＣＡＭｌｍＲＮＡを有さなかったが、ＶＣＡＭｌｂｍＲＮＡの量は、緒＃１およ び＃３に由来するＨＵＶＥＣｓ中のものと対比し得た。これらの２つの生成物が 生成するｔｌｌ、Ｍはなお不明であるが、交互にスプライスされる可能性がある 。２つのｍＲＮＡは、スプライス部位の可能性のある点において１つのドメイン の欠損以外は同一であるなめである。そのドメイン間の位Ｔｔ（フン力ビラーと フッド、１９８９）およびスプライス部位に典型的なジヌクレオチドＡＧの存在 （ブレサナクとチャンポン、１９８１）により判断したものである。更に、交互 スプライシングは、ＶＣＡＭＩが明らかに最も関連するＩｇ遺伝子スーパーファ ミリーの他の構成員に共通である（フン力ビラーとフッド、１９８９）。
作用的には、ＶＣＡＭｌの２つの形態の差異は最小であると考えられる０両者の 形態は、ＣＯ３７細胞中で過渡的に発現された場合、ＲＡＭ０Ｓ細胞に結合し、 この結合はＭｏａｂ１４Ｂ９により完全に阻害されたことから、同一のエビドー グがそれぞれの場合の結合に関与することを示す、更に、このエピトープは、最 初の３つのドメイン内に位置することを示したが、これは両者の形態に共通であ る（実施例■、前記参照）。
Ｋ１且１ ”０−　ＥＬＡＭｌおよびＶＣＡＭｌｂ組換え可溶性ＥＬＡＭ１（ｒｓＥＬＡＭ ｌ）を発現するベクタを作成した。このベクタをｐｓＡＢ１０８と呼ぶ。
ｐｓＡＢ１０８により発現されるｒｓＥＬＡＭｌは、第１図のヌクレオチド１４ １〜ヌクレオチド１９７０のＤＮＡ配列によりコードされるＥＬＡＭＩの細胞外 ドメインの一部を含有する。
ｐｓＡＢ１０８を作成するため、第１にｒｓＥＬＡＭｌをコードするＤＮＡ断片 を創製した０Ｍ１ｕＩおよびＮｏｔＩによりＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６を消 化した。これにより、ＥＬＡＭＩをコードするＤＮＡ配列を含む３．８ｋｂのＤ ＮＡ断片を得た。ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（実施例■に記載）により予 め処理しなＮｏｔＩ消化ｐＮＮ１１にこの断片をサブクローン化した。これをベ クタＰＮＮＥＬＡＭＩとした。
部位特異的変異誘発を使用し、ＥＬＡＭｌの膜横断および細胞内領域を除去した （ベデンとナサンス、１９８２、カルゾロンら、１９８２、オーストラら、１９ ８３）、よって、ｐＮＮＥＬＡＭｌのサンプルをＥｃｏＲＩにより消化し、大き い断片を単離した。５ｃａＩによりｐＮＮＥＬＡＭｌの他のサンプルを線状化し た。その後、配列５−ＴＧＴ　ＧＡＡＧＣＴ　ＣＣＣＴＡＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣを 有するオリゴヌクレオチドを合成した。この配列がＥＬＡＭ１アンチセンス配列 にハイブリダイズすると、これはヌクレオチド番号１７９０以降のＥＬＡＭＩＤ ＮＡ配列に停止コドンおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入する。モリナガら＜１９ ８４）およびチャンら（１９８４）の方法により、これらの３つの断片を使用し てへテロデユープレックスを創製した。フレニュー断片およびＴ４リガーゼを用 いて一重鎖ギャップを埋め、混合物を使用してイー・コリＭＣ１０６１を形質転 換した。ＢａｍＨＩ部位についてチェックすることにより得られたコロニーを検 索し、変異誘発クローンを選択した。結果的に発現に際し、ポリペプチドのＷＡ 横断領域は除去され、Ｃ−末端アミノ酸はズロリンである。
これをプラスミドＰＳＡＢ１００と呼ぶ。
その後ＡａｔＩ［およびＮｃｏＩによりｐｓＡＢｌｏｏを消化し、５．２ｋｂ断 片を単離した。また、ｐＮＮＥＬＡＭｌをこれらの２つの酵素で消化し、１．４ ｋｂ断片を単離した。
ＮｃｏＩは、ＥＬＡＭＩコード領域の中央付近で、第１図のヌクレオチド９２７ で切断する。これらの２つのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐｓＡ８１０８と した。このように構成したのは、部位特異的変異誘発により、場合により分子の 他の部分に変異が起こり、ｒｓＥＬＡＭｌのコード領域中でのこの種の全ゆる変 異を回避せんがためである。ＮｏｔＩによりＰＳＡＢ１０８を消化し、３．８ｋ ｂ断片を単離した。この断片を、後記するようにして創製したｐＢＧ３４１．ｊ ｏｄの７８１９ｂｐ！７ｒ片に連結した。
まず、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ベセスダ、Ｍｄ（米国 ）からｐＳＶ２−ＤＨＰＲ，ＡＴＣＣ３７１４６を得た（サブラマニら、１９８ １）、これをＡｐａ■およびＥｃｏＲＩにより消化し、４４２０ｂＰ断片を単離 した。その後、ＡｐａＩオーバーハングを有する合成二本鎖ＤＮＡ配列、ヒトガ ストリン遺伝子（サトら、１９８６、第４図）のヌクレオチド＋１９０〜＋２３ ３、Ｘｈｏ工部位およびＥｃｏＲＩオーバーハングをコードするＤＮＡ配列を作 成した。このオリゴヌクレオチドをｐＳＶ２−ＤＨＰＲの４４２゜ｂＰ断片に連 結し、得られたプラスミドをｐ　Ｄ　Ｔ　４と呼ぶこととした。Ａａｔｆｉおよ びＸｈｏ工によりこのプラスミドを消化し、４３９１ｂｐ断片を単離した。
その後、Ａａｔｌ［およびＳａｌ工によりミュラー阻害物質発現ベクタｐＤ１　 （ゲートら、１９８６）を開裂し、５４６２ｂｐ断片を単離した。この断片をｐ ＤＴ４の４３９１ｂｐ断片と連結してｐＪＯＤ−１０を作成した。
Ｈｆｎｃｆ！！［およびＢｓ　ｔＥｆｆによりｐ　ＪＯＤ−１０を消化し、ミュ ラー阻害物質をコードしない大断片を単離した。断片末端を平滑末端とし、この 末端に５ａｌＪリンカを連結し、ベクタを自己連結させた。これはｐＪＯＤ−５ を与えた。
その後ＡａｔｌおよびＮｏｔＩによりｐＪＯＤ−ｓを消化し、６７５０ｂｐ断片 を単離した。これを次のようにして創製したｐＢＧ３４１由来の１１００ｂｐＮ ｏｔＩ断片に連結した。
ｐ　ＢＯ２１２のＳｍａＩ部位（ゲートら、１９８６）をＮｏｔ工部位で置換す ることによりＰＢＧ３４１を創製した。
Ｂｇ　ｌ　ＩＩ４：：ヨリｐＢＧ３１２を線状化し、フレニューによす埋めるこ とによりこの断片を平滑末端とし、これを自己連結させた。ＢａｍＨ７によりこ のグラスミドを線状化し、再度平滑末端とし、これを自己連結させた。ＳｍａＩ によりこのプラスミドを線状化し、配列５−ＧＣＧＧＣＧＣを有するＮｏｔＩリ ンカを末端に連結しな、得られたプラスミドをｐＢＧ３４１と呼ぶこととした。
Ａａｔ［およびＮｏｔＩによりｐＢＧ３４１を消化し、１１００ｂｐ断片を単離 した。この断片をｐＪＯＤ−ｓの６７５０ｂＰ断片に連結した。得られたプラス ミドをｐＢＧ３４１．Ｊ　ａｄと呼ぶこととした。このプラスミドは、ＳＶ４０ 初期およびアデノアイルス主要後期１０モータを含有する。Ｎｏｔ工部位にてプ ラスミドに挿入された遺伝子は、これらのいずれのプロモータからでも転写され る。
その後、ＮｏｔＩによりｐＢＧ３４１．Ｊｏｄを線状化し、線状７８１９ｂｐ断 片を単離した。これを、ｒｓＥＬＡＭｌをコードするｐｓＡＢ１０８の３．８ｋ ｂＫ片に連結し、グラスミドＰＳＡＢＩＩＯを作成した。
Ａ　ａ　ｔ　ＩＩにより線状化したプラスミドｐｓＡＢ１１０を用いてエレクト ロボーレーションによりＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞に感染させた。２０ｍＭＨＥＰ ＥＳ、ｐＨ７，０５，１３７ｍＭＮａＣ１，５ｍＭＫＣｌ、０．７ｍＭＮａ２Ｈ ＰＯ，、並びに６ｍＭデキストロース中で１０？細胞／　ｍ　ｌを使用し、２０ μｇプラスミドおよび２００μｇ超音波処理サゲ精子ＤＮＡを用いて、２７０Ｖ および９６０μＦＤにて、バイオラド（登録商標）ジーン・パルサーによりエレ クトロボーレーションを行った。感染後、選択培地、α−ＭＢＭ（５００ｎＭメ トトレキセートおよび１０％透析ＦＣ３を含有する）中で細胞を培養した。コロ ニーを取り上げ、これらを９６六クラスタープレートにプレートし、モノクロー ナル抗体ＢＢＩＩを使用してｒｓＥＬＡＭ１発現細胞を検出した。１０％ウシ胎 児血清（Ｆｅ２）を含有する完全培地中で群集になるまで細胞を生育させた後、 細胞がｒｓＥＬＡＭｌを生産する２％ＦＣ３を含有する培地中でこれらを維持し た。培地を回収し、３〜４日毎に新鮮な２％血清によりこれを置換した。
このコンディショニングした培地から少なくとも９５％純度にｒｓＥＬＡＭｌを 単離した。これには、培地を濃縮し、プロティンＡセファロースに共有結合した （シュナイダーら、１９８２）ＭｏａｂＢＢｌｌを用いてこれを一夜インキユベ ートすることが包含される。その後ＰＢＳによりこの樹脂を洗浄し、未結合蛋白 質を除去し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２，７により結合物質を溶出させ、溶出物 をリン酸ナトリウムで中和し、これをＰＢＳに対して透析した。ＰＢＳ中でのプ ロティンＡセファロースによるクロマトグラフィにより、ｒｓＥＬＡＭｌを更に 精製した。
次のアッセイを使用し、ｒｓＥＬＡＭｌを生産したことを示す、直径６ｃｍの細 菌用プラスチック（例えばファルコン＃１００７、登録商標）のベトリ皿に、２ ．５ｍｌの５０ｍＭトリス綬衝液、ｐＨ９，５を添加した。これに１０μｇの純 粋なｒｓＥＬＡＭｌを添加した。このプレートを室温で６０分間インキュベート し、ｒｓＥＬＡＭｌをプレートに結合させた。
その後培地を吸引し、１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳによ りこれを置換した。この−ａ液中でプレートを一夜４℃でインキュベートし、プ レート上の残留する蛋白質結合部位をブロックした。プレートを室温に加温し、 １０％ウシ胎児血清を含有する培地によりこれらを洗浄し、２ｍｌの細胞＜２Ｘ １０’ｍ！−”）を用いて２０分間これらをインキュベートした。培地を吸引し 、３ｍｌのそれぞれの培地（１０％血清を有するＲＰＭ１１６４０）によりプレ ートを２回洗浄した。
その後顕微鏡によりプレートを検定した。
ＨＬ−６０！胞のようなＥＬＡＭｌに結合する細胞は、ｒｓＥＬＡＭ１被覆プレ ートに結合することを認めたが、例えばＢセルラインＲＡＭＯ３のようなＥＬＡ Ｍｌに結合しない細胞はこれらのプレートに結合しないことを認めた。
更に、特異的ＭｏａｂＢＢ１１はｒｓＥＬＡＭ１被覆プレートに対するＨＬ−６ ０４１１！胞の結合を遮断することを認めた。また、これらの結果はまず、ｒｓ ＥＬＡＭｌが生産され、次にＥＬＡＭｌのように、ｒｓＥＬＡＭｌは白血球に結 合する能力を有することを示す。
また、組換え可溶性ＶＣＡＭ１ｂ　（ｒｓＶｃＡＭｌｂ）を発現するベクタを作 成した。このベクタをＰＢＮ１００６と命名した。ｐＢＮ１００６により発現さ れるｒｓＶｃＡＭｌｂは、第４図に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド１０７〜ヌク レオチド２１９３によりコードされるＶＣＡＭｌ　ｂの細胞外ドメインの一部を 含有する。
可溶性ＶＣＡＭ１ｂの全長を構成的に発現し得るセルラインを作成するため、ま ずアデノウィルス主要後期プロモータの下流の独特のＮｏｔＩ部位を有するｐＪ ＯＤ−ｓからベクタを作成し、発現ベクタへのＮｏｔ工断片の挿入を図った。プ ラスミドＤＮＡのＮ０ｔＩ開裂によりｐＪＯＤ−ｓを線状化した。突出する５− 末端をマング・ビーン・ヌクレアーゼを使用して平清末端とし、線状化したＤＮ ＡＨ片を、低融点アガロース（ＬＭＡ）ゲル電気泳動により精製した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼを使用してＤＮＡ＠片を再連結した。その後連結した分子をイー・コ リＪＡ２２１　（ＡＴＣＣ受託番号３３８７５）に形質転換した。ＮｏｔＩ部位 の非存在についてコロニーを検索した。
、得られたベクダをｐＪＯＤ−ＳデルタＮｏｔｌとした。
ｐＪＯＤ　ＳデルタＮｏｔｌをＳａｌ■を使用して線状化し、ウシ腸アルカリ性 ホスファターゼを使用して５−末端を脱リン酸化しな、ＬＭＡゲル電気泳動によ り線状化したＤＮＡ断片を精製し、ホスホリル化オリゴヌクレオチドＡＣＥ１７ ５（５−ｐＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧ）の存在下に連結した。連結混合物を イー・コリＪＡ２２１に形質転換し、Ｎｏｔ工部位の存在についてコロニーを検 索した０合致するプラスミドをｐＭＤＲ９０１と命名した。
Ａｌｕ工による消化によりヌクレオチド２１９３でＶＣＡＭ１ｂクローンＩＥ１ １を縮めることにより、可溶性ＶＣＡＭ１　ｂを得、これによりＷＡ横断および 細胞内部分並びに３−非翻訳領域を除去した。停止コドン−Ｎｏｔ■リンカを添 加し、挿入物をｐＣＤＭ８に再連結した。ＮｏｔＩによりＰＣＤＭ８から挿入物 を切り取り、ＮｏｔＩ部位でＰＭＤＲ９０１に連結した。この構成物をｐＢＮ１ ００６としたが、これは第４図に示すようにアミノ酸１〜６９８を有する可溶性 ＶＣＡＭ１ｂの全長をコードする。
先に記載した材料および方法を使用し、前記したｒｓＥＬＡＭｌおよびｒｓＶｃ ＡＭ１ｂ分子の縮めた形態を発現するプラスミドを同様に作成した。これらの縮 めた形態は、ＥＬＡＭｌおよびＶＣＡＭｌ　ｂの細胞外領域の１以上の特定のド メインのアミノ酸配列からなり、これを使用していずれのドメインが細胞−細胞 付着に直接関与するかを検討した。最初の実験では、これらの分子に対する抗体 、すなわちそれぞれ抗体ＢＢＩＩおよび４Ｂ９により認識されるＥＬＡＭＩおよ びＶＣＡＭｌおよび１ｂのドメインを検討した。
ＣＨＩＯＩとした可溶性ＥＬＡＭＩ構成物を調製した。これはＥＬＡＭｌのレク チン様ドメインからなる。第１図を参照すると、Ｃ）ｔｌｏｌは、ヌクレオチド １〜５５７　（ＥＬＡＭＩのアミノ酸１〜１３９をコードする）および停止コド ンを含むｃＤＮＡ配列の発現生成物であった。ＣＨ１０２とした他の可溶性構成 物を調製した。これはレクチン様ドメインおよびＥＬ、ＡＭＩのＥＧＦ様ドノド メインなる。第１図を参照すると、ＣＨ１０２は、ヌクレオチド１〜６７１　（ ＥＬＡＭＩのアミノ酸１〜１７７をコードする）および停止コドンを含むｃＤＮ Ａ配列の発現生成物であった。可溶性ＥＬＡＭＩ構成物ＣＨ１０２は、抗ＥＬＡ ＭＩモノクローナル抗体、ＢＢＩＩを免疫沈澱させることが認められた。
次の可溶性ＶＣＡＭ１および１ｂ構成物を同様に調製した＝（Ａ）ドメイン１（ アミノ酸１〜１０８をコードする第３図のヌクレオチド１〜４３０）、 （Ｂ）ドメイン１＋ドメイン２（アミノ酸１〜２１７をコードする第３図のヌク レオチド１〜７５７）、（Ｃ）ドメイン１十ドメイン２＋ドメイン３（アミノ酸 ｌ〜３１０をコードする第３図のヌクレオチド１〜１０３６）、（Ｄ）ドメイン １＋ドメイン２＋ドメイン３　（ＶＣＡＭＩとＶＣＡＭＩｂｃＤＮＡとのハイブ リッド、第４図に示すアミノＤ１〜３１７をコードする）、 （Ｅ）可溶性ＶＣＡＭ１の全長く第３図のヌクレオチド１〜１９２４、アミノ酸 １〜６０６をコードする）、並びに（Ｆ）可溶性ＶＣＡＭ１　ｂの全長（第４図 のヌクレオチド１〜２１９３、アミノ酸１〜６９８をコードする）。
前記しりＶ　ＣＡ　Ｍ　１　ｍ　成ｅｌ　（１’）　内、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ並びに Ｆ（Ａを除く）は、抗ＶＣＡＭＩ抗体４Ｂ９と免疫沈澱する。また、構成物Ｂ、 Ｄ、Ｅ並びにＦは、細胞吸着に機能的な蛋白質を生産することが認められた。構 成物Ｂ、Ｄ、Ｅ並びにＦによりコードされる蛋白質を含有するコンディショニン グ培地を濃縮し、固定化４Ｂ９抗体の免疫アフィニティカラムを通し、結合した 蛋白質を溶出させ、ｒｓＥＬＡＭｌについて記載したように中和した。ｒｓＥＬ ＡＭｉについて記載したように溶出蛋白質をグラスチックに固定化し、ＲＡＭＯ ３およびＪ４ＪＲＫＡＴ４１１１ｆｌ！！、の支持＃−特異的付着を認めた。こ れらの結果は、ＶＣＡＭＩの最初の２つのドメインは、所定のＶＬＡ４発現ヒト リンパ球セルラインの付着を支持するのに十分であることを示す。
衷豊±■ ＥＬＡＭｌおよびＶＣＡＭｌ　プ０モータ（７）単離ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ ｌ　ｉｉ伝子について染色体クローンを単離し特徴を調べた。ＥＬＡＭＩクロー ンを次のようにして単離した。
ＥＬＡＭｃＤＮＡプローブを用いてヒト染色体ＥＭＢＬ３ライ８４０ｂｐの５− フランク配列および７２０ｂｐのＥ　ＬＡＭ　１遺伝子の５′末端を含む領域の 配列決定を行った（最初の２つのエクソン、最初のイントロン並びに第２イント ロンの一部を含む）、この配列を第７図に示す、５−フランク領域は、ＴＡＴＡ ＡＡおよびＣＡＡＴ配列を含む古典的なプロモータ構のＮＦ−にＢ結合配列であ る。ＮＦ−にＢは、炎症および免疫応答に関連する多数の遺伝子（例えば免疫グ ロブリン、インターロイキン−２レセプタ、並びにβ−インターフェロン、その 他）の転写を刺激することが知られた、または推定された誘導性ＤＮＡ結合蛋白 質である。これは、Ｅ　ＬＡＭ　１　、　ＶＣＡＭ　１並びにＩＣＡＭｌの生産 を′ｇＪ激することが知られた同一のインデューサであるＴＮＦ、ＩＬ−１並び にＬＰＳにより活性化され得る（レナルドとバルチモア、１９８９．オスポーン ら、１９８９＞、ＮＦ−にＢＤＮＡ結合活性は、ＩＬ−１およびＴＮＦにより内 皮細胞中で刺激されることを示したが、ここでは、内皮および他の種類の細胞中 にプロモータ／レセプタ遺伝子構成物を感染させることにより、ＥＬＡＭＩプロ モータからの誘導性転写に必要な最少のＤＮＡ配列の特定を行った。
ブダペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、リンチカ ム、Ｍｄ（米国）に対し、１９８９年１２月７日にクローンＥＬＬ−０７を寄託 した。これは次のように同定される： ＬＩ−０７ 受託番号ＩＶＩ−１０２１８゜ ＶＣＡＭｌ　ｃＤＮＡの５−末端に相同ｅ７）　）２　ｐ　ラベルした３゜塩基 オリゴマープローブを用いて前記ＥＭＢＬ３ヒト染色体う・イブラリを１０−ブ することにより、ＶＣＡＭ１遺伝子を示すＥＭＢＬ３染色体クローンを単離した 。このクローンをＶＣＩ−１６とし、これをプダペスト条約により、イン・ビト ロ・インターナショナル・インコ、リンチヵム、Ｍｄ（米国）に対し、１９８９ 年１２月７日に寄託した。これは次のように同定される： Ｃｌ−１６ 受託１ｔＩＶＩ−１０２１７゜ ＶＣＡＭ１遺伝子の約３００ｂｐの５−フランク配列および９００ｂｐの５−末 端を含む領域を配列決定した（第１エクソン、第１イントロン、並びに第２エク ソンの一部を含む）、この配列を第８図に示す、５゛フランク配は、古典的なＴ ＡＴＡＡＡ配列および２つのＮＦ−にＢコンセンサス配列：転写開始から約−６ ３〜−５４からのセンス鏡上のＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣ２および約−６９〜−７８ からの逆相補鏡上のＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣを有する。この配列は、ＥＬＡＭＩプ ロモータ配列について提唱したものと類似する検討に使用し得る。
Ｋ１且Ｘ Ｌ生塁星旦旦■ ＣＤＸ、ＥＬＡＭＩ媒介付着に関与するＭＩＬＡを単離した。
最初の工程として、白血球細胞表面上で抗原を認識し、白血球−内皮細胞結合を 妨害するモノクローナル抗体を調製した。これらのモノクローナルが認識する抗 原がＥＬＡＭＩ媒介付着に関与することを確認するため、ＥＬＡＭＩ！介結合が 排重結合細胞−細胞結合経路である系でモノクローナルを試験した。
白血球−内皮細胞結合を阻害するＭｏａｂｓを同定するため、内皮細胞−白血球 付着を検出する改良したアッセイをＲ発した。
ＨＬ−６０細胞およびＨＵＶＥＣｓを使用してこのアッセイを行った６ＭＩＬＡ を発現するいずれかのセルラインを使用し、ＥＬＡＭを発現するいずれかのセル ラインを用いて、この種のアッセイを行うことができるのは明らかであろう、４ ８六Ｍ織培養プレート中で、ＨＵＶＥＣｓを群集に生育させた（８Ｘ１０４細胞 ／穴）、ＲＰＭＩ／１％ＦＣＳにより細胞を１回洗浄し、それぞれの穴に対して １３Ｕ／ｍｌのＩＬ−１βにより０．５ｍｌのＲＰＭＩ／１％ＦＣ３を添加した （コントロールの穴を除く）、これらの細胞を３７℃で４時間インキュベートし た。使用の直前にこれらをＲＰＭＩ／１％ＦＣ３により１回洗浄した。アッセイ に使用したＨＬ−６０細胞を１βＣｉ／ｍｌの３ゝＳ−メチオニンにより一部ラ ベルした。これらの細胞を１回洗浄した後、これらを５Ｘ１０’細胞／ｍｌでＲ ＰＭＩ／１％ＦＣ３中に再懸濁した。１００μｍのＨＬ−６０細胞を取り、５０ ．ｕｌのＭｏａｂ　（１βｇ／ｍｌ　＞を用いて０℃で３０分間これらをインキ ュベートした。その後それぞれの穴に対して１５０μｌのＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃｓを 添加した。２０℃で１０分間細胞を結合させた後、ＲＰＭＩ／１％ＦＣＳを用い て穴を穏やかに１回洗浄した。ＲＰＭＩ／１％ＦＣ３により穴を満たし、プレー トを封止し、これらを反転させ、５００Ｘｇで２分間これらを遠心した。培地を 除去し、ＰＢＳ−により更に２凹穴を洗浄した（ＰＢＳ”は、Ｃａ’“を含有せ ず、Ｍｇ”を含有しないＰＢＳである）、２００ｕｌの０．２ＮＮａＯＨ／１％ ＳＤＳによりそれぞれの穴中で細胞を可溶化し、４．５ｍｌのシンチラント（レ ディ・プロティン、ベックマン）を添加し、シンチレーション・カウンタでカウ ントすることにより、ＨＵＶＥＣｓに結合したＨＬ−６０！胞の数を測定した。
ｂ、ハイプリドーマの調 ＣＤＸに対するモノクローナル抗体を作成するため、次のようにしてハイブリド ーマを調製した。全体の生きたＨＬ−６０細胞を用いてＢＡＬＢ　Ｃマウスを注 射した。最初に、それぞれのマウスは腹膜内（ＩＰ）にＰＢＳ”中の２Ｘ１０’ 細胞を受けた。２〜２４時間後に異なる部位にて腹膜内に完全フレンドアジュバ ントを注射した。６週間に渡り、２ｙ１間毎に２×１０’＃Ｗ１１Ｐによりマウ スを補助装薬しな、融合４日前に、マウスに対し静脈内に５Ｘ１０’細胞、ＩＰ により５Ｘ１０’細胞を注射した。
前記した付着アッセイによりＩＬ−１β刺激ＨＵＶＥＣｓに対するＨＬ−６０！ 胞の結合を阻害する能力についてこれらの動物からの免疫血清を試験した。第３ 回の補助装薬後に免疫血清は試験の結果陽性となり、免疫した動物の膵臓細胞か らのハイプリドーマ生産を続けた。当業界で標準的な様式（ゴディング、工９８ ３参照ンで、胛Ｍａｌ胞とミエローマ細胞との融合を行った。
前記した付着アッセイを使用し、ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｓに対するＨＬ−６ ０細胞の結合を阻害するモノクローナル抗体を生産するものについてハイブリド ーマを検索した。このようにして、ＣＤＸを認識するモノクローナル抗体を生産 するバイプリドーマを同定した。これらのハイブリドーマの５つを使用して腹水 液を生産した。５ＧＢｓ　Ｂ４としたこれらの１つを、ブダペスト条約により、 イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、リンチカム、Ｍｄ＜米国）に対し 、１９８９年４月２５日に寄託した。これは次のように同定される： ５ＧＢＩ８４ 受託番号ＩＶＩ−１０２０５゜ Ｃ１旦込≦口し１近 いずれの種類の細胞に対してこのモノクローナルが結合するかを同定するため、 ＦＡＣ３分析を行った。これは、２×１０’細胞を取り、ＰＢＳ’によりこれら を１回洗浄し、その後２５μｍのＲＰＭ！、１％ＦＣＳ、Ｏ，１ｍｇ／ｍｌヒト ＩｇＧ、並びに０．１％アジ化ナトリウム中で０℃にて１０分間インキュベート することによりＦｃレセプタを遮断することを含む、その後抗体（１μｇ／ｍｌ で２５μｌ）を添加し、細胞を０℃で３０分間インキュベートした。２５０Ｘｇ で５分間細胞を遠心し、ｌＩ街液Ａ　（ＰＢＳ”　、５％ＦＣ３，０，１％アザ イド）によりこれらを２回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧを含有する２５ μｌの緩衝液Ａにこれらを再懸濁した。
フルオレセイン共役抗マウスＩｇＧ（緩衝液Ａ中に５μｇ／ｍ１で２５μｌ）（ キャベル）を添加し、混合物を０℃で３０分間インキュベートした。細胞を遠心 し、これらを緩衝液Ａにより１回洗浄し、これらを２５０μｍのｉｆ　ｍ液Ａに 再懸濁した。
その後、ベクトンーディキンノンＦＡＣＳター・セルソーターによりこれらを分 析した。
主としてＨＬ−６０＋１１１胞−ＨＵＶＥＣ付着アッセイについて記載したよう に、ＥＬＡＭＩ発現ＣＯ８細胞により細胞結合の検討を行った。
ＥＬＡＭ１媒介結合に関与するＭＩＬＡ＜特にＣＤＸ）について、ハイブリドー マＳ　Ｇ　Ｂ　ｓ　Ｂ　４由来のモノクローナルの特異的認識を示す証拠たる幾 つかのラインを開発した。
第１に、α−ＣＤＸ抗体は、ＣＤｘ′ｔｔ発現する細胞のＥＬＡＭＩ発現細胞へ の結合を阻害する筈である。付着アッセイを使用し、これらのモノクローナルが 、ＩＬ−１β誘導Ｈ１ＪＶＥＣｓおよびＥＬＡＭＩ発現ＣＯ３７細胞に対するＨ Ｌ−６０！胞およびＰＭＮｓの結合を実際に阻害することを示す、６０．３、β ２インテグリン鎖に対するモノクローナル抗体の存在下では、ＥＬＡＭＩ発現Ｃ Ｏ３７細胞中で利用されるＨＬ−６０細胞およびＰＭＮｓに対する唯一の結合経 路はＥ　Ｌ　ＡＭ　ｉ自体である。したがって、この系における細胞−細胞付着 の抗体阻害は、ＣＤＸを経由するＥＬＡＭ１経路を介する必要がある。
第２に、α−ＣＤＸモノクローナルは、付着アッセイにおいてＥＬＡＭ１発現細 胞に結合するこれらの細胞を認識する筈で。
あるが、このアッセイにおいてＥＬＡ、Ｍｌに結合しないこれらの細胞を認識し ない筈である。ＦＡＣ３分析を使用し、このＭｏ　ａｂ　ｓの結合パターンを決 定した。これらのモノクローナルは次の種類の細胞に結合した：ＨＬ−６０、Ｕ ９３７、ＨＴ−２９、ＴＨＰ−１，５Ｗ６２０．５Ｗ９４８．５Ｗ１４１７、単 球、エオシン好性細胞、並びにＰＭＮｓ、これらは次の細胞には結合しなかった ：　ＲＡＪ　ｌ、ＤＡＵＤＩ、ＲＡ　Ｍ　ＯＳ　、　Ｈｅ　Ｌ　ａ　、　＊たは ＪＹ、（末梢血液白血球を分画することにより非形質転換細胞を単離した。）こ れらの結合パターンは、これらの細胞のＥＬＡＭＩ発現ＣＯ３７細胞およびｒ　 ｓ　Ｅ　ＬＡＭ　１被覆プレートに対する結合と正確に平行したものである。
第３に、α−ＣＤＸモノクローナルは、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ４４、Ｉ ＣＡＭＩ並びにＣＤ４のような他の白血球細胞表面抗原に対するモノクローナル とは異なる認識パターンを示す筈である。実際、ここで考える他のモノクローナ ルには、本発明の抗体と同じ細胞認識パターンを示すものはな要は、ハイブリド ーマ５Ｇ８３Ｂ＝により、およびここで単離した他のハイブリドーマにより生産 されるモノクローナルがＣＤＸを認識することは明らかである。最終的に、これ らのモノクローナルを使用してＣＤＸ自体を単離しな。
１旌［ユ 以以及五１１ １、ＭＬ−６０４１！！　表　のヨウ素ＰＢＳ”によりｌＸ１０’ＨＬ−６０細 胞を３０洗浄し、これらを０．５ｍＩＰＢＳ−に再懸濁し、５ＯＡＬｇの１．３ ．４゜６−テトラクロロ−３α、６α−ジフエニルグリコウリル（シグマ・ケミ カルス社）により被覆したチューブにこれらを添加した。これに１ｍＣ１”’ｒ を添加した。この混合物を０℃で３０分間インキュベートした。ラベルした細胞 を１０ｍ１のＲＰＭ　ｒ／１０％ＦＣ５を含有するチューブに移し、１１０００ Ｘで５分間これらを遠心した。その後これらを最初に別の１０ｍ１のＲＰＭＩ／ １０％ＦＣ３により、次に２ｍｌのＰＢＳ”により洗浄した。（、ｔた、３５Ｓ −メチオニンまたは３ｓＳ−システィンを用いて細胞を代謝的にラベルした。） １％ＮＰ４０．２ｍＭＰＭＳＦ、ＬｍＭＥＤＴＡ、大豆トリプシンインヒビタ（ ５０ｍｇ／ｍｌ＞並びにロイペプチン（１ｍＭ）（シグマ・ケミカルス社）を含 有する１、０ｍｌのＰＢＳ”の添加により細胞を溶解した。その後これらを０℃ で３０分間インキュベートした。溶解物を１０分間１０．ＯＯＯＸｇで遠心して 粒子物を除去した。ｌＯμｇのウサギ抗マウスＩｇＭ＜ジャクンン・イムノ−リ サーチ・ラプス）および５０μｌの蛋白質Ａセファロース（ジムド、２ｍｇ蛋白 質Ａ／ｍりを用いて、０℃で２時間、ラベルしな可溶化膜蛋白質を含有する上澄 を予備清澄化した。溶解物を４℃で保存した。
２、Ω２に立又反盈澱 Ｍｏａｂｓ＠−使用してこれを免疫沈殿させるべく他のラベルした蛋白質からＣ ＤＸを精製した６次のようにして免疫沈殿を行った。
１０λのＡＲＸビーズを用いて４℃で２時間予備清澄化した溶解物（５０〜１０ ０μｍ）をインキュベートした。０，７５％ＮＰ４０．０．２％ＤＯＣ１並びに ＬｍＭＥＤＴＡを含有する２ｍｌのＰＢＳ”によりセファロースを４回洗浄した 。そのリアクリルアミドゲル上で分子を分離した。ゲルを乾燥し、これをオート ラジオグラフにかけた。
ＣＤＸは、約１５０ｋＤの分子量を有する単一の拡散バンドとしてオートラジオ グラフ上に現れた。
尺胤且工Ｉ ＣＤＸ　ローンの 実施例工の一般的手順に従い、２つの種類のＣＤＸ発現細胞、ＨＬ−６０細胞お よびＵ９３７細胞に由来するＰＣＤＭ８ベクタ中の２つのｃＤＮＡライブラリを 調製した。その後、最初に１μグラムのＨＬ−６，０ポリＡ十ｍＲＮＡ由来のｍ ａｐラベルｃＤＮＡグローブを創製することにより富化したＣＤＸｃＤＮＡライ ブラリを調製し、その後ＨｅＬａ４１Ｂ胞由来の３０μグラムのポリＡ十ｍＲＮ Ａ　（これはＣＤＸを発現しない）とハイブリダイズすることにより１０−プか ら非ＣＤＸｃＤＮＡ配列を減算した（デービス、１９８６参照）。
減算１０−プを使用してイー・コリｍ　ｃ　１０６１　Ｐ　３中でＨＬ−６０細 胞から富化したサブライブラリを創部し、２２の９６六プレート中で約２１００ クローンを生育させた。
ｖ９３７富化ＣＤＸサブライブラリを同様の様式で調製し、１４００のクローン を得た。
実施例■の一般的手順に従い、スフ二ロプラスト融合によりＣＯ３７細胞の感染 についてコロニーを２２のプールに分割した。シードとアルフォ（１９８７）の 方法により、ハイブリドーマ５ＧＣ２Ｅ５　（実施例Ｘで単離）からα−ＣＤＸ モノクローナル抗体を選別することによりＣＤＸ発現について感染Ｃｏ　Ｓ　７ Ｉｓ胞をアッセイした。アッセイの結果ブール＃７は陽性であり、２．１ｋｂｃ ＤＮＡ挿入物を有する２つのクローンを生成し、これを７．１および７．２とし た。
配列決定ベクタｐＮＮ１１にサブクローン化したＣＤＸｐＣＤＭ８クローン７． ２および７．２挿入物の一部から、マキサムとギルバート技術（１９８０）によ りＣＤＸのＤＮＡ配列を得た。後者のプラスミドをｐ　ＳＣ２１９とした。
得られたＤＮＡ配列を第９図に示す。
ブダペスト条約により、イン・ビトロ・インター・ナショナル・インコ、６１１ Ｐ、ハモンド・フェリーＲｄ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１９９０年４ 月２６日に１ラスミドＣＤＸｐＣＤＭ８クローン７．２を含有する培養物を寄託 した。
これは次のように同定される： ＣＤＸｐＣＤＭ８／イー・コリＭＣ１０６１Ｐ３受託番号ＩＶＩ−１０２４２゜ また、ＣＤＸ９ｏ−ン７．１および７．２をＣＯ３７ａ胞に感染させ、ＣＤＸの 発現を確認した。感染後４８時間で、これらの細胞は、ＦＡＣ３によるアッセイ によりα−ＣＤＸ抗体が結合するその細胞表面で蛋白質を発現した。この細胞表 面蛋白質は１２５Ｉによりラベルすることができ、免疫沈殿した。免疫沈殿した ダブレットのみかけの分子量は約１２５ｋＤだった。
また、ＣＤＸ発現ＣＯ３７，２はｒｓＥＬＡＭｌにより被覆したセファロースビ ーズの周囲にロゼツトを形成し、このロゼツト形成は陽イオン依存性であり、Ｂ Ｂｌｌ（抗ＥＬＡＭ１抗体）により阻害され、更にｐＣＤＭ８単独（挿入された ＣＤＸ遺伝子を有さない）により感染したＣＯ８＠胞は、ｒｓＥＬＡＭ１ビーズ にロゼツト形成しなかった。また、ＣＯ３７，２Ｍ胞は、ウシ血清アルブミンに より被覆したビーズにロゼツト形成しなかった。前記した事実は全てＣＤＸがＥ ＬＡＭｌについてのリガンドであることを示す。
ＣＤＸの推論されたアミノ酸配列の一次分析により、４０５アミノ酸部分（第９ 図のヌクレオチド６６〜１２８０）が示された。ＵＷＧＣＧ配列回折ソフトウェ アパッケージ（バージボン６．１．１９８９年８月）を使用し、他の蛋白質との 相同性につきプログラムＦＡＳＴＡを使用してＮＢＲＦ蛋白質データベース（解 放２３．１９８９年１２月）を検索した。また、ＴＦＡＳＴＡを使用して、ゲン バンク（解放６３．１９９０年３月）およびＥＭＢＬ（解放１９．１９８９年５ 月）を検索した。これらの検索で、ヘルペス・シンブレックス・ウィルス・タイ プ１、デングウィルス、黄熱および他のフラビウイルスを含む所定のウィルスエ ンベロープ蛋白質に対して相同の短い領域（例えば約２３７ミノＨ）を認めた。
一般に、公知の蛋白質に対する相同性は低く、ＣＤＸは新規な蛋白質であると結 論した。艮１叢又Ｉ ＶＣＡＭｌのＭＩＬＡｓを籾−る　体 全ＪｔＪＲＫＡＴ細胞により免疫した３匹のマウスからポリクローナル抗血清を 得た。１つのマウス由来の血清は、室温で４時間誘導ＨＵＶＥＣｓに対するＲＡ ＭＯ８およびＪＵＲＫＡＴ結合の両者を完全に阻害した。他の２つのマウス由来 の血清はＲＡＭＯ３を完全に阻害したが、同様の条件下でＪＵＲＫＡＴ結合を部 分的に阻害するのみであった。これらのデータは、ＲＡＭＯ３およびＪＵＲＫＡ ＴはＭＩＬＡを共有し、ＪｔＪＲＫＡＴはＲＡＭＯ３により共有されていない少 なくとも１つの他のＭＩＬＡを阻害することを示す。
リンパ球Ｍ　Ｉ　Ｌ　Ａｓに単するＭｏａｂｓを調製するため、全生存ＲＡＭＯ ３およびＪＵＲＫＡＴ＃胞に対してマウスを免疫し、前記実施例■に記載した様 式にて、ＪｔＪＲＫＡＴ免疫マウス由来の膣１ｊＡＩｉｌｌｌ胞とミエローマ細 胞との融合を行った。ＣＤＸに対するモノクローナル抗体を得るのに成功裡に使 用した実施例■に記載した方法により、得られたバイプリドーマを検索した。現 在まで、ＴＮＦにより２４時間処理したＨＵＶＥＣｓに対するＲＡＭ０９付着を 阻害する約２６０のハイブリドーマをコンディショニングした培地から検索した 。約２５のハイブリドーマが付着の一貫した部分的阻害を示し、現在これらは再 検索のためサブクローン化されている。この種の抗体は、リンパ球ＭＩＬＡｓの 単離およびクローン化の両者に使用することができる。
衷ａ ＶＬＡ４がＶＣＡＭ１’Ｊガントチ　る′本発明者および協力者は、ＶＬＡ４は ＶＣＡＭｌのリガンドであり、ＶＬＡ４はＶＣＡＭｌおよびフィブロネクチンに 対する別の結合部位を有することを示す幾つかの検討を行った。
最初に、ＶＬＡ４のサブユニットに対するモノクローナル抗体は、活性化ＨＵＶ ＥＣｓおよびＶＣＡＭｌにより感染したＣＯ３４ａ胞に対するＶＬＡ４発現細胞 の付着を阻害することを示した。ＶＬＡ４は、サブユニットβ１およびα４から 構成される（ヘムラー、１９８８）、β寡に対するＢＩＥＩＩとしたモノクロー ナル抗体、およびヤギ抗β１ヘテロ抗血清は、活性化ＨＵＶＥＣｓおよび感染Ｃ Ｏ８細胞に対するＲＡＭ０ＳＡＩ胞の付着を完全に阻害することを認めた。対照 の抗体は付着を阻害しなかった。更に、ＨＰ２／１としたα４サブユニツトに対 するモノクローナル抗体は、同様にこれらの細胞に対するＲＡＭＯ３の付゛着を 遮断した。同様に、これらの抗体は、ＶＬＡ４発現Ｔリンパ芽球セルラインＨＰ Ｂ−ＡＬＬの付着を阻害した。
次に、本来ＶＬＡ４を発現しない細胞をα４により感染することにより、これら をＶＣＡＭ１発現細胞に結合させることが可能なことを示す、２つのセットのに 一５６２赤白血病細胞を感染させた。１つのセットは、α４をコードするｃＤＮ Ａを用いて感染させた（タカダら、１９８９）、他は、ＶＬＡ４の一部ではない α２を用いて感染させた（タカダとヘムラー、１９８９）、α４により感染した に一５６２細胞は、かくしてＶＣＡＭＩ感染ｃｏｓｓ胞またはＴＮＦ活性化ＨＵ ＶＥＣｓのモルイヤに結合することが可能となったが、親に−５６２細胞および に一５６２α２感染ｍ胞は可能ではなかったことを示した。
更に、α４またはβ１に対するモノクローナル抗体は、これらのＶＣＡＭ１発現 細胞に対するα４感染に一５６２細胞（これは通常はβ１サブユニットを発現す る）の付着を排除した。
最近の検討により、ＶＬＡ４は、ＦＮＣ３−１部位を介してヒトプラズマフィブ ロネクチン（ＦＮ）に対する細胞付着を媒介することが示された（ワイナーら、 １９８９）、ＶＣＡＭＩに対するＶＬＡ４結合部位は、ＦＮに対するその結合部 位とは異なることを示した。ｉ初に、ＲＡＭＯ８細胞またはα４感染に一６５２ 細胞とＦＮ−４０（可溶性ＦＮ断片）との予備インキュベーションにより、ＦＮ −４０とのその結合が＠害されるが、ＶＣＡＭ１感染ｃｏｓＩｉＩＩ！胞または ＴＮＦα活性化ＨＵＶＥＣｓとでは阻害されないことを認めた０次に、ＶＬＡ４ 、ＨＰ１／３に対するモノクローナルは、感染ＣＯ８細胞または活性化ＨＵＶＥ Ｃｓに対するこれらの細胞の結合を阻害するが、ＦＮ−４０に対しては＠害しな いことを認めた。
合成有機化学物質、天然発酵生成物、ペプチド等のような可能な阻害剤を検索す る３つの基本的な付着アッセイにおいて、Ｅ　Ｌ　Ａ　Ｍ　ｓおよびそのリガン ドを使用することができる。
１、　−細　着アッセイ 第１のアッセイにより、細胞−細胞付着を阻害する分子の能力を試験し得る。こ のアッセイは、９６六マイクロタイタブレート中で行うことができる。最初に、 例えば実施例Ｖに記載したように、ＥＬＡＭを安定に発現するセルラインを創製 する。
その後、これらの細胞をプレートアウトし、ＨＬ−６０細胞を添加する。阻害剤 は、ＥＬＡＭ発現細胞に対するＨＬ−６０結合を阻害するその能力により同定す る。ＥＬＡＭリガンドに対するモノクローナル抗体を検索する際に記載したのと 全く同様にアッセイを行い得る。
害する低分子の能力を試験し得る。９６六マイクロタイタブレートで行うｒ　ｓ 　Ｅ　Ｌ　Ａ　Ｍ　１によるこの種のアッセイを開発した。
細菌性プラスチックからなるこれらのプレート（例えば、リンプロ／タイタテツ ク＃７６−２３２−０５、登録商標）を、５０μ！の１５ｍＭ炭酸ナトリウム／ 　３５　ｍ　Ｍ重炭酸ナトリウム、ＰＨ９，２中の穴当り０．５ｉμｇのｒｓＥ ＬＡＭｌにより、４℃で一部インキユベートする。その後１０ｍｇ／ｍｌのウシ 血清アルブミンを含有するＰＢＳによりこのプレートを室温で１時間ブロックし 、その後例えば六当り５０μｍのＨＬ−６０細胞、２Ｘ１０’／ｍ＋を使用し、 実施例■に記載したようにして付着アッセイを行う、これらの条件下で、ＨＬ− ６０細胞はｒｓＥＬＡＭｌに良好に結合し、検索に便利なマイクロアッセイを提 供する。プレートに対するＨＬ−６０結合を阻害するその能力により阻害剤を同 定し得る。その他、グローブとしてＥＬＡＭを安定に発現するセルラインを使用 し、このアッセイにおいてＥＬＡＭリガンドを使用することができる。
この範驕の他のアッセイは、それぞｔＬＥＬＡＭリカンドまたはＥＬＡＭを安定 に発現する細胞のモルイヤに対する可溶性ＥＬＡＭまたはＥＬＡＭリガンドの結 合を検定するものである。
この可溶性分子は、レポータ一群（例えば、放射能、蛍光プローブ、酵素等）に よりラベルし得る。
３、付　白　−・　白　アッセイ このアッセイは、ＥＬＡＭのそのリガンドに対する結合を阻害する低分子の能力 を検定するものである。可溶性形態の２つの分子、例えば可溶性ＥＬＡＭを９６ 六マイクロタイタブレートの穴に固定化し、この対の曲の構成員、例えばレポー タ一群によりラベルしたＥＬＡＭリガンドの結合により付着を測定する。
これらの３つのアッセイのいずれにおいても、付着を阻害するその能力によって 阻害剤を検出する。
Ｘ１皿１− ＶＣＡＭＩ／　グロブリン 発現に際してｒｓＶＣＡＭ１／免疫グロブリン融合蛋白質を生産するＤＮＡ配列 を調製した。このＤＮＡ配列は、５゛から３°に、ＶＣＡＭＩドメイン１〜３お よびＩ　ｇ　Ｇ　Ｈ重鎖遺伝子の一定領域を含む。
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により、第３図のヌクレオチド１０３５を介して ＶＣＡＭ１ドメイン１〜３を含有するＤＮＡＵｒ片を生産したＣサンブロックら 、１９８９）、３−−５−プライマは、配列５°ＧＡ　ＧＣＴ　ＣＧＡ　ＧＧＣ ＣＧＣＡＣＣＡＴＧ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＡＴＧを有する。
これは第３図のヌクレオチド１００〜１１４に相補的であり、ＶＣＡＭ１開始コ ドンおよびＸｈｏＩおよびＮｏｔＩについての認識部位を含有する。５〜−３− プライマは、配列５−ＣＴＡＧＣＴＡＧ　ＣＧＣＧＴＴ　ＴＴＡ　ＣＴＴ　ＣＡ Ｃを有する。これはドメイン３の末端で第３図のヌクレオチド１０１６〜１０３ ５に相補的であり、ＮｈｅＩ認識部位を含有する。これらのプライマを使用し、 ＡＭｐｃＤＭ８クローン４１のＶＣＡＭ１コード領域を含有するプラスミドから 断片を増幅した。このプロセスの生成物は、ＶＣＡＭ１ドメイン１〜３をコード するＤＮＡ配列であった。ＸｈｏＩおよびＮｈｅｌによりこのＤＮＡｌＪｉ片を 消化し、次のようにして作成しなｐＡＢ５３にこれを挿入しな。
Ｓａｌ工によりｐＪＯＤ−５（実施例■）を消化し、ヒトｒｓＣＤ４をコードす るｃＤＮＡ配列を挿入した。このプラスミドをｐＪＯＤ−ｒｓＴ４と呼ぶことと した。Ｐｖｕ［および５ｐｈＩによりｐＪＯＤ−ｒｓＴ４を部分消化し、ＤＨＦ ＲｃＤＮＡの転写を調節するＳＶ４０プロモータ中の２つのＳＶ４０エンハンサ リピートを含む断片を欠損させた。プラスミドを再連結し、これをｐＪＯＤ−ｒ ｓＴ４デルタＥとした。その後、Ｎｈｅ”ｆ−およびＮｏｔ工によりＰＪＯＤ− ｒｓＴ４デルタＥを消化し、２つのＤＮＡ断片を挿入した。ｆｉ初に５−ｍＲＮ Ａスプライス部位を含むＮｈ　ｅ　Ｉ−Ｈｉ　ｎｄｌｌＩリンカ、次にＩｇＧ重 鎖遺伝子の一定領域をコードするＤＮＡ断片である。これらの断片を次のように して得た。
次の配列を有するＮｈｅｌ−Ｈｉｎｄｌ［ｒリンカを合成した：。
５゛スゲライス ５“ＣＴＡ　ＧＧＴ　ＴＴＣＣＡＡ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＴＣＣＴ八　３′３’　 ＧＡ　ＡＡＧ　ＧＴＴ　ＣＣＡ　ＣＴＣＡＧＧ　ＡＴＴ　ＣＧＡ５’ＩｇＧ重鎮 遺伝子のＤＮＡ配列はエリノンら（１９８Ｌ２）に記載されている。ＥＭＢＬ３ ヒト染色体ライブラリ（実施例■）からオリゴヌクレオチドプローブを使用して この遺伝子の断片を単離した。Ｈｔ　ｎｄｌｌおよびＮｏｔ工によりこの断片を 消化し、一定の重ドメインおよび随伴するイントロンを含む断片を単離した。
これらの２つの断片をｐＪＯＤｒｓＴ４デルタＥに連結し、得られたグラスミド をｐＡ８５３と呼ぶこととした。ＸｈｏｌおよびＮｈｅＩによりｐＡＢ５３を消 化し、ｒ　ｓ　Ｔ　４コード領域を欠損させた。この場所に、ＶＣＡＭＩドメイ ン１〜３をコードするＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ断片を挿入した。このプラスミドをＶ ＣＡＭＩ　ＩｇＧ＋と呼ぶこととした。
ｒｓＶｃＡＭ１／ＩｇＧ融合蛋白質を、このプラスミドを使用して発現させた。
安定した発現のため、このグラスミドをＣＨＯ細胞に感染させた。この遺伝子の 転写後、ｍＲＮＡをスプライスしてイントロンを除去し、翻訳の際に、細胞はｒ ｓＶＣＡＭ−Ｉ　ｇＧ融合蛋白質を生産した。
ここで、ＶＣＡＭｌに対するアンチセンス核酸および誘導されたＨＵＶＥＣｓに おけるＶＣＡＭ１発現を阻害するその能力を試験する方法を記載する。アンチセ ンス核酸についての有効な核酸配列は、ｍＲＮＡのコード領域、更に詳しくは開 始コドンＡＵＧ、ｔたはスプライス部位に相補的なものである（マルクスーセク ラ、１９８８）。また、約１５ヌクレオチドのオリゴマが最も好適である。よっ て、ＶＣＡＭｌに対する最も有効なアンチセンス核酸は、ＤＮＡ配列５−ＣＣＣ ＡＧＧ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　ＡＡＧを有するオリゴマである。これは、第３図のヌ クレオチド９４〜１０８に結合し得る（アンチセンス開始コドン）、このＤＮＡ 配列は、例えば自動ＤＮＡ合成装置によって合成される。
このアンチセンス核酸のＶＣＡＭ１発現を阻害する能力は次のようにして試験す る。４ｆｌｌ胞生育に使用する血清を６０℃で３０分間熱失活させてヌクレアー ゼを失活させる以外は、実施例Ｖと同様にしてＨＵＶＥＣｓを群集に生育させる 。４〜４８時間、１０μＭ〜１００μＭの濃度で、最も好ましくは細胞生存性に 影響を与えない最も高い濃度で、オリゴマを用いて細胞を予備インキュベートす る。これらの範囲は、有効な阻害のために必要である（マルクスーセクラ、１９ ８８、ベラカーら、１９８９）、その後、ＨＵＶＥＣｓをＬｏｎｇ／ｍ１ＴＮＦ により処理してＶＣＡＭｌを誘導する。約４時間後、細胞の表面上のＶＣＡＭＩ の存在を付着アッセイにより試験する。
Ｋ胤且工ｊ Ｖ　ＣＡ　Ｍ　１　ｍ　ＲＮ　Ａ　’Ｉ：　ｔ　るハンマーへラドリボ　イム次 のようにしてハセルホフとゲーラー（１９８８）の規則に従い、ＶＣＡＭｌｍＲ ＮＡを認識するハンマーヘッド型すボザイムをを調製する。最初に、標的ｍＲＮ Ａ上の開裂部位を同定する。ハンマーへッドリボザイムは、配列５−ＧＵＸ（Ｘ はいずれかのヌクレオチドである）の後を開裂する。ＶＣＡＭｌｍＲＮＡのコー ド領域中のこの配列の最初の例は、６番目のコドン、５−ＡＵＧ　ＣＣＵ　ＧＧ Ｇ　ＡＡＧ　ＡＵＧ　ＧＵＣＧＵＧ　ＡＵＣＣＵＵである。Ｗｌ切な認識配列に は、開裂部位の側面に位置する５−および３゛領域の約６のヌクレオチドか包含 される。開裂部位を含む１８塩基の認識配列は、５−ＡＡＧ　ＡＵＧ　ＧＵＣＣ ＵＧ　ＡＵＣＣＵＵである。
その後、認識配列および触媒「ハンマーヘッド」の配列を含むリボザイムについ てＲＮＡ配列を設計する。この種の配列は、５°ＡＡＧ　ＧＡＵ　ＣＡＣ［ＣＵ ＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧＧＡＣＧＡＡ］ＡＣＣＡＵ　ＣＵｔＪである。括 弧内の配列は、触媒「ハンマーヘッド」および５゛および３−フランク配列を生 成し、認識部位に相補的で、これに結合する。同様の方法で、より短い認識配列 またはＶＣＡＭｌｍＲＮＡの他の開裂部位についてのものまたは他のＥＬＡＭま たはＥＬＡＭリガンドｍＲＮＡについてのものを設計し得る。
乱１豆Ｘ旦 ＥＬＡＭＩＩガントを：　る　イディオタイプＨＬ−６０ｍ胞上のＥＬＡＭｌの リガンドに結合する抗ＥＬＡＭＩ抗体に対する抗イデイオタイプ抗体を調製しな 、完全フレンドアジュバント中で１：１に乳化した蛋白質Ａ精製ＣＤＢ。
ＢＢＩ　１．ＢＣ６モノクローナル（実施例Ｖ）によりウサギを免疫した。免疫 後２６日に、ウサギを採血し、ＦＡＣ３を使用して特異的抗体について抗血清を 分析した。ＨＬ−６０！胞（ＥＬＡＭＩのリガンドを発現する）またはＲＡＭＯ ８細胞（発現しない）を用いて抗体調製物をインキュベートした。この抗体調製 物は、）（Ｌ−６０４Ｊ胞に特異的に結合したが、ＲＡＭ０３Ｍ胞には結合しな いことを認め、これはＥＬＡＭ１リガンドを認識する抗体を含有することが示さ れた。対照抗血清は、いずれのセルラインとも反応しなかった。
ｘ１皿工］ 様である）の結合は、ＥＬＡＭＩ、ＶＣＡＭＩ、および／まなはＩＣＡＭＩに至 る特定のＭｏａｂｓ経路によっては遮断されない、しかしながら、Ｕ９３７結合 は、ＣＤ２９、β１インテグリン・サブユニットに対するモノクローナル抗体に よって遮断される。このことから、β１インテグリンを介して白血球と相互作用 するＨＵＶＥＣｓ上の新たな付着分子の存在が推定される。この新たな分子はＶ ＣＡＭｌに類似する時間経過により誘導され、誘導後４８時間最大レベルを維持 する。２．５時間ＩＬ−１誘ＷＨＵＶＥＣ減算サブライブラリについて先に記載 した方法を使用し、４８時間ＴＮＦ処理ＨＵＶＥＣｓから減算ライブラリを作成 した。先に記載した直接発現手順を使用し、新たな分子のクローン化を試みてい るところである。
この発明の多数のＢ８をここに記載したが、当業者であれば本発明の手順を改変 して、この発明の方法および組成物を利用する他の態様を提供し得ることは明ら かである。したがって、この発明の範囲はここに添付する請求の範囲により特定 され、例として示した特定の態様によらないことが銘記されよう。
」ＩＬ（献 ｐｐ、３２ニー３３　（１９８８） ｐｐ、３６５−６９　（１９６７） ”ｔＰＰ、　ココ６５−６９　（１９８７）Ｌ、　ｐｐ、Ｅ１５４−６４　（１ ９Ｂ１）江ｌ豊丘崖Ｉ Ｆ工ＧＵＲＥ　ＩＡ Ｆ工ＧＵＲＥ　ＩＢ Ｆ工ＧＵＲＥ　Ｉｃ ＦＹＧＵＲＥ　ＩＤ Ｆ工ＧＵＲＥ　３Ａ Ｆ’工ＧＵＲＥ　３Ｂ Ｆ’工ＧＵＲＥ　３Ｃ Ｆ工ＧＯＲＥ　：］ｌ’） ＦＩＧＵＲＥ　４八 ＦＩＧＵＲＥ　４Ｂ ＦＩＧＵＲＥ　４Ｃ ＦＩＧＵＲＥ　４Ｄ ロｏｏｏｏｏ　ｏ　ｏ　ロ　ロ　ロロｅ３６　ロー　Ｎ　内　彎　−〇　−・　 ・　ロ　−　へ　ＩＩＩ　苛　−ＦＩＧＵＲＥ　９Ａ ＦＩＧＵＲＥ　９Ｂ ＦＩＧＵＲＥ　９Ｃ 国際調査報告 ＦＯＲＭ　２１０　１ｓ＊ｃｏｎｄ　５ｈｏｅセｌ　ＰＡＲＴ　Ｘ５３０７３０ ０，３５０，３８７，３８９，３９１，８０８，８０９゜Ｃｌ２Ｎ　１５１００ ，１５１０３−０７．ｉｓ／１２１　Ｃ１２０１１０２ＪＧＯＩＮ　３３１５３ ６．　３３１５４３．３３１５６６、　３３１５１１ＦＩＥＬＤＳ　５ＥＡＲＣ ＢＥＤ　−ＭＺＮＩＭＬＩＭ、、、−ＰＡＲＴ　Ｈ５３０／３００，３５０，３ ８７，３８９，３９１，８０８，８０９゜５３６／２フ ＾６１Ｋ　３１／７０，３７１０２，３９／３９５，４８１００，４９１００， ４９１０２゜ＤＯＣＵＭＥＩｌ？ＡＴＩＯＭ　５ＥＡＲＣＨＥＤ　０ＲＴ）ＩＥ ＲＴＨＡＮ　ＭＩＮＩＭＵ１４．、。
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Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）ヌクレオチド番号１４１から番号１９７０までの第１図におけるＥＬ ＡＭ１ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号１４４から番号１９７０までの第１図におけるＥＬＡＭ １ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＥＬＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号２０４から番号１９７０までの、必要に応じその５′末 端にＡＴＧ開始コドンを含む第１図のＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、（ｆ）標準ハイブリッド化条 件下で前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化するＤＮＡ配列、および（ｇ ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列を発現に際しコー ドするＤＮＡ配列よりなる群から選択される内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡ Ｍ）もしくはその断片をコードするＤＮＡ配列。 ２．内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）もしくはその断片をコードするＤＮ Ａ配列からなり、前記ＤＮＡ配列は（ａ）ヌクレオチド番号１４１から番号１９ ７０までの第１図におけるＥＬＡＭ１ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号１４４から番号１９７０までの第１図におけるＥＬＡＭ １ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＥＬＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号２０４から番号１９７０までの、必要に応じその５′末 端にＡＴＧ開始コドンを含む第１図のＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、（ｆ）標準ハイブリッド化条 件下で前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化するＤＮＡ配列、および（ｇ ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列を発現に際しコー ドするＤＮＡ配列よりなる群から選択されることを特徴とする組換ＤＮＡ分子。 ３．前記ＤＮＡ配列が発現制御配列に作用結合してなる請求の範囲第１項に記載 の組換ＤＮＡ分子。 ４．前記発現制御配列がＳＶ４０もしくはアデノウイルスの早期もしくは後期プ ロモータ、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主オペレー タおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、３−ホスホグリセレート キナーゼのプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータおよび酵母α−接合因子 のプロモータよりなる群から選択される請求の範囲第３項に記載の組換ＤＮＡ分 子。 ５．プラスミドＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６からなる請求の範囲第３項に記載 の組換ＤＮＡ分子。 ６．内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）をコードするＤＮＡ配列もしくはそ の断片からなり、前記ＤＮＡ配列は（ａ）ヌクレオチド１４１から番号１９７０ までの第１図におけるＥＬＡＭ１ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号１４４から番号１９７０までの第１図におけるＥＬＡＭ １ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＥＬＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号２０４から番号１９７０までの、必要に応じその５′末 端にＡＴＧ開始コドンを含む第１図のＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、（ｆ）標準ハイブリッド化条 件下で前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化するＤＮＡ配列、および（ｇ ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列を発現に際しコー ドするＤＮＡ配列よりなる群から選択され、しかも前記ＤＮＡ配列が発現制御配 列に作用結合してなる組換ＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主。 ７．前記発現制御配列がＳＶ４０もしくはアデノウイルスの早期もしくは後期プ ロモータ、１ａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主オペレー タおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、３−ホスホグリセレート キナーゼのプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータおよび酵母α−接合因子 のプロモータよりなる群から選択される請求の範囲第６項に記載の単細胞宿主。 ８．プラスミドＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６からなる請求の範囲第６項に記載 の形質転換宿主。 ９．単細胞宿主がイー・コリ、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、 酵母、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、Ｂ ＳＣ４０およびＢＭＴ１０細胞、組織培養における植物細胞、昆虫細胞およびヒ ト細胞よりなる群から選択される請求の範囲第６項に記載の形質転換宿主。 １０．請求の範囲第７項に記載の形質転換宿主を培養することを特徴とするＥＬ ＡＭ１の産生方法。 １１．第７図のヌクレオチド配列から誘導されるサイトキン−誘発性発現制御配 列。 １２．第７図のヌクレオチド７４０〜１３０７からなる請求の範囲第１１項に記 載のサイトキン−誘発性発現制御配列。 １３．ＥＬＡＭ１、ＥＬＡＭ１のレクチン状ドメイン、ＥＬＡＭ１のＥＧＦ状ド メイン、ＥＬＡＭ１の一致システイン反復単位、可溶性ＥＬＡＭ１、成熟ＥＬＡ Ｍ１およびＥＬＡＭ１リガンドに結合しうるＥＬＡＭ１断片よりなる群から選択 される常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＥＬＡＭもしくはその断片。 １４．アミノ酸番号２２（Ｔｒｐ）からアミノ酸番号６０９（Ｌｅｕ）までの、 必要に応じＮ−末端メチオニン残基を含む第１図のアミノ酸配列からなる請求の 範囲第１３項に記載の分子。 １５．ハイブリドーマＣＤＢ．ＢＢ１１．ＢＣ６抗−ＥＬＡＭ１。 １６．ハイブリドーマＣＤＢ．ＢＢ１１．ＢＣ６抗−ＥＬＡＭ１により産生され るモノクローナル抗体。 １７．ＥＬＡＭ１もしくはその断片のためのＭＩＬＡをコードするＤＮＡ配列。 １８．（ａ）ヌクレオチド６６〜１２８０の第９図におけるＣＤＸＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド６９〜１２８０の第９図におけるＣＤＸＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＣＤＸアミノ酸配列をコードするＣＤＸＤＮＡ配列、 （ｄ）可溶性ＣＤＸアミノ酸配列をコードするＣＤＸＤＮＡ配列、 （ｅ）標準ハイブリッド化条件下に前記ＣＤＸＤＮＡ配列のいずれかにハイブリ ッド化するＤＮＡ配列、（ｆ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるア ミノ酸配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択される請求の 範囲第１７項に記載のＤＮＡ配列もしくはその断片。 １９．ＭＩＬＡがＥＬＡＭ１リガンドである請求の範囲第１７項に記載のＤＮＡ 配列。 ２０．ＥＬＡＭ１もしくはその断片のためのＭＩＬＡをコードするＤＮＡ配列か らなる組換ＤＮＡ分子。 ２１．ＤＮＡ配列が、 （ａ）ヌクレオチド６６〜１２８０の第９図におけるＣＤＸＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド６９〜１２８０の第９図におけるＣＤＸＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＣＤＸアミノ酸配列をコードするＣＤＸＤＮＡ配列、 （ｄ）可溶性ＣＤＸアミノ酸配列をコードするＣＤＸＤＮＡ配列、 （ｅ）標準ハイブリッド化条件下に前記ＣＤＸＤＮＡ配列のいずれかにハイブリ ッド化するＤＮＡ配列、（ｆ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるア ミノ酸配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択される請求の 範囲第２０項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ２２．ＭＩＬＡがＥＬＡＭ１リガンドである請求の範囲第２０項に記載の組換Ｄ ＮＡ分子。 ２３．前記ＤＮＡ配列が発現制御配列に作用結合されてなる請求の範囲第２０項 に記載の組換ＤＮＡ分子。 ２４．ＥＬＡＭ１もしくはその断片のためのＭＩＬＡをコードするＤＮＡ配列か らなる組換ＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主。 ２５．ＭＩＬＡがＣＤＸである請求の範囲第２４項に記載の単細胞宿主。 ２６．ＭＩＬＡがＥＬＡＭ１リガンドである請求の範囲第２４項に記載の単細胞 宿主。 ２７．イー・コリ、シュードそナス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、ＣＨ Ｏ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、 ＢＭＴ１０細胞、組織培養における植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞よりなる 群から選択される請求の範囲第２４項に記載の単細胞宿主。 ２８．常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＥＬＡＭ１もしくはその断片の ためのＭＩＬＡ。 ２９．ＣＤＸからなる請求の範囲第２８項に記載のＭＩＬＡ。 ３０．第９図に示したアミノ酸配列を有する請求の範囲第２８項に記載のＭＩＬ Ａ。 ３１．ＥＬＡＭ１に結合する請求の範囲第２８項に記載のＭＩＬＡの断片。 ３２．前記断片が可溶性ポリペプチドである請求の範囲第３１項に記載のＭＩＬ Ａ断片。 ３３．ハイブリッドーマＳＧＢ３Ｂ４。 ３４．ハイブリッドーマＳＧＢ３Ｂ４により産生されるモノクローナル抗体。 ３５．ＥＬＡＭ１のためのＭＩＬＡに対し反応性であるが、白血球細胞表面にお ける他の蛋白には反応性でない抗体調型物。 ３６。ＭＩＬＡがＣＤＸである請求の範囲第３５項に記載の抗体調製物。 ３７．実質的にモノクローナル抗体よりなる請求の範囲第３５項に記載の抗体調 製物。 ３８．生物をＣＤＸもしくはその抗原性断片で免疫化することを特徴とするＥＬ ＡＭ１のためのＭＩＬＡに対し反応性の抗体調製物の製造方法。 ３９．（ａ）ヌクレオチド番号１０７から番号２０４７までの第３図におけるＶ ＣＡＭ１ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号１１０から番号２０４７までの第３図におけるＶＣＡＭ １ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＶＣＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号１７９〜２０４７の、必要に応じその５′末端にＡＴＧ 開始コドンを含む第３図のＶＣＡＭｌＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＶＣＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、（ｆ）ヌクレオチド番号１０ ０〜番号２３１６の第４図におけるＶＣＡＭ１ｂＤＮＡ配列、 （ｇ）ヌクレオチド番号１０３〜番号２３１６までの第４図におけるＶＣＡＭ１ ｂＤＮＡ配列、 （ｈ）成熟ＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｉ）可溶性ＶＣＡＭ１ｂをコードするＤＮＡ配列、（ｊ）ヌクレオチド番号１ ７２〜番号２３１６までの、必要に応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む 第４図のＶＣＡＭ１ｂＤＮＡ配列、 （ｋ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化 するＤＮＡ配列、（ｌ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸 配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択される内皮細胞−白 血球付着分子もしくはその断片をコードするＤＮＡ配列。 ４０．内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）もしくはその断片をコードするＤ ＮＡ配列からなり、前記ＤＮＡ配列は （ａ）ヌクレオチド番号１０７から番号２０４７までの第３図におけるＶＣＡＭ １ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号１１０から番号２０４７までの第３図におけるＶＣＡＭ 工ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＶＣＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号１７９〜２３１６の、必要に応じその５′末端にＡＴＧ 開始コドンを含む第４図のＶＣＡＭｌＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＶＣＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、（ｆ）ヌクレオチド番号１０ ０〜番号２３１６の第４図におけるＶＣＡＭ１ｂＤＮＡ配列、 （ｇ）ヌクレオチド番号１０３〜番号２３１６までの第４図におけるＶＣＡＭ１ ｂＤＮＡ配列、 （ｈ）成熟ＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｉ）可溶性ＶＣＡＭ１ｂをコードするＤＮＡ配列、（ｊ）ヌクレオチド番号１ ７２〜番号２３１６までの、必要に応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む 第４図のＶＣＡＭ１ｂＤＮＡ配列、 （ｋ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化 するＤＮＡ配列、（１）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸 配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択される組換ＤＮＡ分 子。 ４１．前記ＤＮＡ配列が発現制御配列に作用結合されてなる請求の範囲第４０項 に記載の組換ＤＮＡ分子。 ４２．前記発現制御配列がＳＶ４０もしくはアデノウイルスの早期もしくは後期 プロモータ、１ａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主オペレ ータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、３−ホスホグリセレー トキナーゼのプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータおよび酵母α−接合因 子のプロモータよりなる群から選択される請求の範囲第４１項に記載の組換ＤＮ Ａ分子。 ４３．プラスミドＡＭｐＣＤＭ８クローン４１またはプラスミドＶＣＡＭ１ｂク ローン１Ｅ１１ｐＣＤＭ８からなる請求の範囲第４１項に記載の組換ＤＮＡ分子 。 ４４．内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）もしくはその断片をコードするＤ ＮＡ配列からなり、前記ＤＮＡ配列は （ａ）ヌクレオチド番号１０７から番号２０４７までの第３図におけるＶＣＡＭ １ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号１１０から番号２０４７までの第３図におけるＶＣＡＭ １ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＶＣＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号１７９〜２３１６の、必要に応じその５′末端にＡＴＧ 開始コドンを含む第４図のＶＣＡＭｌＤＮＡ配列、 （ｃ）可溶性ＶＣＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、（ｆ）ヌクレオチド番号１０ ０〜番号２３１６の第４図におけるＶＣＡＭ１ｂＤＮＡ配列、 （ｇ）ヌクレオチド番号１０３〜番号２３１６までの第４図におけるＶＣＡＭ１ ｂＤＮＡ配列、 （ｈ）成熟ＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸を列をコードするＤＮＡ配列、 （ｉ）可溶性ＶＣＡＭ１ｂをコードするＤＮＡ配列、（ｊ）ヌクレオチド番号１ ７２〜番号２３１６までの、必要に応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む 第４図のＶＣＡＭ１ｂＤＮＡ配列、 （ｋ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化 するＤＮＡ配列、（１）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸 配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択され、しかも前記Ｄ ＮＡ配列が発現制御配列に作用結合されてなる組換ＤＮＡ分子により形質転換さ れた単細胞宿主。 ４５．組換ＤＮＡ分子がプラスミドＡＭｐＣＤＭ８クローン４１またはクローン ＶＣＡＭ１ｂｐＣＤＭ８クローン１Ｅ１１からなる請求の範囲第４４項に記載の 単細胞宿主。 ４６．イー・コリ、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、ＣＨ Ｏ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０お よびＢＭＴ１０、組織培養における植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞よりなる 群から選択される請求の範囲第４４項に記載の単細胞宿主。 ４７．請求の範囲第４４項に記載の単細胞宿主を培養することを特徴とするＶＣ ＡＭ１の産生方法。 ４８．常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ ｂまたはその断片。 ４９．ＶＣＡＭ１のドメイン１、ＶＣＡＭ１のドメイン２、ＶＣＡＭ１のドメイ ン３、ＶＣＡＭ１のドメイン４、ＶＣＡＭ１のドメイン５、ＶＣＡＭ１のドメイ ン６、ＶＣＡＭ１ｂのドメイン３、ＶＣＡＭ１ｂのドメイン３Ｂ、ＶＣＡＭ１ｂ のドメイン４およびその組合せよりなる群からから選択されるＶＣＡＭ１もしく はＶＣＡＭ１ｂポリペプチド。 ５０．アミノ酸番号２５からアミノ酸番号６４７までの、必要に応じＮ−末端メ チオニン残基を含む第３図のアミノ酸配列からなる請求の範囲第４８項に記載の ＶＣＡＭ１。 ５１．ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂに対し反応性であるが、内皮細胞表面上 で発現される他の付着分子に対し反応性でない抗体調製物。 ５２．前記抗体調製物が実質的にモノクローナル抗体よりなる請求の範囲第５１ 項に記載の抗体調製物。 ５３．ＶＣＡＭ１を認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ。 ５４．生物をＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂまたはその抗原性断片で免疫化す ることを特徴とするＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂを認識する抗体の産生方法 。 ５５．（ａ）分子をＥＬＡＭまたはＥＬＡＭ発現性細胞と接触させて第１混合物 を作成し、 （ｂ）前記第１混合物をＥＬＡＭリガンドまたはＭＩＬＡ発現性細胞と接触させ て第２混合物を作成し、（ｃ）前記第２混合物を、前記ＥＬＡＭリガンドもしく はＭＩＬＡ−発現性細胞に結合した前記ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ発現性細胞の 量につき試験することを特徴とする内皮細胞に対する白血球の結合を阻止する分 子の同定方法。 ５６．（ａ）分子をＥＬＡＭリガンドまたはＭＩＬＡ発現性細胞と接触させて第 １混合物を作成し、（ｂ）前記第１混合物をＥＬＡＭまたはＥＬＡＭ発現性細胞 と接触させて第２混合物を作成し、（ｃ）前記第２混合物を、前記ＥＬＡＭもし くはＥＬＡＭ発現性細胞に結合した前記ＥＬＡＭリガンドもしくはＥＬＡＭ発現 性細胞の量にっき試験することを特徴とする内皮細胞に対する白血球の結合を阻 止する分子の同定方法。 ５７．ＥＬＡＭがＥＬＡＭ１である請求の範囲第５５項または第５６項に記載の 方法。 ５８．ＥＬＡＭリガンドがＥＬＡＭ１リガンドである請求の範囲第５５項または 第５６項に記載の方法。 ５９．ＭＩＬＡがＣＤＸである請求の範囲第５５項または第５６項に記載の方法 。 ６０．ＥＬＡＭがＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂである請求の範囲第５５項ま たは第５６項に記載の方法。 ６１．ＭＩＬＡがＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂリガンドである請求の範囲第 ５５項または第５６項に記載の方法。 ６２．ＭＩＬＡがＶＬＡ４である請求の範囲第５５項または第５６項に記載の方 法。 ６３．白血球と内皮細胞との間の付着をこれらを含有する系にて阻止するに際し 、有効量の阻止剤を前記系に導入し、前記阻止剤をＥＬＡＭリガンドに結合しう るＥＬＡＭもしくはその断片、ＭＩＬＡを認識する抗体、ＥＬＡＭに結合しうる ＥＬＡＭリガンドもしくはその断片、ＥＬＡＭに結合する炭水化物、およびＥＬ ＡＭを認識する抗体よりなる群から選択する白血球と内皮細胞との間の付着の阻 止方法。 ６４．阻止剤が、ＥＬＡＭ１のレクチン状ドメイン、ＥＬＡＭ１のＥＧＦ状ドメ イン、ＥＬＡＭ１の一致システイン反復単位、および可溶性ＥＬＡＭ１よりなる 群から選択されるＥＬＡＭ１もしくはＥＬＡＭの断片である請求の範囲第６３項 に記載の方法。 ６５．阻止剤が、ＥＬＡＭ１リガンドを認識するモノクローナル抗体の調製物で ある請求の範囲第６３項に記載の方法。 ６６．阻止剤が、ＣＤＸを認識するモノクローナル抗体である請求の範囲第６３ 項に記載の方法。 ６７．モノクローナル抗体がハイプリドーマＳＧＢ３Ｂ４により産生されるもの である請求の範囲第６６項に記載の方法。 ６８．前記阻止剤が、ＥＬＡＭ１に結合しうるＥＬＡＭ１リガンドもしくはその 断片である請求の範囲第６３項に記載の方法。 ６９．阻止剤が、ＥＬＡＭ１を認識するモノクローナル抗体である請求の範囲第 ６３項に記載の方法。 ７０．モノクローナル抗体がハイプリドーマＣＤＢ．ＢＢ１１．ＢＣ６抗一ＥＬ ＡＭ１により産生されるものである請求の範囲第６９項に記載の方法。 ７１．前記阻止剤をＶＬＡ４に結合するＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１ｂおよびその断 片よりなる群から選択する請求の範囲第６３項に記載の方法。 ７２．前記阻止剤が、ＶＣＡＭ１リガンドを認識するモノクローナル抗体である 請求の範囲第６３項に記載の方法。 ７３．前記阻止剤が、ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂに結合するＶＣＡＭ１リ ガンドもしくはその断片である請求の範囲第６３項に記載の方法。 ７４．ＶＣＡＭ１リガンドがＶＬＡ４である請求の範囲第７３項に記載の方法。 ７５．前記阻止剤が、ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂを認識するモノクローナ ル抗体である請求の範囲第６３項に記載の方法。 ７６．ＥＬＡＭリガンド、ＥＬＡＭリガンドのＥＬＡＭ結合性断片、およびＥＬ ＡＭを認識する抗体よりなる群から選択される検出自在に標識された化合物を投 与することを特徴とする炎症の検出方法。 ７７．（ａ）血液、血清もしくは他の体液の試料を検出自在に標識されたＥＬＡ Ｍリガンド、ＥＬＡＭリガンドのＥＬＡＭ結合性断片またはＥＬＡＭを認識する 抗体と接触させて混合物を作成し、 （ｂ）前記混合物をＥＬＡＭリガンド、ＥＬＡＭリガンドのＥＬＡＭ結合性断片 もしくはＥＬＡＭに結合した抗体の量につき試験する ことを特徴とする炎症の検出方法。 ７８．ＥＬＡＭリガンドがＥＬＡＭ１リガンドである請求の範囲第７６項または 第７７項に記載の方法。 ７９．ＥＬＡＭリガンドがＶＣＡＭ１ｂリガンドもしくはＶＣＡＭ１ｂリガンド である請求の範囲第７６項または第７７項に記載の方法。 ８０．ＶＣＡＭ１リガンドがＶＬＡ４である請求の範囲第７９項に記載の方法。 ８１．抗体がハイプリドーマＣＤＢ．Ｂ１１．ＢＣ６抗一ＥＬＡＭ１により産生 されたものである請求の範囲第７６項または第７７項に記載の方法。 ８２．ＥＬＡＭもしくはその断片を発現に際しコーするＤＮＡ配列、および免疫 グロブリン分子の一定領域を発現に際しコードするＤＮＡ配列からなることを特 徴とするＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白を発現に際しコードする組換ＤＮＡ 分子。 ８３．ＥＬＡＭがＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂである請求の範 囲第８２項に記載のＤＮＡ配列。 ８４．ＶＣＡＭ１ドメイン１−３およびヒト免疫グロブリンＣ−γ−１の一定領 域からなる請求の範囲第８２項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ８５．ｍＲＮＡにハイブリッド化する核酸配列からなるＥＬＡＭもしくはＭＩＬ ＡｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸。 ８６．前記ｍＲＮＡの開始コドンに結合する請求の範囲第８５項に記載のアンチ センスオリゴヌクレオチド。 ８７．ＥＬＡＭがＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂである請求の範 囲第８５項に記載のアンチセンス核酸。 ８８．ＭＩＬＡがＥＬＡＭ１リガンドである請求の範囲第８５項に記載のアンチ センス核酸。 ８９．ＭＩＬＡがＣＤＸである請求の範囲第８５項に記載のアンチセンス拡散。 ９０．ＭＩＬＡがＶＬＡ４である請求の範囲第８５項に記載のアンチセンス核酸 。 ９１．ＤＮＡを含む請求の範囲第８５項に記載のアンチセンス核酸。 ９２．ＲＮＡを含む請求の範囲第８５項に記載のアンチセンス核酸。 ９３．ＤＮＡ配列５′ＣＣＣＡＧＧＣＡＴＴＴＴＡＡＧを有する請求の範囲第８ ５項に記載のアンチセンス核酸。 ９４．ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡｍＲＮＡに対するアンチセンスリボ核酸を転写 に際し産生するＤＮＡ配列を有し、前記アンチセンスリボ核酸が前記ｍＲＮＡに ハイブリッド化する核酸配列からなることを特徴とする組換ＤＮＡ分子。 ９５．ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡｍＲＮＡに対するアンチセンスリボ核酸を転写 に際し産生するＤＮＡ配列を有し、前記アンチセンスリボ核酸が前記ｍＲＮＡに ハイブリッド化する核酸配列からなる組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトさ れたＥＬＡＭ生産性もしくはＭＩＬＡ−生産性細胞ライン。 ９６．ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡｍＲＮＡに対するアンチセンスリボ核酸を転写 に際し産生するＤＮＡ配列を有し、前記アンチセンスリボ核酸が前記ｍＲＮＡに ハイブリッド化する核酸配列からなる組換ＤＮＡ分子によりＥＬＡＭ−生産性も しくはＭＩＬＡ−生産性細胞ラインをトランスフェクトすることを特徴とするＥ ＬＡＭもしくはＭＩＬＡの減少した発現を示す細胞ラインの作成方法。 ９７．１種もしくはそれ以上のＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡの産生を減少させるの に有効な量の請求の範囲第８２項に記載のアンチセンス核酸を投与することを特 徴とする炎症の処置方法。 ９８．ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡｍＲＮＡを切断するリボチーム。 ９９．ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂｍＲＮＡを切断する請求の 範囲第９８項に記載のリボチーム。 １００．ＥＬＡＭリガンドｍＲＮＡを切断する請求の範囲第９８項に記載のリボ チーム。 １０１．ＣＤＸｍＲＮＡを切断する請求の範囲第９８項に記載のリボチーム。 １０２．ＶＬＡ４ｍＲＮＡを切断する請求の範囲第９８項に記載のリボチーム。 １０３．テトラヒメナ型リボチームをさらに含む請求の範囲第９８項に記載のリ ボチーム。 １０４．ハンマーヘッド型リボチームをさらに含む請求の範囲第９８項に記載の リボチーム。 １０５．ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡｍＲＮＡを切断するリボチームを転写に際し 産生するＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡ分子。 １０６．ＲＮＡ配列【配列があります】からなる請求の範囲第９８項に記載のリ ボチーム。 １０７．ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡｍＲＮＡを切断するリボチームを転写に際し 産生するＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトされたＥＬ ＡＭ生産性もしくはＭＩＬＡｍＲＮＡ生産性細胞ライン。 １０８．ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡｍＲＮＡを切断するリボチームを転写に際し 産生する組長ＤＮＡ分子によりＥＬＡＭ−生産性もしくはＭＩＬＡ−生産性細胞 ラインをトランスフェクトすることを特徴とするＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡの減 少した発現を示す細胞ラインの作成方法。 １０９．ＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドの産生を減少させるのに有効な量の ＥＬＡＭｍＲＮＡもしくはＥＬＡＭリガンドｍＲＮＡを切断するリボチームを投 与することを特徴とする炎症の処置方法。 １１０．ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡに対し反応性である抗ーイディオタイプ抗体 調製物。 １１１．ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂに対し反応性である請求 の範囲第１１０項に記載の抗−イディオタイプ抗体調製物。 １１２．ＥＬＡＭ１リガンドに対し反応性である請求の範囲第１１０項に記載の 抗−イディオタイプ抗体調製物。 １１３．ＶＬＡ４に対し反応性である請求の範囲第１１０項に記載の抗−イディ オタイプ抗体調製物。 １１４．ＣＤＸに対し反応性である請求の範囲第１１０項に記載の抗−イディオ タイプ抗体調製物。 １１５．ＶＣＡＭ１のドメイン１、２、３、４、５もしくは６またはＶＣＡＭ１ ｂのドメイン３、３Ｂもしくは４に対し反応性である請求の範囲第１１０項に記 載の抗−イディオタイプ抗体調製物。 １１６．（ａ）ＥＬＡＭ１、ＣＤＸ、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１ｂもしくはＶＬＡ ４のいずれか１種を認識する抗体を認識する抗−イディオタイプ抗体に対し結合 する蛋白につき蛋白混合物をスクリーニングし、（ｂ）前記抗−イディオタイプ 抗体に結合する分子を分離し、 （ｃ）ＥＬＡＭ１、ＣＤＸ、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１ｂもしくはＶＬＡ４に結合 する蛋白の能力を試験する ことを特徴とするＥＬＡＭ１、ＣＤＸ、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１ｂもしくはＶＬ Ａ４のいずれか１種に結合するＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドの同定方法。 １１７．（ａ）ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂの前記ドメインのすいずれかを 認識する抗体を認識する抗−イディオタイプ抗体に対し結合する蛋白にっき蛋白 混合物をスクリーニングし、 （ｂ）前記抗−イディオタイプ抗体に結合する蛋白を分離し、 （ｃ）ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂの前記ドメインのいずれかに結合する蛋 白の能力を試験することを特徴とするＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂのドメイ ンのいずれかに結合するＥＬＡＭリガンドの同定方法。 １１８．ＩＬ−１、ＴＮＦもしくはＩＦＮ−γを認識する抗体の有効量を投与す ることを特徴とするＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂ発現の阻止方法。 １１９．核種に結合したＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂを認識する抗体からな る放射線免疫結合体。 １２０．核種がＩ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６よりなる群から選択される請 求の範囲第１１９項に記載の放射線免疫結合体。 １２１．細胞毒素に結合したＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭｌｂを認識する抗体か らなる免疫毒素。 １２２．細胞毒素がシュードモナス外生毒素である請求の範囲第１２１項に記載 の免疫毒素。 １２３．ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂを認識する抗体を持った放射線免疫結 合体を投与することを特徴とするＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂ−生産性癌細 胞の検出方法。 １２４．ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂを認識する抗体を持った放射線免疫結 合体もしくは免疫毒素の有効量を投与することを特徴とする癌の処置方法。 １２５．ＶＣＡＭ１リガンドを結合するＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂドメイ ンおよびＩＣＡＭＩリガンドを結合するＩＣＡＭ１ドメインに関するＤＮＡ配列 からなる、ＶＣＡＭ／ＩＣＡＭ融合蛋白をコードするＤＮＡ配列。 １２６．ＶＣＡＭ１リガンドがＶＬＡ４であり、ＩＣＡＭ１リガンドがＬＦＡ１ である請求の範囲第１２５項に記載のＤＮＡ配列。 １２７．ＶＣＡＭ１リガンドを結合するＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂドメイ ンおよびＩＣＡＭ１リガンドを結合するＩＣＡＭ１ドメインからなるＶＣＡＭ／ ＩＣＡＭ融合蛋白。 １２８．ＶＣＡＭ１リガンドがＶＬＡ４であり、ＩＣＡＭ１リガンドがＬＦＡ１ である請求の範囲第１２７項に記載の融合蛋白。 １２９．（１）腫瘍組織の試料を、この種の腫瘍を有する哺乳動物から剔出し、 （２）腫瘍組織に浸潤した１個もしくはそれ以上の白血球を前記試料から分離し 、 （３）殺腫瘍剤をコードする遺伝子を含むと共に殺腫瘍性遺伝子生産物を前記白 血球内に発現しうる組換発現ベクターにより前記１個もしくはそれ以上の浸潤性 白血球をトランスフェクトし、 （４）トランスフェクトされた白血球を前記哺乳動物に導入する ことを特徴とするＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１ｂもしくはそのリガンド を発現する腫瘍の処置方法。 １３０．殺腫瘍性遺伝子生産物がＴＮＦもしくはリンパ性毒素である請求の範囲 第１２９項に記載の方法。 １３１．哺乳動物がヒトである請求の範囲第１３０項に記載の方法。 １３２．組換発現ベクターがレトロウイルスベクターである請求の範囲第１２９ 項に記載の方法。 １３３．トランスフェクトされた白血球を哺乳動物に導入する前に、前記トラン スフェクトされた白血球をＩＬ−２で拡充させる請求の範囲第１２９項に記載の 方法。 １３４．腫瘍が悪性腫瘍である請求の範囲第１２９項に記載の方法。 １３５．腫瘍がＶＬＡ４もしくはＣＤＸを発現する請求の範囲第１２９項に記載 の方法。 １３６．腫瘍が黒色腫もしくは結腸癌である請求の範囲第１３５項に記載の方法 。 １３７．ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡを発現する標的細胞に対し白血球の細胞融解 特性を向上させるに際し、前記標的細胞により発現されたＥＬＡＭもしくはＭＩ ＬＡに結合するＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ分子をコードする遺伝子を備え、さら に前記白血球内に前記遺伝子を発現しうる組換発現ベクターにより前記白血球を トランスフェクトすることを特徴とする白血球の細胞融解特性の向上方法。 １３８．標的細胞が黒色腫もしくは結腸癌である請求の範囲第１３７項に記載の 方法。 １３９．遺伝子がＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂをコードし、またはＥＬＡＭ １をコードする請求の範囲第１３８項に記載の方法。 １４０．組換発現ベクターがレトロウイルスベクターである請求の範囲第１３７ 項に記載の方法。 １４１．組換発現ベクターが殺腫瘍剤をコードする遺伝子をさらに含む請求の範 囲第１４０項に記載の方法。 １４２．白血球が腫瘍浸潤性白血球である請求の範囲第１４０項に記載の方法。
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