JP2002065285A - 内皮細胞−白血球付着分子（ｅｌａｍ）および白血球付着に関与する分子（ｍｉｌａ） - Google Patents

内皮細胞−白血球付着分子（ｅｌａｍ）および白血球付着に関与する分子（ｍｉｌａ）

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 炎症を検討し、診断し、予防しかつ処置する
ための新規な手段を提供する。 【解決手段】 内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）
をコードするＤＮＡ配列、この種の分子の生産方法およ
び常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＥＬＡＭ
（特定分子ＥＬＡＭ１並びにＶＣＡＭ１および１ｂを含
む）につき開示する。さらにＥＬＡＭに対する抗体につ
いても開示する。白血球付着に関与する分子（ＭＩＬ
Ａ）をコードするＤＮＡ配列、この種の分子の生産方
法、並びに常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＭ
ＩＬＡ（特定分子ＣＤＸを含む）についても開示する。
ＭＩＬＡに対し反応性である抗体調製物についても開示
する。内皮細胞に対する白血球の結合を阻止する分子の
同定方法、内皮細胞に結合する白血球の阻止方法、並び
に急性炎症の検出方法についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】本発明は、炎症の際の内皮細胞に対
する白血球の付着に関与する分子、およびこれらを発現
に際しコードするＤＮＡ配列に関するものである。より
詳細には本発明は、ＥＬＡＭ１並びに血管細胞付着分子
１および１ｂ（ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂ）を包含
する内皮細胞付着分子（ＥＬＡＭ）に関するものであ
る。さらに本発明は、内皮細胞に対する白血球付着に関
与する白血球の表面における分子（ＭＩＬＡ）に関する
ものである。これらはＣＤＸ、すなわちＥＬＡＭ１付着
経路に関与する分子、並びにＶＬＡ４、すなわちＶＣＡ
Ｍ１およびＶＣＡＭ１ｂのリガンドを包含する。さらに
本発明は、これら付着分子を認識する抗体、並びにこれ
ら抗体と付着分子のためのリガンドもしくはリセプタと
の両者を認識する抗−イディオタイプ抗体に関するもの
である。さらに本発明は、この種の付着分子のためのｍ
ＲＮＡに対し相補的なアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ
分子に関し、さらにこの種の分子のためのｍＲＮＡを認
識するリボチームに関する。さらに本発明は、たとえば
内皮細胞に対する白血球付着を検出し或いは阻止するた
めの診断剤および治療剤を開発する際の上記分子、ＤＮ
Ａ配列、抗体、抗−イディオタイプ抗体、アンチセンス
分子およびリボチームの使用方法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】炎症は、感染もしくは外傷に対する血管
組織の反応である。臨床上、これは４種類の徴候を伴
う：すなわち発赤、発熱、疼痛および浮腫。その経過は
急性もしくは慢性のいずれかである。
【０００３】細胞レベルにて、炎症は血管の内皮壁に対
する白血球の付着および周囲組織中へのその浸潤を伴う
［ハーラン、1985］。急性炎症は多形核白血球（ＰＭ
Ｎ）の付着および浸潤を特徴とする［ハーラン、1987並
びにマレヒおよびガリン、1987］。組織内のＰＭＮ蓄積
は炎症刺戟の2.5 〜4 時間後にそのピークに達し、約28
時間で止まる［ベビラッカおよびギンブロン、1987］。
これに対し、慢性炎症は他の白血球、特に単核細胞およ
びリンパ球の付着および、浸潤を特徴とする。
【０００４】一般的な炎症において、浸潤性白血球は侵
入生物もしくは死滅細胞を食菌すると共に、組織修復お
よび免疫反応に役割を演ずる。しかしながら病理学的炎
症においては、浸潤性白血球が重大かつしばしば致命的
な損傷をもたらしうる。関節リウマチ症およびアテロー
ム性硬化症が慢性炎症病の例であり、単核白血球が組織
に浸潤して損傷をもたらす［フーおよびソコロフ、1985
並びにロス、1986］。多器官不全症候群、成人呼吸困難
症候群（ＡＲＤＳ）および虚血性再灌流障害は急性炎症
であって、浸潤性ＰＭＮが損傷をもたらす［ハーラン、
1987並びにマレヒおよびガリン、1987］。たとえば重症
火傷に伴うショックを受けた後に生じうる多器官不全症
候群においては、ＰＭＮ媒介の損傷が外傷を悪化させ
る。ＡＲＤＳにおいては、ＰＭＮが肺に液体を充満させ
て犠牲者を溺死させることがある。血液の供給が遮断さ
れた組織に突然に血液が灌流された際に生ずる虚血性再
灌流障害（たとえば心臓発作または脚部再結合の後）に
おいて、ＰＭＮ付着は重大な組織損傷をもたらす［ハー
ラン、1987］。
【０００５】白血球浸潤が多くの炎症関連病理学の原因
であり、かつ白血球付着が浸潤の第１過程であることを
認識して、最近研究者は内皮細胞表面に結合する白血球
のメカニズムに注意を集中している。研究が示したとこ
ろでは、結合はリセプタおよびリガンドとして作用する
内皮細胞と白血球との両者における細胞表面分子により
媒介される［ハーラン等、1987；ダナ等、1986；および
ベビラッカ等、1987ａ］。
【０００６】炎症の経過に際し、或る種の炎症剤は白血
球に対し作用して、これらを内皮に対し高付着性にす
る。公知の炎症剤はロイコトリエン−Ｂ４（ＬＴＢ
４）、相補因子５ａ（Ｃ５ａ）およびホルミル−メチオ
ニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）を包含
する。これらの薬剤は、ＬｅｕＣＡＭと呼ばれる１群の
蛋白を活性化させる。ＬｅｕＣＡＭはＣＤ１１およびＣ
Ｄ１８蛋白の二量体である。ＬｅｕＣＡＭの１種、すな
わちＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ１とも呼ばれる）
は、ＩＣＡＭ１（細胞間付着分子１）とも呼ばれる内皮
細胞上のリセプタに結合する［ハーラン、1985およびダ
ナ等、1986］。研究者等が示したところでは、ＬｅｕＣ
ＡＭに対するモノクロ−ナル抗体（Ｍｏａｂｓ）はイン
ビトロおよびインビボの両者にて内皮に対するＰＭＮ付
着を阻止する［アルフォルス、1987；ベダー等、1988；
およびトッド、1989］。
【０００７】他の炎症剤は内皮細胞に直接作用して、実
質的に白血球付着を開始させる。これらの薬剤はサイト
キン類、すなわちインタロイキン−１（ＩＬ−１）、リ
ンパ性毒素（ＬＴ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、並
びに細菌内生毒素、リポ多糖類（ＬＰＳ）を包含する。
たとえばＩＬ−１は、ヒト内皮細胞の単層に対するＰＭ
Ｎ、単核細胞および関連細胞ラインＨＬ−60（ＰＭＮ
状）およびＵ937 （単核細胞状）の付着を刺戟すること
が示されている。作用は時間依存性であると共に蛋白合
成依存性である［ベビラッカ等、1987ａ；ベビラッカ
等、1987ｂ；およびベビラッカ等、1985］。
【０００８】現在の証拠が示すように、これらの薬剤は
内皮細胞表面に対するＥＬＡＭ（内皮細胞−白血球付着
分子）と呼ばれる１群の分子を誘発させる。現在まで研
究者は２種のこれら分子、すなわち細胞間付着分子１
（ＩＣＡＭ１）および内皮細胞−血球付着分子１（ＥＬ
ＡＭ１）を同定している［シモンス等、1988；スタウン
トン等、1988；およびベビラッカ等、1987b]。ＩＣＡＭ
１は多くの細胞型で見出だされ、さらに血管内皮上での
その発現は炎症性サイトキン、すなわちインタロイキン
−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ）および
γインタフェロン（ＩＦＮ−γ）によりインビトロおよ
びインビボの両者にて強力に増大される［ポバー等、19
86；ダスチンおよびスプリンガー、1988；並びにコトラ
ンおよびポバー、1988］。
【０００９】ＥＬＡＭ１は最初に検出され、かつサイト
キン処理されたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対
するＰＭＮ付着を部分的に阻止するモノクロ−ナル抗体
（Ｍｏａｂ）を特徴とする。ＥＬＡＭ１は、炎症性サイ
トキンＩＬ−１もしくはＴＮＦに反応するがＩＦＮ−γ
には反応せずにＨＵＶＥＣにより急速に合成される116
ｋＤの細胞表面グリコ蛋白である［ベビラッカ等、1987
b]。ＩＣＡＭ１とは異なり、ＥＬＡＭ１は内皮において
のみ発現されると思われ、その発現は継続したサイトキ
ンの存在下においてさえ一時的である。ＩＣＡＭ１と同
様に、ＥＬＡＭ１もインビボにて炎症部位に存在する。
免疫組織学の研究は、これが急性炎症部位には存在する
が慢性炎症部位には存在せず、非炎症血管壁にも存在し
ないことを示している［コトラン等、1986、並びにコト
ランおよびポバー、1988］。したがって、ＥＬＡＭ１は
インビボにおける炎症血管壁に対するＰＭＮ付着の主た
る媒体であると思われる。重要なことに、細胞表面にお
けるＥＬＡＭ１の存在は急性炎症の自然経過を辿り、刺
戟の数時間後に出現すると共に１日以内に徐々に消失す
る［ベビラッカ等、1987ｂ］。
【００１０】間接的証拠は、他のＥＬＡＭが存在するこ
とを示唆する。炎症剤はインビトロにて内皮に対するＰ
ＭＮ、単核細胞およびリンパ球の結合を誘発するが、Ｅ
ＬＡＭ１に対するＭｏａｂｓはＰＭＮおよび関連細胞の
結合のみを阻止する［ベビラッカおよびギンブロン、19
87］。さらに、インビボにおける炎症部位でのリンパ球
および単核細胞の最大蓄積は、ＥＬＡＭ１発現が基礎レ
ベルまで復帰した際に約24時間にて生ずる。この情報に
基づき研究者は、これらリンパ球および単核細胞の結合
を媒介する他のＥＬＡＭの存在を想定した［ベビラッカ
等、1987ｂ］。以下詳細に説明するように、本発明者等
はさらに２種のＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂと称する
ＥＬＡＭを特性化すると共にクローン化し、これらは内
皮細胞に対するリンパ球の結合を媒介する。したがっ
て、ＥＬＡＭは１群の分子と見なすことができる。
【００１１】多くの証拠が示すように、ＥＬＡＭは腫瘍
侵蝕、転移およびウィルス感染を包含する細胞−細胞認
識を含む広範囲の病理学的状態にて重要な役割を演ずる
［ハーラン、1985；ワリスおよびハーラン、1986；ベビ
ラッカ等、1987ａ；並びにコトランおよびポバー、198
8］。
【００１２】ＥＬＡＭを発現する細胞に対する白血球の
付着は、白血球上にＥＬＡＭリガンドが存在することを
示唆する。この種の分子の１種はＩＣＡＭ１リガンド、
すなわちリンパ球機能に関連した抗原１（ＬＦＡ１）で
ある。ＬＦＡ１は、β２インテグリンもしくはＣＤ１１
／１８属として知られた３種のヘテロダイマー分子の１
種である［ダスチン等、1986；ロスライン等、1986；並
びにマーリンおよびスプリンガー、1987］。最近の研究
が示すところでは、ＩＣＡＭ１／ＬＦＡ１経路はインビ
トロにて内皮細胞に対するリンパ球および多形核白血球
（ＰＭＮ）の両者の付着に役割を演ずる［ダスチンおよ
びスプリンガー、1988；スミス等、1989］。本明細書で
は、ＥＬＡＭ１リガンドであると証明しうる、内皮細胞
に対する白血球付着に関与する分子（ＭＩＬＡ）の分離
につき説明する。ＣＤＸと称する分子は約150 ｋＤの蛋
白であって、ＨＬ−60細胞から分離された。ＣＤＸを認
識するモノクロ−ナル抗体は、ＥＬＡＭ１−発現性細胞
に対するＰＭＮおよびＨＬ−60細胞の結合を阻止する。
さらに、ＣＤＸはＥＬＡＭ１に付着することが知られた
種類の白血球細胞に存在し、ＥＬＡＭ１に付着しない種
類の白血球細胞およびその他の細胞には存在しない。し
たがってＣＤＸは或る種の白血球で発現される分子であ
って、ＥＬＡＭ１−媒介の白血球−内皮細胞付着におい
て重要な役割を演ずる。さらに、ＣＤＸをコードするｃ
ＤＮＡの分離および配列決定についても説明する。
【００１３】さらに、ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂリ
ガンド、すなわちＶＬＡ４の同定についても説明する
［ヘルマーおよびタカダ、ＥＰ330 506 号］。ＶＬＡ４
のα4およびβ1 サブ単位に特異性の抗体は、ＶＣＡＭ
１に対するＶＬＡ４−発現性細胞の結合を完全に排除す
る。
【００１４】血管壁に対する白血球付着は炎症における
第１過程であるため、この過程を防止することに向けら
れる治療は病理学的炎症の処置に関し魅力的である。臨
床医は或る程度の成功を以て白血球媒介付着の阻止に基
づく治療につき既に試験している。この種の対策の１つ
は、ＰＭＮ付着を阻止するための白血球細胞表面複合体
（ＣＤ１１／ＣＤ１８）に対するＭｏａｂｓ結合を含む
（アルフォルス等、1987；ベダー等、1988；およびトッ
ド等、1989）。
【００１５】内皮細胞媒介の結合、並びにＥＬＡＭおよ
びＭＩＬＡ（ＥＬＡＭリガンドを含む）に基づく白血球
付着を防止するための代案治療は特に一層有望であると
思われる。ＥＬＡＭ系は２つの理由から特に魅力的であ
る：第１に、内皮細胞におけるＥＬＡＭ発現は構成的で
なく誘発されるので、ＥＬＡＭは炎症の部位に集中する
と共に数が制限される。このことは付着阻止剤が局部的
にのみ作用すればよく、したがって構成的に発現される
分子に向けられた阻止剤よりも少なくい投与量にて効果
的であることを意味する。第２に、ＥＬＡＭ結合は種々
異なる種類の白血球に対し選択的である。たとえばＥＬ
ＡＭ１はＰＭＮを結合するのに対し、ＶＣＡＭ１はリン
パ球を結合する。したがって、これらの治療は所定の種
類の白血球に対し特異性であると共に、他の種類の白血
球の循環もしくは移動に影響を与えない。さらに上記の
理由から、この種の治療は安価かつ毒性が低いと判明し
た。
【００１６】ＥＬＡＭに基づく治療に対する対策は、常
態結合した動物蛋白を含まない高度精製型におけるＥＬ
ＡＭおよびＭＩＬＡの両者を出発物質として必要とす
る。さらに、これら分子を生産する方法も必要とされ
る。これらおよびその他の必要性は、特定付着分子を発
現に際しコードするＤＮＡ配列を分離すると共に、その
生産のための組換ＤＮＡ分子および発現ビークルを作成
することにより、本明細書中に説明するように解決され
る。
【００１７】
【発明の要点】本発明の主たる目的は炎症を検討し、診
断し、予防しかつ処置するための新規な手段を提供する
ことにある。より詳細には本発明の目的は、内皮細胞に
対する白血球結合に関与する分子を提供すると共に、白
血球の内皮細胞結合を阻止するのに自体有用である他の
分子を分離することにある。
【００１８】本発明は、内皮細胞−白血球付着分子（Ｅ
ＬＡＭ）を発現に際しコードするＤＮＡ配列、ＥＬＡＭ
のためのゲノムＤＮＡ配列（ＥＬＡＭ発現制御配列を包
含する）、これらＤＮＡ配列を有する組換ＤＮＡ分子、
これらＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主、Ｅ
ＬＡＭの産生方法、並びに常態結合した動物蛋白を実質
的に含まないＥＬＡＭ蛋白を提供する。さらに本発明
は、ＥＬＡＭに対し反応性の抗体調製物をも提供する。
【００１９】さらに本発明は、内皮細胞に対する白血球
付着に関与した分子（ＭＩＬＡ）を発現に際しコードす
るＤＮＡ配列をも提供する。ＭＩＬＡは、ＥＬＡＭに直
接結合する白血球表面分子、すなわちＥＬＡＭリガンド
を包含する。ＥＬＡＭリガンドを認識するモノクロ−ナ
ル抗体は、ＥＬＡＭ／ＥＬＡＭリガンド結合を直接に阻
止することができる。さらにＭＩＬＡは、付着に間接的
に関与する白血球表面分子、たとえばモノクロ−ナル抗
体のような第３の分子と相互作用することによりＥＬＡ
Ｍ／ＥＬＡＭリガンド結合を阻止する分子を包含する。
この種の分子は、たとえばＥＬＡＭに対する親和性を低
下させるようＥＬＡＭリガンドの表面構成を変化するこ
とにより作用することができる。さらに本発明は、ＭＩ
ＬＡ ＤＮＡ配列を有する組換ＤＮＡ分子、およびこれ
らにより形質転換された単細胞宿主をも提供する。さら
に常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＭＩＬＡ蛋
白、ＭＩＬＡの生産方法、並びにＭＩＬＡ（特にＣＤ
Ｘ）を認識するモノクロ−ナル抗体をも提供する。特に
本発明は、さらにＣＤＸをコードするＤＮＡ配列を持っ
た組換ＤＮＡ分子を提供し、さらにこれらにより形質転
換された単細胞宿主を提供する。
【００２０】さらに本発明はＥＬＡＭ、ＥＬＡＭリガン
ドを包含するＭＩＬＡ、またはこれら分子の１部をリセ
プタもしくはリガンドを阻止するため使用することを含
む内皮細胞に対するＰＭＮ結合の阻止方法をも提供す
る。さらに、ＥＬＡＭ発現を阻止するためのアンチセン
ス核酸およびリボチームの使用にも関する。さらに本発
明は、ＥＬＡＭのそのリガンドに対する結合を阻止する
能力につき分子をスクリーニングすることによる結合阻
止剤の同定方法にも関する。さらに本発明は、ＥＬＡＭ
およびそのリガンドの同定方法をも提供する。この種の
１つの方法は、ＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドを認
識する抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を使用す
る。
【００２１】
【発明の説明】以下の詳細な説明には次の定義を用い
る：発現制御配列：他のＤＮＡ配列の転写および翻訳を
制御かつ調整するＤＮＡ配列。
【００２２】作用結合：発現制御配列がＤＮＡ配列の転
写および翻訳を制御かつ調整する際に前記ＤＮＡ配列が
発現制御配列に作用結合する。「作用結合」という用語
は、発現すべきＤＮＡ配列の前側に適当な出発信号（た
とえばＡＴＧ）を有し、かつ正確な読枠を維持して発現
制御配列の制御下におけるＤＮＡ配列の発現とＤＮＡ配
列によりコードされた所望生産物の産生とを可能にする
ことを含む。組換ＤＮＡ分子中に挿入することを所望す
る遺伝子が適当に出発信号を持たなければ、この種の出
発信号を遺伝子の前側に挿入することができる。
【００２３】抗体：免疫グロブリン分子またはその機能
的断片、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）2 もしくはｄＡ
ｂ。抗体調製物は、この調製物における個々の免疫グロ
ブリン分子の少なくとも１部が抗原を認識する際（すな
わち、これに結合する際）、特定抗原に対し反応性であ
る。抗体調製物は、抗原に対する調製物における個々の
免疫グロブリン分子の結合が慣用の方法により検出しえ
ない場合、抗原に対し非反応性である。
【００２４】標準ハイブリッド化条件：ハイブリッド化
と洗浄との両者につき５ｘＳＳＣおよび65℃に実質的に
等しい塩および温度の条件。
【００２５】ＤＮＡ配列：本発明のＤＮＡ配列は、組換
ＤＮＡ技術を用いて作成され或いは分離されたＤＮＡ配
列を意味する。これらはｃＤＮＡ配列、その天然ゲノム
から分離されたＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包
含する。請求の範囲に用いる用語は、天然に存在する場
合にも天然ＤＮＡ配列を包含することを意図しない。
【００２６】ＥＬＡＭ：内皮細胞に対する白血球の付着
を媒介する、内皮細胞の表面で発現される分子。
【００２７】ＭＩＬＡ：内皮細胞に対するＥＬＡＭ−媒
介結合に関与する、白血球の表面で発現される分子。こ
れはＥＬＡＭリガンド、すなわちＥＬＡＭに直接結合す
る分子を包含する。
【００２８】以下に説明するように、本発明者等はｃＤ
ＮＡをＥＬＡＭｍＲＮＡから分離すると共に配列決定
し、ＥＬＡＭ分子を適当な宿主にて発現させ、ＭＩＬＡ
をコードするｃＤＮＡを分離すると共に配列決定し、さ
らにＭＩＬＡ用のＤＮＡ配列を分離しかつ発現させた。
【００２９】本発明による組換ＤＮＡ分子の発現は、宿
主細胞による得られたポリペプチドの翻訳後の改変を包
含する。たとえば哺乳動物細胞において、発現は特にポ
リペプチドのグリコシル化、リピド化もしくはホスホリ
ル化、或いは「成熟」蛋白を産生するための信号配列の
切断を包含する。したがって、ここで用いるＥＬＡＭお
よびＭＩＬＡという用語は、全長ポリペプチドおよびそ
の改変物もしくは誘導体、たとえばこの種のポリペプチ
ド、成熟蛋白、信号ペプチドを保持するポリペリチド、
匹敵した生物活性を有する切断ポリペプチドなどのグリ
コシル化物を包含する。
【００３０】ＥＬＡＭは、炎症時にのみ内皮細胞の表面
で発現される。この現象を利用してＥＬＡＭ ｃＤＮＡ
を分離した。本発明のｃＤＮＡ分離物ＥＬＡＭ１により
コードされたポリペプチドをＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ
１ｂと命名した。この分離に関与する第１工程は、ＥＬ
ＡＭ分子を種々異なって発現する細胞の選択である。ヒ
トの臍静脈内皮細胞を選択した。何故なら、これらは炎
症性サイトキシンＩＬ−１βにより誘発された際にＥＬ
ＡＭを産生するからである。しかしながら実際には、こ
のサイトキン、この細胞型、または特にヒト細胞のみに
限定されない。他の哺乳動物細胞、たとえばヒヒ内皮細
胞もＥＬＡＭを産生することが知られている［コトラン
およびポバー、1988］。
【００３１】次の工程は、ＥＬＡＭを発現する細胞（こ
の場合にはＩＬ−１β−誘発ＨＵＶＥＣ）からｍＲＮＡ
を分離すると共にそれらからｃＤＮＡ保存物を作成する
ことである。ｍＲＮＡを分離しかつそれからｃＤＮＡを
作成するには、多くの方法が知られている［たとえばグ
ブラーおよびホフマン、1983、並びにマニアチス等、19
82参照］。
【００３２】次いで、ｃＤＮＡを適当なベクターに挿入
した。ブライアン・シードにより記載されたように真核
性発現ベクターｐＣＤＭ８を選択した［シード、198
7］。このプラスミドはイ−・コリにおける高コピー数
と、真核性プロモータと、たとえばＣＯＳ７細胞のよう
な一時的発現系における高レベルの発現とを含む幾つか
の利点を有する。しかしながら、他の数種のベクター系
も可能である［たとえばケート等、1986参照］。
【００３３】ｃＤＮＡ保存物を作成した後、次の工程は
それからＥＬＡＭ ｃＤＮＡ配列を持ったクローンを分
離することであった。種々異なって発現されたｍＲＮＡ
につきｃＤＮＡを分離するには現在多くの方法がある。
これらはたとえば（１）標識されたｃＤＮＡによる＋／
−スクリーニング；（２）抜取ｃＤＮＡ保存物の作成；
および（３）抜取ｃＤＮＡプローブによるスクリーニン
グ［デービス、1986；サージェント、1987；デービス
等、1985、ヘドリック等、1984；およびヅギド等、198
8］。第３の技術、すなわち抜取ｃＤＮＡプローブによ
るスクリーニングを選択すると共に、ＥＬＡＭ配列を豊
富化させたｃＤＮＡサブ保存物を作成した。
【００３４】以下、一層詳細に説明するように、サイト
キン誘発細胞により産生されるが未誘発細胞では産生さ
れないｍＲＮＡを豊富化させた抜取ｃＤＮＡプローブを
作成した。次いで、当業界で周知された技術を用いて、
抜取ｃＤＮＡプローブにより、サイトキン誘発ｃＤＮＡ
保存物を試験した。これにより、ＥＬＡＭ配列を豊富化
したサブ保存物を形成するクローンを分離することがで
きた。
【００３５】この時点で、２つの技術を用いてＥＬＡＭ
配列に関するｃＤＮＡを持ったクローンを同定した。第
１方法においては、適する真核性発現系にてＥＬＡＭ活
性を発現するクローンを試験した。λＧＴ１１でクロー
ン化されるｃＤＮＡによってコードされた融合蛋白の抗
体スクリーニングを含む各種の直接的発現技術を用いる
ことができ［ヤングおよびデービス、1983；ヤングおよ
びデービス、1984］；またはクローン化されたｃＤＮ
Ａ、或いはＳＰ６／Ｔ７プロモータを有するプラスミド
もしくはファージＤＮＡからのｍＲＮＡを注射した後に
卵母細胞調節媒体の活性分析を用いることができる。或
いは、各種のプロモータ、選択素子および複製素子を有
するプラスミド、ファージおよびコスミドベクターにて
保存物を作成することもできる。動物細胞を、一時的も
しくは安定な発現のため保存物でトランスフェクトする
ことができる。トランスフェクションは各種の方法で行
なうことができる。一時的な発現につき、研究者はスフ
ェロプラスト融合、ＤＥＡＥデキストランおよびエレク
トロポレーションを用いている。安定な発現について
は、燐酸カルシウム、スフェロプラスト融合およびエレ
クトロポレーションを用いている。本発明者等は、スフ
ェロプラスト融合によりトランスフェクトされたＣＯＳ
７細胞、すなわち一時的な発現系を用いた［アルッフォ
およびシード、1987］。
【００３６】最近まで、直接発現によるクローン化分子
の同定は鋭敏な分析を必要とし、リンホキンのみに制限
されていた。しかしながら、抗体「パニング」技術［ウ
ィソッキおよびサトウ、1978］による或いはＦＡＣＳで
の機能分子の同定［ヤマサキ等、1988］による効率的な
一時的発現ベクターにおける一本鎖細胞−表面分子のｃ
ＤＮＡクローン化［たとえばシードおよびアルッフォ、
1987並びにシード、1987参照］は、直接的発現により同
定しうるクローン化分子の範囲を拡大した。本発明者等
は、クローン化分子につきリガンドを発現する適当な細
胞種類を用いてこの分子を同定するという付着分析を用
いることにより技術を拡大した。
【００３７】ヒト好中球状細胞ラインＨＬ−60［ベビラ
ッカ等、1985］またはヒトＢ−リンパ球状細胞ラインＲ
ＡＭＯＣ［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ1596、ヒト・バ−キット
・リンパ腫］のいずれかを結合するトランスフェクト細
胞の能力を試験することにより、ＥＬＡＭ発現を検出し
た。これにつき以下詳細に説明する。トランスフェクト
細胞はヒト細胞でないため、ヒトＥＬＡＭポリペプチド
を産生するものは実質的に精製された形態であって、常
態結合した動物蛋白を実質的に含まない。この分析にて
陽性の試験結果を得た細胞を釣り上げ、プラスミドＤＮ
Ａを回収し、さらにそれらから挿入物を分離した。これ
ら挿入物は、ＥＬＡＭ１（ＨＬ−60細胞に対する付着に
より選択）およびＶＣＡＭ１（ＲＡＭＯＳ細胞に対する
付着により選択）をコードするＤＮＡ配列を有した。
【００３８】第２の方法においては、誘発されたｍＲＮ
Ａ（未誘発のｍＲＮＡでない）の４ｋｂバンドに対しノ
ーザン・ブロットでハイブリッド化した豊富化サブ保存
物からｃＤＮＡ挿入物を同定した。これら挿入物の２種
は、ＥＬＡＭ１に関するＤＮＡ配列を有した。サブ保存
物からの他の挿入物は、異なる誘発ｍＲＮＡをコードす
る。
【００３９】ＩＬ−１β−誘発ＨＵＶＥＣ ｃＤＮＡ保
存物をＶＣＡＭ１ ｃＤＮＡ配列から誘導されたランダ
ム処理のオレゴヌクレオチドＰ32標識プローブで試験す
ることにより、他のＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ１ｂに関するｃ
ＤＮＡを分離した。ＶＣＡＭ１ｂはＶＣＡＭ１より大で
ある。
【００４０】これら３種の方法により同定されたクロー
ンを用いて、ＥＬＡＭ１並びにＶＣＡＭ１および１ｂに
つきｃＤＮＡの配列を決定した。遺伝子コードの縮退に
基づき、これら配列の多くのヌクレオチドを変化させる
と共に図１、図３および図４に示したＤＮＡ配列により
コードされるものと同一のアミノ酸配列を発現に際しコ
ードするＤＮＡ配列を保持し得ることに注目すべきであ
る。さらに、ＥＬＡＭｃＤＮＡ配列の断片に関するＤＮ
Ａ配列（すなわちＥＬＡＭ ｃＤＮＡ配列に対し実質的
に相同であって、それ自身でＥＬＡＭポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列）は標準ハイブリッド化条件下で上
記ＥＬＡＭ ｃＤＮＡ配列にハイブリッド化する。
【００４１】上記ＤＮＡ配列からＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ
１およびＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列を推定した。蛋白
処理技術の現状に鑑み、当業者はこれらアミノ酸配列に
おける合理的な改変、挿入および欠失を行なって、ここ
に開示した分子と実質的に同じ生物学的もしくは免疫学
的活性を有する各種の分子を明らかに得ることができ
る。
【００４２】さらにＥＬＡＭ１並びにＶＣＡＭ１および
１ｂ遺伝子につき、転写プロモータを含むゲノムＤＮＡ
配列を分離した。ヒトゲノム保存物をＥＬＡＭ１または
ＶＣＡＭ１ ＤＮＡ配列のコード化領域から誘導された
Ｐ32標識プローブでスクリーニングした。これにより、
ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１の両遺伝子の５′未転写お
よび未翻訳領域の部分を有するクローンを得た。
【００４３】ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１転写プロモー
タは多数の用途を有する。第１に、これらはサイトキン
（たとえばＴＮＦもしくはＩＬ−１）および細菌性リポ
多糖類（ＬＰＳ）または内皮細胞にてＥＬＡＭの発現を
誘発することが知られた他の薬剤によって誘発しうるベ
クターを作成するのに有用である。この種のベクターは
たとえば遺伝子転移分析に有用であり、たとえばクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、ルシフェラーゼなどのリポータ遺伝子の
転写を開始させるよう、誘発性プロモータを位置せしめ
る。次いで、この作成物を一時的に或いは安定的に適当
な哺乳動物細胞ラインに導入する。誘発の有力な阻止剤
もしくは刺激剤を、次いで上記誘発剤のいずれか或いは
全てによる誘発に対する作用を測定して分析することが
できる。
【００４４】さらに、ＢＢ１１と称するＥＬＡＭ１を認
識するモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリドーマを
分離した。後記実施例Ｖにその生産につき説明する。
【００４５】ＶＣＡＭ１は、内皮細胞に結合するＴおよ
びＢ細胞に関与する。レクチン刺激もしくは特定抗原に
より活性化されたＴ細胞は、インビトロにてＨＵＶＥＣ
に結合する。この結合は部分的にＩＣＡＭ／ＬＦＡ１経
路によって媒介される。何故なら、ＣＤ１８における阻
止性エピトープ（ＬＦＡ１の共通β連鎖）に結合するモ
ノクロ−ナル抗体がＴ細胞結合を部分的に阻止するから
である。さらに、抗−ＣＤ１８および抗−ＶＣＡＭ１モ
ノクロ−ナル抗体は結合を完全に阻止することも判明し
た。ＣＤ１８が欠損した人間は炎症部位に対するリンパ
球の正常な修復を示すと共に、活性化されたＴ細胞はリ
ンパ系を介して循環しない（すなわち、これらは炎症部
位以外には血流から流出しない）という観察と組合わせ
て、これはＶＣＡＭ１がインビボにおける活性化Ｔ細胞
移動に対し重要であることを意味する。すなわち、ＶＣ
ＡＭ１は全活性化Ｔ細胞を炎症部位に集中させるよう作
用する。活性化Ｔ細胞の存在が多くの炎症および自己免
疫病の特徴であるため、これはＶＣＡＭ１の不適切な発
現がこの種の病気の基本的な病理化学的特徴であること
を意味する。したがって、ＶＣＡＭ１経路は活性化Ｔ細
胞修復が関与する病気（たとえば関節炎、狼瘡、多発性
硬化症など）に対する重要な介入点を与える。したがっ
て、ＶＣＡＭ１結合経路を阻止することにより内皮に対
するＴ細胞結合を阻止するための治療処置につき開示す
る。これは、本明細書中に記載するいずれかの手段によ
り行なうことができる。
【００４６】ＶＣＡＭ１のＤＮＡ配列は分子がＥＬＡＭ
１に対し構造類似性を持たず、免疫クロブリン超遺伝子
群の一員であることを示す。免疫グロブリン超遺伝子群
のうち３種は細胞−細胞付着分子であると確認される。
これらはＮＣＡＭ、ＣＥＡおよびＩＣＡＭ１である。Ｎ
ＣＡＭはそれ自身で他の細胞の表面にて結合し（ホモタ
イプ付着）、かくして同種類の細胞間の付着を促進す
る。ＣＥＡの機能は最近まで未知であったが、付着分子
として機能することにより結腸腫瘍細胞およびＣＥＡに
関するｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のホモタ
イプ凝集を媒介することが見出された［ベンチモル等、
1989］。ＩＣＡＭ１は白血球表面蛋白ＬＦＡ１のリガン
ドであって、白血球−白血球付着および白血球−内皮細
胞付着の両者を媒介する［スタウントン等、1988］。Ｉ
ＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１は或る程度の機能的類似性を
有し、たとえば両者はサイトキンで処理した後に内皮細
胞内で誘発され、さらに両者はリンパ球と関連細胞ライ
ンとの付着を媒介する。ＩＣＡＭ１のリガンド（すなわ
ちＬＦＡ−１）は充分特性化されている。ＶＣＡＭ１の
リガンドはＶＬＡ４として同定されている（後記参
照）。ＩＣＡＭ１は、インビボにおける炎症部位までの
リンパ球の移動だけでなく免疫反応に関する多くのリン
パ球機能にも役割を演ずると思われる。さらに、ＩＣＡ
Ｍ１は多くのリノウィルスのためのリセプタとなること
も最近示された。他のウィルス（たとえばポリオ、ＨＩ
Ｖ）のリセプタもＩｇ上科のメンバーである［ホワイト
およびリットマン、1989］。たとえば、ＶＣＡＭ１は免
疫調節およびウィルス感染の両者において重要な役割を
演ずる。
【００４７】ＣＥＡとＩＣＡＭ１との両者は腫瘍細胞で
発現される。ＣＥＡは、結腸癌のための診断標識として
永年にわたり使用されている。最近の診断技術は放射線
免疫結合体の使用を含み、抗−ＣＥＡ抗体を放射性標識
に結合させると共に患者中に導入する。この方法によ
り、臨床医は３mm程度に小さい腫瘍を同定することがで
きる［ゴールデンベルク、1989］。
【００４８】研究者等は、さらに放射線免疫治療および
免疫毒素治療を開発している。放射線免疫治療は放射線
免疫結合体の使用を含み、たとえばＩ125 、Ｙ90、Ｒｅ
186などの核種を特定の表面抗原を認識する抗体に結合
させる。免疫毒素は、たとえばシュードモナス外生毒素
などの細胞毒素と結合した抗体である。注射に際し、こ
れらの結合した抗体は、抗原を発現する細胞に対し毒性
剤を指向させる。本発明によれば、放射性標識、核種お
よび細胞毒素をＶＣＡＭ１および１ｂ或いはこれらを認
識する抗体と結合させて、ＶＣＡＭ１リガンド（たとえ
ばＶＬＡ４）もしくはＶＣＡＭ１を発現する細胞を標的
とすることができる。
【００４９】新規なＥＬＡＭの発見、またはたとえば腫
瘍細胞のような他の細胞で発現されるＥＬＡＭもしくは
ＭＩＬＡの将来の発見も、新規なＴＩＬ治療を可能にす
る。たとえばＥＬＡＭを表面上で発現する腫瘍が見出だ
された場合、この腫瘍を生検して浸潤リンパ球を除去す
ることができる。たとえばレトロウィルス発現ベクター
におけるＴＮＦのような殺腫瘍剤のための遺伝子を用い
て、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）をトランスフェクト
し、次いでこれをＩＬ−２で拡充させる。トランスフェ
クトされたＴＩＬを患者中に注射すれば、ＴＩＬは初期
の腫瘍に特異的に指向すると共に腫瘍中に移動して、こ
こで殺腫瘍遺伝子生産物が局部作用のため放出される
［トーマスおよびシコラ、1989参照］。ＥＬＡＭは全て
或る種の白血球を結合することにより浸潤を媒介するの
で、浸潤白血球を分離し、特定の所望遺伝子生産物の発
現につきトランスフェクトし、増量させ、かつ患者に再
導入するという改変ＴＩＬ治療も考えられる。
【００５０】代案のＴＩＬ治療は、或る種の細胞型（特
に或る種の癌細胞）がＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡを発現
するという事実を利用する。たとえば、結腸癌はＣＤＸ
を発現するのに対し、黒色腫はＶＬＡ４を発現すること
が知られている。
【００５１】ここに開示するＤＮＡ配列を用いて、白血
球をトランスフェクトすることにより表面ＥＬＡＭもし
くはＭＩＬＡを発現させて白血球の細胞融解活性を向上
させ、対応リガンドを発現する標的細胞に対し結合を向
上させるよう、治療を設計することができる。白血球型
の細胞融解活性がより強い細胞−細胞付着の関数として
増大する場合、この種の方法は白血球が標的細胞を破壊
する能力を向上させる。たとえば、結腸癌または黒色腫
の場合、白血球（好ましくは既に標的癌細胞に対し親和
性を持った浸潤性白血球）をＥＬＡＭ１の遺伝子（結腸
癌の場合）またはＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂの遺
伝子（黒色腫の場合）を含む発現ベクターでトランスフ
ェクトすることができる。この種の白血球を患者中に導
入すれば、それぞれ癌細胞もしくは黒色腫細胞に留まり
得る白血球の群が得られる。これら白血球は、腫瘍細胞
に付着して所望の細胞融解作用を発生する向上した能力
を有する。
【００５２】ＨＵＶＥＣをＴＮＦおよびＩＦＮ−γと一
緒に培養すれば、ＶＣＡＭ１発現がＴＮＦ単独での培養
よりも約100 ％増大することが判明した。活性化Ｔ細胞
はＩＦＮ−γを分泌し、したがって積極的なフィードバ
ック系を介し炎症部位に対するそれ自身の補充を促進す
ることができる。ＶＣＡＭはＴ細胞結合を生ぜしめ、Ｔ
細胞はさらにＩＦＮ−γ分泌を介しＶＣＡＭ生産をさら
に刺戟する。したがって、このフィードバックメカニズ
ムの阻害を含むＶＣＡＭ依存性病理学につき新たな処置
を考案した。この処置はたとえばＩＬ−１、ＴＮＦもし
くはＩＦＮ−γのようなサイトキンをたとえばモノクロ
−ナル抗体で阻止して、サイトキン刺戟されたＶＣＡＭ
の生産を阻止することからなっている。
【００５３】さらにＥＬＡＭ１−媒介付着に関与し、事
実恐らく極く最近の本発明者等の証拠が示すように、Ｅ
ＬＡＭ１リガンドに関与するＭＩＬＡ、ＣＤＸを分離し
た。分離は第１工程としてＣＤＸ分子に対するモノクロ
−ナル抗体の生産を含んだ。マウスに対し、ＥＬＡＭ１
に結合することが知られた全ＨＬ−60細胞、すなわちＰ
ＭＮ−関連細胞ラインで免疫化した。或いは、ＰＭＮ自
身および本発明が示すＵ937 細胞を包含するＥＬＡＭ１
に結合する細胞ラインで免疫化することもできる。さら
に、他のＥＬＡＭに対する付着に関与するＭＩＬＡを分
離するため、適するＥＬＡＭに結合する任意の細胞ライ
ンで免疫化することもできる。たとえばＶＣＡＭ１を分
離する際、これら２種の細胞ライン、すなわちＢ−リン
パ球状細胞ライン（ＲＡＭＯＳ）およびＴ−リンパ球状
細胞ライン（ＪＵＲＫＡＴ）を同定した。
【００５４】免疫化されたマウスからの免疫血清が付着
分析にてＨＵＶＥＣに対するＨＬ−60細胞の結合を阻止
したことを知った後、当業界で周知された方法にて脾細
胞からハイブリドーマを作成した［ゴジング、1983］。
次いで、ＣＤＸに対するモノクロ−ナル抗体（Ｍｏａｂ
ｓ）を産生するハイブリドーマを、付着分析にて誘発Ｈ
ＵＶＥＣに対するＨＬ−60細胞の結合を阻止する能力に
つき試験することにより同定した。これらハイブリドー
マの数種を用いて、モノクロ−ナル抗体を含有する腹水
液を作成した。
【００５５】さらに、ヒューゼ等（1989）の技術を用い
て、これら抗原を認識するモノクロ−ナルＦａｂ断片を
生ぜしめこともできる（さらにスケラおよびプリュック
スン、1988参照）。或いは、ワード等（1989）により記
載されたように、単一ドメインの抗体を産生させること
もできる。
【００５６】ＣＤＸに対する本発明のモノクロ−ナル抗
体は次の特徴を有する：第１に、これらはＥＬＡＭ１を
発現する細胞に対するＨＬ−60細胞もしくはＰＭＮの結
合を阻止する。第２に、これら抗体は特異的な細胞結合
パターンを示し、すなわちこれらはＥＬＡＭ１に結合す
る細胞を認識するが、ＥＬＡＭ１に結合しない細胞は認
識しない。第３に、これらはヒト細胞ラインに関し他の
細胞−表面分子（たとえば抗−ＬＦＡ−１、抗−ＬＦＡ
−３、抗−ＣＤ４４、抗−ＩＣＡＭ、抗−ＣＤ４および
抗−Ｌｅｕ８）に対する抗体のパターンとは異なる認識
パターンを有する。
【００５７】これらＭｏａｂｓを用いてＣＤＸを分離し
た。ＨＬ−60表面蛋白および好中球（ヒト血液から分
離）からの表面蛋白をクルチンガーにより記載された方
法［クルチンガー等、1981］の変法より沃素で放射能標
識し、或いはＳ35−メチオニンで代謝的に標識した。膜
蛋白を可溶化させると共に、これらを蛋白Ａセファロー
ス（ＡＲＸ）に対しμ鎖−特異性ウサギ抗−マウスＩｇ
Ｇを介し結合された抗−ＣＤＸモノクロ−ナル抗体（α
−ＣＤＸ Ｍｏａｂｓ）と共に培養し、次いで抗体結合
した蛋白を分離した。この蛋白は、約150 ｋＤの単一の
核酸バンドとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に出現する。しば
しば、90ｋＤ蛋白バンドがＨＬ−60細胞からの結合蛋白
および常に好中球からの蛋白に観察された。この90ｋＤ
バンドはＣＤＸ分解生成物を示すと思われる。さらに、
しばしば一層高い分子量のバンド（すなわち約150 ｋ
Ｄ）も観察された。これらは非特異性バンドである。分
離した150 ｋＤ蛋白をＮ−グリカナーゼで処理した場
合、分子量が約70ｋＤまで低下した。150 ｋＤバンドを
Ｎ−グリカナーゼおよびＯ−グリカナーゼで処理した場
合、分子量はさらに約45ｋＤまで減少した。これは極め
て重度にグリコシル化した蛋白の蛋白コアを示すと思わ
れる。この蛋白は、常態結合した動物蛋白を実質的に含
まない分離ＣＤＸである。
【００５８】さらに当業界で知られた技術を用いて、Ｃ
ＤＸを発現に際しコードするＤＮＡ配列を分離した。幾
つかの実際的技術は、クローン化ＤＮＡを発現するため
の発現系を使用する。上記したように、各種の真核性発
現系を用いることができる。ＣＤＸを発現する細胞ライ
ンＨＬ−60のｍＲＮＡからｃＤＮＡ保存物を作成した。
この保存物を上記したような抜取技術によりＣＤＸを発
現しない細胞ライン（この場合はヘラ細胞）でＣＤＸ
ＤＮＡ配列につき豊富化させた。細胞ラインＣＯＳ ７
を抜取保存物でトランスフェクトすると共に約2100種の
クローンを得、これらからＣＤＸを発現する細胞を多数
の方法で検査した。
【００５９】トランスフェクト細胞をα−ＣＤＸ Ｍｏ
ａｂｓと共に培養し、かつこれらを抗−マウスＩｇＧも
しくはＩｇＭで被覆されたプレートに塗抹し、プレート
に結合する細胞はＣＤＸを発現する細胞である。このよ
うにして、ＣＤＸをコードする２．１ｋｂのＤＮＡ挿入
体を同定し、配列決定用ベクターにサブクローン化さ
せ、これをｐＳＱ２１９と称する。
【００６０】ＣＤＸ（または他のＭＩＬＡ）を分離する
他の方法は、蛍光性抗体標識を用いる。この方法におい
ては、ＣＤＸ発現性細胞をα−ＣＤＸ Ｍｏａｂｓと共
に培養し、次いでＭｏａｂｓをたとえば蛍光標識された
抗−マウス抗体で標識する。蛍光性抗体を結合する細胞
を、次いで蛍光活性化細胞分類器（ＦＡＣＳ）で分類し
た。分類された細胞からのＤＮＡを用いて、たとえばイ
ー・コリのような細菌宿主を形質転換させた。次いで、
得られたコロニーからのＤＮＡを用いてＣＯＳ７細胞を
トランスフェクトし、この手順を単一のＣＤＸ−発現性
クローンが確認されるまで反復することができる。
【００６１】第３の方法は、上記したようにトランスフ
ェクトされた細胞を組換可溶性ＥＬＡＭ１（ｒｓＥＬＡ
Ｍ１）で被覆されたプレート上に塗沫することである。
実施例ＶIIIにおいてはプレートをｒｓＥＬＡＭ１で被
覆する方法を説明する。これらプレートに結合する細胞
は、ＣＤＸを発現するものである。同様に、他の可溶性
ＥＬＡＭを用いて、その付着経路に関与するリガンドも
しくはＭＩＬＡを発現する細胞を分離することができ
る。
【００６２】さらに、発現保存物をイー・コリで作成す
ることもできる。たとえば、λＺＡＰ（登録商標）（ス
トラタジーン）／ＨＬ−60保存物を作成すると共にこれ
を用いて、イー・コリで挿入ＤＮＡを発現させることが
できる。塗沫した後、プラークをたとえば放射能標識さ
れたα−ＣＤＸモノクロ−ナル抗体で直接にスクリーニ
ングすることができる［ヤングおよびデービス、1983、
並びにヤングおよびデービス、1984］。モノクロ−ナル
抗体が結合するプラークを釣り上げて、ＤＮＡ挿入物を
これらから分離することができる。
【００６３】抗体認識に基づかずにＥＬＡＭリガンドを
同定すべく使用する他の方法は、ＣＯＳ７細胞を適当な
保存物（抜取ることができる）でトランスフェクトし、
次いでこれらをＥＬＡＭ発現性細胞（たとえば誘発ＨＵ
ＶＥＣ、ＥＬＡＭ−発現性ＣＯＳ７細胞、またはＥＬＡ
Ｍ−発現性ＣＨＯ細胞）に直接載せることである。この
場合も、適切なクローンを分離するよう充分に保存物を
豊富化するには、複数回の処理が必要である。
【００６４】ＣＤＸ（または他のＭＩＬＡ）をコードす
るＤＮＡ配列を分離するための他の技術は、オリゴヌク
レオチドプローブによるｃＤＮＡ保存物のスクリーニン
グを含む。たとえばＣＤＸに対する固定化抗体または固
定化ＥＬＡＭ１を用いる親和性クロマトグラフィーによ
り充分量のＣＤＸ蛋白を精製すれば、部分アミノ酸配列
を決定して、ＣＤＸ遺伝子の少なくとも１部に対応する
オリゴヌクレオチドプローブを合成することができる。
次いで、これらプローブを用いてｃＤＮＡ保存物をスク
リーニングすることができる。或いは、オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして使用することにより、ＣＤＸ
（ＭＩＬＡ）遺伝子用の保存物をスクリーニングする際
に使用すべき長いプローブを生ぜしめることができる。
【００６５】ＣＤＸのためのコード化配列を含むｃＤＮ
Ａ挿入物を分離した後、ＣＤＸがＥＬＡＭ１用のリガン
ド（または少なくとも１種のリガンド）であるという証
拠をさらに蓄積した。ＣＤＸ挿入物でトランスフェクト
されたＣＯＳ７細胞は、ｒｓＥＬＡＭ１で被覆されたビ
ーズに付着した。この相互作用は陽イオン依存性であっ
て、ＢＢ１１（すなわちＥＬＡＭ１を認識するモノクロ
−ナル抗体と共に事前培養して阻止された。さらに、Ｃ
ＤＸ挿入物でトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞は、
蛍光標識されたα−ＣＤＸ Ｍｏａｂｓと共に培養した
後にＦＡＣＳ上で陽性分析を示した。さらにＣＤＸトラ
ンスフェクトされたＣＯＳ７細胞は、α−ＣＤＸ被覆さ
れたセファロースビーズによりロゼットを形成する［シ
ードおよびアルッフォ、1987］。さらに、約120 ｋＤの
蛋白を沃素化すると共に、ＡＲＸビーズ（すなわち蛋白
Ａセファロースに対しμ連鎖−特異性ウサギ抗−マウス
ＩｇＧを介し結合したα−ＣＤＸ）を用いてＣＤＸ Ｃ
ＯＳ７細胞から免疫沈殿させることができる。
【００６６】重質炭水化物成分が天然産ＣＤＸと明らか
に結合することに鑑み、さらにシアリダーゼによるＨＬ
−60細胞（ＣＤＸ−発現性）の処理がＥＬＡＭ１に対す
る結合のロスをもたらすことも明らかに観察した。これ
は、たとえばＣＤＸ糖におけるシアル酸成分がＥＬＡＭ
１結合に直接関与するという直接作用である。或いは、
これはたとえばシアル酸成分の開裂がＣＤＸの電荷にお
ける急激な変化をもたらして、ＥＬＡＭ１に対する結合
を阻止しうるという間接的効果でもある。
【００６７】さらに、ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂに
関するリガンドを同定した。これはインテグリンＶＬＡ
４である［ヘムラー、1988；ヘムラー等、1987ａ；およ
びヘムラー等、1987b]。インテグリンは細胞−細胞外マ
トリックスおよびα，β−ヘテロダイマー構造を示す細
胞−細胞付着リセプタの１群である［ハイネス、1987；
マルカントニオおよびハイネス、1988］。研究者等は、
β−サブ単位によって分類される３種のサブ群のインテ
グリンを確認した。ＶＬＡ（極後期の抗原）蛋白はβ1
サブ群に属し、これらの多くは細胞−細胞外マトリック
ス付着に対し特異的である［ハイネス、1987およびルオ
スラ−チ、1988］。ＶＬＡ４はリンパ性細胞（たとえば
ＢおよびＴ細胞）、並びに骨髄性細胞にて比較的高レベ
ルで発現されるが、他の細胞では検出困難である［ヘム
ラー等、上記］。細胞外マトリックスに対するＢおよび
Ｔ細胞の結合は、ＶＬＡ４およびそのリガンド、ヒトフ
ィブロネクチン（ＦＮ）によって媒介される［ウェイナ
ー等、1989］。ＶＬＡ４がＶＣＡＭ１のためのリガンド
であるという知見は、これが活性化内皮細胞に対するＢ
およびＴリンバ球の１つの結合経路を規定するので重要
である。したがって、下記する方法におけるリガンドお
よびリセプタとしてのＶＬＡ４並びにＶＣＡＭ１および
１ｂの使用につき説明する。
【００６８】本発明では、ＥＬＡＭおよびＭＩＬＡ Ｄ
ＮＡ配列および分子に関する幾つかの用途が考えられ
る。第１に、ＥＬＡＭおよびＭＩＬＡを用いて、これら
分子に対し反応性のモノクロ−ナル抗体調製物を作成す
ることができる。次いで、Ｍｏａｂｓを治療剤として使
用することにより、内皮細胞に対する白血球結合を阻止
することができる。
【００６９】第２に、可溶型ＥＬＡＭ、可溶性ＥＬＡＭ
リガンドまたはそのいずれかの断片を結合阻止剤として
使用することができる。ＥＬＡＭペプチドは白血球上の
ＥＬＡＭリガンドに結合し、ＥＬＡＭリガンドは内皮細
胞上のＥＬＡＭに結合する。両方法は、内皮細胞に対す
る白血球結合を阻止する。組換可溶性ＥＬＡＭ（ｒｓＥ
ＬＡＭ）またはｒｓＥＬＡＭリガンドを作成するため、
好ましくは経膜領域を除去するよう分子をコードするＤ
ＮＡを変化させる。かくして、可溶性分子のためのＤＮ
Ａは、恐らく細胞質ドメインに付着した細胞外ドメイン
の全部または１部を含む。この対策は、可溶性ＣＤ４、
すなわちＡＩＤＳウィルスに結合するＴ細胞における表
面蛋白を用いて既に証明されている［フィッシャー等、
1988］。この対策はさらに抗体治療の問題を回避する。
何故なら、用いるポリペプチドが免疫反応を殆んど誘発
しないからである。
【００７０】可溶性組換分子につき研究者等が遭遇した
１つの問題は、短いインビボの血漿半減期である［カポ
ン等、1989］。この種の分子は系から急速に除去される
ので、治療効果を得るには大投与量もしくは頻繁な注射
が必要である。したがって、研究者等は可溶性分子の半
減期を増大させる方法を探求した。有力な解決策は、可
溶性分子を血流中における長い半減期を持つことが知ら
れた他の分子に結合させることである。その長い半減期
により、免疫グロブリン分子は有力な候補となる。カポ
ン等（1989）は、組換ＤＮＡ技術を用いた免疫グロブリ
ン分子に対する可溶性ＣＤ４の結合を記載している。こ
の対策においては、免疫グロブリン分子の可変領域の代
りに可溶性蛋白を用いて蛋白／免疫グロブリン融合蛋白
を形成させる。
【００７１】ｒｓＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白
は、ｒｓＥＬＡＭ単独よりも長い血漿半減期を有するこ
とが予想される。この種の融合蛋白は好ましくは組換作
成物で製造され、その際可溶性分子をコードするＤＮＡ
配列を免疫グロブリン分子の一定ドメインをコード化す
るＤＮＡ配列に融合させる。次いで、組換ＤＮＡを適当
な宿主細胞、好ましくは動物細胞で発現させて、融合蛋
白を産生させる。
【００７２】ＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白は他の
利点を有すると思われる。免疫グロブリン分子は一般に
二価であるため（すなわち、これらは２個の結合部位を
有するため）、ＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白は２
個のＥＬＡＭを有し、したがって２個のＥＬＡＭリガン
ド結合部位を有する。したがって、これらはＥＬＡＭリ
ガンドを示す細胞に対し大きい親和性もしくは親和力を
有すると思われる。
【００７３】第３に、ＥＬＡＭに結合する分子（たとえ
ば抗−ＥＬＡＭ抗体または標識、たとえばリガンドもし
くはその断片）を用いて、炎症を検出することができ
る。これは、たとえば蛍光性もしくは放射能により分子
を検出可能にし、これを患者に投与すると共に人体のど
こにそれが蓄積したかを決定する。このようにして、炎
症の種類を確認することもできる。たとえば、ＥＬＡＭ
１に対する結合は慢性炎症でなく急性炎症を示す。
【００７４】第４に、ＥＬＡＭが炭水化物成分または他
の翻訳後の改変を介しリガンドに結合すれば、ＥＬＡＭ
を用いてこれが結合したＥＬＡＭリガンドにおける炭水
化物を確認することもできる。
【００７５】第５に、ＥＬＡＭおよびＭＩＬＡを系の１
部として用いることにより、付着阻止剤のための小分子
をスクリーニングすることができる。たとえば、小分子
をＣＤＸとＥＬＡＭ１との間の相互作用を阻止する能力
につき試験するような分析系を作成することができる。
この方法で同定された小分子阻止剤は、抗炎症剤の候補
となる。
【００７６】第６に、これら分子を用いて、ＥＬＡＭに
対する白血球結合を阻止するような内生蛋白を確認する
こともできる。研究者は、この種の１つの分子、すなわ
ち内皮から結合ＰＭＮを脱着させる際に関与する白血球
付着阻止剤（ＬＡＩ）を一時的に確認した［ホイーラー
等、1988］。
【００７７】第７に、ＶＣＡＭ／ＩＣＡＭ融合蛋白を生
ぜしめることができる。両蛋白は数種の構造ドメインで
構成されることが知られている［シモンス等、1988］。
各蛋白の各種ドメインをコードするＤＮＡ配列を、たと
えばＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白の作成につき説
明した遺伝子融合技術を用いて融合させる。選択される
ドメインは、それぞれＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂ
リガンドおよびＩＣＡＭ１リガンドを結合する能力を持
ったものである。ＶＬＡ４およびＬＦＡ１（公知のリガ
ンド）を結合するドメインが好適である。これらＤＮＡ
配列の発現に際し産生されるポリペプチドは、リガンド
を有する細胞がＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂまたは
ＩＣＡＭ１もしくはその両者のいずれかに付着するのを
阻止するため有用である。
【００７８】最後に、ＥＬＡＭおよびＥＬＡＭリガンド
ＤＮＡ配列を用いて、ＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガン
ドの発現を翻訳レベルで介入する核酸分子を生成させる
ことができる。この手段は、特定ｍＲＮＡの翻訳をこの
ｍＲＮＡをアンチセンス核酸で遮蔽し或いはこれをリボ
チームで切断することにより阻止するためのアンチセン
ス核酸およびリボチームを利用する。これらの方法は炎
症状態を処置する際に有用である。
【００７９】アンチセンス核酸は、特定ｍＲＮＡ分子の
少なくとも１部に対し相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ分
子である［ワイントラウブ、1990；マルクス−セクラ、
1988］。細胞において、これらは前記ｍＲＮＡにハイブ
リッド化して二本鎖分子を形成する。細胞はこの二本鎖
形態でｍＲＮＡを翻訳しない。したがって、アンチセン
ス核酸はｍＲＮＡから蛋白への発現を妨げる。約15個の
ヌクレオチドのオリゴマーおよびＡＵＧ開始コドンにハ
イブリッド化する分子は特に効果的である。何故なら、
これらは合成が容易であると共に、これらをＥＬＡＭ生
産性細胞に導入する際に大分子よりも少ない問題しか提
起しないからである。アンチセンス法を用いて、インビ
トロにおける多くの遺伝子の発現を阻止した［マルクス
−セクラ、1988；ハンバー等、1988］。
【００８０】リボチームは、ＤＮＡ制限エンドヌクレア
ーゼと若干類似した方法で他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異
的に切断する能力を備えたＲＮＡ分子である。リボチー
ムは、或る種のｍＲＮＡがそれ自身のイントロンを切除
する能力を有するという観察から見出された。これらＲ
ＮＡのヌクレオチド配列を改変することにより、研究者
等はＲＮＡ分子内の特定ヌクレオチド配列を認識して切
断する分子を処理することができた［セッチ、1988］。
これらは配列特異性であるため、特定配列を持ったｍＲ
ＮＡのみが失活される。
【００８１】研究者等は２種類のリボチーム、すなわち
テトラヒメナ（Tetrahymena ）−型および「ハンマーヘ
ッド」−型を同定した［ハーゼルホッフおよびゲルラッ
ハ、1988］。テトラヒメナ−型リボチームは４−塩基の
配列を認識する一方、「ハンマーヘッド」−型は11〜18
−塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、標的ｍＲ
ＮＡ種類においてのみ生ずる傾向が大となる。したがっ
て、ハンマーヘッド型リボチームは、特定ｍＲＮＡ種類
を失活させるのにテトラヒメナ型リボチームより好まし
く、18−塩基認識配列はより短い認識配列よりも好適で
ある。
【００８２】ここに説明したＤＮＡ配列は、したがって
ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂ、ＣＤＸお
よびＶＬＡ４のためのｍＲＮＡに対するアンチセンス分
子を作成し、これらを切断するリボチームを作成するの
に用いることができる。
【００８３】アンチセンス分子およびリボチームは、付
着分子の発現を妨げる細胞分子中に導入することによ
り、炎症を処置する方法に使用することができる。ＥＬ
ＡＭは炎症の症状発生の間に内皮細胞で誘発され、さら
に治療剤が静脈内注射により容易に血管内皮細胞に供給
され得るので、内皮細胞はこの種の治療に魅力的な標的
であり、ただしアンチセンス分子もしくはリボチームは
適切な細胞に効果的に供給され得るものとする。
【００８４】研究者等は、これら分子を標的細胞に供給
すべく使用しうる２つの手段を示唆している。第１は、
抗−ＥＬＡＭアンチセンス核酸またはＥＬＡＭ−特異性
リボチームをｍＲＮＡ分子として発現するベクターによ
り標的細胞をトランスフェクトすることである［ハンバ
ー等、上記］。この手段はインビトロにて細胞ラインで
処理する際に極めて有用であるが、インビボでは効果的
でないと思われる。インビボ供給につき一層有望である
第２の手段は、リポソームに抗−ＥＬＡＭアンチセンス
分子、ＥＬＡＭ−特異性リボチーム、またはこれらを発
現するベクターを充填することである。これらリポソー
ムは、リポソームを炎症部位に指向させる抗−ＥＬＡＭ
モノクロ−ナル抗体を含有することもできる。この供給
形態は、マイナスフィードバック系を与える。何故な
ら、細胞上のＥＬＡＭの出現はこの細胞を抑制の標的に
するからである。さらにアンチセンス成分またはリボチ
ーム成分の浸透が成功すれば、ＥＬＡＭ産生を停止させ
ることにより標的としての細胞を除去する。
【００８５】本発明の他の特徴は、ここに説明したＥＬ
ＡＭおよびＭＩＬＡ ＤＮＡ配列の発現である。当業界
で周知されているように、ＤＮＡ配列は、これらを適切
な発現ベクターにて発現制御配列に作用結合させると共
にこの発現ベクターを用いて適切な単細胞宿主を形質転
換させることにより発現させることができる。
【００８６】発現制御配列に対する本発明のＤＮＡ配列
の作用結合は、勿論、既にＤＮＡ配列の１部でなくても
ＤＮＡ配列の上流における正確な読枠に開始コドンＡＴ
Ｇを与える。
【００８７】本発明のＤＮＡ配列を発現させるには、広
範な種類の宿主／発現ベクター組合せを用いることがで
きる。たとえば、有用な発現ベクターは染色体、非染色
体および合成ＤＮＡ配列の断片で構成することができ
る。適するベクターはＳＶ４０および公知の細菌プラス
ミドの誘導体、たとえばイー・コリプラスミドｃｏｌＥ
１、ｐＣＲ１、ｐＢＰ３２２、ｐＭＢ９およびその誘導
体、たとえばＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮ
Ａ、たとえば多数のファージλの誘導体、たとえばＮＭ
９８９、並びに他のファージＤＮＡ、たとえばＭ１３お
よびフィラメント状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラス
ミド、たとえば２μプラスミドもしくはその誘導体；真
核性細胞に有用なベクター、たとえば昆虫もしくは哺乳
動物細胞に有用なベクター；プラスミドとファージＤＮ
Ａとの組合せから誘導されるベクター、たとえばファー
ジＤＮＡもしくは他の発現制御配列を用いるよう改変さ
れたプラスミドなどを包含する。
【００８８】広範な種類の発現制御配列（作用結合され
たＤＮＡ配列の発現を制御する配列）をこれらベクター
で用いて、本発明のＤＮＡ配列を発現させることができ
る。この種の有用な発現制御配列は、たとえばＳＶ４０
もしくはアデノウィルスの早期および後期プロモータ、
ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣもしくはＴＲＣ系、ファー
ジλの主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート
蛋白の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼもし
くは他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼの
プロモータ（たとえばＰｈｏ５）、酵母α−接合因子の
プロモータ、並びに原核性もしくは真核性細胞またはそ
のウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られた他
の配列、並びにその種々の組合せを包含する。
【００８９】本発明のＤＮＡ配列を発現するには、広範
な種類の単細胞宿主細胞も有用である。これらの宿主は
周知の真核性および原核性宿主、たとえばイー・コリ、
シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、真菌類
（たとえば酵母）の菌株、並びに動物細胞、たとえばＣ
ＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、アフリカミ
ドリザル腎臓細胞（たとえばＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳ
Ｃ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０）、並びに組織培養
における昆虫細胞（たとえばＳｆ９）、ヒト細胞および
植物細胞を包含する。
【００９０】必ずしも全てのベクター、発現制御配列お
よび宿主が本発明のＤＮＡ配列を同等に充分発現するよ
う機能するとは限らないことが了解されよう。さらに、
必ずしも全ての宿主が同じ発現系により同等に機能する
とき限らない。しかしながら当業者は、本発明の範囲を
逸脱することなく、所望の発現を達成するよう無駄な実
験なしに適切なベクター、発現制御配列および宿主を選
択することができる。たとえば、ベクターを選択する
際、ベクターが宿主中で機能せねばならないので、この
宿主を考慮せねばならない。ベクターのコピー数、この
コピー数を制御する能力、およびベクターによりコード
される任意の他の蛋白（たとえば抗生物質マーカー）の
発現も考慮される。
【００９１】発現制御配列を選択する際は、各種の因子
が一般に考慮される。これらは、たとえば系の相対強
度、その制御性および発現すべき特定のＤＮＡ配列もし
くは遺伝子との適合性を包含し、特に有力な二次構造を
考慮せねばならない。適する単細胞宿主は、たとえば選
択されたベクターに対する相容性、分泌特性、蛋白を正
確に折重ねる能力、およびその発酵要求性、並びに発現
すべきＤＮＡ配列によりコードされる生産物の主宿に対
する毒性、さらに発現生産物の精製容易さを考慮して選
択される。
【００９２】これらおよび他の因子を考慮して、当業者
は発酵または大規模の動物培養に際し本発明のＤＮＡ配
列を発現する各種のベクター／発現制御配列／宿主の組
合せを作成することができる。
【００９３】ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１および１ｂ、ＣＤ
ＸおよびＶＬＡ４に対する抗体の存在は、他のＥＬＡＭ
およびＥＬＡＭリガンドに関する他の分離方法を可能に
する。この方法は、イディオタイプとして知られた抗体
特性を利用する。各抗体は、抗原に対し特異性の独特な
領域を有する。この領域をイディオタイプと称する。抗
体自身は抗原決定子を有し、抗体のイディオタイプはそ
の分子に独特な抗原決定子である。抗体で生物を免疫化
することにより、イディオタイプを認識する抗体を含
め、これらを認識する「抗−抗体」を生ぜしめることが
できる。他の抗体のイディオタイプを認識する抗体を抗
−イジィオタイプ抗体と称する。或る種の抗−イディオ
タイプ抗体は、抗体が認識する初期抗原の形状に類似す
ると共に、抗原の「内部イメージ」を有すると言われる
［ケネディー、1986］。抗原がリガンドである場合、或
る種の抗−イディオタイプはそのリガンドリセプタに結
合することができる。研究者等は、インシュリン、アン
ギオテンシンII、アデノシンＩ、β−アドレナリンおよ
びラット脳ニコチンのためのリセプタ並びに麻酔性リセ
プタに結合する抗−イディオタイプを包含するこれら数
種を同定した［カールソンおよびグラッド、1989］。
【００９４】この現象を利用して、抗−イディオタイプ
抗体を用いることにより他のＥＬＡＭおよびＥＬＡＭリ
ガンドを分離することができる。抗−イディオタイプを
用いて、初期抗原に結合する分子をスクリーニングする
ことができる。たとえば、この技術を用いて他のＥＬＡ
Ｍリガンドを同定することができる。
【００９５】同様なドメイン構造を有する関連ＥＬＡＭ
が存在することを突き止めた（すなわちＶＣＡＭ１およ
びＶＣＡＭ１ｂ）。遺伝子組換の結果、１個もしくはそ
れ以上のドメインを有する数種の付着分子を細胞表面上
に存在させることができる。任意の共有ドメインを認識
する抗−イディオタイプ抗体は、ビオアッセイにより同
定されないＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドを免疫化
学的に分離するのに有用であり、これは構造でなく蛋白
の機能に依存する。
【００９６】本発明を一層良好に理解しうるよう、以下
に実施例を示す。これら実施例は例示の目的であって、
決して本発明の範囲を限定するものと解釈してはならな
い。
【００９７】
【実施例】実施例Ｉ ＥＬＡＭ配列について富化したｃＤＮＡサブライブラリ
の調製 次のようにして、ＥＬＡＭ配列について富化したｃＤＮ
Ａサブライブラリを調製した：臍帯からヒト臍静脈内皮
細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を単離し、この細胞を予備培養で
生育させ、ギムブロン（１９７６）に記載されたように
これらを継代した。ライブラリ作成のため、４〜５継代
のＨＵＶＥＣｓを使用した。細胞を誘導してＥＬＡＭｓ
についてのｍＲＮＡを生産するため、群集モノレイヤを
３７℃で２．５時間、組換えヒトＩＬ−１β（１０単位
／ｍｌ）を用いてインキュベートした。これらの細胞か
らｍＲＮＡを単離し、当業界で周知の技術を使用してこ
れをｃＤＮＡに逆転写させた（グブラーとホフマン、１
９８３）。標準的手順を使用し、次の配列を有するＮｏ
ｔＩ−ＢｓｔＸＩリンカ／アダプタに二本鎖ｃＤＮＡを
連結した： ５′GCG GCC GCT TTA GAG CAC A ３′ ３′CGC CGG CGA AAT CTC ５′ その後、ブリアン・シードの手順により、ベックマン
（登録商標）ＳＷ６０ローター中で３時間５０，０００
ｒｐｍで２２℃にて、４．２ｍｌ５〜２０％酢酸カリウ
ムグラジエント、２ｍＭＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌエチジ
ウムブロミドによりｃＤＮＡを大きさにより選択した
（同様にマニアティスら、１９８２、第２７８頁参
照）。５００塩基対より大きいｃＤＮＡ断片をプールし
た。その後ベクタ、ｐＣＤＭ８（ブリアン・シードより
贈呈）を調製した。このプラスミドをＢｓｔＸＩにより
消化した。４００塩基対の近接断片を除去するため、こ
の混合物を前記したように酢酸カリウムグラジエントに
より遠心し、大きな断片を単離した。アガロースゲル電
気泳動によりこの断片を更に精製した後、このｃＤＮＡ
をベクタと連結した。このようにして、誘導ＨＵＶＥＣ
ｓ中で発現されるｍＲＮＡについてのＤＮＡ配列を含有
する組換えＤＮＡ分子を創製した。これらのプラスミド
を使用してイー・コリＭＣ１０６１Ｐ３を形質転換し
た。この結果、ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｍＲＮＡにつ
いてのｃＤＮＡライブラリからなる７×１０6 組換えク
ローンのコレクションを得た。
【００９８】このｃＤＮＡライブラリからＥＬＡＭｃＤ
ＮＡ配列について富化したサブライブラリを調製するた
め、最初にＥＬＡＭ配列富化減算プローブを調製した。
前記したように、ＩＬ−１βにより誘導したＨＵＶＥＣ
ｓからｃＤＮＡを調製し、これを32Ｐによりラベルした
（デービス、１９８６）。その後、誘導されなかったＨ
ＵＶＥＣｓからｍＲＮＡを単離した。未誘導ｃＤＮＡ配
列を誘導配列から減算するため、ｍＲＮＡとｃＤＮＡと
をハイブリダイズさせ、デービス（１９８６）により記
載されたようにして、ｍＲＮＡにハイブリダイズしなか
ったｃＤＮＡを単離した。単離したｃＤＮＡを他のラウ
ンドの減算に供し、富化のレベルを増加させた。結局、
ＥＬＡＭ配列について富化された減算プローブの３つの
バッチを調製した。
【００９９】ノーザンブロットによりプローブの精製の
レベルを試験した（レーラーら、１９７７）。誘導およ
び未誘導ＨＵＶＥＣｓに由来するポリＡ＋ｍＲＮＡの平
行レーンによりゲルを走らせ、これをジーン・スクリー
ン（登録商標）（ニュー・イングランド・ヌクレア）に
ブロットした。ハイブリダイゼーションおよび続くオー
トラジオグラフィにより、プローブは誘導レーン中で４
ｋｂのバンドに強固に結合したが、未誘導レーンではバ
ックグラウンドを越えた結合はしないことが明らかとな
った。場合により、誘導レーン中の他のメッセージより
弱いハイブリダイゼーションバンドを認めた。
【０１００】減算プローブを使用し、ＩＬ−１β誘導配
列について富化されたイー・コリＭＣ１０６１Ｐ３中で
ｃＤＮＡライブラリを作成した。ＩＬ−１β誘導ＨＵＶ
ＥＣｃＤＮＡライブラリの百万のクローンをプレートア
ウトすることにより開始した。１２．５μｇ／ｍｌアン
ピシリンおよび７．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含
有するＬＢ寒天上で、ジーン・スクリーン・プラス（登
録商標）フィルタ（ニュー・イングランド・ヌクレア）
上に百万のコロニーをプレートし、これらを３７℃で１
２時間生育させた。それぞれのマスターから２つのレプ
リカフィルタ（リフト）を作成した。１２．５μｇ／ｍ
ｌアンピシリンおよび７．５μｇ／ｍｌテトラサイクリ
ンを含有するＬＢ寒天上でこれらを４時間生育させ、２
５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒
天上でこれらを１６時間増幅した。製造業者の仕様書に
従ってフィルタを溶解し、その後これらをプラーク・ス
クリーン（登録商標）緩衝液（０．０５Ｍトリス−ＨＣ
ｌｐＨ７．５、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、０．１％ピ
ロリン酸ナトリウム、０．２％ポリビニルピロリドン
（ＰＶＰ）、０．２％フィコール−４００、０．２％Ｂ
ＳＡ）中で予備ハイブリダイズした。１０％硫酸デキス
トランおよび１００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ並びに約１
×１０7 ｃｐｍの減算ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｃＤＮ
Ａを含有する５０ｍｌのプラーク・スクリーン（登録商
標）緩衝液中で、フィルタを６５℃で４０時間ハイブリ
ダイズさせた。その後、６５℃にてプラーク・スクリー
ン（登録商標）緩衝液で２回、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ
で２回、そして１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで２回フィルタ
を洗浄した。その後このフィルタを５日間フィルムに露
呈した。
【０１０１】オートラジオグラフを用いてマスターフィ
ルタをアニールし、滅菌した楊枝を用いてコロニーをフ
ィルタから掻き取ることによりプローブにハイブリダイ
ズするコロニーを選択した。それぞれの掻き取り物を９
６穴マイクロタイタプレートの１つの穴に入れ、７．５
μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび１２．５μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含有するＬＢブロスで満たした。接種
後、マイクロタイタプレートを３７℃で一夜インキュベ
ートした。細胞が成育したならば、それぞれの穴に対
し、最終濃度２０％でグリセリンを添加し、プレートを
−７０℃で保存した。このようにして、マスターライブ
ラリフィルタから８６４のＥＬＡＭ配列について富化し
たｃＤＮＡサブライブラリからなるコロニーを単離し
た。プレートする密度のため、富化したサブライブラリ
の全てのコロニーが純粋ではないことを銘記する。
【０１０２】富化したｃＤＮＡサブライブラリを用いて
並列に２つのセットの手順を行った。実施例II ＥＬＡＭ１を発現するクローンの単離 第１の手順で、富化したサブライブラリからＥＬＡＭ１
を発現するクローンを単離した。このサブライブラリを
選択して、高レベルの過渡的発現についてコンピテント
なセルライン、アフリカミドリザルのセルラインＣＯＳ
７に感染させた。この細胞をプレートし、スフェロプラ
スト融合（サンドリ−ゴールディンら、１９８１）によ
りサブライブラリを感染させた。感染後４８時間に、Ｈ
Ｌ−６０細胞（炎症剤により刺激された内皮細胞に結合
することが知られたセルライン）に結合する能力によ
り、ＥＬＡＭ１の発現についてＣＯＳ７セルラインをア
ッセイした。
【０１０３】次のようにしてアッセイを行った：ブリー
ナンとパリッシュ法（ブリーナンとパリッシュ、１９８
４）により、カルボキシフルオロセイン二酢酸を用いて
ＨＬ−６０細胞をラベルした。すなわち、ＨＬ−６０細
胞を１×１０7 細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ／１０％Ｆ
ＣＳに再懸濁し、アセトン中の１０ｍｇ／ｍｌの保存溶
液から０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度でカルボキシフルオ
ロセイン二酢酸を添加した。室温で１５分間ラベルした
ＨＬ−６０細胞と共にＣＯＳ７細胞をインキュベートし
た。ＲＰＭＩ／１％ＦＣＳにより細胞を３〜４回洗浄し
た。蛍光顕微鏡により付着性ＨＬ−６０細胞の群集につ
いてペトリ皿を検査した。ＨＬ−６０細胞の群集を有す
る細胞プレートの領域を取り上げ、０．６％ＳＤＳ、１
０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８中で溶解させた後、ヒルト（ヒ
ルト、１９６７）の方法によりプラスミドを遊離させ
た。これらのプールしたプラスミドを使用してイー・コ
リＭＣ１０６１Ｐ３を形質転換した。これらの形質転換
体からコロニーを生育させ、ＣＯＳ７細胞を用い、続い
てＨＬ−６０付着についてのアッセイを用いて第２回の
スフェロプラスト融合を行った。付着について陽性であ
った細胞の中から１つを選択し、これからプラスミドを
単離した。このプラスミドＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン
６を含有する培養物を選定した。このプラスミドを、ブ
タペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナ
ル・インコ、６１１ピー・ハモンド・フェリー・アール
ディ、リンチカム、Ｍｄ、２１０９０（米国）に対し、
１９８９年４月２０日に寄託した。これは次のように同
定される：ＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６／イー・コリ
ＭＣ１０６１Ｐ３受託番号ＩＶＩ−１０２０４。
【０１０４】実施例III ＥＬＡＭ１配列についてのｃＤＮＡ挿入物の単離 第２の手順で、ＩＬ−１β誘導ｃＤＮＡ配列についての
ｃＤＮＡ挿入物を単離した。富化したライブラリの８６
４のコロニーから２４を無作為に選択し、マニアティス
のアルカリ性ミニ調製手順を使用してこれらからプラス
ミドを単離した（マニアティス、１９８２）。ＸｈｏＩ
またはＮｏｔＩによりプラスミドを消化し、１％アガロ
ースゲル上で断片を単離した。３ｋｂを越える大きさの
挿入物を有する２つのプラスミドをこのゲルから同定
し、これらの挿入物を単離し、32Ｐによりこれらをラベ
ルした（フェインバーグとボーゲルスタイン、１９８３
および１９８４参照）。
【０１０５】その後これらの挿入物を用いてノーザンブ
ロットを前記したようにして行った。両者の挿入物は、
誘導ＨＵＶＥＣｍＲＮＡレーン中で４ｋｂのバンドにハ
イブリダイズしたが、未誘導ＨＵＶＥＣｍＲＮＡレーン
にはハイブリダイズしなかった。また、この挿入物は、
ＥＬＡＭ１発現プラスミドＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン
６（前記）に交叉ハイブリダイズした。これらの挿入物
を、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼにより処理したＮ
ｏｔＩ消化ｐＮＮ１１に挿入した。制限消化および新し
い合成断片による置換により、市販のプラスミドｐＵＣ
８（ファルマシアＰＬバイオケミカルス）から合成ポリ
リンカを除去することにより、配列決定プラスミドｐＮ
Ｎ１１を作成した。複製開始点を与えアンピシリン耐性
を与えるｐＵＣプラスミドに共通の２．５ｋｂ骨格はそ
のまま残した。ｐＮＮ１１の新しい合成部分を図２に示
す。これらの新しい構成物をそれぞれｐＳＱ１４８およ
びｐＳＱ１４９と呼ぶ。
【０１０６】実施例IV ＥＬＡＭ１のＤＮＡ配列 プラスミドｐＳＱ１４８およびｐＳＱ１４９の挿入物の
全ＤＮＡ配列、およびＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６の
挿入物の５′末端の配列の６２４ヌクレオチドを決定し
た。マキサム−ギルバート法（マキサムとギルバート、
１９８０）を使用した。これらの配列は顕著な重複を有
するため、ＥＬＡＭｃＤＮＡの複合配列、３８６３ヌク
レオチドの配列を得た。この配列は、５′非翻訳領域の
１４０ヌクレオチド、６１０アミノ酸をコードする１８
３０ヌクレオチド、並びに３′非翻訳領域の１８９３ヌ
クレオチド（翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグ
ナルを含む）よりなる。推論されたアミノ酸配列から誘
導された成熟蛋白質をＥＬＡＭ１とし、コード領域をＥ
ＬＡＭ１ＤＮＡ配列とした。ＥＬＡＭ１のｃＤＮＡ配列
を図１に示す。
【０１０７】ジーンバンク・データベース（解放５８、
１９８８年１２月）の検索により、ＥＬＡＭ１のＤＮＡ
配列は、公知のＤＮＡ配列とは顕著な相同性を有さない
ことが明らかになった。
【０１０８】このｃＤＮＡ配列を使用してＥＬＡＭ１ア
ミノ酸配列を推論した。これも図１に示す。この配列の
解析により、次の特性が明らかになった。この蛋白質
は、シグナル配列に特徴的な疎水性Ｎ−末端配列を有す
る（フォン・ヘイジン、１９８６）。蛋白質配列決定で
は、シグナル開裂部位および成熟Ｎ−末端は決定しなか
ったが、フォン・ヘイジンによれば、成熟Ｎ−末端アミ
ノ酸はトリプトファン、図１のヌクレオチド番号２０４
であると考えられる。ポリペプチドの外部ドメインは、
シグナル配列を含む約５５４アミノ酸であり、この後に
２４アミノ酸の疎水性膜横断領域が続く。この蛋白質
は、３２アミノ酸の短い、荷電したサイトプラズム尾部
を有する。この蛋白質はシステインに富み、１１の可能
なＮ−グリコシル化部位を含むことを銘記する。
【０１０９】ＥＬＡＭ１のアミノ酸配列とＭＢＲＦおよ
びＮＥＷ蛋白質データベースの他の蛋白質とを比較し、
相補的Ｃ２前駆体、β−２糖蛋白質Ｉ、Ｃ４ｂ結合蛋白
質、相補的因子Ｂ、相補的因子Ｈ、ドロソフィラのノッ
チ蛋白質、ＩｇＥレセプタヘパチックレクチン、並びに
凝集因子ＩＸおよびＸ前駆体を含む幾つかの蛋白質との
相同性を認めた。よって、前記した蛋白質との相同性に
基き、ＥＬＡＭ１を少なくとも３つのドメインに分割す
ることができる：（１）レクチン様ドメイン（図１のヌ
クレオチド２０４〜５６３）、（２）ＥＧＦ様ドメイン
（ヌクレオチド５６４〜６６８）、並びに（３）リピー
ト当り６のシステイン残基を含有する５９〜６３アミノ
酸のコンセンサスシステインリピート単位（ヌクレオチ
ド６６９〜１７９３）。それぞれのリピート中の他の変
化しないアミノ酸は、プロリン、グリシン並びにトリプ
トファンである。
【０１１０】実施例Ｖ ＥＬＡＭ１を認識するモノクローナル抗体 ＥＬＡＭ１を認識するモノクローナル抗体を作成するた
め、実施例Ｘ（後記）で行ったものと主として同様にし
てハイブリドーマを調製した。ただし、ＩＬ−１β誘導
ＨＵＶＥＣｓに対するＨＬ−６０細胞付着を遮断する能
力について抗血清を試験することにより抗ＥＬＡＭ１抗
体を生産するマウスを同定した。
【０１１１】幾つかのアッセイを使用し、これらの抗Ｅ
ＬＡＭ１モノクローナルを生産するものにつきこの様式
で産生したハイブリドーマを検索した。第１に、ＥＬＡ
Ｍ１を安定に発現するセルラインに結合する能力を有す
る抗体について、培養上澄を試験した。このセルライン
は、ＥＬＡＭ１動物細胞発現ベクタ、ｐＢＧ３４１ｊｏ
ｄ．ＥＬＡＭにより感染したＣＨＯ−ＤＨＦＲ- のライ
ンとした。ＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ配列をｐＣＤ
Ｍ８クローン６からｐＢＧ３４１．ｊｏｄのＮｏｔＩ部
位（実施例ＶIII、後記に記載）に導入することにより
このプラスミドを創製した。ＥＬＡＭ１発現ＣＨＯ−Ｄ
ＨＦＲ- 誘導セルラインは、ＨＬ−６０細胞に対する付
着アッセイを使用して検出した。
【０１１２】第２に、サイトカイン誘導ＨＵＶＥＣｓに
結合する能力（コントロールには結合しない）について
ハイブリドーマ培養上澄を検索した。
【０１１３】第３に、サイトカイン誘導ＨＵＶＥＣモノ
レイヤに対するＨＬ−６０細胞付着を阻害するこれらの
能力につきこれらを試験した。
【０１１４】３つの全てのアッセイで陽性の結果を与え
た１つのハイブリドーマクローン、ＢＢ１１を同定し
た。ＢＢ１１免疫沈殿蛋白質は、ＥＬＡＭ１発現ＨＵＶ
ＥＣｓおよびＣＯＳ細胞に由来する約１１０ｋＤおよび
９６ｋＤの分子量を有し、ＥＬＡＭ１の種々のグリコシ
ル化形態を示す（ベビラッカら、１９８９）。またこれ
は、ＥＬＡＭ１発現ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞に対するＨ
Ｌ−６０細胞の付着を完全に遮断した。これはＩｇＧ2b
クラスのイムノグロブリンを生産した。ブタペスト条約
により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、
６１１ピー・ハモンド・フェリー・アールディ、リンチ
カム、Ｍｄ、２１０９０（米国）に対し、１９８９年１
２月１３日に寄託した。これは次のように同定される：
モノクローナル抗体ＣＤＢ．ＢＢ１１．ＢＣ６受託番号
ＩＶＩ−１０２２０。
【０１１５】実施例VI ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂを発現するクローンの単
離 更に、リンパ球およびリンパ球様セルラインに結合する
２つの異なるＥＬＡＭｓの特徴を調べクローン化した。
第１の工程として、４、２４、または４８時間、ＩＬ−
１βまたはＴＮＦにより誘導したＨＵＶＥＣｓに対し、
ＲＡＭＯＳ、Ｂ−リンパ球様ライン、ＪＵＲＫＡＴ、Ｔ
−リンパ球様ラインの結合経路の特徴を調べた。ＲＡＭ
ＯＳおよびＪＵＲＫＡＴ結合の両者は、ＩＬ−１βまた
はＴＮＦによる誘発の４時間後に最大となり、結合は２
４時間、誘発後４８時間維持されることを認めた。ＲＡ
ＭＯＳ結合は温度感受性であり、室温では進行するが４
℃では進行しなかった。ＪＵＲＫＡＴ結合は４℃で減少
したが、完全には除去されなかったため、ＪＵＲＫＡＴ
は、温度感受性および温度非感受性の両者の成分を示し
た。ＪＵＲＫＡＴ細胞により免疫したマウス由来の抗血
清は、ＨＵＶＥＣｓに対するＪＵＲＫＡＴおよびＲＡＭ
ＯＳ細胞の両者の結合を阻害し、ＲＡＭＯＳおよびＪＵ
ＲＫＡＴがＭＩＬＡを共有することを示した。誘発後４
〜４８時間で、ＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴの両者
は、ＥＬＡＭ１を発現するＣＯＳまたはＣＨＯ細胞に結
合せず、ＨＵＶＥＣｓ上の少なくとも１つの他の誘導性
ＥＬＡＭの存在を示した。
【０１１６】ＨＵＶＥＣｓに結合するＲＡＭＯＳおよび
ＪＵＲＫＡＴに含まれるＥＬＡＭｓを発現するクローン
を単離するため、実施例II、前記に記載した方法によ
り、先に記載したＥＬＡＭ富化ＨＵＶＥＣｃＤＮＡサブ
ライブラリを検索した。サブライブラリ感染ＣＯＳ７細
胞と共に、カルボキシフルオレセイン二酢酸ラベルした
ＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴ細胞をインキュベートし
た。結合細胞の群集を有する細胞プレートの領域を取り
出して溶解し、プラスミドを得、イー・コリに形質転換
し、先に記載したようにＣＯＳ７細胞中で再アッセイし
た。再アッセイで陽性であった形質転換体に由来する個
々の細菌コロニーからプラスミドを単離した。これらの
プラスミドをＣＯＳ７細胞に個々に感染させ、ＲＡＭＯ
ＳおよびＪＵＲＫＡＴへの付着についての試験で陽性の
プラスミドを同定した。このプラスミドからｃＤＮＡ挿
入物を摘出し、放射能ラベルし、レーラ（１９７９）の
手順に従ってノーザンブロットのプローブとして使用し
た。このプローブは、長さ約３．４ｋｂのＲＮＡ分子種
にハイブリダイズした。このＲＮＡは、未誘導ＨＵＶＥ
ＣＲＮＡにおいては検出できず、ＩＬ−１βによる処理
の５、１０、３０または６０分後にかろうじて検出する
ことができたが、ＩＬ−１βによる処理の２、２４、４
８並びに７２時間後には十分に存在した。
【０１１７】プラスミドＡＭｐＣＤＭ８クローン４１を
作成した。このプラスミドを、ブタペスト条約により、
イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、リンチカ
ム、Ｍｄ（米国）に対し、１９８９年５月２４日に寄託
した。これは次のように同定される： ＡＭｐＣＤＭ８クローン４１／イー・コリＭＣ１０６１
Ｐ３ 受託番号ＩＶＩ−１０２０６。
【０１１８】また、他のＶＣＡＭからｃＤＮＡを単離し
た。ＡＭｐＣＤＭ８クローン４１からラベルしたＶＣＡ
Ｍ１コード挿入物を用いてＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｃ
ＤＮＡライブラリ（実施例Ｉ）を検索した。これらのク
ローンの１つである１Ｅ１１を配列決定した。ＸｂａＩ
による制限マッピングによる分析により、クローン４１
挿入物より長い幾つかのクローンを認めた。これらの１
つのクローンである１Ｅ１１を配列決定した。これを、
ブタペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショ
ナル・インコ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１９
８９年１２月７日に寄託した。これは次のように同定さ
れる：ＶＣＡＭ１Ｂクローン１Ｅ１１ｐＣＤＭ８／イー
・コリＭＣ１０６１ｐ３受託番号ＩＶＩ−１０２１６。
【０１１９】また、他のＥＬＡＭｓについてのＤＮＡ配
列を単離した。ＩＬ−１β誘発後４８時間に渡りＨＵＶ
ＥＣｓからｍＲＮＡを集めた。ＥＬＡＭ１およびＶＣＡ
Ｍ１および１ｂについてｃＤＮＡ配列を単離するのに使
用したものと同様にしてＥＬＡＭｃＤＮＡ配列を単離し
得る。
【０１２０】また、ＴＮＦ、ＬＴ、ＬＰＳ、インターフ
ェロンのような他の炎症剤、またはこの種の薬剤の組合
せを用いて誘発することにより他のＥＬＡＭｓを同定し
得る。
【０１２１】実施例VII ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのＤＮＡ配列 マキサムとギルバート（１９８０）の方法により、プラ
スミドＡＭｐＣＤＭ８クローン４１の挿入物の全ＤＮＡ
配列を決定した。この配列は、１０６ヌクレオチドの
５′非翻訳領域、１９４１ヌクレオチドをコードする６
４７アミノ酸、並びに翻訳停止コドンを含む７６４ヌク
レオチドの３′非翻訳領域よりなる。このｃＤＮＡ配列
から誘導した蛋白質をＶＣＡＭ１とし、コード配列をＶ
ＣＡＭ１ＤＮＡ配列とした。図３にＶＣＡＭ１のｃＤＮ
Ａ配列を示す。ＶＣＡＭ１の推定されるアミノ酸配列を
同様に図３に示す。
【０１２２】また、マキサムとギルバート（１９８０）
の方法により、プラスミドＶＣＡＭ１ｂｐＣＤＭ８１Ｅ
１１の挿入物のＤＮＡ配列を決定した。この配列は、９
９ヌクレオチドの５´非翻訳領域、２２１７ヌクレオチ
ドをコードする７３９アミノ酸、並びに翻訳停止コドン
を含む７６４ヌクレオチドの３′非翻訳領域よりなる。
ｃＤＮＡ配列から誘導された成熟蛋白質をＶＣＡＭ１ｂ
とし、コード配列をＶＣＡＭ１ｂＤＮＡ配列とした。ｃ
ＤＮＡ配列および推定されたＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配
列を図４に示した。
【０１２３】ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのＤＮＡお
よびアミノ酸配列の比較により、１つの有意な差以外
は、これらは実質的に同一であることが明らかとなっ
た。すなわち、ＶＣＡＭ１ｂは、コード領域の中間付近
に２７６ヌクレオチドの挿入を含む。これらのヌクレオ
チドは、ＶＣＡＭ１ドメイン３の末端とＶＣＡＭ１ドメ
イン４の開始部との間に位置する８４アミノ酸の余分な
ドメインを形成する９２の付加的なアミノ酸をコードす
る。ＶＣＡＭ１ドメイン３Ｂとしたこのドメインの意義
を以下に論ずる。
【０１２４】配列の解析により次の特性が明らかとなっ
た：ＶＣＡＭ１ポリペプチドは、シグナル配列（フォン
・ヘイジン、１９８６）を特徴とする疎水性Ｎ−末端配
列を有する。蛋白質配列決定では、シグナル開裂部位お
よび成熟Ｎ−末端を決定しなかったが、ヘイジンによ
り、成熟蛋白質のＮ−末端アミノ酸は、図３のヌクレオ
チド番号１７９のフェニルアラニンと推定される。この
ポリペプチドの細胞外ドメインは、シグナル配列を含む
約６０６アミノ酸であり、その後に２２アミノ酸の疎水
性膜横断領域が続く。この蛋白質は、１９アミノ酸から
なる短い荷電したサイトプラズム尾部を有する。この蛋
白質は、６の可能なＮ−グリコシル化部位を含有するこ
とを銘記する。
【０１２５】同様に、成熟ＶＣＡＭ１ｂ蛋白質のＮ−末
端アミノ酸はフェニルアラニンの筈であり、これは図４
のヌクレオチド番号１７２である。このポリペプチドの
細胞外ドメインはＶＣＡＭ１より長く、シグナル配列を
含む約６９８アミノ酸であり、この後に２２アミノ酸の
疎水性膜横断領域が続く。この蛋白質は、１９アミノ酸
の短い荷電したサイトプラズム尾部を有する。この蛋白
質は７の可能なＮ−グルコシル化部位を含有することを
銘記する。
【０１２６】ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸
配列とＮＢＲＦおよびＮＥＷ蛋白質データベース中の他
の蛋白質とを比較することにより、非特異的交叉反応抗
原（ＮＣＡ）、胆汁糖蛋白質１（ＢＧ１）、神経細胞付
着分子（ＮＣＡＭ）、発癌胚抗原（ＣＥＡ）、免疫グロ
ブリンα鎖一定領域、Ｔ細胞レセプタ（ＴＣＲ）αおよ
びβ鎖変動領域、並びにミエリン関連糖蛋白質（ＭＡ
Ｇ）を含む幾つかの蛋白質との顕著な相同性が明らかと
なった。より少ない相同性が、ミオシン軽鎖キナーゼ、
リブロース二リン酸カルボキシラーゼ、アデノウイルス
Ｅ１Ａ２８Ｋ蛋白質、シウドウリジン合成酵素、並びに
キシルロキナーゼについて認められる。ＶＣＡＭ１およ
び１ｂ並びにＶＣＡＭ１および１ｂＤＮＡ配列は、先に
記載したＥＬＡＭ１（前記）と全く相同性を示さず、こ
れとは異なるものである。
【０１２７】重要なことは、ＮＣＡ、ＢＧ１、ＮＣＡ
Ｍ、ＣＥＡ、ＭＡＧ並びにＴＣＲが免疫グロブリンスー
パーファミリーの一員であることである（ウイリアムス
とバークレイ、１９８８、フンカピラーとフッド、１９
８９）。このファミリーの構成員は、イムノグロブリン
（Ｉｇ）分子の基本構造単位、Ｉｇ相同単位に対して相
同な１以上の領域の存在により特定される（フンカピラ
ーとフッド、１９８９）。これらの単位は、長さ約７０
〜１１０残基の一次アミノ酸配列を特徴とし、５０〜７
０残基に及ぶ実質的に変動しないジスルフィド架橋を有
し、「抗体の折り畳み」と呼ばれる三次構造を確立する
際に包含される幾つかの他の比較的保存された残基を有
する。これらの単位は、更に３つの群に分割することが
できる。すなわち、Ｖ、Ｃ１およびＣ２（ウイリアムス
とバークレイ、１９８８）、またはＶ、ＣおよびＨ（フ
ンカピラーとフッド、１９８９）であり、内部システイ
ン離間、β鎖の数、並びに保存残基の種類を含む種々の
基準に基く。これらの基準を推論されたＶＣＡＭ１の一
次配列に適用すると、この配列を６のＩｇ単位に分割す
ることができ、これをドメイン１〜６とすると、その全
てはＣ２またはＨサブセットとなり、それぞれ約１００
アミノ酸の長さである。図３に示すように、６のドメイ
ンの変動しないジスルフィド架橋は、システイン４７お
よび９５（ドメイン１）、１３７および１９５（ドメイ
ン２）、２４６および２９１（ドメイン３）、３３３お
よび３９１（ドメイン４）、４４２および４８７（ドメ
イン５）並びに５３１および５７６（ドメイン６）の間
に存在する。
【０１２８】前記したように、ＶＣＡＭ１ｂは７のドメ
インを有する。付加的なドメインをドメイン３Ｂとし
た。このドメインは、図４のヌクレオチド１０２７で開
始しヌクレオチド１３０５で終了するＶＣＡＭ１ｂの付
加的な２７６ヌクレオチドに含まれる。ドメイン１〜３
に及ぶＤＮＡ配列は、ドメイン３Ｂ〜５に及ぶＤＮＡ配
列に対し７２％相同である。ポリペプチドレベルでは、
それぞれドメイン１および３Ｂ、２および４、並びに３
および５の間に顕著な相同性がある。図５および図６
に、ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのドメイン構造を示
す。
【０１２９】ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのｍＲＮＡ
は２つの機構により生成し得る。これらは同一の遺伝子
生成物の交互にスプライスされた形態を与えることがで
きるか、別のＶＣＡＭ対立遺伝子の生成物たり得る。こ
れらの可能性の区別に供すべく、サイトカイン誘発後の
異なる時点で、３つの個体からのＶＣＡＭ１およびｍＲ
ＮＡを試験した。３つの異なる個体に由来する臍帯から
ＨＵＶＥＣｓを調製し、緒のサンプルを＃１、＃２、並
びに＃３とラベルした。それぞれの調製物を４つの別の
フラスコに分け、ＴＮＦによる０（未処理）、２．５、
２４並びに４８時間の処理に供した。ＶＣＡＭ１および
ＶＣＡＭ１ｂｍＲＮＡの相対量は、ノーザンブロットお
よびそれぞれの形態について特異的な合成オリゴヌクレ
オチドによるプローブによって決定した。ＶＣＡＭ１ｂ
は、３つの臍帯調製物の全てにおいて、明らかに主要な
存在するｍＲＮＡであった。ＶＣＡＭ１は緒＃１および
＃３に存在し、２．５時間の誘発時点で最も優勢であっ
たが、緒＃３ＶＣＡＭ１も２４および４８時間において
存在した。緒＃２細胞は殆どまたは全くＶＣＡＭ１ｍＲ
ＮＡを有さなかったが、ＶＣＡＭ１ｂｍＲＮＡの量は、
緒＃１および＃３に由来するＨＵＶＥＣｓ中のものと対
比し得た。これらの２つの生成物が生成する機構はなお
不明であるが、交互にスプライスされる可能性がある。
２つのｍＲＮＡは、スプライス部位の可能性のある点に
おいて１つのドメインの欠損以外は同一であるためであ
る。そのドメイン間の位置（フンカピラーとフッド、１
９８９）およびスプライス部位に典型的なジヌクレオチ
ドＡＧの存在（ブレサナクとチャンボン、１９８１）に
より判断したものである。更に、交互スプライシング
は、ＶＣＡＭ１が明らかに最も関連するＩｇ遺伝子スー
パーファミリーの他の構成員に共通である（フンカピラ
ーとフッド、１９８９）。
【０１３０】作用的には、ＶＣＡＭ１の２つの形態の差
異は最小であると考えられる。両者の形態は、ＣＯＳ７
細胞中で過渡的に発現された場合、ＲＡＭＯＳ細胞に結
合し、この結合はＭｏａｂ１４Ｂ９により完全に阻害さ
れたことから、同一のエピトープがそれぞれの場合の結
合に関与することを示す。更に、このエピトープは、最
初の３つのドメイン内に位置することを示したが、これ
は両者の形態に共通である（実施例VIII、前記参照）。
【０１３１】実施例VIII 組換え可溶性ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂ 組換え可溶性ＥＬＡＭ１（ｒｓＥＬＡＭ１）を発現する
ベクタを作成した。このベクタをｐＳＡＢ１０８と呼
ぶ。ｐＳＡＢ１０８により発現されるｒｓＥＬＡＭ１
は、図１のヌクレオチド１４１〜ヌクレオチド１９７０
のＤＮＡ配列によりコードされるＥＬＡＭ１の細胞外ド
メインの一部を含有する。
【０１３２】ｐＳＡＢ１０８を作成するため、第１にｒ
ｓＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ断片を創製した。Ｍｌ
ｕＩおよびＮｏｔＩによりＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン
６を消化した。これにより、ＥＬＡＭ１をコードするＤ
ＮＡ配列を含む３．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ウシ腸
アルカリ性ホスファターゼ（実施例IIIに記載）により
予め処理したＮｏｔＩ消化ｐＮＮ１１にこの断片をサブ
クローン化した。これをベクタｐＮＮＥＬＡＭ１とし
た。
【０１３３】部位特異的変異誘発を使用し、ＥＬＡＭ１
の膜横断および細胞内領域を除去した（ペデンとナサン
ス、１９８２、カルデロンら、１９８２、オーストラ
ら、１９８３）。よって、ｐＮＮＥＬＡＭ１のサンプル
をＥｃｏＲＩにより消化し、大きい断片を単離した。Ｓ
ｃａＩによりｐＮＮＥＬＡＭ１の他のサンプルを線状化
した。その後、配列５′ＴＧＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＣ
Ｃ ＴＡＡ ＡＴＴ ＣＣＣを有するオリゴヌクレオチ
ドを合成した。この配列がＥＬＡＭ１アンチセンス配列
にハイブリダイズすると、これはヌクレオチド番号１７
９０以降のＥＬＡＭ１ＤＮＡ配列に停止コドンおよびＢ
ａｍＨＩ制限部位を導入する。モリナガら（１９８４）
およびチャンら（１９８４）の方法により、これらの３
つの断片を使用してヘテロデュープレックスを創製し
た。クレニュー断片およびＴ４リガーゼを用いて一本鎖
ギャップを埋め、混合物を使用してイー・コリＭＣ１０
６１を形質転換した。ＢａｍＨＩ部位についてチェック
することにより得られたコロニーを検索し、変異誘発ク
ローンを選択した。結果的に発現に際し、ポリペプチド
の膜横断領域は除去され、Ｃ−末端アミノ酸はプロリン
である。これをプラスミドｐＳＡＢ１００と呼ぶ。
【０１３４】その後ＡａｔIIおよびＮｃｏＩによりｐＳ
ＡＢ１００を消化し、５．２ｋｂ断片を単離した。ま
た、ｐＮＮＥＬＡＭ１をこれらの２つの酵素で消化し、
１．４ｋｂ断片を単離した。ＮｃｏＩは、ＥＬＡＭ１コ
ード領域の中央付近で、図１のヌクレオチド９２７で切
断する。これらの２つのＤＮＡ断片を連結し、プラスミ
ドｐＳＡＢ１０８とした。このように構成したのは、部
位特異的変異誘発により、場合により分子の他の部分に
変異が起こり、ｒｓＥＬＡＭ１のコード領域中でのこの
種の全ゆる変異を回避せんがためである。ＮｏｔＩによ
りｐＳＡＢ１０８を消化し、３．８ｋｂ断片を単離し
た。この断片を、後記するようにして創製したｐＢＧ３
４１．ｊｏｄの７８１９ｂｐ断片に連結した。
【０１３５】まず、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション、ベセスダ、Ｍｄ（米国）からｐＳＶ２−
ＤＨＦＲ、ＡＴＣＣ３７１４６を得た（サブラマニら、
１９８１）。これをＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩにより消
化し、４４２０ｂｐ断片を単離した。その後、ＡｐａＩ
オーバーハングを有する合成二本鎖ＤＮＡ配列、ヒトガ
ストリン遺伝子（サトら、１９８６、図４）のヌクレオ
チド＋１９０〜＋２３３、ＸｈｏＩ部位およびＥｃｏＲ
ＩオーバーハングをコードするＤＮＡ配列を作成した。
このオリゴヌクレオチドをｐＳＶ２−ＤＨＦＲの４４２
０ｂｐ断片に連結し、得られたプラスミドをｐＤＴ４と
呼ぶこととした。ＡａｔIIおよびＸｈｏＩによりこのプ
ラスミドを消化し、４３９１ｂｐ断片を単離した。
【０１３６】その後、ＡａｔIIおよびＳａｌＩによりミ
ュラー阻害物質発現ベクタｐＤ１（ケートら、１９８
６）を開裂し、５４６２ｂｐ断片を単離した。この断片
をｐＤＴ４の４３９１ｂｐ断片と連結してｐＪＯＤ−１
０を作成した。
【０１３７】ＨｉｎｄIIIおよびＢｓｔＥIIによりｐＪ
ＯＤ−１０を消化し、ミュラー阻害物質をコードしない
大断片を単離した。断片末端を平滑末端とし、この末端
にＳａｌＩリンカを連結し、ベクタを自己連結させた。
これはｐＪＯＤ−ｓを与えた。
【０１３８】その後ＡａｔＩおよびＮｏｔＩによりｐＪ
ＯＤ−ｓを消化し、６７５０ｂｐ断片を単離した。これ
を次のようにして創製したｐＢＧ３４１由来の１１００
ｂｐＮｏｔＩ断片に連結した。
【０１３９】ｐＢＧ３１２のＳｍａＩ部位（ケートら、
１９８６）をＮｏｔＩ部位で置換することによりｐＢＧ
３４１を創製した。ＢｇｌIIによりｐＢＧ３１２を線状
化し、クレニューにより埋めることによりこの断片を平
滑末端とし、これを自己連結させた。ＢａｍＨＩにより
このプラスミドを線状化し、再度平滑末端とし、これを
自己連結させた。ＳｍａＩによりこのプラスミドを線状
化し、配列５′ＧＣＧＧＣＧＣを有するＮｏｔＩリンカ
を末端に連結した。得られたプラスミドをｐＢＧ３４１
と呼ぶこととした。
【０１４０】ＡａｔIIおよびＮｏｔＩによりｐＢＧ３４
１を消化し、１１００ｂｐ断片を単離した。この断片を
ｐＪＯＤ−ｓの６７５０ｂｐ断片に連結した。得られた
プラスミドをｐＢＧ３４１．ｊｏｄと呼ぶこととした。
このプラスミドは、ＳＶ４０初期およびアデノアイルス
主要後期プロモータを含有する。ＮｏｔＩ部位にてプラ
スミドに挿入された遺伝子は、これらのいずれのプロモ
ータからでも転写される。
【０１４１】その後、ＮｏｔＩによりｐＢＧ３４１．ｊ
ｏｄを線状化し、線状７８１９ｂｐ断片を単離した。こ
れを、ｒｓＥＬＡＭ１をコードするｐＳＡＢ１０８の
３．８ｋｂ断片に連結し、プラスミドｐＳＡＢ１１０を
作成した。
【０１４２】ＡａｔIIにより線状化したプラスミドｐＳ
ＡＢ１１０を用いてエレクトロポーレーションによりＣ
ＨＯ−ＤＨＦＲ- 細胞に感染させた。２０ｍＭＨＥＰＥ
Ｓ、ｐＨ７．０５、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、並びに６ｍＭデキ
ストロース中で１０7 細胞／ｍｌを使用し、２０μｇプ
ラスミドおよび２００μｇ超音波処理サケ精子ＤＮＡを
用いて、２７０Ｖおよび９６０μＦＤにて、バイオラド
（登録商標）ジーン・パルサーによりエレクトロポーレ
ーションを行った。感染後、選択培地、α- ＭＥＭ（５
００ｎＭメトトレキセートおよび１０％透析ＦＣＳを含
有する）中で細胞を培養した。コロニーを取り上げ、こ
れらを９６穴クラスタープレートにプレートし、モノク
ローナル抗体ＢＢ１１を使用してｒｓＥＬＡＭ１発現細
胞を検出した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有す
る完全培地中で群集になるまで細胞を生育させた後、細
胞がｒｓＥＬＡＭ１を生産する２％ＦＣＳを含有する培
地中でこれらを維持した。培地を回収し、３〜４日毎に
新鮮な２％血清によりこれを置換した。
【０１４３】このコンディショニングした培地から少な
くとも９５％純度にｒｓＥＬＡＭ１を単離した。これに
は、培地を濃縮し、プロテインＡセファロースに共有結
合した（シュナイダーら、１９８２）Ｍｏａｂ ＢＢ１
１を用いてこれを一夜インキュベートすることが包含さ
れる。その後ＰＢＳによりこの樹脂を洗浄し、未結合蛋
白質を除去し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７により結
合物質を溶出させ、溶出物をリン酸ナトリウムで中和
し、これをＰＢＳに対して透析した。ＰＢＳ中でのプロ
テインＡセファロースによるクロマトグラフィにより、
ｒｓＥＬＡＭ１を更に精製した。
【０１４４】次のアッセイを使用し、ｒｓＥＬＡＭ１を
生産したことを示す。直径６ｃｍの細菌用プラスチック
（例えばファルコン＃１００７、登録商標）のペトリ皿
に、２．５ｍｌの５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ９．５を
添加した。これに１０μｇの純粋なｒｓＥＬＡＭ１を添
加した。このプレートを室温で６０分間インキュベート
し、ｒｓＥＬＡＭ１をプレートに結合させた。その後培
地を吸引し、１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有
するＰＢＳによりこれを置換した。この溶液中でプレー
トを一夜４℃でインキュベートし、プレート上の残留す
る蛋白質結合部位をブロックした。プレートを室温に加
温し、１０％ウシ胎児血清を含有する培地によりこれら
を洗浄し、２ｍｌの細胞（２×１０6 ｍｌ-1）を用いて
２０分間これらをインキュベートした。培地を吸引し、
３ｍｌのそれぞれの培地（１０％血清を有するＲＰＭＩ
１６４０）によりプレートを２回洗浄した。その後顕微
鏡によりプレートを検定した。
【０１４５】ＨＬ−６０細胞のようなＥＬＡＭ１に結合
する細胞は、ｒｓＥＬＡＭ１被覆プレートに結合するこ
とを認めたが、例えばＢセルラインＲＡＭＯＳのような
ＥＬＡＭ１に結合しない細胞はこれらのプレートに結合
しないことを認めた。
【０１４６】更に、特異的Ｍｏａｂ ＢＢ１１はｒｓＥ
ＬＡＭ１被覆プレートに対するＨＬ−６０細胞の結合を
遮断することを認めた。また、これらの結果はまず、ｒ
ｓＥＬＡＭ１が生産され、次にＥＬＡＭ１のように、ｒ
ｓＥＬＡＭ１は白血球に結合する能力を有することを示
す。
【０１４７】また、組換え可溶性ＶＣＡＭ１ｂ（ｒｓＶ
ＣＡＭ１ｂ）を発現するベクタを作成した。このベクタ
をｐＢＮ１００６と命名した。ｐＢＮ１００６により発
現されるｒｓＶＣＡＭ１ｂは、図４に示すＤＮＡ配列の
ヌクレオチド１０７〜ヌクレオチド２１９３によりコー
ドされるＶＣＡＭ１ｂの細胞外ドメインの一部を含有す
る。
【０１４８】可溶性ＶＣＡＭ１ｂの全長を構成的に発現
し得るセルラインを作成するため、まずアデノウイルス
主要後期プロモータの下流の独特のＮｏｔＩ部位を有す
るｐＪＯＤ−ｓからベクタを作成し、発現ベクタへのＮ
ｏｔＩ断片の挿入を図った。プラスミドＤＮＡのＮｏｔ
Ｉ開裂によりｐＪＯＤ−ｓを線状化した。突出する５′
末端をマング・ビーン・ヌクレアーゼを使用して平滑末
端とし、線状化したＤＮＡ断片を、低融点アガロース
（ＬＭＡ）ゲル電気泳動により精製した。Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを使用してＤＮＡ断片を再連結した。その後連結
した分子をイー・コリＪＡ２２１（ＡＴＣＣ受託番号３
３８７５）に形質転換した。ＮｏｔＩ部位の非存在につ
いてコロニーを検索した。得られたベクタをｐＪＯＤ−
ｓデルタＮｏｔ１とした。ｐＪＯＤ−ｓデルタＮｏｔ１
をＳａｌＩを使用して線状化し、ウシ腸アルカリ性ホス
ファターゼを使用して５′末端を脱リン酸化した。ＬＭ
Ａゲル電気泳動により線状化したＤＮＡ断片を精製し、
ホスホリル化オリゴヌクレオチドＡＣＥ１７５（５′ｐ
ＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧ）の存在下に連結した。
連結混合物をイー・コリＪＡ２２１に形質転換し、Ｎｏ
ｔＩ部位の存在についてコロニーを検索した。合致する
プラスミドをｐＭＤＲ９０１と命名した。
【０１４９】ＡｌｕＩによる消化によりヌクレオチド２
１９３でＶＣＡＭ１ｂクローン１Ｅ１１を縮めることに
より、可溶性ＶＣＡＭ１ｂを得、これにより膜横断およ
び細胞内部分並びに３′非翻訳領域を除去した。停止コ
ドン−ＮｏｔＩリンカを添加し、挿入物をｐＣＤＭ８に
再連結した。ＮｏｔＩによりｐＣＤＭ８から挿入物を切
り取り、ＮｏｔＩ部位でｐＭＤＲ９０１に連結した。こ
の構成物をｐＢＮ１００６としたが、これは図４に示す
ようにアミノ酸１〜６９８を有する可溶性ＶＣＡＭ１ｂ
の全長をコードする。
【０１５０】先に記載した材料および方法を使用し、前
記したｒｓＥＬＡＭ１およびｒｓＶＣＡＭ１ｂ分子の縮
めた形態を発現するプラスミドを同様に作成した。これ
らの縮めた形態は、ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂの細
胞外領域の１以上の特定のドメインのアミノ酸配列から
なり、これを使用していずれのドメインが細胞−細胞付
着に直接関与するかを検討した。最初の実験では、これ
らの分子に対する抗体、すなわちそれぞれ抗体ＢＢ１１
および４Ｂ９により認識されるＥＬＡＭ１およびＶＣＡ
Ｍ１および１ｂのドメインを検討した。
【０１５１】ＣＨ１０１とした可溶性ＥＬＡＭ１構成物
を調製した。これはＥＬＡＭ１のレクチン様ドメインか
らなる。図１を参照すると、ＣＨ１０１は、ヌクレオチ
ド１〜５５７（ＥＬＡＭ１のアミノ酸１〜１３９をコー
ドする）および停止コドンを含むｃＤＮＡ配列の発現生
成物であった。ＣＨ１０２とした他の可溶性構成物を調
製した。これはレクチン様ドメインおよびＥＬＡＭ１の
ＥＧＦ様ドメインからなる。図１を参照すると、ＣＨ１
０２は、ヌクレオチド１〜６７１（ＥＬＡＭ１のアミノ
酸１〜１７７をコードする）および停止コドンを含むｃ
ＤＮＡ配列の発現生成物であった。可溶性ＥＬＡＭ１構
成物ＣＨ１０２は、抗ＥＬＡＭ１モノクローナル抗体、
ＢＢ１１を免疫沈澱させることが認められた。
【０１５２】次の可溶性ＶＣＡＭ１および１ｂ構成物を
同様に調製した：（Ａ）ドメイン１（アミノ酸１〜１０
８をコードする図３のヌクレオチド１〜４３０）、
（Ｂ）ドメイン１＋ドメイン２（アミノ酸１〜２１７を
コードする図３のヌクレオチド１〜７５７）、（Ｃ）ド
メイン１＋ドメイン２＋ドメイン３（アミノ酸１〜３１
０をコードする図３のヌクレオチド１〜１０３６）、
（Ｄ）ドメイン１＋ドメイン２＋ドメイン３（ＶＣＡＭ
１とＶＣＡＭ１ｂｃＤＮＡとのハイブリッド、図４に示
すアミノ酸１〜３１７をコードする）、（Ｅ）可溶性Ｖ
ＣＡＭ１の全長（図３のヌクレオチド１〜１９２４、ア
ミノ酸１〜６０６をコードする）、並びに（Ｆ）可溶性
ＶＣＡＭ１ｂの全長（図４のヌクレオチド１〜２１９
３、アミノ酸１〜６９８をコードする）。
【０１５３】前記したＶＣＡＭ１構成物の内、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ並びにＦ（Ａを除く）は、抗ＶＣＡＭ１抗体４Ｂ
９と免疫沈澱する。また、構成物Ｂ、Ｄ、Ｅ並びにＦ
は、細胞吸着に機能的な蛋白質を生産することが認めら
れた。構成物Ｂ、Ｄ、Ｅ並びにＦによりコードされる蛋
白質を含有するコンディショニング培地を濃縮し、固定
化４Ｂ９抗体の免疫アフィニティカラムを通し、結合し
た蛋白質を溶出させ、ｒｓＥＬＡＭ１について記載した
ように中和した。ｒｓＥＬＡＭ１について記載したよう
に溶出蛋白質をプラスチックに固定化し、ＲＡＭＯＳお
よびＪＵＲＫＡＴ細胞の支持体特異的付着を認めた。こ
れらの結果は、ＶＣＡＭ１の最初の２つのドメインは、
所定のＶＬＡ４発現ヒトリンパ球セルラインの付着を支
持するのに十分であることを示す。
【０１５４】実施例IX ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１プロモータの単離 ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１遺伝子について染色体クロ
ーンを単離し特徴を調べた。ＥＬＡＭ１クローンを次の
ようにして単離した。
【０１５５】プローブとして全ＥＬＡＭｐＣＤＭ８クロ
ーン６挿入物またはその５´末端から４００塩基対断片
を選択した。ランダンム・プライミングによりこれらの
分子を32Ｐラベルした。その後、ＥＬＡＭｃＤＮＡプロ
ーブを用いてヒト染色体ＥＭＢＬ３ライブラリを検索し
た。ライブラリから染色体ＥＬＡＭ１クローンを単離し
て特徴を調べ、これをＥＬ１−０７とした。これは、Ｅ
ＬＡＭ１の転写プロモータを含む１５ｋｂの５′フラン
ク配列および遺伝子の５′末端の約１００塩基対のコー
ド領域を含む。現在の知識によれば、誘導についての関
連する制御配列は、このファージクローンにより示され
るＤＮＡ配列内に含まれることが示唆されている（レオ
ナルドとバルチモア、１９８９）。８４０ｂｐの５′フ
ランク配列および７２０ｂｐのＥＬＡＭ１遺伝子の５´
末端を含む領域の配列決定を行った（最初の２つのエク
ソン、最初のイントロン並びに第２イントロンの一部を
含む）。この配列を図７に示す。５′フランク領域は、
ＴＡＴＡＡＡおよびＣＡＡＴ配列を含む古典的なプロモ
ータ構造を示す。またこれは、転写の推定開始から約９
５塩基対上流の配列ＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣを含む。この
配列は、ヒトκ免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子エンハン
サに認められるものと同一のＮＦ−κＢ結合配列であ
る。ＮＦ−κＢは、炎症および免疫応答に関連する多数
の遺伝子（例えば免疫グロブリン、インターロイキン−
２レセプタ、並びにβ−インターフェロン、その他）の
転写を刺激することが知られた、または推定された誘導
性ＤＮＡ結合蛋白質である。これは、ＥＬＡＭ１、ＶＣ
ＡＭ１並びにＩＣＡＭ１の生産を刺激することが知られ
た同一のインデューサであるＴＮＦ、ＩＬ−１並びにＬ
ＰＳにより活性化され得る（レナルドとバルチモア、１
９８９、オスボーンら、１９８９）。ＮＦ−κＢＤＮＡ
結合活性は、ＩＬ−１およびＴＮＦにより内皮細胞中で
刺激されることを示したが、ここでは、内皮および他の
種類の細胞中にプロモータ／レセプタ遺伝子構成物を感
染させることにより、ＥＬＡＭ１プロモータからの誘導
性転写に必要な最少のＤＮＡ配列の特定を行った。
【０１５６】ブダペスト条約により、イン・ビトロ・イ
ンターナショナル・インコ、リンチカム、Ｍｄ（米国）
に対し、１９８９年１２月７日にクローンＥＬ１−０７
を寄託した。これは次のように同定される： ＥＬ１−０７ 受託番号ＩＶＩ−１０２１８。
【０１５７】ＶＣＡＭ１ｃＤＮＡの５′末端に相同の32
Ｐラベルした３０塩基オリゴマープローブを用いて前記
ＥＭＢＬ３ヒト染色体ライブラリをプローブすることに
より、ＶＣＡＭ１遺伝子を示すＥＭＢＬ３染色体クロー
ンを単離した。このクローンをＶＣ１−１６とし、これ
をブダペスト条約により、イン・ビトロ・インターナシ
ョナル・インコ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１
９８９年１２月７日に寄託した。これは次のように同定
される： ＶＣ１−１６ 受託番号ＩＶＩ−１０２１７。
【０１５８】ＶＣＡＭ１遺伝子の約３００ｂｐの５′フ
ランク配列および９００ｂｐの５′末端を含む領域を配
列決定した（第１エクソン、第１イントロン、並びに第
２エクソンの一部を含む）。この配列を図８に示す。
５′フランク配列は、古典的なＴＡＴＡＡＡ配列および
２つのＮＦ−κＢコンセンサス配列：転写開始から約−
６３〜−５４からのセンス鎖上のＡＧＧＧＡＴＴＴＣ
Ｃ、および約−６９〜−７８からの逆相補鎖上のＧＧＧ
ＧＡＡＡＣＣＣを有する。この配列は、ＥＬＡＭ１プロ
モータ配列について提唱したものと類似する検討に使用
し得る。
【０１５９】実施例Ｘ 抗体認識ＣＤＸ ＣＤＸ、ＥＬＡＭ１媒介付着に関与するＭＩＬＡを単離
した。最初の工程として、白血球細胞表面上で抗原を認
識し、白血球−内皮細胞結合を妨害するモノクローナル
抗体を調製した。これらのモノクローナルが認識する抗
原がＥＬＡＭ１媒介付着に関与することを確認するた
め、ＥＬＡＭ１媒介結合が排他的な細胞−細胞結合経路
である系でモノクローナルを試験した。
【０１６０】１．ＣＤＸに対するモノクローナル抗体の
調製および分析 ａ．付着アッセイ 白血球−内皮細胞結合を阻害するＭｏａｂｓを同定する
ため、内皮細胞−白血球付着を検出する改良したアッセ
イを開発した。ＨＬ−６０細胞およびＨＵＶＥＣｓを使
用してこのアッセイを行った。ＭＩＬＡを発現するいず
れかのセルラインを使用し、ＥＬＡＭを発現するいずれ
かのセルラインを用いて、この種のアッセイを行うこと
ができるのは明らかであろう。４８穴組織培養プレート
中で、ＨＵＶＥＣｓを群集に生育させた（８×１０4 細
胞／穴）。ＲＰＭＩ／１％ＦＣＳにより細胞を１回洗浄
し、それぞれの穴に対して１３Ｕ／ｍｌのＩＬ−１βに
より０．５ｍｌのＲＰＭＩ／１％ＦＣＳを添加した（コ
ントロールの穴を除く）。これらの細胞を３７℃で４時
間インキュベートした。使用の直前にこれらをＲＰＭＩ
／１％ＦＣＳにより１回洗浄した。アッセイに使用した
ＨＬ−６０細胞を１μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−メチオニンに
より一夜ラベルした。これらの細胞を１回洗浄した後、
これらを５×１０6 細胞／ｍｌでＲＰＭＩ／１％ＦＣＳ
中に再懸濁した。１００μｌのＨＬ−６０細胞を取り、
５０μｌのＭｏａｂ（１μｇ／ｍｌ）を用いて０℃で３
０分間これらをインキュベートした。その後それぞれの
穴に対して１５０μｌのＨＵＶＥＣｓを添加した。２０
℃で１０分間細胞を結合させた後、ＲＰＭＩ／１％ＦＣ
Ｓを用いて穴を穏やかに１回洗浄した。ＲＰＭＩ／１％
ＦＣＳにより穴を満たし、プレートを封止し、これらを
反転させ、５００×ｇで２分間これらを遠心した。培地
を除去し、ＰＢＳ* により更に２回穴を洗浄した（ＰＢ
Ｓ* は、Ｃａ++を含有せず、Ｍｇ++を含有しないＰＢＳ
である）。２００μｌの０．２ＮＮａＯＨ／１％ＳＤＳ
によりそれぞれの穴中で細胞を可溶化し、４．５ｍｌの
シンチラント（レディ・プロテイン、ベックマン）を添
加し、シンチレーション・カウンタでカウントすること
により、ＨＵＶＥＣｓに結合したＨＬ−６０細胞の数を
測定した。
【０１６１】ｂ．ハイブリドーマの調製 ＣＤＸに対するモノクローナル抗体を作成するため、次
のようにしてハイブリドーマを調製した。全体の生きた
ＨＬ−６０細胞を用いてＢＡＬＢ Ｃマウスを注射し
た。最初に、それぞれのマウスは腹膜内（ＩＰ）にＰＢ
Ｓ* 中の２×１０ 7 細胞を受けた。２〜２４時間後に異
なる部位にて腹膜内に完全フレンドアジュバントを注射
した。６週間に渡り、２週間毎に２×１０7 細胞ＩＰに
よりマウスを補助装薬した。融合４日前に、マウスに対
し静脈内に５×１０6 細胞、ＩＰにより５×１０6 細胞
を注射した。
【０１６２】前記した付着アッセイによりＩＬ−１β刺
激ＨＵＶＥＣｓに対するＨＬ−６０細胞の結合を阻害す
る能力についてこれらの動物からの免疫血清を試験し
た。第３回の補助装薬後に免疫血清は試験の結果陽性と
なり、免疫した動物の脾臓細胞からのハイブリドーマ生
産を続けた。当業界で標準的な様式（ゴディング、１９
８３参照）で、脾臓細胞とミエローマ細胞との融合を行
った。
【０１６３】前記した付着アッセイを使用し、ＩＬ−１
β誘導ＨＵＶＥＣｓに対するＨＬ−６０細胞の結合を阻
害するモノクローナル抗体を生産するものについてハイ
ブリドーマを検索した。このようにして、ＣＤＸを認識
するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同
定した。これらのハイブリドーマの５つを使用して腹水
液を生産した。ＳＧＢ3 Ｂ4 としたこれらの１つを、ブ
ダペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナ
ル・インコ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１９８
９年４月２５日に寄託した。これは次のように同定され
る：ＳＧＢ3 Ｂ4 受託番号ＩＶＩ−１０２０５。
【０１６４】ｃ．ＦＡＣＳ分析 いずれの種類の細胞に対してこのモノクローナルが結合
するかを同定するため、ＦＡＣＳ分析を行った。これ
は、２×１０5 細胞を取り、ＰＢＳ* によりこれらを１
回洗浄し、その後２５μｌのＲＰＭＩ、１％ＦＣＳ、
０．１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧ、並びに０．１％アジ化ナ
トリウム中で０℃にて１０分間インキュベートすること
によりＦｃレセプタを遮断することを含む。その後抗体
（１μｇ／ｍｌで２５μｌ）を添加し、細胞を０℃で３
０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間細胞を
遠心し、緩衝液Ａ（ＰＢＳ* 、５％ＦＣＳ、０．１％ア
ザイド）によりこれらを２回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌ
ヒトＩｇＧを含有する２５μｌの緩衝液Ａにこれらを再
懸濁した。フルオレセイン共役抗マウスＩｇＧ（緩衝液
Ａ中に５μｇ／ｍｌで２５μｌ）（キャペル）を添加
し、混合物を０℃で３０分間インキュベートした。細胞
を遠心し、これらを緩衝液Ａにより１回洗浄し、これら
を２５０μｌの緩衝液Ａに再懸濁した。その後、ベクト
ン−ディキンソンＦＡＣＳター・セルソーターによりこ
れらを分析した。
【０１６５】主としてＨＬ−６０細胞−ＨＵＶＥＣ付着
アッセイについて記載したように、ＥＬＡＭ１発現ＣＯ
Ｓ細胞により細胞結合の検討を行った。
【０１６６】２．ハイブリドーマＳＧＢ3 Ｂ4 は、ＣＤ
Ｘを認識するモノクローナル抗体を生産することの説明 ＥＬＡＭ１媒介結合に関与するＭＩＬＡ（特にＣＤＸ）
について、ハイブリドーマＳＧＢ3 Ｂ4 由来のモノクロ
ーナルの特異的認識を示す証拠たる幾つかのラインを開
発した。
【０１６７】第１に、α−ＣＤＸ抗体は、ＣＤＸを発現
する細胞のＥＬＡＭ１発現細胞への結合を阻害する筈で
ある。付着アッセイを使用し、これらのモノクローナル
が、ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｓおよびＥＬＡＭ１発現
ＣＯＳ７細胞に対するＨＬ−６０細胞およびＰＭＮｓの
結合を実際に阻害することを示す。６０．３、β2 イン
テグリン鎖に対するモノクローナル抗体の存在下では、
ＥＬＡＭ１発現ＣＯＳ７細胞中で利用されるＨＬ−６０
細胞およびＰＭＮｓに対する唯一の結合経路はＥＬＡＭ
１自体である。したがって、この系における細胞−細胞
付着の抗体阻害は、ＣＤＸを経由するＥＬＡＭ１経路を
介する必要がある。
【０１６８】第２に、α−ＣＤＸモノクローナルは、付
着アッセイにおいてＥＬＡＭ１発現細胞に結合するこれ
らの細胞を認識する筈であるが、このアッセイにおいて
ＥＬＡＭ１に結合しないこれらの細胞を認識しない筈で
ある。ＦＡＣＳ分析を使用し、このＭｏａｂｓの結合パ
ターンを決定した。これらのモノクローナルは次の種類
の細胞に結合した：ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨＴ−２
９、ＴＨＰ−１、ＳＷ６２０、ＳＷ９４８、ＳＷ１４１
７、単球、エオジン好性細胞、並びにＰＭＮｓ。これら
は次の細胞には結合しなかった：ＲＡＪＩ、ＤＡＵＤ
Ｉ、ＲＡＭＯＳ、ＨｅＬａ、またはＪＹ。（末梢血液白
血球を分画することにより非形質転換細胞を単離し
た。）これらの結合パターンは、これらの細胞のＥＬＡ
Ｍ１発現ＣＯＳ７細胞およびｒｓＥＬＡＭ１被覆プレー
トに対する結合と正確に平行したものである。
【０１６９】第３に、α−ＣＤＸモノクローナルは、Ｌ
ＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ１並びにＣ
Ｄ４のような他の白血球細胞表面抗原に対するモノクロ
ーナルとは異なる認識パターンを示す筈である。実際、
ここで考える他のモノクローナルには、本発明の抗体と
同じ細胞認識パターンを示すものはない。
【０１７０】要は、ハイブリドーマＳＧＢ3 Ｂ4 によ
り、およびここで単離した他のハイブリドーマにより生
産されるモノクローナルがＣＤＸを認識することは明ら
かである。最終的に、これらのモノクローナルを使用し
てＣＤＸ自体を単離した。
【０１７１】実施例XI ＣＤＸの単離 １．ＨＬ−６０細胞表面蛋白質のヨウ素化 ＰＢＳ* により１×１０7 ＨＬ−６０細胞を３回洗浄
し、これらを０．５ｍｌＰＢＳ* に再懸濁し、５０μｇ
の１，３，４，６−テトラクロロ−３α，６α−ジフェ
ニルグリコウリル（シグマ・ケミカルス社）により被覆
したチューブにこれらを添加した。これに１ｍＣｉ125
Ｉを添加した。この混合物を０℃で３０分間インキュベ
ートした。ラベルした細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ／１０
％ＦＣＳを含有するチューブに移し、１０００×ｇで５
分間これらを遠心した。その後これらを最初に別の１０
ｍｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳにより、次に２ｍｌのＰ
ＢＳ * により洗浄した。（また、35Ｓ−メチオニンまた
は35Ｓ−システインを用いて細胞を代謝的にラベルし
た。）１％ＮＰ４０、２ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、大豆トリプシンインヒビタ（５０ｍｇ／ｍｌ）並び
にロイペプチン（１ｍＭ）（シグマ・ケミカルス社）を
含有する１．０ｍｌのＰＢＳ* の添加により細胞を溶解
した。その後これらを０℃で３０分間インキュベートし
た。溶解物を１０分間１０，０００×ｇで遠心して粒子
物を除去した。１０μｇのウサギ抗マウスＩｇＭ（ジャ
クソン・イムノ−リサーチ・ラブス）および５０μｌの
蛋白質Ａセファロース（ジムド、２ｍｇ蛋白質Ａ／ｍ
ｌ）を用いて、０℃で２時間、ラベルした可溶化膜蛋白
質を含有する上澄を予備清澄化した。溶解物を４℃で保
存した。
【０１７２】２．ＣＤＸの免疫沈殿 Ｍｏａｂｓを使用してこれを免疫沈殿させるべく他のラ
ベルした蛋白質からＣＤＸを精製した。次のようにして
免疫沈殿を行った。
【０１７３】１０λのＡＲＸビーズを用いて４℃で２時
間予備清澄化した溶解物（５０〜１００μｌ）をインキ
ュベートした。０．７５％ＮＰ４０、０．２％ＤＯＣ、
並びに１ｍＭＥＤＴＡを含有する２ｍｌのＰＢＳ* によ
りセファロースを４回洗浄した。その後、ＡＲＸビーズ
を非還元性ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁した。このサ
ンプルを８５℃で１０分間加熱し、上澄を除去した。こ
れにβ−ＭＥを５％添加し、５分間加熱し、１０％ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル上で分子を分離した。ゲルを
乾燥し、これをオートラジオグラフにかけた。
【０１７４】ＣＤＸは、約１５０ｋＤの分子量を有する
単一の拡散バンドとしてオートラジオグラフ上に現れ
た。
【０１７５】実施例XII ＣＤＸを発現するクローンの単離 実施例Ｉの一般的手順に従い、２つの種類のＣＤＸ発現
細胞、ＨＬ−６０細胞およびＵ９３７細胞に由来するｐ
ＣＤＭ８ベクタ中の２つのｃＤＮＡライブラリを調製し
た。その後、最初に１μグラムのＨＬ−６０ポリＡ＋ｍ
ＲＮＡ由来の32ＰラベルｃＤＮＡプローブを創製するこ
とにより富化したＣＤＸｃＤＮＡライブラリを調製し、
その後ＨｅＬａ細胞由来の３０μグラムのポリＡ＋ｍＲ
ＮＡ（これはＣＤＸを発現しない）とハイブリダイズす
ることによりプローブから非ＣＤＸｃＤＮＡ配列を減算
した（デービス、１９８６参照）。減算プローブを使用
してイー・コリＭＣ１０６１Ｐ３中でＨＬ−６０細胞か
ら富化したサブライブラリを創製し、２２の９６穴プレ
ート中で約２１００クローンを生育させた。Ｖ９３７富
化ＣＤＸサブライブラリを同様の様式で調製し、１４０
０のクローンを得た。
【０１７６】実施例IIの一般的手順に従い、スフェロプ
ラスト融合によりＣＯＳ７細胞の感染についてコロニー
を２２のプールに分割した。シードとアルフォ（１９８
７）の方法により、ハイブリドーマＳＧＣ2 Ｅ5 （実施
例Ｘで単離）からα−ＣＤＸモノクローナル抗体を選別
することによりＣＤＸ発現について感染ＣＯＳ７細胞を
アッセイした。アッセイの結果プール＃７は陽性であ
り、２．１ｋｂｃＤＮＡ挿入物を有する２つのクローン
を生成し、これを７．１および７．２とした。
【０１７７】配列決定ベクタｐＮＮ１１にサブクローン
化したＣＤＸｐＣＤＭ８クローン７．２および７．２挿
入物の一部から、マキサムとギルバート技術（１９８
０）によりＣＤＸのＤＮＡ配列を得た。後者のプラスミ
ドをｐＳＱ２１９とした。得られたＤＮＡ配列を図９に
示す。
【０１７８】ブダペスト条約により、イン・ビトロ・イ
ンターナショナル・インコ、６１１Ｐ、ハモンド・フェ
リーＲｄ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１９９０
年４月２６日にプラスミドＣＤＸｐＣＤＭ８クローン
７．２を含有する培養物を寄託した。これは次のように
同定される： ＣＤＸｐＣＤＭ８／イー・コリＭＣ１０６１Ｐ３ 受託番号ＩＶＩ−１０２４２。
【０１７９】また、ＣＤＸクローン７．１および７．２
をＣＯＳ７細胞に感染させ、ＣＤＸの発現を確認した。
感染後４８時間で、これらの細胞は、ＦＡＣＳによるア
ッセイによりα−ＣＤＸ抗体が結合するその細胞表面で
蛋白質を発現した。この細胞表面蛋白質は125Ｉにより
ラベルすることができ、免疫沈殿した。免疫沈殿したダ
ブレットのみかけの分子量は約１２５ｋＤだった。ま
た、ＣＤＸ発現ＣＯＳ７．２はｒｓＥＬＡＭ１により被
覆したセファロースビーズの周囲にロゼットを形成し、
このロゼット形成は陽イオン依存性であり、ＢＢ１１
（抗ＥＬＡＭ１抗体）により阻害され、更にｐＣＤＭ８
単独（挿入されたＣＤＸ遺伝子を有さない）により感染
したＣＯＳ細胞は、ｒｓＥＬＡＭ１ビーズにロゼット形
成しなかった。また、ＣＯＳ７．２細胞は、ウシ血清ア
ルブミンにより被覆したビーズにロゼット形成しなかっ
た。前記した事実は全てＣＤＸがＥＬＡＭ１についての
リガンドであることを示す。
【０１８０】ＣＤＸの推論されたアミノ酸配列の一次分
析により、４０５アミノ酸部分（図９のヌクレオチド６
６〜１２８０）が示された。ＵＷＧＣＧ配列回折ソフト
ウエアパッケージ（バージョン６．１、１９８９年８
月）を使用し、他の蛋白質との相同性につきプログラム
ＦＡＳＴＡを使用してＮＢＲＦ蛋白質データベース（解
放２３、１９８９年１２月）を検索した。また、ＴＦＡ
ＳＴＡを使用して、ゲンバンク（解放６３、１９９０年
３月）およびＥＭＢＬ（解放１９、１９８９年５月）を
検索した。これらの検索で、ヘルペス・シンプレックス
・ウイルス・タイプ１、デングウイルス、黄熱および他
のフラビウイルスを含む所定のウイルスエンベロープ蛋
白質に対して相同の短い領域（例えば約２３アミノ酸）
を認めた。一般に、公知の蛋白質に対する相同性は低
く、ＣＤＸは新規な蛋白質であると結論した。
【０１８１】実施例XIII ＶＣＡＭ１のＭＩＬＡｓを認識する抗体 全ＪＵＲＫＡＴ細胞により免疫した３匹のマウスからポ
リクローナル抗血清を得た。１つのマウス由来の血清
は、室温で４時間誘導ＨＵＶＥＣｓに対するＲＡＭＯＳ
およびＪＵＲＫＡＴ結合の両者を完全に阻害した。他の
２つのマウス由来の血清はＲＡＭＯＳを完全に阻害した
が、同様の条件下でＪＵＲＫＡＴ結合を部分的に阻害す
るのみであった。これらのデータは、ＲＡＭＯＳおよび
ＪＵＲＫＡＴはＭＩＬＡを共有し、ＪＵＲＫＡＴはＲＡ
ＭＯＳにより共有されていない少なくとも１つの他のＭ
ＩＬＡを阻害することを示す。
【０１８２】リンパ球ＭＩＬＡｓに単するＭｏａｂｓを
調製するため、全生存ＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴ細
胞に対してマウスを免疫し、前記実施例VIIIに記載した
様式にて、ＪＵＲＫＡＴ免疫マウス由来の脾臓細胞とミ
エローマ細胞との融合を行った。ＣＤＸに対するモノク
ローナル抗体を得るのに成功裡に使用した実施例VIIに
記載した方法により、得られたハイブリドーマを検索し
た。現在まで、ＴＮＦにより２４時間処理したＨＵＶＥ
Ｃｓに対するＲＡＭＯＳ付着を阻害する約２６０のハイ
ブリドーマをコンディショニングした培地から検索し
た。約２５のハイブリドーマが付着の一貫した部分的阻
害を示し、現在これらは再検索のためサブクローン化さ
れている。この種の抗体は、リンパ球ＭＩＬＡｓの単離
およびクローン化の両者に使用することができる。
【０１８３】実施例XIV ＶＬＡ４がＶＣＡＭ１リガンドである証拠 本発明者および協力者は、ＶＬＡ４はＶＣＡＭ１のリガ
ンドであり、ＶＬＡ４はＶＣＡＭ１およびフィブロネク
チンに対する別の結合部位を有することを示す幾つかの
検討を行った。
【０１８４】最初に、ＶＬＡ４のサブユニットに対する
モノクローナル抗体は、活性化ＨＵＶＥＣｓおよびＶＣ
ＡＭ１により感染したＣＯＳ細胞に対するＶＬＡ４発現
細胞の付着を阻害することを示した。ＶＬＡ４は、サブ
ユニットβ1 およびα4 から構成される（ヘムラー、１
９８８）。β1 に対するＢ１Ｅ１１としたモノクローナ
ル抗体、およびヤギ抗β1 ヘテロ抗血清は、活性化ＨＵ
ＶＥＣｓおよび感染ＣＯＳ細胞に対するＲＡＭＯＳ細胞
の付着を完全に阻害することを認めた。対照の抗体は付
着を阻害しなかった。更に、ＨＰ２／１としたα4 サブ
ユニットに対するモノクローナル抗体は、同様にこれら
の細胞に対するＲＡＭＯＳの付着を遮断した。同様に、
これらの抗体は、ＶＬＡ４発現Ｔリンパ芽球セルライン
ＨＰＢ−ＡＬＬの付着を阻害した。
【０１８５】次に、本来ＶＬＡ４を発現しない細胞をα
4 により感染することにより、これらをＶＣＡＭ１発現
細胞に結合させることが可能なことを示す。２つのセッ
トのＫ−５６２赤白血病細胞を感染させた。１つのセッ
トは、α4 をコードするｃＤＮＡを用いて感染させた
（タカダら、１９８９）。他は、ＶＬＡ４の一部ではな
いα2 を用いて感染させた（タカダとヘムラー、１９８
９）。α4 により感染したＫ−５６２細胞は、かくして
ＶＣＡＭ１感染ＣＯＳ細胞またはＴＮＦ活性化ＨＵＶＥ
Ｃｓのモノレイヤに結合することが可能となったが、親
Ｋ−５６２細胞およびＫ−５６２α2 感染細胞は可能で
はなかったことを示した。更に、α4 またはβ1 に対す
るモノクローナル抗体は、これらのＶＣＡＭ１発現細胞
に対するα 4 感染Ｋ−５６２細胞（これは通常はβ1 サ
ブユニットを発現する）の付着を排除した。
【０１８６】最近の検討により、ＶＬＡ４は、ＦＮＣＳ
−１部位を介してヒトプラズマフィブロネクチン（Ｆ
Ｎ）に対する細胞付着を媒介することが示された（ワイ
ナーら、１９８９）。ＶＣＡＭ１に対するＶＬＡ４結合
部位は、ＦＮに対するその結合部位とは異なることを示
した。最初に、ＲＡＭＯＳ細胞またはα4 感染Ｋ−６５
２細胞とＦＮ−４０（可溶性ＦＮ断片）との予備インキ
ュベーションにより、ＦＮ−４０とのその結合が阻害さ
れるが、ＶＣＡＭ１感染ＣＯＳ細胞またはＴＮＦα活性
化ＨＵＶＥＣｓとでは阻害されないことを認めた。次
に、ＶＬＡ４、ＨＰ１／３に対するモノクローナルは、
感染ＣＯＳ細胞または活性化ＨＵＶＥＣｓに対するこれ
らの細胞の結合を阻害するが、ＦＮ−４０に対しては阻
害しないことを認めた。
【０１８７】実施例XV 阻害剤検索 合成有機化学物質、天然発酵生成物、ペプチド等のよう
な可能な阻害剤を検索する３つの基本的な付着アッセイ
において、ＥＬＡＭｓおよびそのリガンドを使用するこ
とができる。
【０１８８】１．細胞−細胞付着アッセイ 第１のアッセイにより、細胞−細胞付着を阻害する分子
の能力を試験し得る。このアッセイは、９６穴マイクロ
タイタプレート中で行うことができる。最初に、例えば
実施例Ｖに記載したように、ＥＬＡＭを安定に発現する
セルラインを創製する。その後、これらの細胞をプレー
トアウトし、ＨＬ−６０細胞を添加する。阻害剤は、Ｅ
ＬＡＭ発現細胞に対するＨＬ−６０結合を阻害するその
能力により同定する。ＥＬＡＭリガンドに対するモノク
ローナル抗体を検索する際に記載したのと全く同様にア
ッセイを行い得る。
【０１８９】２．細胞付着蛋白質アッセイ 第２のアッセイにより、ＥＬＡＭ自体に対する細胞結合
を阻害する低分子の能力を試験し得る。９６穴マイクロ
タイタプレートで行うｒｓＥＬＡＭ１によるこの種のア
ッセイを開発した。細菌性プラスチックからなるこれら
のプレート（例えば、リンブロ／タイタテック＃７６−
２３２−０５、登録商標）を、５０μｌの１５ｍＭ炭酸
ナトリウム／３５ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．２中
の穴当り０．５μｇのｒｓＥＬＡＭ１により、４℃で一
夜インキュベートする。その後１０ｍｇ／ｍｌのウシ血
清アルブミンを含有するＰＢＳによりこのプレートを室
温で１時間ブロックし、その後例えば穴当り５０μｌの
ＨＬ−６０細胞、２×１０ 6 ／ｍｌを使用し、実施例VI
IIに記載したようにして付着アッセイを行う。これらの
条件下で、ＨＬ−６０細胞はｒｓＥＬＡＭ１に良好に結
合し、検索に便利なマイクロアッセイを提供する。プレ
ートに対するＨＬ−６０結合を阻害するその能力により
阻害剤を同定し得る。その他、プローブとしてＥＬＡＭ
を安定に発現するセルラインを使用し、このアッセイに
おいてＥＬＡＭリガンドを使用することができる。
【０１９０】この範疇の他のアッセイは、それぞれＥＬ
ＡＭリガンドまたはＥＬＡＭを安定に発現する細胞のモ
ノレイヤに対する可溶性ＥＬＡＭまたはＥＬＡＭリガン
ドの結合を検定するものである。この可溶性分子は、レ
ポーター群（例えば、放射能、蛍光プローブ、酵素等）
によりラベルし得る。
【０１９１】３．付着蛋白質−付着蛋白質アッセイ このアッセイは、ＥＬＡＭのそのリガンドに対する結合
を阻害する低分子の能力を検定するものである。可溶性
形態の２つの分子、例えば可溶性ＥＬＡＭを９６穴マイ
クロタイタプレートの穴に固定化し、この対の他の構成
員、例えばレポーター群によりラベルしたＥＬＡＭリガ
ンドの結合により付着を測定する。
【０１９２】これらの３つのアッセイのいずれにおいて
も、付着を阻害するその能力によって阻害剤を検出す
る。
【０１９３】実施例XVI ＶＣＡＭ１／免疫グロブリン構成物 発現に際してｒｓＶＣＡＭ１／免疫グロブリン融合蛋白
質を生産するＤＮＡ配列を調製した。このＤＮＡ配列
は、５′から３′に、ＶＣＡＭ１ドメイン１〜３および
ＩｇＧ1 重鎖遺伝子の一定領域を含む。
【０１９４】ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により、図
３のヌクレオチド１０３５を介してＶＣＡＭ１ドメイン
１〜３を含有するＤＮＡ断片を生産した（サンブロック
ら、１９８９）。３′−５′プライマは、配列５′ＧＡ
ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＧＣＣＧＣ ＡＣＣ ＡＴＧ Ｃ
ＣＴ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧを有する。これは図３の
ヌクレオチド１００〜１１４に相補的であり、ＶＣＡＭ
１開始コドンおよびＸｈｏＩおよびＮｏｔＩについての
認識部位を含有する。５′−３′プライマは、配列５′
ＣＴ ＡＧＣ ＴＡＧ ＣＧＣ ＧＴＴ ＴＴＡ ＣＴ
Ｔ ＣＡＣを有する。これはドメイン３の末端で図３の
ヌクレオチド１０１６〜１０３５に相補的であり、Ｎｈ
ｅＩ認識部位を含有する。これらのプライマを使用し、
ＡＭｐｃＤＭ８クローン４１のＶＣＡＭ１コード領域を
含有するプラスミドから断片を増幅した。このプロセス
の生成物は、ＶＣＡＭ１ドメイン１〜３をコードするＤ
ＮＡ配列であった。ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩによりこの
ＤＮＡ断片を消化し、次のようにして作成したｐＡＢ５
３にこれを挿入した。
【０１９５】ＳａｌＩによりｐＪＯＤ−ｓ（実施例ＶII
I）を消化し、ヒトｒｓＣＤ４をコードするｃＤＮＡ配
列を挿入した。このプラスミドをｐＪＯＤ−ｒｓＴ４と
呼ぶこととした。ＰｖｕIIおよびＳｐｈＩによりｐＪＯ
Ｄ−ｒｓＴ４を部分消化し、ＤＨＦＲｃＤＮＡの転写を
調節するＳＶ４０プロモータ中の２つのＳＶ４０エンハ
ンサリピートを含む断片を欠損させた。プラスミドを再
連結し、これをｐＪＯＤ−ｒｓＴ４デルタＥとした。そ
の後、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩによりｐＪＯＤ−ｒｓＴ
４デルタＥを消化し、２つのＤＮＡ断片を挿入した。最
初に５′ｍＲＮＡスプライス部位を含むＮｈｅＩ−Ｈｉ
ｎｄIIIリンカ、次にＩｇＧ重鎖遺伝子の一定領域をコ
ードするＤＮＡ断片である。これらの断片を次のように
して得た。
【０１９６】次の配列を有するＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIII
リンカを合成した： ５′スプライス 5′CTA GCT TTC CAA GGT GAG TCC TA 3′ 3′ GA AAG GTT CCA CTC AGG ATT CGA5′
【０１９７】ＩｇＧ重鎖遺伝子のＤＮＡ配列はエリソン
ら（１９８２）に記載されている。ＥＭＢＬ３ヒト染色
体ライブラリ（実施例ＶIII）からオリゴヌクレオチド
プローブを使用してこの遺伝子の断片を単離した。Ｈｉ
ｎｄIIIおよびＮｏｔＩによりこの断片を消化し、一定
の重ドメインおよび随伴するイントロンを含む断片を単
離した。
【０１９８】これらの２つの断片をｐＪＯＤｒｓＴ４デ
ルタＥに連結し、得られたプラスミドをｐＡＢ５３と呼
ぶこととした。ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩによりｐＡＢ５
３を消化し、ｒｓＴ４コード領域を欠損させた。この場
所に、ＶＣＡＭ１ドメイン１〜３をコードするＸｈｏＩ
−ＮｈｅＩ断片を挿入した。このプラスミドをＶＣＡＭ
１−ＩｇＧ1 と呼ぶこととした。
【０１９９】ｒｓＶＣＡＭ１／ＩｇＧ融合蛋白質を、こ
のプラスミドを使用して発現させた。安定した発現のた
め、このプラスミドをＣＨＯ細胞に感染させた。この遺
伝子の転写後、ｍＲＮＡをスプライスしてイントロンを
除去し、翻訳の際に、細胞はｒｓＶＣＡＭ−ＩｇＧ融合
蛋白質を生産した。
【０２００】実施例XVII アンチセンス核酸による阻害ＶＣＡＭ１発現 ここで、ＶＣＡＭ１に対するアンチセンス核酸および誘
導されたＨＵＶＥＣｓにおけるＶＣＡＭ１発現を阻害す
るその能力を試験する方法を記載する。アンチセンス核
酸についての有効な核酸配列は、ｍＲＮＡのコード領
域、更に詳しくは開始コドンＡＵＧ、またはスプライス
部位に相補的なものである（マルクス−セクラ、１９８
８）。また、約１５ヌクレオチドのオリゴマが最も好適
である。よって、ＶＣＡＭ１に対する最も有効なアンチ
センス核酸は、ＤＮＡ配列５′ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＴ
ＴＴＴ ＡＡＧを有するオリゴマである。これは、図
３のヌクレオチド９４〜１０８に結合し得る（アンチセ
ンス開始コドン）。このＤＮＡ配列は、例えば自動ＤＮ
Ａ合成装置によって合成される。
【０２０１】このアンチセンス核酸のＶＣＡＭ１発現を
阻害する能力は次のようにして試験する。細胞生育に使
用する血清を６０℃で３０分間熱失活させてヌクレアー
ゼを失活させる以外は、実施例Ｖと同様にしてＨＵＶＥ
Ｃｓを群集に生育させる。４〜４８時間、１０μＭ〜１
００μＭの濃度で、最も好ましくは細胞生存性に影響を
与えない最も高い濃度で、オリゴマを用いて細胞を予備
インキュベートする。これらの範囲は、有効な阻害のた
めに必要である（マルクス−セクラ、１９８８、ベッカ
ーら、１９８９）。その後、ＨＵＶＥＣｓを１０ｎｇ／
ｍｌＴＮＦにより処理してＶＣＡＭ１を誘導する。約４
時間後、細胞の表面上のＶＣＡＭ１の存在を付着アッセ
イにより試験する。
【０２０２】実施例XVIII ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡを認識するハンマーヘッドリボザイ
ム 次のようにしてハセルホフとゲーラー（１９８８）の規
則に従い、ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡを認識するハンマーヘッ
ド型リボザイムをを調製する。最初に、標的ｍＲＮＡ上
の開裂部位を同定する。ハンマーヘッドリボザイムは、
配列５′ＧＵＸ（Ｘはいずれかのヌクレオチドである）
の後を開裂する。ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡのコード領域中の
この配列の最初の例は、６番目のコドン、５′ＡＵＧ
ＣＣＵＧＧＧ ＡＡＧ ＡＵＧ ＧＵＣ ＧＵＧ ＡＵ
Ｃ ＣＵＵである。適切な認識配列には、開裂部位の側
面に位置する５′および３′領域の約６のヌクレオチド
が包含される。開裂部位を含む１８塩基の認識配列は、
５′ＡＡＧ ＡＵＧ ＧＵＣ ＣＵＧ ＡＵＣ ＣＵＵ
である。
【０２０３】その後、認識配列および触媒「ハンマーヘ
ッド」の配列を含むリボザイムについてＲＮＡ配列を設
計する。この種の配列は、５′ＡＡＧ ＧＡＵ ＣＡＣ
［ＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧＧＡＣＧＡＡ］Ａ
Ｃ ＣＡＵ ＣＵＵである。括弧内の配列は、触媒「ハ
ンマーヘッド」および５′および３′フランク配列を生
成し、認識部位に相補的で、これに結合する。同様の方
法で、より短い認識配列またはＶＣＡＭ１ｍＲＮＡの他
の開裂部位についてのものまたは他のＥＬＡＭまたはＥ
ＬＡＭリガンドｍＲＮＡについてのものを設計し得る。
【０２０４】実施例XIX ＥＬＡＭ１リガンドを認識する抗イディオタイプ抗体 ＨＬ−６０細胞上のＥＬＡＭ１のリガンドに結合する抗
ＥＬＡＭ１抗体に対する抗イディオタイプ抗体を調製し
た。完全フレンドアジュバント中で１：１に乳化した蛋
白質Ａ精製ＣＤＢ．ＢＢ１１．ＢＣ６モノクローナル
（実施例Ｖ）によりウサギを免疫した。免疫後２６日
に、ウサギを採血し、ＦＡＣＳを使用して特異的抗体に
ついて抗血清を分析した。ＨＬ−６０細胞（ＥＬＡＭ１
のリガンドを発現する）またはＲＡＭＯＳ細胞（発現し
ない）を用いて抗体調製物をインキュベートした。この
抗体調製物は、ＨＬ−６０細胞に特異的に結合したが、
ＲＡＭＯＳ細胞には結合しないことを認め、これはＥＬ
ＡＭ１リガンドを認識する抗体を含有することが示され
た。対照抗血清は、いずれのセルラインとも反応しなか
った。
【０２０５】実施例XX 新規なＥＬＡＭの証拠 誘導されたＨＵＶＥＣｓに対するＵ９３７細胞（これは
単球様である）の結合は、ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１、お
よび／またはＩＣＡＭ１に至る特定のＭｏａｂｓ経路に
よっては遮断されない。しかしながら、Ｕ９３７結合
は、ＣＤ２９、β 1 インテグリン・サブユニットに対す
るモノクローナル抗体によって遮断される。このことか
ら、β1 インテグリンを介して白血球と相互作用するＨ
ＵＶＥＣｓ上の新たな付着分子の存在が推定される。こ
の新たな分子はＶＣＡＭ１に類似する時間経過により誘
導され、誘導後４８時間最大レベルを維持する。２．５
時間ＩＬ−１誘導ＨＵＶＥＣ減算サブライブラリについ
て先に記載した方法を使用し、４８時間ＴＮＦ処理ＨＵ
ＶＥＣｓから減算ライブラリを作成した。先に記載した
直接発現手順を使用し、新たな分子のクローン化を試み
ているところである。
【０２０６】この発明の多数の態様をここに記載した
が、当業者であれば本発明の手順を改変して、この発明
の方法および組成物を利用する他の態様を提供し得るこ
とは明らかである。したがって、この発明の範囲はここ
に添付する請求の範囲により特定され、例として示した
特定の態様によらないことが銘記されよう。
【０２０７】
【表１】
【０２０８】
【表２】
【０２０９】
【表３】
【０２１０】
【表４】
【０２１１】
【表５】
【０２１２】
【表６】
【０２１３】
【表７】
【０２１４】
【表８】
【０２１５】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＥＬＡＭ ｐＣＤＭ８クローン６、ｐＳＱ１
４８およびｐＳＱ１４９のＤＮＡ配列から誘導された複
合ＥＬＡＭ１ ｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を
示し、ヌクレオチドは1〜3863の番号を有する。本明細
書の全体にわたり、この図のコード化ＤＮＡ配列をＥＬ
ＡＭ１のためのＤＮＡ配列と称する。さらに、この図に
示したアミノ酸配列からなる分子をＥＬＡＭ１と称す
る。
【図１Ｂ】図１Ａの分図である。
【図１Ｃ】図１Ａの分図である。
【図１Ｄ】図１Ａの分図である。
【図１Ｅ】図１Ａの分図である。
【図２】ｐＮＮ１１の合成ポリリンカーのＤＮＡ配列を
示す。
【図３Ａ】ＡＭ ｐＣＤＭ８クローン４１から誘導され
たＶＣＡＭ１をコードするｃＤＮＡの配列およびＶＣＡ
Ｍ１の推定アミノ酸配列を示し、ヌクレオチドは1〜281
1の番号を有する。本明細書において、この図のコード
化ＤＮＡ配列をＶＣＡＭ１のためのＤＮＡ配列と称す
る。さらに、この図に示したアミノ酸配列からなる分子
をＶＣＡＭ１と称する。
【図３Ｂ】図３Ａの分図である。
【図３Ｃ】図３Ａの分図である。
【図３Ｄ】図３Ａの分図である。
【図４Ａ】ＶＣＡＭ１ｂ ｐＣＤＭ８クローン１Ｅ１１
から誘導されたＶＣＡＭ１ｂをコードするｃＤＮＡの配
列およびＶＣＡＭ１ｂの推定アミノ酸配列を示し、ヌク
レオチドは1〜3080の数で示す。本明細書において、こ
の図のコード化ＤＮＡ配列をＶＣＡＭ１ｂのためのＤＮ
Ａ配列と称する。さらに、この図に示したアミノ酸配列
からなる分子をＶＣＡＭ１ｂと称する。
【図４Ｂ】図４Ａの分図である。
【図４Ｃ】図４Ａの分図である。
【図４Ｄ】図４Ａの分図である。
【図５】ＶＣＡＭ１のドメイン構造を示し、アミノ酸は
ウィスコンシン大学のジェネティックス・コンピュータ
・グループにより使用される一文字コードによって示さ
れる［デブロー等、1984］。
【図６】ＶＣＡＭ１ｂのドメイン構造を示し、アミノ酸
はウィスコンシン大学のジェネティックス・コンピュー
タ・グループにより使用される一文字コードによって示
される［デブロー等、1984］。
【図７】クローンＥＬ１−０７から誘導されたＥＬＡＭ
１の５′未翻訳および未転写領域における部分のＤＮＡ
配列を示す。
【図８】クローンＶＣ１−１６から誘導されたＶＣＡＭ
１の５′未翻訳および未転写領域における部分のＤＮＡ
配列を示す。
【図９Ａ】ｐＳＱ２１９およびＣＤＸ ｐＣＤＭ８クロ
ーン７．２から誘導されたＣＤＸをコードするｃＤＮＡ
の配列および推定アミノ酸配列を示し、ヌクレオチドは
1〜2175の番号を有する。本明細書において、この図の
コード化ＤＮＡ配列をＣＤＸ用のＤＮＡ配列と称する。
さらに、この図に示したアミノ酸配列からなるポリペプ
チドをＣＤＸと称する。
【図９Ｂ】図９Ａの分図である。
【図９Ｃ】図９Ａの分図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８４ 17/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８７ 35/00 16/18 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/47 16/42 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/42 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ 21/08 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 33/577 Ｂ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 15/00 Ｃ 33/577 5/00 Ｂ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (72)発明者 ロッブ，ロイ アール アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02090、ウェストウッド、ローリング ス トリート 62 (72)発明者 ゲルツ，スーザン イー アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01890、ウインチェスター、ポンド スト リート 195 (72)発明者 オズボーン，ローレリー アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02146、ブライトン 31、エングルウッド アベニュー 39 (72)発明者 ベンジャミン，クリストファー デー アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01915、ベバリー、オーク ヒル レーン ２ (72)発明者 ローザ，マーガレット デー アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01890、ウインチェスター、ブローブ ス トリート 32 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA04 CA07 CA09 CA11 CA20 DA01 DA02 DA03 DA05 DA12 EA02 EA04 FA01 FA02 GA03 GA11 GA25 GA27 HA11 HA13 HA14 HA20 4B063 QA01 QA05 QQ61 QR41 QR77 QR80 QX10 4B064 AG01 AG27 CA02 CA06 CA10 CA11 CA19 CA20 CC01 CC24 CE12 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA90X AA91X AA93Y AB01 AB05 AC14 AC15 AC16 BA02 BA03 BA25 BB01 BC01 BD14 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA13 AA14 BA44 CA27 CA36 DA25 DA32 NA14 ZA662 ZA892 ZB262 4C087 AA01 AA02 BB37 NA13 NA14 ZA66 ZA89 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74 GA26

Claims (110)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）ヌクレオチド番号141 から番号19
    70までの図１におけるＥＬＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号144 から番号1970までの図１に
    おけるＥＬＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＥＬＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮ
    Ａ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号204 から番号1970までの、必要
    に応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む図１のＤ
    ＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、 （ｆ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のい
    ずれかにハイブリッド化するＤＮＡ配列、および （ｇ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるア
    ミノ酸配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列、よりな
    る群から選択される内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡ
    Ｍ）もしくはその断片をコードするＤＮＡ配列。
  2. 【請求項２】 内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）
    もしくはその断片をコードするＤＮＡ配列からなり、前
    記ＤＮＡ配列は （ａ）ヌクレオチド番号141 から番号1970までの図１に
    おけるＥＬＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号144 から番号1970までの図１に
    おけるＥＬＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＥＬＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮ
    Ａ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号204 から番号1970までの、必要
    に応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む図１のＤ
    ＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、 （ｆ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のい
    ずれかにハイブリッド化するＤＮＡ配列、および （ｇ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるア
    ミノ酸配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列、よりな
    る群から選択されることを特徴とする組換ＤＮＡ分子。
  3. 【請求項３】 前記ＤＮＡ配列が発現制御配列に作用結
    合してなる請求の範囲第２項に記載の組換ＤＮＡ分子。
  4. 【請求項４】 前記発現制御配列がＳＶ４０もしくはア
    デノウィルスの早期もしくは後期プロモータ、ｌａｃ
    系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主オ
    ペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御
    領域、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモータ、
    酸ホスファターゼのプロモータおよび酵母α−接合因子
    のプロモータよりなる群から選択される請求の範囲第３
    項に記載の組換ＤＮＡ分子。
  5. 【請求項５】 プラスミドＥＬＡＭ ｐＣＤＭ８クロー
    ン６からなる請求の範囲第３項に記載の組換ＤＮＡ分
    子。
  6. 【請求項６】 内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）
    をコードするＤＮＡ配列もしくはその断片からなり、前
    記ＤＮＡ配列は （ａ）ヌクレオチド141 から番号1970までの図１におけ
    るＥＬＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号144 から番号1970までの図１に
    おけるＥＬＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＥＬＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮ
    Ａ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号204 から番号1970までの、必要
    に応じその５′末端に ＡＴＧ開始コドンを含む図１のＤＮＡ配列、（ｅ）可溶
    性ＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、 （ｆ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のい
    ずれかにハイブリッド化するＤＮＡ配列、および （ｇ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるア
    ミノ酸配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列、よりな
    る群から選択され、しかも前記ＤＮＡ配列が発現制御配
    列に作用結合してなる組換ＤＮＡ分子により形質転換さ
    れた単細胞宿主。
  7. 【請求項７】 前記発現制御配列がＳＶ４０もしくはア
    デノウィルスの早期もしくは後期プロモータ、ｌａｃ
    系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主オ
    ペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御
    領域、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモータ、
    酸ホスファターゼのプロモータおよび酵母α−接合因子
    のプロモータよりなる群から選択される請求の範囲第６
    項に記載の単細胞宿主。
  8. 【請求項８】 プラスミドＥＬＡＭ ｐＣＤＭ８クロー
    ン６からなる請求の範囲第６項に記載の形質転換宿主。
  9. 【請求項９】 単細胞宿主がイー・コリ、シュードモナ
    ス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、ＣＨＯ、Ｒ
    １．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ７、ＢＳ
    Ｃ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０細胞、組織培養にお
    ける植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞よりなる群から
    選択される請求の範囲第６項に記載の形質転換宿主。
  10. 【請求項１０】 請求の範囲第７項に記載の形質転換宿
    主を培養することを特徴とするＥＬＡＭ１の産生方法。
  11. 【請求項１１】 図７のヌクレオチド配列から誘導され
    るサイトキン−誘発性発現制御配列。
  12. 【請求項１２】 図７のヌクレオチド740 〜1307からな
    る請求の範囲第１１項に記載のサイトキン−誘発性発現
    制御配列。
  13. 【請求項１３】 ＥＬＡＭ１、ＥＬＡＭ１のレクチン状
    ドメイン、ＥＬＡＭ１のＥＧＦ状ドメイン、ＥＬＡＭ１
    の一致システイン反復単位、可溶性ＥＬＡＭ１、成熟Ｅ
    ＬＡＭ１およびＥＬＡＭ１リガンドに結合しうるＥＬＡ
    Ｍ１断片よりなる群から選択される常態結合した動物蛋
    白を実質的に含まないＥＬＡＭもしくはその断片。
  14. 【請求項１４】 アミノ酸番号２２（Ｔｒｐ）からアミ
    ノ酸番号609（Ｌｅｕ）までの、必要に応じＮ−末端メ
    チオニン残基を 含む図１のアミノ酸配列からなる請求
    の範囲第１３項に記載の分子。
  15. 【請求項１５】 ハイブリドーマＣＤＢ．ＢＢ１１．Ｂ
    Ｃ６抗−ＥＬＡＭ１。
  16. 【請求項１６】 ハイブリドーマＣＤＢ．ＢＢ１１．Ｂ
    Ｃ６抗−ＥＬＡＭ１により産生されるモノクロ−ナル抗
    体。
  17. 【請求項１７】 ＥＬＡＭ１もしくはその断片のための
    ＭＩＬＡをコードするＤＮＡ配列。
  18. 【請求項１８】 ＭＩＬＡがＥＬＡＭ１リガンドである
    請求の範囲第１７項に記載のＤＮＡ配列。
  19. 【請求項１９】 ＥＬＡＭ１もしくはその断片のための
    ＭＩＬＡをコードするＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡ分
    子。
  20. 【請求項２０】 ＭＩＬＡがＥＬＡＭ１リガンドである
    請求の範囲第１９項に記載の組換ＤＮＡ分子。
  21. 【請求項２１】 前記ＤＮＡ配列が発現制御配列に作用
    結合されてなる請求の範囲第１９項に記載の組換ＤＮＡ
    分子。
  22. 【請求項２２】 ＥＬＡＭ１もしくはその断片のための
    ＭＩＬＡをコードするＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡ分
    子により形質転換された単細胞宿主。
  23. 【請求項２３】 ＭＩＬＡがＥＬＡＭ１リガンドである
    請求の範囲第２２項に記載の単細胞宿主。
  24. 【請求項２４】 イー・コリ、シュードモナス、バチル
    ス、ストレプトミセス、酵母、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−
    Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ１、ＢＳ
    Ｃ４０、ＢＭＴ １０細胞、組織培養における植物細
    胞、昆虫細胞およびヒト細胞よりなる群から選択される
    請求の範囲第２２項に記載の単細胞宿主。
  25. 【請求項２５】 常態結合した動物蛋白質を実質的に含
    まないＥＬＡＭ１もしくはその断片のためのＭＩＬＡ。
  26. 【請求項２６】 ＥＬＡＭ１に結合する請求の範囲第２
    ５項に記載のＭＩＬＡの断片。
  27. 【請求項２７】 ＥＬＡＭ１のためのＭＩＬＡに対し反
    応性であるが、白血球細胞表面における他の蛋白質には
    反応性でない抗体調製物。
  28. 【請求項２８】 実質的にモノクロ−ナル抗体よりなる
    請求の範囲第２７項に記載の抗体調製物。
  29. 【請求項２９】 （ａ）ヌクレオチド番号107 から番号
    2047までの図３におけるＶＣＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号110 から番号2047までの図３に
    おけるＶＣＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＶＣＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮ
    Ａ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号179 〜2047の、必要に応じその
    ５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む図３のＶＣＡＭ１
    ＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＶＣＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、 （ｆ）ヌクレオチド番号100 〜番号2316の図４における
    ＶＣＡＭ１ｂ ＤＮＡ配列、 （ｇ）ヌクレオチド番号103 〜番号2316までの図４にお
    けるＶＣＡＭ１ｂ ＤＮＡ配列、 （ｈ）成熟ＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列をコードするＤ
    ＮＡ配列、 （ｉ）可溶性ＶＣＡＭ１ｂをコードするＤＮＡ配列、 （ｊ）ヌクレオチド番号172 〜番号2316までの、必要に
    応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む図４のＶＣ
    ＡＭ１ｂ ＤＮＡ配列、 （ｋ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のい
    ずれかにハイブリッド化するＤＮＡ配列、 （ｌ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるア
    ミノ酸配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列、よりな
    る群から選択される内皮細胞−白血球付着分子もしくは
    その断片をコードするＤＮＡ配列。
  30. 【請求項３０】 内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡ
    Ｍ）もしくはその断片をコードするＤＮＡ配列からな
    り、前記ＤＮＡ配列は （ａ）ヌクレオチド番号107 から番号2047までの図３に
    おけるＶＣＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号110 から番号2047までの図３に
    おけるＶＣＡＭ１ Ｄ ＮＡ配列、（ｃ）成熟ＶＣＡＭ１のアミノ酸配列をコー
    ドするＤＮＡ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号179 〜2316の、必要に応じその
    ５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む図４のＶＣＡＭ１
    ＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＶＣＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、 （ｆ）ヌクレオチド番号100 〜番号2316の図４における
    ＶＣＡＭ１ｂ ＤＮＡ配列、 （ｇ）ヌクレオチド番号103 〜番号2316までの図４にお
    けるＶＣＡＭ１ｂ ＤＮＡ配列、 （ｈ）成熟ＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列をコードするＤ
    ＮＡ配列、 （ｉ）可溶性ＶＣＡＭ１ｂをコードするＤＮＡ配列、 （ｊ）ヌクレオチド番号172 〜番号2316までの、必要に
    応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む図４のＶＣ
    ＡＭ１ｂ ＤＮＡ配列、 （ｋ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のい
    ずれかにハイブリッド化するＤＮＡ配列、 （ｌ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるア
    ミノ酸配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列、よりな
    る群から選択されることを特徴とする組換ＤＮＡ分子。
  31. 【請求項３１】 前記ＤＮＡ配列が発現制御配列に作用
    結合されてなる請求の範囲第３０項に記載の組換ＤＮＡ
    分子。
  32. 【請求項３２】 前記発現制御配列がＳＶ４０もしくは
    アデノウィルスの早期もしくは後期プロモータ、ｌａｃ
    系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主オ
    ペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御
    領域、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモータ、
    酸ホスファターゼのプロモータおよび酵母α−接合因子
    のプロモータよりなる群から選択される請求の範囲第３
    １項に記載の組換ＤＮＡ分子。
  33. 【請求項３３】 プラスミドＡＭ ｐＣＤＭ８クローン
    ４１またはプラスミドＶＣＡＭ１ｂクローン１Ｅ１１
    ｐＣＤＭ８からなる請求の範囲第３１項に記載の組換Ｄ
    ＮＡ分子。
  34. 【請求項３４】 内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡ
    Ｍ）もしくはその断片をコードするＤＮＡ配列からな
    り、前記ＤＮＡ配列は （ａ）ヌクレオチド番号107 から番号2047までの図３に
    おけるＶＣＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｂ）ヌクレオチド番号110 から番号2047までの図３に
    おけるＶＣＡＭ１ ＤＮＡ配列、 （ｃ）成熟ＶＣＡＭ１のアミノ酸配列をコードするＤＮ
    Ａ配列、 （ｄ）ヌクレオチド番号179 〜2316の、必要に応じその
    ５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む図４のＶＣＡＭ １
    ＤＮＡ配列、 （ｅ）可溶性ＶＣＡＭ１をコードするＤＮＡ配列、 （ｆ）ヌクレオチド番号100 〜番号2316の図４における
    ＶＣＡＭ１ｂ ＤＮＡ配列、 （ｇ）ヌクレオチド番号103 〜番号2316までの図４にお
    けるＶＣＡＭ１ｂ ＤＮＡ配列、 （ｈ）成熟ＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列をコードするＤ
    ＮＡ配列、 （ｉ）可溶性ＶＣＡＭ１ｂをコードするＤＮＡ配列、 （ｊ）ヌクレオチド番号172 〜番号2316までの、必要に
    応じその５′末端にＡＴＧ開始コドンを含む図４のＶＣ
    ＡＭ１ｂ ＤＮＡ配列、 （ｋ）標準ハイブリッド化条件下で前記ＤＮＡ配列のい
    ずれかにハイブリッド化するＤＮＡ配列、 （ｌ）前記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるア
    ミノ酸配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列 よりなる群から選択され、しかも前記ＤＮＡ配列が発現
    制御配列に作用結合されてなる組換ＤＮＡ分子により形
    質転換された単細胞宿主。
  35. 【請求項３５】 組換ＤＮＡ分子がプラスミドＡＭ ｐ
    ＣＤＭ８クローン４１またはクローンＶＣＡＭ１ｂ ｐ
    ＣＤＭ８クローン１Ｅ１１からなる請求の範囲第３４項
    に記載の単細胞宿主。
  36. 【請求項３６】 単細胞性宿主がイー・コリ、シュード
    モナス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、ＣＨＯ、
    Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、
    ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０、組織培養にお
    ける植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞よりなる群から
    選択される請求の範囲第３４項に記載の単細胞宿主。
  37. 【請求項３７】 請求の範囲第３４項に記載の単細胞宿
    主を培養することを特徴とするＶＣＡＭ１の産生方法。
  38. 【請求項３８】 常態結合した動物蛋白質を実質的に含
    まないＶＣＡＭ １もしくはＶＣＡＭ１ｂまたはその断
    片。
  39. 【請求項３９】 ＶＣＡＭ１のドメイン１、ＶＣＡＭ１
    のドメイン２、ＶＣＡＭ１のドメイン３、ＶＣＡＭ１の
    ドメイン４、ＶＣＡＭ１のドメイン５、ＶＣＡＭ１のド
    メイン６、ＶＣＡＭ１ｂのドメイン３、ＶＣＡＭ１ｂの
    ドメイン３Ｂ、ＶＣＡＭ１ｂのドメイン４およびその組
    合せよりなる群からから選択されるＶＣＡＭ１もしくは
    ＶＣＡＭ１ｂポリペプチド。
  40. 【請求項４０】 アミノ酸番号25からアミノ酸番号647
    までの、必要に応じＮ−末端メチオニン残基を含む図３
    のアミノ酸配列からなる請求の範囲第３８項に記載のＶ
    ＣＡＭ１。
  41. 【請求項４１】 ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂに対
    し反応性であるが、内皮細胞表面上で発現される他の付
    着分子に対し反応性でない抗体調製物。
  42. 【請求項４２】 前記抗体調製物が実質的にモノクロ−
    ナル抗体よりなる請求の範囲第４１項に記載の抗体調製
    物。
  43. 【請求項４３】 ＶＣＡＭ１を認識するモノクロ−ナル
    抗体を産生するハイブリドーマ。
  44. 【請求項４４】 生物をＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１
    ｂまたはその抗原性断片で免疫化することを特徴とする
    ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂを認識する抗体の産生
    方法。
  45. 【請求項４５】 （ａ）分子をＥＬＡＭまたはＥＬＡＭ
    発現性細胞と接触させて第１混合物を作成し、 （ｂ）前記第１混合物をＥＬＡＭリガンドまたはＭＩＬ
    Ａ発現性細胞と接触させて第２混合物を作成し、 （ｃ）前記第２混合物を、前記ＥＬＡＭリガンドもしく
    はＭＩＬＡ−発現性細胞に結合した前記ＥＬＡＭもしく
    はＭＩＬＡ発現性細胞の量につき試験することを特徴と
    する内皮細胞に対する白血球の結合を阻止する分子の同
    定方法。
  46. 【請求項４６】 （ａ）分子をＥＬＡＭリガンドまたは
    ＭＩＬＡ発現性細胞と接触させて第１混合物を作成し、 （ｂ）前記第１混合物をＥＬＡＭまたはＥＬＡＭ発現性
    細胞と接触させて第２混合物を作成し、 （ｃ）前記第２混合物を、前記ＥＬＡＭもしくはＥＬＡ
    Ｍ発現性細胞に結合した前記ＥＬＡＭリガンドもしくは
    ＥＬＡＭ発現性細胞の量につき試験する、ことを特徴と
    する内皮細胞に対する白血球の結合を阻止する分子の同
    定方法。
  47. 【請求項４７】 ＥＬＡＭがＥＬＡＭ１である請求の範
    囲第４５項または第４６項に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 ＥＬＡＭリガンドがＥＬＡＭ１リガン
    ドである請求の範囲第４５項または第４６項に記載の方
    法。
  49. 【請求項４９】 ＥＬＡＭがＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡ
    Ｍ１ｂである請求の範囲第４５項または第４６項に記載
    の方法。
  50. 【請求項５０】 ＭＩＬＡがＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡ
    Ｍ１ｂリガンドである請求の範囲第４５項または第４６
    項に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 ＭＩＬＡがＶＬＡ４である請求の範囲
    第４５項または第４６項に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 白血球と内皮細胞との間の付着をこれ
    らを含有する系にて阻止するに際し、有効量の阻止剤を
    前記系に導入し、前記阻止剤をＥＬＡＭリガンドに結合
    しうるＥＬＡＭもしくはその断片、ＭＩＬＡを認識する
    抗体、ＥＬＡＭに結合しうるＥＬＡＭリガンドもしくは
    その断片、ＥＬＡＭに結合する炭水化物、およびＥＬＡ
    Ｍを認識する抗体よりなる群から選択する白血球と内皮
    細胞との間の付着の阻止方法。
  53. 【請求項５３】 阻止剤が、ＥＬＡＭ１のレクチン状ド
    メイン、ＥＬＡＭ１のＥＧＦ様ドメイン、ＥＬＡＭ１の
    一致システイン反復単位、および可溶性ＥＬＡＭ１より
    なる群から選択されるＥＬＡＭ１もしくはＥＬＡＭの断
    片である請求の範囲第５２項に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 阻止剤が、ＥＬＡＭ１リガンドを認識
    するモノクロ−ナル抗体の調製物である請求の範囲第５
    ２項に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 阻止剤が、ＶＬＡ−４を認識するモノ
    クロ−ナル抗体の調製物である請求の範囲第５２項に記
    載の方法。
  56. 【請求項５６】 モノクロ−ナル抗体がＶＬＡ−４のα
    ４サブユニットを認識することを特徴とする請求の範囲
    第５５項に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 前記阻止剤が、ＥＬＡＭ１に結合しう
    るＥＬＡＭ１リガンドもしくはその断片である請求の範
    囲第５２項に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 阻止剤が、ＥＬＡＭ１を認識するモノ
    クロ−ナル抗体である請求の範囲第５２項に記載の方
    法。
  59. 【請求項５９】 モノクロ−ナル抗体がハイブリドーマ
    ＣＤＢ．ＢＢ１１．ＢＣ６抗−ＥＬＡＭ１により産生さ
    れるものである請求の範囲第５８項に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記阻止剤をＶＬＡ４に結合するＶＣ
    ＡＭ１、ＶＣＡＭ１ｂおよびその断片よりなる群から選
    択する請求の範囲第５２項に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 前記阻止剤が、ＶＣＡＭ１リガンドを
    認識するモノクロ−ナル抗体である請求の範囲第５２項
    に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 前記阻止剤が、ＶＣＡＭ１もしくはＶ
    ＣＡＭ１ｂに結合するＶＣＡＭ１リガンドもしくはその
    断片である請求の範囲第５２項に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 ＶＣＡＭ１リガンドがＶＬＡ４である
    請求の範囲第６２項に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 白血球と内皮細胞との間の付着をこれ
    らを含有する系にて阻止するに際し、有効量の阻止剤を
    前記系に導入し、前記阻止剤がＶＣＡＭ１もしくはＶＣ
    ＡＭ１ｂを認識するモノクロ−ナル抗体である白血球と
    内皮細胞との間の付着の阻止方法。
  65. 【請求項６５】 ＥＬＡＭリガンド、ＥＬＡＭリガンド
    のＥＬＡＭ結合性断片、およびＥＬＡＭを認識する抗体
    よりなる群から選択される検出可能となるよう標識した
    化合物を投与する工程からなる炎症の検出方法。
  66. 【請求項６６】 （ａ）血液、血清もしくは他の体液の
    試料を検出可能となるよう標識したＥＬＡＭリガンド、
    ＥＬＡＭリガンドのＥＬＡＭ結合性断片またはＥＬＡＭ
    を認識する抗体と接触させて混合物を作成し、 （ｂ）前記混合物をＥＬＡＭリガンド、ＥＬＡＭリガン
    ドのＥＬＡＭ結合性断片もしくはＥＬＡＭに結合した抗
    体の量につき試験することを特徴とする炎症の検出方
    法。
  67. 【請求項６７】 ＥＬＡＭリガンドがＥＬＡＭ１リガン
    ドである請求の範囲第６５項または第６６項に記載の方
    法。
  68. 【請求項６８】 ＥＬＡＭリガンドがＶＣＡＭ１リガン
    ドもしくはＶＣＡＭ１ｂリガンドである請求の範囲第６
    ５項または第６６項に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 ＶＣＡＭ１リガンドがＶＬＡ４である
    請求の範囲第６８項に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 抗体がハイブリドーマＣＤＢ．Ｂ１
    １．ＢＣ６抗−ＥＬＡＭ１により産生されたものである
    請求の範囲第６５項または第６６項に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 ＥＬＡＭもしくはその断片を発現に際
    しコードするＤＮＡ配列、および免疫グロブリン分子の
    定常領域を発現に際しコードするＤＮＡ配列からなるこ
    とを特徴とするＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白質を
    発現に際しコードする組換ＤＮＡ分子。
  72. 【請求項７２】 ＥＬＡＭがＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１も
    しくはＶＣＡＭ１ｂである請求の範囲第７１項に記載の
    ＤＮＡ配列。
  73. 【請求項７３】 ＶＣＡＭ１ドメイン１−３およびヒト
    免疫グロブリンＣ−γ−１の定常領域を含む請求の範囲
    第７１項に記載の組換ＤＮＡ分子。
  74. 【請求項７４】 ｍＲＮＡにハイブリッド化する核酸配
    列からなるＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ ｍＲＮＡに対す
    るアンチセンス核酸。
  75. 【請求項７５】 前記ｍＲＮＡの開始コドンに結合する
    請求の範囲第７４項に記載のアンチセンスオリゴヌクレ
    オチド。
  76. 【請求項７６】 ＥＬＡＭがＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１も
    しくはＶＣＡＭ１ｂである請求の範囲第７４項に記載の
    アンチセンス核酸。
  77. 【請求項７７】 ＭＩＬＡがＥＬＡＭ１リガンドである
    請求の範囲第７４項に記載のアンチセンス核酸。
  78. 【請求項７８】 ｍＲＮＡにハイブリッド化する核酸配
    列からなるＶＬＡ４ｍＲＮＡに対するアンチセンス核
    酸。
  79. 【請求項７９】 ＤＮＡを含む請求の範囲第７４項に記
    載のアンチセンス核酸。
  80. 【請求項８０】 ＲＮＡを含む請求の範囲第７４項に記
    載のアンチセンス核酸。
  81. 【請求項８１】 ＤＮＡ配列５′ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡ
    Ｔ ＴＴＴ ＡＡＧを有する請求の範囲第８０項に記載
    のアンチセンス核酸。
  82. 【請求項８２】 ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ ｍＲＮＡ
    に対するアンチセンスリボ核酸を転写に際し産生するＤ
    ＮＡ配列を有し、前記アンチセンスリボ核酸が前記ｍＲ
    ＮＡにハイブリッド化する核酸配列からなることを特徴
    とする組換ＤＮＡ分子。
  83. 【請求項８３】 ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ ｍＲＮＡ
    に対するアンチセンスリボ核酸を転写に際し産生するＤ
    ＮＡ配列を有し、前記アンチセンスリボ核酸が前記ｍＲ
    ＮＡにハイブリッド化する核酸配列からなる組換ＤＮＡ
    分子によりトランスフェクトされたＥＬＡＭ生産性もし
    くはＭＩＬＡ−生産性細胞ライン。
  84. 【請求項８４】 ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ ｍＲＮＡ
    に対するアンチセンスリボ核酸を転写に際し産生するＤ
    ＮＡ配列を有し、前記アンチセンスリボ核酸が前記ｍＲ
    ＮＡにハイブリッド化する核酸配列からなる組換ＤＮＡ
    分子によりＥＬＡＭ−生産性もしくはＭＩＬＡ−生産性
    細胞ラインをトランスフェクトすることを特徴とするＥ
    ＬＡＭもしくはＭＩＬＡの減少した発現を示す細胞ライ
    ンの作成方法。
  85. 【請求項８５】 １種もしくはそれ以上のＥＬＡＭもし
    くはＭＩＬＡの産生を減少させるのに有効な量の請求の
    範囲第７１項に記載のアンチセンス核酸を投与すること
    を特徴とする炎症の処置方法。
  86. 【請求項８６】 ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ ｍＲＮＡ
    を切断するリボザイムを転写に際し産生するＤＮＡ配列
    からなる組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトされた
    ＥＬＡＭ生産性もしくはＭＩＬＡ ｍＲＮＡ生産性細胞
    ライン。
  87. 【請求項８７】 ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡ ｍＲＮＡ
    を切断するリボザイムを転写に際し産生する組換ＤＮＡ
    分子によりＥＬＡＭ−生産性もしくはＭＩＬＡ−生産性
    細胞ラインをトランスフェクトすることを特徴とするＥ
    ＬＡＭもしくはＭＩＬＡの減少した発現を示す細胞ライ
    ンの作成方法。
  88. 【請求項８８】 ＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドの
    産生を減少させるのに有効な量のＥＬＡＭ ｍＲＮＡも
    しくはＥＬＡＭリガンド ｍＲＮＡを切断するリボザイ
    ムを投与することを特徴とする炎症の処置方法。
  89. 【請求項８９】 ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡに対し反応
    性である抗−イディオタイプ抗体調製物。
  90. 【請求項９０】 ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１もしくはＶＣ
    ＡＭ１ｂに対し反応性である請求の範囲第８９項に記載
    の抗−イディオタイプ抗体調製物。
  91. 【請求項９１】 ＥＬＡＭ１リガンドに対し反応性であ
    る請求の範囲第８９項に記載の抗−イディオタイプ抗体
    調製物。
  92. 【請求項９２】 ＶＬＡ４に対し反応性である請求の範
    囲第８９項に記載の抗−イディオタイプ抗体調製物。
  93. 【請求項９３】 ＣＤＸに対し反応性である請求の範囲
    第８９項に記載の抗−イディオタイプ抗体調製物。
  94. 【請求項９４】 ＶＣＡＭ１のドメイン１、２、３、
    ４、５もしくは６またはＶＣＡＭ１ｂのドメイン３、３
    Ｂもしくは４に対し反応性である請求の範囲第８９項に
    記載の抗−イディオタイプ抗体調製物。
  95. 【請求項９５】 （ａ）ＥＬＡＭ１、ＣＤＸ、ＶＣＡＭ
    １、ＶＣＡＭ１ｂもしくはＶＬＡ４のいずれか１種を認
    識する抗体を認識する抗−イディオタイプ抗体に対し結
    合する蛋白質につき蛋白質混合物をスクリーニングし、 （ｂ）前記抗−イディオタイプ抗体に結合する分子を分
    離し、 （ｃ）ＥＬＡＭ１、ＣＤＸ、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１ｂ
    もしくはＶＬＡ４に結合する蛋白の能力を試験する ことを特徴とするＥＬＡＭ１、ＣＤＸ、ＶＣＡＭ１、Ｖ
    ＣＡＭ１ｂもしくはＶＬＡ４のいずれか１種に結合する
    ＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドの同定方法。
  96. 【請求項９６】 ＩＬ−１、ＴＮＦもしくはＩＦＮ−γ
    を認識する 抗体の有効量を投与することを特徴とする
    ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂ発現の阻止方法。
  97. 【請求項９７】 ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂを認
    識する抗体を持った放射線免疫結合体を投与することを
    特徴とするＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂ−生産性癌
    細胞の検出方法。
  98. 【請求項９８】 ＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂを認
    識する抗体を持った放射線免疫結合体もしくは免疫毒素
    の有効量を投与することを特徴とする癌の処置方法。
  99. 【請求項９９】 ＶＣＡＭ１リガンドを結合するＶＣＡ
    Ｍ１もしくはＶＣＡＭ１ｂドメインおよびＩＣＡＭＩリ
    ガンドを結合するＩＣＡＭ１ドメインに関するＤＮＡ配
    列からなる、ＶＣＡＭ／ＩＣＡＭ融合蛋白質をコードす
    るＤＮＡ配列。
  100. 【請求項１００】 ＶＣＡＭ１リガンドがＶＬＡ４であ
    り、ＩＣＡＭ１リガンドがＬＦＡ１である請求の範囲第
    ９９項に記載のＤＮＡ配列。
  101. 【請求項１０１】 ＶＣＡＭ１リガンドを結合するＶＣ
    ＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂドメインおよびＩＣＡＭ１
    リガンドを結合するＩＣＡＭ１ドメインからなるＶＣＡ
    Ｍ／ＩＣＡＭ融合蛋白質。
  102. 【請求項１０２】 ＶＣＡＭ１リガンドがＶＬＡ４であ
    り、ＩＣＡＭ１リガンドがＬＦＡ１である請求の範囲第
    １０１項に記載の融合蛋白質。
  103. 【請求項１０３】 （１）腫瘍組織の試料を、この種の
    腫瘍を有する哺乳動物から剔出し、 （２）腫瘍組織に浸潤した１個もしくはそれ以上の白血
    球を前記試料から分離し、 （３）殺腫瘍剤をコードする遺伝子を含むと共に殺腫瘍
    性遺伝子生産物を前記白血球内に発現しうる組換発現ベ
    クターにより前記１個もしくはそれ以上の浸潤性白血球
    をトランスフェクトし、 （４）トランスフェクトされた白血球を前記哺乳動物に
    導入することを特徴とするＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１、Ｖ
    ＣＡＭ１ｂ もしくはそのリガンドを発現する腫瘍の処
    置方法。
  104. 【請求項１０４】 殺腫瘍性遺伝子生産物がＴＮＦもし
    くはリンパ性毒素である請求の範囲第１０３項に記載の
    方法。
  105. 【請求項１０５】 哺乳動物がヒトである請求の範囲第
    １０４項に記載の方法。
  106. 【請求項１０６】 組換発現ベクターがレトロウィルス
    ベクターである請求の範囲第１０３項に記載の方法。
  107. 【請求項１０７】 トランスフェクトされた白血球を哺
    乳動物に導入する前に、前記トランスフェクトされた白
    血球をＩＬ−２で拡充させる請求の範囲第１０３項に記
    載の方法。
  108. 【請求項１０８】 腫瘍が悪性腫瘍である請求の範囲第
    １０３項に記載の方法。
  109. 【請求項１０９】 腫瘍がＶＬＡ４もしくはＣＤＸを発
    現する請求の範囲第１０３項に記載の方法。
  110. 【請求項１１０】 腫瘍が黒色腫もしくは結腸癌である
    請求の範囲第１０９項に記載の方法。
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