TWI474000B - 捕捉腫瘤細胞之套組及方法 - Google Patents

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捕捉腫瘤細胞之套組及方法
本發明係關於一種捕捉體液樣本或含血清樣本中之腫瘤細胞的套組及方法。特定言之，提供本發明之套組及方法來捕捉循環性腫瘤細胞。
癌症為累積性的多基因突變之結果，該等突變使致癌基因活化及/或腫瘤抑制基因失活。癌症仍為全球死亡率之主要原因。儘管在診斷及治療方面已有進步，但在過去多年的總存活率並未得到顯著改善。仍有需要實現更敏感之腫瘤診斷方式。
大多數癌症死亡並非由於原發性腫瘤所致。實際上，死亡由轉移(亦即多個分布廣泛之腫瘤群落，由自身自原始腫瘤部位脫離且常常行經身體到達遠端部位的惡性細胞形成)而引起。若能儘早偵測到原發性腫瘤，則手術、輻射、化學療法或彼等治療之某種組合常可將其消除。令人遺憾的是，轉移群落較難偵測及消除，且常常無法成功地治療所有轉移群落。因此，就臨床觀點而言，轉移可視為天然癌症進程中之決定性因素。此外，轉移能力為一可獨特特徵化惡性腫瘤之性質。癌轉移包含以下一系列複雜的連續事件：1.自原發地點擴展至周圍組織；2.穿透至體腔及血管中；3.釋放腫瘤細胞以經由循環系統輸送至遠端部位；4.在停滯部位處再侵入組織；及，5.適應新環境以促進腫瘤細胞存活、血管形成及腫瘤生長。基於癌症及癌轉移之複雜性以及多年來在治療癌症患者方面之挫折，已有眾多嘗試來開發針對轉移及早期復發之發展情況的偵測測試。
循環性腫瘤細胞(CTC)為自原發性腫瘤或其在周邊血液中循環之轉移灶脫出之癌細胞。雖然轉移為造成大多數癌症死亡之直接原因，但CTC可構成轉移之起因且可指出疾病之擴散程度。當CTC極其稀少(每毫升至多數個CTC)時，鑑別CTC可指示癌症，或甚至在出現明顯臨床症狀之前指示癌前期生長。在一個多世紀前已對偵測周邊血液中之CTC首次表現出潛在關注，但接著便有所減退，因為樣本中之CTC數目極少，所以由習知方法難以偵測到。對於鑑別及特徵化在血液中循環之稀少腫瘤細胞而言，其挑戰在於開發一種結合高敏感性與高特異性之方法，從而能夠將腫瘤細胞與正常上皮細胞及白血球加以區分。循環性腫瘤細胞之偵測可有助於癌症預後、微小殘留疾病之診斷、腫瘤對抗癌藥物之敏感性評估及抗癌療法之個人化(personalization)。CTC之高度敏感性與特異性鑑別亦可應用於侵襲性癌症之早期診斷及篩選。
基於DNA或RNA之腫瘤特異性異常之PCR擴增的分子技術已有助於隱蔽(隱藏)性腫瘤細胞之偵測。已發展出能夠在一百萬個正常細胞中以常規方式偵測一個腫瘤細胞的基於PCR之測試，來鑑別各種類型癌瘤中之循環性腫瘤細胞。舉例而言，Smith B.等人開發出逆轉錄酶-聚合酶鏈反應來偵測周邊血液中之黑素瘤細胞(Lancet,338: 1227-1236,1991)。然而，此等方法可能無法有效地自正常細胞擴增活腫瘤細胞。因為細胞完整性在DNA或RNA萃取期間遭到破壞，所以此方法阻礙了對細胞形態及表型之分析，詳言之，因而可能既無法區別自正常組織直接脫出之物質與自腫瘤脫出之物質，亦無法對相同細胞中之若干相關變化進行偵測。
免疫螢光顯微術能夠分析細胞形態且能夠對可鑑別之推定腫瘤細胞直接進行計數。使用適當抗體對細胞作免疫標記來進行偵測。然而，因為迄今尚不存在針對腫瘤之抗體，所以已使用特異性抗原來鑑別CTC。此外，對於偵測結腸直腸癌患者體內之CTC團簇，亦已開發並評估使用免疫細胞化學標記之免疫磁性細胞分離(Clinical Cancer Research,2001,第7卷，第4080-4085頁)。WO 2006050352提供一種改良之細胞黏附基質(「CAM」)及一種改良之分離靶細胞(諸如來自血液或其他組織液樣本之腫瘤細胞、胎兒細胞及血管生成細胞)的細胞分離裝置。此外，WO 2009051734揭示一種捕捉循環、非造血性腫瘤細胞之裝置，其包括結合腫瘤特異性結合劑之微流通道及在該通道中產生0.1至20 dyn/cm2 之連續、單向剪應力的泵。然而，上述技術均無法有效地偵測CTC。
顯而易見的是，尤其在癌症早期，極其需要一種在繼發性腫瘤形成之前鑑別在循環中具有轉移潛力之彼等細胞的方法及/或套組。
本發明之一目的在於提供一種捕捉體液樣本或含血清樣本中之腫瘤細胞的方法，其包含以下步驟：
(a)使類內皮(endothelium-like)細胞或類上皮(epithelium-like)細胞附著於固體支撐物上；
(b)用一或多種發炎誘導劑誘導(a)之細胞的發炎反應；
(c)使白血球附著於(a)之細胞上；及
(d)將體液樣本或含血清樣本添加至固體支撐物，藉此，白血球及類內皮細胞或類上皮細胞捕捉體液樣本或含血清樣本中所含之腫瘤細胞。
本發明之另一目的在於提供一種捕捉體液樣本或含血清樣本中之腫瘤細胞的套組，其包含(a)固體支撐物；(b)附著於該固體支撐物上之類內皮細胞或類上皮細胞；(c)附著於(b)之細胞上的白血球；及(d)一或多種發炎誘導劑。
本發明係關於一種捕捉體液樣本或含血清樣本中之腫瘤細胞的方法及套組。藉由利用白血球可捕捉樣本中活的含核異源細胞之概念，可達成對體液樣本或含血清樣本中之腫瘤細胞的偵測及確認。本發明之套組及方法可捕捉活腫瘤細胞，而無法捕捉非活的腫瘤細胞或細胞片段，從而可藉由進一步培養所捕捉之腫瘤細胞來進一步鑑別該腫瘤之種類。測試樣本中之未知腫瘤細胞難以鑑別，因為其稀少且具有各種尺寸及抗原決定基。本發明之套組及方法可輕易地鑑別樣本是否含有腫瘤細胞且收集此等腫瘤細胞以供進一步鑑別，從而可發現癌症之存在以及轉移與早期復發之發展情況。
在一態樣中，本發明提供一種捕捉體液樣本或含血清樣本中之腫瘤細胞的方法，其包含以下步驟：
(a)使類內皮細胞或類上皮細胞附著於固體支撐物上；
(b)用一或多種發炎誘導劑誘導(a)之細胞的發炎反應；
(c)使白血球附著於(a)之細胞上；及
(d)將體液樣本添加至固體支撐物，藉此，白血球及類內皮細胞或類上皮細胞捕捉體液樣本或含血清樣本中所含之腫瘤細胞。
在一實施例中，該方法可進一步包含在使用該方法之前，預處理體液樣本或含血清樣本以使該樣本處於生理條件下的步驟。在另一實施例中，該方法可進一步包含在使用該方法之前，將生物樣本預處理成體液樣本或含血清樣本之步驟。在另一實施例中，該方法亦可進一步包含在步驟(d)之後收集所捕捉之腫瘤細胞的步驟。
在另一態樣中，本發明提供一種捕捉體液樣本或含血清樣本中之腫瘤細胞的套組，其包含(a)固體支撐物，(b)附著於該固體支撐物上之類內皮細胞或類上皮細胞，(c)附著於(b)之細胞上的白血球，及(d)一或多種發炎誘導劑。
根據本發明，「固體支撐物」或「固體載體」意謂任何固相材料，上面可附著、接合或固定本發明捕捉方法中所用之細胞。固體支撐物涵蓋諸如「膜」、「樹脂」、「固相」、「表面」及「支撐物」之術語。在一實施例中，固體支撐物為親水性的。特定言之，可將固體支撐物之表面修飾成親水性表面。修飾方法可為(但不限於)氧電漿處理、水電漿處理及化學處理。此支撐物可由以下有機聚合物構成：諸如硝化纖維素膜、耐綸膜(nylon membrane)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯及聚丙烯醯胺，以及其共聚物及接枝聚合物。固體支撐物亦可為無機物，諸如玻璃、二氧化矽、逆相二氧化矽或生物晶片。固體支撐物之組態可呈珠粒、球體、粒子、顆粒、凝膠或表面之形式。表面可為平面、實質上平面或非平面的。固體支撐物之組態可呈孔(well)、凹陷(depression)或其他貯器(container)、容器(vessel)或位置之形式。固體支撐物較佳為皮氏培養皿(petri dish)或盤，其較佳具有複數個可進行檢定之孔。該盤較佳為多孔微量滴定盤。在另一實施例中，支撐物表面可具有電極。該(該等)電極可偵測所捕捉之腫瘤細胞的存在及其量。使用電極偵測細胞在此項技術中為已知的。美國專利第6,716,633號提供一種血細胞偵測器，其包括具有單一孔口之孔口區、將第一血液試樣供應至孔口區中之第一供應區、將第二血液試樣供應至孔口區中之第二供應區，以及在孔口之相對側上提供之第一電極及第二電極，當使第一血液試樣及第二血液試樣選擇性地通過孔口時，第一電極及第二電極用於偵測第一血液試樣及第二血液試樣中之每一者的阻抗變化，該專利以引用的方式併入本文中。在一實施例中，電極可由氧化銦錫(ITO)、碳奈米管、矽或氧化鈦構成。藉由改變電流頻率，電極可產生介電泳力(DEP力)。DEP力可提供能夠捕捉細胞或將細胞移走之力。在具有電極之區域上捕捉到恆定細胞且該區域經證實為定量計數區域。
根據本發明，「類內皮細胞或類上皮細胞」係指內皮細胞或上皮細胞及其類似細胞。類內皮細胞或類上皮細胞較佳為血管細胞、淋巴管細胞、口腔上皮細胞或人類臍靜脈內皮細胞。
根據本發明，「發炎誘導劑」係指可誘導發炎反應之試劑。發炎誘導劑較佳為細胞因子、生長因子、表面蛋白或介白素。發炎誘導劑較佳為腫瘤壞死因子或介白素。發炎誘導劑更佳為腫瘤壞死因子-α、介白素-1(IL-1)、IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、干擾素-γ(IFN-γ)、干擾素-α(IFN-α)或TNF-α。
根據本發明，「白血球」係指保護身體免受傳染病與外來物質侵害之免疫系統細胞。在一實施例中，白血球包括嗜中性球(neutrophil)、嗜酸性球(eosinophil)、嗜鹼性球(basophil)、淋巴細胞、單核細胞及巨噬細胞。白血球較佳為嗜中性球及巨噬細胞。在發炎期間，白血球向發炎部位遷移且其附著外來物質以殺死此等物質。根據本發明，白血球之特徵為附著活的含核異源細胞。根據本發明誘導發炎反應之後，白血球移動至類內皮細胞或類上皮細胞且附著於其上。在本發明之一實施例中，本發明方法中所用之白血球可原始存在於體液樣本中。在本發明之另一實施例中，可額外添加白血球且將其應用於本發明。
根據本發明，「體液樣本」或「含血清樣本」可來源於任何生物來源，諸如生理流體，包括全血、腹水、唾液、尿液、滑液、腹膜液、羊膜液、腦脊髓液、漿液、脊髓液及可能含有腫瘤細胞之其他身體組份。若樣本含有腫瘤細胞，則在執行本發明之套組及方法時，白血球可捕捉腫瘤細胞，因為該等腫瘤細胞為含核異源細胞且可由白血球鑑別及識別。根據本發明之一實施例，因為本發明之一目的在於捕捉活腫瘤細胞且在本發明之方法及套組中使用活細胞，所以在供本發明之方法及套組使用之前，可預處理體液樣本或含血清樣本以使該樣本處於生理條件下。根據本發明之另一實施例，該方法可進一步包含將生物樣本預處理成含血清樣本之步驟。根據本發明，生物樣本為任何種類之身體樣本；生物樣本較佳為骨髓抽取物、骨髓均質物、淋巴組織均質物或組織均質物。生物樣本較佳為含有組織之溶液。較佳將樣本預稀釋10倍以上。在一實施例中，本發明中所用之樣本體積在約5 mL至約30 mL之範圍內。樣本體積較佳為約5 mL至約25 mL、約5 mL至約20 mL、約5 mL至約15 mL、約5 mL至約10 mL、約10 mL至約25 mL、約15 mL至約25 mL、約10 mL至約20 mL或15 mL至20 mL。
根據本發明，體液樣本或含血清樣本中之腫瘤細胞為自腫瘤組織剝奪或分泌且接著進入體液樣本中之腫瘤細胞。腫瘤細胞較佳為循環腫瘤細胞。根據本發明，在捕捉腫瘤細胞之後，可由此項技術中已知之方法進一步收集該等腫瘤細胞。舉例而言，用完全DMEM中之廣效性抗生素及抗真菌溶液充分洗滌腫瘤細胞或其片段(洗滌6-7次)以達到與標準細胞培養條件相容之無菌程度。接著，將細胞或片段切割成1至2 mm3 小片。將此等小片接種於預塗有PolyHEMA且含2 mL完全培養基之6孔盤中。將腫瘤片段培養2天，且接著回收培養基並以單獨培養基或含藥物培養基置換，歷時24小時。所用藥物為拓撲異構酶-I抑制劑代謝物SN-38(7-乙基-10-羥基喜樹鹼(7-ethyl-10-hydroxycamptotecin；其為喜樹鹼(camptothecin)之活性代謝物)，10-5 mM/l，該濃度與將喜樹鹼靜脈投與人類後於腫瘤中所觀測到的濃度類似。在此時段結束時，進行洗脫以清除藥物，且歷經72小時添加培養基。
本發明之套組為用於實施本發明方法之套組。根據本發明，該套組包括(a)固體支撐物，(b)附著於該固體支撐物上之類內皮細胞或類上皮細胞，(c)附著於(b)之細胞上的白血球，及(d)一或多種發炎誘導劑。將該套組之(a)、(b)、(c)及(d)之上述材料中之每一者置放於獨立貯器(諸如小瓶、管及其類似物)中。亦即，各貯器包含一種欲在檢定中使用之獨立材料。套組可進一步包括一組使用該套組之說明書以指導捕捉體液樣本中之腫瘤細胞的預定檢定。
在本發明之套組及方法中，可誘導附著於固體支撐物之類內皮細胞或類上皮細胞以產生發炎反應。藉由添加一或多種發炎誘導劑來誘導發炎反應。在誘導發炎後，本發明之套組及方法中所用之白血球將向炎性細胞遷移且附著於炎性細胞。由於白血球將捕捉活的含核異源細胞，因此在添加體液樣本後，白血球將捕捉樣品中之腫瘤細胞。然而，白血球不會捕捉樣本中之非活性細胞、非活性細胞片段及其他污染物。藉由使用本發明之套組及方法，可獲得體液樣本或含血清樣本中之活腫瘤細胞，且對其進行培養後，可使用此項技術中已知之方法(諸如即時PCR或流動式細胞測量術)進一步鑑別腫瘤細胞種類(Barrett DL,Jensen RH,King EB,Dean PN,Mayall BH. Flow cytometry of human gynecologic specimens using log chromomycin A: fluorescence and log 90" light scatter. J Histochem Cytochem 27(1): 573-578,1979；Darzynkiewicz Z: Acridine orange as a molecular probe in studies of nucleic acids in situ. Flow Cytometry and Sorting,MelamedMR ,Mullaney PF,Mendelsohn ML(編),John Wiley & Sons,New York,1979,第285-316頁；Frost JK,Tyrer HW,Pressman NJ,Albright CD,Vansickel MH,Gill GW: Automatic cell identification and enrichment in lung cancer. I. Light scatter and fluorescence parameters. J Histochem Cytochem 27545-551,1979；及Frost JK,Tyrer HW,Pressman NJ,Adams LA,Vansickel MH,Albright CD,Gill GW,Tiffany SM: Automatic cell identification and enrichment in lung cancer. Light scatter and two fluorescence parameters. J Histochem Cytochem 27557-559,1979)。
實例
實例1　腫瘤細胞於上皮細胞上之附著情況
將具有經明膠修飾之表面的玻璃盤置於皮氏培養皿之底部，且接著將約50,000個人類胚腎293T(HEK-293T)內皮細胞或人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)接種於該玻璃盤中。將DMEM及M199培養基添加至皮氏培養皿中之後，在37℃、5% CO2 下培養細胞24小時。隨後，自皮氏培養皿中移除DMEM及M199培養基，且用PBS緩衝液洗滌該等皮氏培養皿。隨後，將新鮮DMEM及M199培養基添加至皮氏培養皿中。將50 ng發炎誘導劑(諸如介白素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α))添加至皮氏培養皿中以誘導HEK-293T及HUVEC之發炎反應，歷時24小時。由酶聯結免疫檢定(ELISA)量測介白素-6(IL-6)之表現量。若IL-6之表現量大於30 ng/ml，則出現發炎反應。或者，可由流動式細胞測量術偵測IL-6之表現量。將附著有螢光素異硫氰酸鹽(FITC)之ICAM抗體添加至皮氏培養皿中以捕捉由IL-1及TNFα誘導且由內皮細胞表現之ICAM-1(細胞間黏附分子1)。由流動式細胞測量術量測FITC螢光素。若ICAM-1之表現量大於10 ng/ml，則出現發炎反應。
用綠色螢光蛋白(GFP)轉染腫瘤細胞，亦即肝癌細胞hepG2。將含GFP之hepG2細胞添加至皮氏培養皿中。震盪10分鐘後，添加15 ml PBS緩衝液進行洗滌。洗滌3次後，分別使用光學顯微鏡及螢光顯微術來檢查該等皮氏培養皿。
圖1係關於光學顯微鏡之照片，其展示在使用IL-1β誘導上皮細胞上之發炎反應的情況下(圖1(B))或在未使用IL-1β誘導上皮細胞上之發炎反應的情況下(圖1(A))，腫瘤細胞於上皮細胞上之附著情況。在圖1(A)中，洗滌後，無hepG2細胞附著於上皮細胞；而在圖1(B)中，洗滌後，可觀察到hepG2細胞附著於上皮細胞。
圖2係關於光學顯微鏡之照片，其展示在使用IL-1β(圖2(A))及TNF-α(圖2(B))誘導上皮細胞上之發炎反應後，腫瘤細胞於上皮細胞上之附著情況。在圖2(A)與圖2(B)中，洗滌後，均可觀察到hepG2細胞附著於上皮細胞。在由IL-1β或TNF-α誘導發炎反應後，上皮細胞可捕捉腫瘤細胞。
實例2 　在誘導上皮細胞上之發炎反應後，腫瘤細胞於白血球(嗜中性球)上之附著情況
將具有經明膠修飾之表面的玻璃盤置於皮氏培養皿之底部，且接著將約50,000個人類胚腎293T(HEK-293T)內皮細胞或人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)接種於該玻璃盤中。將DMEM及M199培養基添加至皮氏培養皿中之後，在37℃、5% CO2 下培養細胞24小時。隨後，自皮氏培養皿中移除DMEM及M199培養基，且用PBS緩衝液洗滌該等皮氏培養皿。隨後，將新鮮DMEM及M199培養基添加至皮氏培養皿中。將50 ng發炎誘導劑(諸如介白素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α))添加至皮氏培養皿中以誘導HEK-293T及HUVEC之發炎反應，歷時24小時。由酶聯結免疫檢定(ELISA)量測介白素-6(IL-6)之表現量。若IL-6之表現量大於30 ng/ml，則出現發炎反應。或者，可由流動式細胞測量術偵測IL-6之表現量。將附著有螢光素異硫氰酸鹽(FITC)之ICAM抗體添加至皮氏培養皿中以捕捉由IL-1及TNFα誘導且由內皮細胞表現之ICAM-1(細胞間黏附分子1)。由流動式細胞測量術量測FITC螢光素。若ICAM-1之表現量大於10 ng/ml，則出現發炎反應。
將嗜中性球添加至皮氏培養皿中且其附著於發炎性HEK-293T及HUVEC細胞。用綠色螢光蛋白(GFP)轉染腫瘤細胞，亦即肝癌細胞hepG2。將含GFP之hepG2細胞添加至皮氏培養皿中。震盪10分鐘後，添加15 ml PBS緩衝液進行洗滌。洗滌3次後，分別使用光學顯微鏡及螢光顯微術來檢查該等皮氏培養皿。
圖3係關於光學顯微鏡之照片，其展示在使用IL-1β(圖3(B))及TNF-α(圖3(C))誘導上皮細胞上之發炎反應後，腫瘤細胞於白血球(嗜中性球)上之附著情況。圖3(A)為未添加白血球之對照組。在圖3(B)及圖3(C)中，hepG2細胞附著於嗜中性球且叢集在一起；而在圖3(A)中，hepG2細胞隨機分布於皮氏培養皿中。
實例3 　在紅血球存在下腫瘤細胞之捕捉情況
將具有經明膠修飾之表面的玻璃盤置於皮氏培養皿之底部，且接著將約50,000個人類胚腎293T(HEK-293T)內皮細胞或人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)接種於該玻璃盤中。將DMEM及M199培養基添加至皮氏培養皿中之後，在37℃、5% CO2 下培養細胞24小時。隨後，自皮氏培養皿中移除DMEM及M199培養基，且用PBS緩衝液洗滌該等皮氏培養皿。隨後，將新鮮DMEM及M199培養基添加至皮氏培養皿中。將50 ng發炎誘導劑(諸如介白素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α))添加至皮氏培養皿中以誘導HEK-293T及HUVEC之發炎反應，歷時24小時。由酶聯結免疫檢定(ELISA)量測介白素-6(IL-6)之表現量。若IL-6之表現量大於30 ng/ml，則出現發炎反應。或者，可由流動式細胞測量術偵測IL-6之表現量。將附著有螢光素異硫氰酸鹽(FITC)之ICAM抗體添加至皮氏培養皿中以捕捉由IL-1及TNFα誘導且由內皮細胞表現之ICAM-1(細胞間黏附分子1)。由流動式細胞測量術量測FITC螢光素。若ICAM-1之表現量大於10 ng/ml，則出現發炎反應。
將嗜中性球添加至皮氏培養皿中且其附著於發炎性HEK-293T及HUVEC細胞。對紅血球的存在是否影響白血球捕捉腫瘤細胞進行評估。收集含有hepG2細胞之全血測試樣本。分別對該等血液樣本不進行稀釋，或稀釋10倍及1000倍。接著將瑞氏染色劑(wright's stain)添加至血液樣本中以標記其中所含之hepG2細胞。染色後，將血液樣本添加至皮氏培養皿中。隨後，使用光學顯微鏡來檢查該等皮氏培養皿。
此外，收集含有hepG2細胞之全血測試樣本且將其冷凍30分鐘。對血液樣本不進行稀釋或稀釋1000倍。接著將瑞氏染色劑添加至血液樣本中以標記其中所含之hepG2細胞。染色後，將血液樣本添加至皮氏培養皿中。隨後，使用光學顯微鏡來檢查該等皮氏培養皿。
圖4係關於光學顯微鏡之照片，其展示在未進行稀釋或進行稀釋(10倍或1,000倍)之情況下，全血樣本中活腫瘤細胞或死腫瘤細胞之捕捉情況。圖4(A)及圖4(B)分別展示在稀釋10倍及1,000倍之情況下含有活hepG2細胞之全血樣本的照片。圖4(C)展示在未進行稀釋之情況下含有活hepG2細胞之全血樣本的照片，且圖4(D)展示在稀釋1,000倍之情況下含有死hepG2細胞之全血樣本的照片。此證實紅血球的存在並不影響嗜中性球捕捉腫瘤細胞。
圖1係關於光學顯微鏡之照片，其展示在使用IL-1β誘導上皮細胞上之發炎反應((B))或未使用IL-1β誘導上皮細胞上之發炎反應((A))的情況下，腫瘤細胞於上皮細胞上之附著情況。在圖中，「a」表示腫瘤細胞(hepG2細胞)且「b」表示上皮細胞。
圖2係關於光學顯微鏡之照片，其展示在使用IL-1β(圖2(A))及TNF-α(圖2(B))誘導上皮細胞上之發炎反應後，腫瘤細胞於上皮細胞上之附著情況。在圖中，「a」表示腫瘤細胞(hepG2細胞)且「b」表示上皮細胞。
圖3係關於光學顯微鏡之照片，其展示在使用IL-1β(圖3(B))及TNF-α(圖3(C))誘導上皮細胞上之發炎反應後，腫瘤細胞於白血球(嗜中性球)上之附著情況。圖3(A)為未添加白血球之對照組。在圖中，「a」表示腫瘤細胞(hepG2細胞)；「b」表示上皮細胞；且「c」表示白血球(嗜中性球)。
圖4(A)及圖4(B)分別展示在稀釋10倍及1,000倍之情況下含有活hepG2細胞之全血樣本的照片。圖4(C)展示在未進行稀釋之情況下含有活hepG2細胞之全血樣本的照片，且圖4(D)展示在稀釋1,000倍之情況下含有死hepG2細胞之全血樣本的照片。在圖中，「a」表示腫瘤細胞(hepG2細胞)；「b」表示上皮細胞；「c」表示白血球(嗜中性球)；且「d」表示紅血球。
(無元件符號說明)

Claims (33)

  1. 一種捕捉體液樣本或含血清樣本中之循環腫瘤細胞的方法，其包含以下步驟：(a)使內皮細胞或上皮細胞附著於固體支撐物上；(b)用一或多種發炎誘導劑誘導(a)之該等細胞的發炎反應；(c)使白血球附著於(a)之該等細胞上；及(d)將體液樣本添加至該固體支撐物，藉此該一或多種發炎誘導劑誘導該(b)中所述之附著的內皮細胞或上皮細胞及(c)中所述的白血球的發炎反應；藉此當加入體液樣本或含血清樣本至該固體支撐物時，(c)的白血球及(b)的內皮細胞或上皮細胞捕捉所含有的循環腫瘤細胞；其中該一或多種發炎誘導劑為腫瘤壞死因子或介白素；及其中該等白血球為嗜中性球(neutrophil)、嗜酸性球(eosinophil)、嗜鹼性球(basophil)、淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞；及其中該體液樣本或含血清樣本經預稀釋10倍以上。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含在使用該方法之前，預處理該體液樣本或該含血清樣本以使該樣本處於生理條件下的步驟。
  3. 如請求項1之方法，其進一步包含在使用該方法之前，將生物樣本預處理成含血清樣本之步驟。
  4. 如請求項1之方法，其進一步包含在步驟(d)之後，收集 該等所捕捉之腫瘤細胞的步驟。
  5. 如請求項1之方法，其中該固體支撐物為親水性的。
  6. 如請求項1之方法，其中該固體支撐物係由選自由以下組成之群的有機聚合物構成：硝化纖維素膜、耐綸膜(nylon membrane)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯及聚丙烯醯胺，以及其共聚物及接枝聚合物。
  7. 如請求項1之方法，其中該固體支撐物係由選自由以下組成之群的無機材料構成：玻璃、二氧化矽及逆相二氧化矽。
  8. 如請求項1之方法，其中固體支撐物之組態係呈珠粒、球體、粒子、顆粒、凝膠或表面之形式。
  9. 如請求項1之方法，其中該固體支撐物係以孔、凹陷或容器之形式作為組態。
  10. 如請求項1之方法，其中該固體支撐物為皮氏培養皿或微量滴定盤。
  11. 如請求項1之方法，其中該固體支撐物具有複數個可進行檢定之孔。
  12. 如請求項1之方法，其中該固體支撐物上具有電極。
  13. 如請求項12之方法，其中該電極係由氧化銦錫(ITO)、碳奈米管、矽或氧化鈦構成。
  14. 如請求項1之方法，其中該發炎誘導劑為介白素-1(IL-1)、IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β或TNF-α。
  15. 如請求項1之方法，其中該等白血球為嗜中性球或巨噬 細胞。
  16. 如請求項1之方法，其中該體液樣本為全血、腹水、唾液、尿液、滑液、腹膜液、羊膜液、腦脊髓液、漿液或脊髓液。
  17. 如請求項1之方法，其中該體液樣本之樣本體積在約5mL至約30mL之範圍內。
  18. 如請求項1之方法，其中該體液樣本之樣本體積在約5mL至約25mL之範圍內。
  19. 一種捕捉體液樣本或含血清樣本中之循環腫瘤細胞的套組，其包含：(a)固體支撐物；(b)內皮細胞或上皮細胞，該內皮細胞或上皮細胞附著於該固體支撐物上；(c)捕捉體液樣本或含血清樣本中之循環腫瘤細胞之白血球細胞，該白血球細胞附著於(b)中所述的該等細胞或置於分開的容器中；及(d)一或多種發炎誘導劑，藉此該一或多種發炎誘導劑誘導該(b)中所述的附著的內皮細胞或上皮細胞及(c)中所述的白血球的發炎反應；藉此當加入體液樣本或含血清樣本至該固體支撐物時，(c)的白血球及(b)的內皮細胞或上皮細胞捕捉所含有的循環腫瘤細胞；其中該一或多種發炎誘導劑為腫瘤壞死因子或介白素；及其中該等白血球為嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、 淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞；及其中該體液樣本或含血清樣本經預稀釋10倍以上。
  20. 如請求項19之套組，其中該固體支撐物為親水性的。
  21. 如請求項19之套組，其中該固體支撐物係由選自由以下組成之群的有機聚合物構成：硝化纖維素膜、耐綸膜、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯及聚丙烯醯胺，以及其共聚物及接枝聚合物。
  22. 如請求項19之套組，其中該固體支撐物係由選自由以下組成之群的無機材料構成：玻璃、二氧化矽及逆相二氧化矽。
  23. 如請求項19之套組，其中固體支撐物之組態係呈珠粒、球體、粒子、顆粒、凝膠或表面之形式。
  24. 如請求項19之套組，其中該固體支撐物係以孔、凹陷或容器之形式作為組態。
  25. 如請求項19之套組，其中該固體支撐物為皮氏培養皿或微量滴定盤。
  26. 如請求項19之套組，其中該固體支撐物具有複數個可進行檢定之孔。
  27. 如請求項19之套組，其中該固體支撐物上具有電極。
  28. 如請求項27之套組，其中該電極係由氧化銦錫(ITO)、碳奈米管、矽或氧化鈦構成。
  29. 如請求項19之套組，其中該發炎誘導劑為介白素-1(IL-1)、IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β或TNF-α。
  30. 如請求項19之套組，其中該等白血球為嗜中性球或巨噬 細胞。
  31. 如請求項19之套組，其中該體液樣本或該含血清樣本為全血、腹水、唾液、尿液、滑液、腹膜液、羊膜液、腦脊髓液、漿液或脊髓液。
  32. 如請求項19之套組，其中該體液樣本或該含血清樣本之樣本體積在約5mL至約30mL之範圍內。
  33. 如請求項19之套組，其中該體液樣本或該含血清樣本之樣本體積在5mL至約25mL之範圍內。
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