KR100291844B1 - 세포간부착분자-3및그것의결합리간드 - Google Patents

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안토닌 알 드푸거로울즈
티모씨 에이. 스프링거
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리차드 엘. 콘
센터포블러드리서치,인코오포레이티드
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Abstract

본 발명은 백혈구가 염증 부위를 인지하고 그 부위로 이동하며, 또한 염증반응 동안 세포 기질에 부착하는 과정에 관계하는 세포간 부착 분자(ICAM-3)에 관한 것이다. 본 발명은 상기 분자, 상기 분자를 동정하는 검색 방법, 및 상기 분자에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 부착 분자 및 이들에 결합할 수 있는 항체의 치료학적 사용 방법 및 진단학적 사용 방법을 포함한다.

Description

[발명의 명칭]
세포간 부착 분자-3 및 그것의 결합 리간드
[발명의 배경]
[관련 출원의 상호 참조]
본 출원은 미합중국 특허 출원 일련 번호 제 07/712,879호(1991년 6월 11일 출원)의 일부 계속 출원이며, 미합중국 특허 출원 일련 번호 제 07/045,963호(1987년 5월 4일 출원), 제 07/115,798호(1987년 11월 2일 출원), 제 07/155,943호(1988년 2월 16일 출원), 제 07/189,815호(1988년 5월 3일 출원) 및 제 07/250,446호(1988년 9월 28일 출원), 제 07/454,294호(1989년 12월 22일 출원) 및 PCT 출원 번호 PCT/US91/02942 및 PCT/US91/02946(1991년 4월 27일 미합중국 수리 관청에 출원)과 관련되며, 상기 출원들을 본원에 참고로 인용한다.
[발명의 분야]
본 발명은 ICAM-3로 명명된 신규의 세포간 부착 분자(intercellular adhesion molecule)의 발견에 관한 것이며, 이 분자는 백혈구 집단이 세포기질을 인지하여 그 기질에 부착하는 과정에 관계한다. ICAM-3은 염증 부위 및 면역 반응 부위에서 기타 림프구, 대식 세포 및 호증구와의 세포 상호작용을 매개한다.
본 발명은 과립구, 림프구 또는 대식세포 계통 세포의 세포간 부착을 억제하기 위해 ICAM-3 단독으로, 또는 ICAM-1, ICAM-2 또는 그 둘다와 함께 사용하는 방법에 관한 것이다. 그러한 분자의 사용은 특이적 및 비특이적 염증치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 HIV에 노출되거나 HIV에 의해 감염된 사람에서 ICAM-3 단독으로, 또는 ICAM-1, ICAM-2 또는 그 둘다와 함께 투여하므로써 HIV, 특히 HIV-1에 의한 감염을 억압하는 치료 방법 및 예방 방법에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 HIV 비루스에 의해 야기되는 AIDS(후천성 면역 결핍증후군)와 같은 질병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 ICAM-3을 단독으로, 또는 ICAM-1, ICAM-2 또는 그 둘다와 함께 사용하여 순환계로부터의 HIV-감염된 세포의 이동을 억합하는 치료 방법에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 HIV-1 비루스에 의해 야기되는 AIDS(후천성 면역 결핍 증후군)와 같은 질병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 ICAM-3을 단독으로, 또는 ICAM-1, ICAM-2 또는 그 둘다와 함께 사용하여 HIV로 감염된 사람에서 T 세포 사멸 및 합포체 형성을 억압하는 치료 방법에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 HIV-1 비루스에 의해 야기되는 AIDS(후천성 면역 결핍 증후군)와 같은 질병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 천식의 치료에 ICAM-3을 단독으로, 또는 ICAM-1, ICAM-2 또는 그 둘다와 함께 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가적으로 ICAM-3에 결합할 수 있는 분자(이하, 항-ICAM-3로 나타냄)에 관한 것이다. ICAM-3에의 항-ICAM-3 분자의 결합은 ICAM-3와 관련된 생물학적 작용을 조절하기 위한 것이다. 본 발명의 결합 분자는 항체, 펩티드, 또는 ICAM-3에 결합할 수 있는 탄수화물일 수 있다. 그러한 결합분자는 ICAM-3의 생물학적 기능을 조절하는데 사용된다.
본 발명은 또한 과립구, 림프구 또는 대식세포 계통 세포의 세포간 부착을 억제하기 위해 ICAM-3 단독으로, 또는 ICAM-1, ICAM-2 또는 그 둘다와 함께 사용하는 방법에 관한 것이다. 그러한 분자의 사용은 특이적 및 비특이적 염증치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 HIV에 노출되거나 HIV에 의해 감염된 사람에서 ICAM-3단독으로, 또는 ICAM-1, ICAM-2 또는 그 둘다와 함께 투여하므로써 HIV, 특히 HIV-1에 의한 백혈구의 감염을 억압하는 치료 방법 및 예방 방법에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 HIV 비루스에 의해 야기되는 AIDS(후천성 면역 결핍 증후군)와 같은 질병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항-ICAM-3 작용제를 단독으로, 또는 ICAM-1, ICAM-2 또는 그 둘다와 함께 사용하여 순환계로부터의 HIV-1 감염된 세포의 이동을 억압하는 치료 방법에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 HIV-1 비루스에 의해 야기되는 AIDS(후천성 면역 결핍 증후군)와 같은 질병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 천식의 치료에 항-ICAM-3 작용제를 단독으로, 또는 항-ICAM-1, 항-ICAM-2 또는 그 둘다와 함께 사용하는 방법에 관한 것이다.
[관련 분야의 설명]
A. 백혈구 부착 및 기능
백혈구는 박테리아 또는 비루스와 같은 외래 침입자에 대해 숙주를 적절히 방어하기 위해 세포 기질에 부착할 수 있어야 하며, 이들 기능의 검토를 위해서는 아이젠, H. W.의 "미생물학, 제3판, 펜실베니아 필라델피아 소재의 하아퍼 ＆ 로우 (1980), 290-295 및 381-418면"을 참조하라. 백혈구는 이들이 순환계로부터 염증 부위로 이동할 수 있도록 내피 세포에 부착할 수 있어야한다. 게다가, 백혈구는 정상적인 특이 면역 반응이 일어날 수 있도록 항원-제공 세포에 부착해야 하며, 마지막으로 백혈구는 비루스 감염된 세포 또는 종양 세포의 용해가 일어날 수 있도록 적합한 표적 세포에 부착해야 한다.
최근에 상기 부착 매개 작용을 매개하는 데 관계된 백혈구 표면 분자가 하이브리도마 기술을 사용하여 동정되었다. 간단히 말해서, 인간 T-세포(데이비그넌, D 등의 Proc, Natl, Acad, Sci. 미합중국 78:4535-4539(1981)) 및 생쥐 비장 세포(스프링거, T 등의 Eur. J. Immunol. 9:301-306(1979))에 대한 단일 클론 항체가 동정되었는데, 이들은 백혈구 표면에 결합하고, 상기 부착 관련 기능을 억제하였다(스프링거, T 등, Fed, Proc. 44:2660-2663(1985)). 상기 항체들에 의해 동정되는 분자들은 Mac-1 및 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1)으로 명명되었다. Mac-1은 대식 세포, 과립구 및 큰 과립성 림프구 상에서 발견되는 헤테로다이머이다. LFA-1은 대부분의 림프구상에서 발견되는 헤테로다이머이다(스프링거, T. A. 등의 Immunol. Rev. 68:111-135(1982)). 상기 두 분자와 세번째 분자인 p150, 95(Mac-1과 유사한 조직분포를 가짐)는 세포 부착에서 역할을 한다(카이저, G등의 Eur, J. Immunol. 15:1142-1147(1985)).
상기 백혈구 분자는 관련 당단백질족(산체즈-마드리드, F. 등의 J. Exper, Med. 158:1785-1803(1983) ; 카이저, G. D. 등의 Eur. J. Immunol 15:1142-1147(1985))의 일원인 것으로 발견되었으며, 당단백질의 "CD-18족"으로 명명되었다. 이 당단백질족은 하나의 알파쇄 및 하나의 베타쇄를 갖는 헤테로다이머로 구성된다. 항원들 각각의 알파쇄는 서로 달랐지만, 베타쇄는 고도로 보존되는 것으로 발견되었다(산체즈-마드리드, F 등의 J. Exper, Med. 158:1785-1803(1983)). 당단백질족의 베타쇄(때때로 CD18로 언급함)는 95 kd의 분자량을 가지는 것으로 밝혀졌으며, 반면에 알파 쇄는 150 kd 내지 180 kd의 분자량을 가지는 것으로 밝혀졌다(스프링거, T., Fed. Proc. 44:2660-2663(1985)). 막단백질의 알파 서브유닛은 베타 서브유닛과 광범위한 상동성을 공유하지는 않지만, 당단백질의 알파 서브유닛의 세밀한 분석은 그들 사이에 실질적인 유사성이 있음을 나타내었다. LFA-1 관련 당단백질의 알파와 베타 서브유닛 사이의 유사성에 관한 검토가 산체즈-마드리드, F. 등의 문헌(J. Exper. Med. 158:586-602(1983) ; J. Exper. Med. 158:1785-1803(1983))에 제공되어 있다.
상기 부착 단백질족의 임의 일원의 정상적인 양을 그들의 백혈구 세포 표면상에 발현시킬 수 없는 사람 집단이 동정되었다(앤더슨, D.C. 등, Fed, Proc. 44:2671-2677(1985) ; 앤더슨, D.C. 등의 J. Infect. Dis. 152:668-689(1985)). 그러한 사람들은 "백혈구 부착성 결핍 질병"(LAD:leukocyte adherence deficiency disease)을 앓고 있다고 말한다(앤더슨, D.C. 등의 Fed. Proc. 44:2671-2677(1985) ; 앤더슨, D.C. 등의 J. Infect, Dis, 152:668-689(1985)). LAD환자의 특징으로는 괴사성 연조직 병변, 손상된 농 형성 및 상처 유합, 또한 시험관내에서 부착-의존성 백혈구 기능의 이상, 및 만성 및 재발성 박테리아 감염에의 민감성 등을 들 수 있다. 이들 LAD 환자의 과립구는 항-CD18 단일 클론 항체의 존재하의 정상인에 대한 것과 동일한 불완전한 방식으로 시험관내에서 행동한다. 즉, 그들은 내피 세포에의 응집 또는 부착과 같은 부착 관련 기능을 수행할 수 없다. 그러나, 보다 중요한 관찰은 이 환자들이 그들의 과립구가 세포 기질에 부착할 수 없으므로 인해 정상적인 염증 반응을 일으킬 수 없다는 것이다. 가장 놀라운 관찰은 이들 LAD 환자의 과립구가 염증 병변 근처 혈관내 내피 세포에 부착할 수 없음으로 인해 피부 감염과 같은 염증 부위에 이를 수 없다는 것이다. 그러한 부착은 혈관외 유출의 필수 단계이다.
이들 환자의 림프구는 정상인과 유사한 시험관내 결함을 나타내었으며, 정상인의 CD-18 분자족은 항체들에 의해 길항되었던 것이다. 게다가, 이들 개인은 그 세포가 세포 기질에 부착할 수 없음으로 인해 정상적인 면역 반응을 일으킬 수 없다(앤더슨, D. C. 등의 Fed. Proc. 44:2671-2677(1985) ; 앤더슨, D. C. 등의 J. Infect. Dis. 152:668-689(1985)). 이들 데이타는 림프구가 CD-18족의 작용성 부착 분자의 결핍으로 인해 정상 유형으로 부착할 수 없을 경우 면역 반응이 완화됨을 나타낸다.
따라서, 요약하면, 동물의 건강 및 생존성을 유지하는 백혈구의 능력은 그들이 기타 세포(예: 내피 세포)에 부착할 수 있는 능력을 필요로 한다. 이 부착은 백혈구의 세포 표면상에 존재하는 특이 수용체 분자가 관련되는 세포-세포 접촉을 필요로 하는 것으로 발견되었다. 이들 수용체는 백혈구가 기타 백혈구에, 내피 세포에 그리고 기타 비-혈관 세포에 부착할 수 있게 한다. 세포 표면 수용체 분자인 LFA-1, Mac-1 및 p150,95는 서로 관련성이 매우 큰 것으로 밝혀졌다. 백혈구가 상기 세포 표면 수용체 분자를 가지고 있지 않은 것인 사람은 만성 및 재발성 감염, 또한 결함성 항체 반응을 포함하는 기타 임상적 증상을 보여준다.
추가적으로, 백혈구 부착이 외래 조직을 확인하고 거부하는 과정에 관계하기 때문에, 이 과정에 대한 이해는 신장과 같은 고체성 기관 이식, 골수와 같은 비고체성 기관 이식, 조직 이식, 알레르기 및 종양학 분야에서 매우 중요한 가치를 지닌다.
B. HIV에 의한 감염
HIV 감염이 AIDS의 원인이다. HIV의 많은 변종이 개시되어 있다 : 주요 2가지가 HIV-1 및 HIV-2이다. HIV-1은 북미 및 유럽에서 성행하고, HIV-2는 아프리카에서만 성행한다. 상기 비루스들은 유사한 구조를 가지며, 유사한 기능을 가진 단백질을 암호화한다. HIV 감염은 비루스 단백질("gp120")이 T4("T헬퍼")림프구 표면상에 존재하는 수용체 문자("CD4")에 결합하므로써 일어나는 것으로 믿어지고 있다(슈니트먼, S. M. 등의 J. Immunol, 141:4181-4186(1988), 본원에 참고로 인용함). 상기 수용체에 결합한 후, 비루스는 세포내로 들어가서 복제하고, 그 과정에서 T세포를 죽인다. 따라서 개인의 T4군집의 파괴가 HIV감염의 직접적인 결과이다.
T 세포의 파괴는 감염된 환자가 기회성 감염에 저항하는 능력에 손상을 초래한다. AIDS를 앓고 있는 사람은 종종 암을 발전시키지만, 이들 암과 HIV감염 사이의 관계는 대부분의 경우 불확실하다.
HIV 비루스의 단순한 복제가 감염된 세포에 치명적이지만, 그러한 복제는 통상 감염된 사람의 T4 세포의 작은 분획에서만 검출된다. 최근 결과는 종래 평가되었던 것보다 많은 비루스 혈증이 발생하며, T 세포 감염 빈도가 1%만큼이나 높을 수 있음을 암시한다.
여러 계통의 연구로부터 HIV 비루스가 T4 군집의 파괴를 매개하는 기타 메카니즘이 규명되었다.
HIV 복제는 별도로 하더라도, HIV 감염된 세포는 세포 독성 킬러 세포의 작용을 통해 파괴될 수 있다. 킬러 세포는 정상적으로 인간에게 존재하며, 숙주를 모니터하여 만나게 되는 임의의 외래 세포(부적합한 수혈 또는 기관 이식등에서 같은)를 파괴하는 작용을 한다. HIV로 감염시 T4 세포는 그 세포 표면상에 gp120 분자를 나타낸다. 킬러 세포는 상기 T4 세포를 외래의(본래의 세포라기 보다는) 세포로 인지하고, 따라서 그 파괴를 매개한다.
HIV 감염은 또한 비감염된 건강한 세포의 파괴를 초래할 수 있다. 감염된 세포는 gp120 단백질을 혈액계내로 분비할 수 있다. 유리 gp120 분자가 건강한, 비감염된 세포의 CD4 수용체에 결합할 수 있다. 그러한 결합은 세포가 HIV 감염된 세포의 외관을 띠게 한다. 세포 독성 킬러 세포는 비감염된 T4 세포에 결합된 gp120을 인지하고 세포가 외래성이라고 결정하고, 그 세포의 파괴를 매개한다.
HIV가 T4 세포 사멸을 일으킬 수 있는 부가 메카니즘, 및 본 발명에 따른 특별한 관심의 메카니즘은 "합포체"의 형성을 통해 일어난다. "합포체"는 수백개씩의 T4 세포의 융합으로부터 형성된 다핵의 거대 세포이다. HIV에 의한 감염은 세포가 기타 T 세포, 즉 HIV 감염되거나 또는 비감염 건강 세포와 융합하는 능력을 얻게 한다. 그 합포체는 기능할 수 없고 곧 사멸한다. 합포체의 사멸은 HIV 감염 및 HIV 비감염 T4 세포 둘다 파괴한다. 이 과정은 그것이 T4 세포의 직접 세포-세포 접촉을 유발하기 때문에 본 발명에 특별한 관심을 제공한다. HIV-감염 세포가 합포체를 형성하는 능력은 상기 세포가 건강세포와 융합하는 수단을 획득한다는 것을 나타낸다.
HIV 감염, 및 특히 HIV-1 감염은 백혈구 인테그린의 세포 표면 발현, 및 이들 헤테로다이머에 의해 매개되는 세포 부착 반응에 영향을 미치는 것같다(쁘띠, A. J. 등의 J. Clin. Invest. 79:188(1987) ; 힐드레드, J. E. K. 등의 사이언스 244:1075(1989) ; 발렌틴, A. 등의 J. immunology 144:934-937(1990) ; 로쎈, R. D. 등의 Trans. Assoc. American Physicians 102:117-130(1989), 이들을 본원에 참고로 인용함). HIV-1으로 감염시킨 후, U937 세포의 동형성 응집이 증가하는데, 이것은 CD18 및 CD11b의 세포 표면 발현과 동일한 것이다(쁘띠, A. J. 등의 J. Clin. Invest. 79:188(1987)). HIV-1 감염된 U937 세포는 비감염 U937 세포보다 더 높은 빈도로 IL-1 자극된 내피에 부착한다 ; 이 행동은 항-CD18 또는 항-CD11a 단일 클론 항체로 감염된 세포를 처리하거나 또는 항-ICAM-1 항체로 내피 기질을 처리하므로써 억압시킬 수 있다(로쎈, R. D. 등의 Trans. Assoc. American Physicians 102:117-130(1989)). CD18 또는 CD11a에 대한 단일 클론 항체는 또한 파이토헤마글루티닌(PHA)- 자극된 림프아세포 및 계속 감염된 CD4-음성 T 세포가 관계하는 합포체 형성을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다(힐드레드, J. E. K. 등, 사이언스 244:1075(1989)). 항-CD18 또는 항-CD11a 단일 클론 항체로 비루스 감염 세포만을 처리하는 것은 합포체 형성에 거의 영향을 끼치지 않는 것으로 밝혀졌는 데, 이것은 상기 항체들이 원칙적으로 비감염 표적 세포가 감염되는 것을 보호한다는 것을 암시한다(힐드레드, J.E.K. 등의 사이언스 244 : 1075(1989) ; 발렌틴, A. 등의 J. immunology 144:934-937(1990)). 발렌틴 등(발렌틴, A. 등의 J. Immunology 144:934-937(1990)은 최근에 CD18에 특이성이 있는 단일 클론 항체가 연속 T 세포주를 HIV-1 감염된 U937 세포와 공동 배양할 경우 형성된 합포체를 억제한다는 것을 입증하므로써 상기 관찰을 확인하였다.
CD18 또는 CD11a에 특이성이 있는 단일 클론 항체가 민감성 세포를 HIV 감염된 세포와 융합하는 것으로부터 보호하는 메카니즘은 알려지지 않았고, 본 발명의 이해에 필수적인 것은 아니지만, 방사성 표지시킨 gp120을 사용한 연구는 CD18을 함유하는 헤테로다이머가 상기 비루스에 대한 결합 부위를 제공하지 않는다는 것을 암시한다(발렌틴, A. 등의 J. Immunology 144:934-937(1990)). 따라서, HIV 감염은 세포-세포 상호 작용, 그러한 세포-세포 상호 작용을 모방하는 비루스-세포 상호 작용, 또는 그 둘다를 필요로 한다. 세포-세포 상호 작용은 내피 장벽을 통해 무세포 비루스의 운반 또는 비루스 감염된 세포의 운반을 초래할 수 있다. 세포-세포 상호 작용을 모방하는 비루스-세포 상호 작용은 유리 비루스가 건강 세포에 부착하거나 또는 건강 세포를 감염시키거나 또는 양자 모두를 용이하게 하거나 또는 가능하게 할 수 있다.
따라서 본 발명은 부분적으로 HIV 감염, 및 특히 HIV-1 감염이 CD11a/CD18 헤테로다이머 및 그 결합 리드간의 발현의 증가를 초래한다는 관찰로부터 유래한다. 이 증가된 발현은 이것이 HIV-감염된 T세포가 서로 부착하거나 또는 응집하는 (즉, "동형성 응집"을 하는) 능력을 증가시킨다는 점에서 중요하다. 그러한 동형성 응집은 무활동성 정상 백혈구 사이에서 일어나지 않는 것으로 관찰되기 때문에, 상기 발견은 CD11/CD18 수용체, ICAM-1와 같은 리간드, 또는 양자 모두의 발현이 상기 응집에 필요함을 나타낸다. LFA-1은 동형성 응집이 일어나도록 ICAM-1에 결합해야 한다. 본원에서 개시하는 바와 같이, ICAM-3가 휴지 T-세포상에서 고레벨로 발현되는 ICAM 분자족의 유일한 일원이다. 항-ICAM-3 항체만이 T-세포가 활성화되지 않는다면 T-세포가 LFA-1에 부착하는 것을 차단할 수 있다. 그러므로 항-ICAM-3 항체를 사용하여 T-세포의 응집을 억압할 수 있다.
추가적으로, 항-ICAM-3 항체를 사용하여 HIV-1이 한 사람의 감염 세포로부터 건강 세포로 전달되게하고, 또한 유리 비루스로 건강 세포를 감염되게 하거나 또는 감염을 용이하게 하는 감염된 T-세포의 부착 과정을 차단할 수 있다.
C. HIV 감염 세포의 이동
백혈구의 이동 및 전파가 감염 결과로부터 개인을 보호하는데 중요하다. 그러나 이들 과정은 또한 비루스-감염된 백혈구의 이동 및 전파에서 역할을 한다. 특히 관심을 끄는 것은 HIV로 감염된 백혈구의 이동 및 전파이다. 그러한 세포의 이동은 혈관외 병소의 형성을 초래하며, 종양 및 기타 이상을 일으킬 수 있다.
영향을 받은 기관의 조직학적 검사는 병소의 혈관외 단핵 세포 침윤물을 나타낸다. 중추 신경계에서 그러한 침윤물내 비루스-감염 세포를 동정하기 위한 시도는 HIV-1 감염 세포의 존재를 나타내었다. 이들 연구는 HIV-1 비루스가 주로 단구 및 대식 세포, 및 이 계통의 기타 세포에 존재함을 보여 주었다(R. T. 존슨 등의 FASEB J. 2:2970(1988) ; M. H. 스톨러 등의 J. Amer. Med. Assn. 256:2360(1986) ; S. 가트너 등의 사이언스 233:215(1986)).
HIV-1 감염된 단구 세포의 혈관외 침윤물의 형성을 자극하는 메카니즘은 지금까지 잘 정립되어 있지 않다. 이 메카니즘은 감염된 단핵 세포의 세포질내 내피 장벽을 통해 무세포 비루스의 운반 또는 비루스의 운반을 필요로 한다.
HIV-1에 의한 감염이 혈관 내피 세포에 백혈구의 부착, 및 혈액으로부터 혈관외 조직 부위로 백혈구의 전좌를 용이하게 하는 분자들의 세포 표면 발현을 자극하기 때문에(C. W. 스미스 등의 J. Clin. Invest. 82:1746(1988), 본원에 참고로 인용함), 세포 이동을 억제하는 항체들을 사용하여 HIV 감염된 세포의 전파를 방지하는 것이 제안되었다(WO90/13316).
D. 천식 : 임상적 특성
천식은 이질성 질병군이다. 그것은 기관 기관지의 자극에 대한 고도-반응성을 특징으로 한다(케이, A. B., 알레르기와 염증, 아카데믹 프레스, 뉴욕(1987)), 본원에 참고로 인용함). 임상적으로, 천식은 기관 기관지의 광범위한 폐색으로, 탁한 점착성의 분비물로, 호흡 곤란, 기침 및 씨근거림의 발작으로 확인된다. 이들 상태 각각의 상대적 역할을 모르지만, 전체 결과는 기도 저항의 증가, 폐 및 흉강의 과다 팽창, 및 통기 및 폐 혈액 흐름의 비정상적 분포이다. 상기 질병은 징후 없는 기간 사이의 급성 징후의 일시적 기간에서 확인된다. 급성의 일시적 징후는 저산소증을 초래할 수 있으며, 치사될 수 있다. 전체 세계 인구의 약 3%가 천식을 앓고 있다.
2가지 유형의 천식이 개시되어 있다 : 알레르기성 천식 및 특이 체질성 천식. 알레르기성 천식은 보통 비염, 두드러기, 습진 등과 같은 유전성 알레르기성 질병과 관련된다. 상태는 공기중 항원(예: 화분, 환경성 오염물 또는 직업적 오염물 등)의 피부내 주입에 대한 양성의 팽진-및-장개(wheal-and-flare) 반응, 및 IgE의 혈청 레벨의 증가가 특징이다. 알레르기성 천식의 발전은 많은 환자에서 IgE 항체의 존재와 인과 관계가 있는 것 같다. 상술한 특성을 나타내지 않는 천식 환자는 특이 체질성 천식으로 간주된다.
알레르기성 천식은 T 및 B 림프구에 의해 조절되고, 공기중 항원과 비만세포-결합된 사전-형성된 IgE 분자와의 상호 작용에 의해 활성화된 IgE 반응에 의존하는 것으로 믿어진다. 항원 접촉은 개인을 감작시키기 위해 지연된 시간동안 IgE 생산을 유도하기에 충분한 농도에서 일어나야 한다. 일단 감작되면, 천식 환자는 극히 낮은 레벨의 항원에 반응하여 징후를 나타낼 수 있다.
천식 징후는 유발 항원, 환경 요소, 직업 요소, 물리적 노동 및 감정적 스트레스의 존재와 양에 의해 악화될 수 있다.
천식은 메틸크산틴(예: 테오필린), 베타-아드레날린성 작용 물질(예: 카테콜아민, 레소르시놀, 살리제닌 및 에피드린), 글루코코르티코이드(예: 히드로코르티손), 비만 세포의 탈과립 억제제(즉, 나트륨크로몰린 같은 크로몬) 및 항콜린 작용약(예: 아트로핀)으로 치료할 수 있다.
천식은 호산구의 폐 조직내로의 유입("호산구 증가증")과 관계되는 것으로 믿어진다(프리가스, E 등의 J. Allergy Clin, Immunol. 77:527-537(1986). 본원에 참고로 인용함).
천식의 면역학적 기초를 기관지 폐포의 세정 연구(고다드, P, 등의 J. Allergy Clin. Immunol. 70:88(1982)), 및 상피에서 벗겨내진 호흡기 연근 조직 연구로부터 밝혀 내었다(플레이버핸, N. A. 등의 J. Appl. Physiol. 58:834(1985) ; 바안스, P. J. 등의 Br. J. Pharmacol. 86:685(1985)). 이들 연구가 천식의 면역학의 기본이 되는 메카니즘을 해명해내지는 못했지만, 이들 연구는 이 질병의 면역학적 병인학과 관계되는 일반적으로 허용되는 가설을 발전시키게 되었다(프리가스, E. 등의 J. Allergy Clin. Immunol. 77:527-537(1986)).
천식의 병원체의 확실한 표시는 호산구에 의한 폐실질의 대량 침윤 및 점액 섬모능의 파괴이다.
"호산구 가설"은 호산구가 폐의 비만 세포에 의해 방출되는 유해성 매개물을 중화시키기 위해 기관지로 유인된다는 것을 제안한다. 상기 가설에 따르면, 호산구는 세포 독성 분자를 방출하도록 호산구가 탈과립화되는 기관지로 유인된다. 탈과립화시에 호산구는 히스타미나제, 아릴설퍼타제 및 포스포리파제 D와 같은 효소를 방출하는데, 이 효소들은 비만 세포의 유해성 매개물을 중화시킨다. 그러나, 이들 분자는 또한 점액성 섬모체의 파괴를 촉진하여 기관지 분비물의 정화를 방해하고 천식의 특징인 폐손상에 기여한다.
천식은 세포들의 이동과 관계되기 때문에, 환자에서 알레르기 유발원의 영향을 경감시키기 위해 상기 이동을 억제하는 항체들을 사용하는 것이 제안되었다.
[발명의 요약]
본 발명은 세포간 부착 분자-3(ICAM-3:Intercellular Adhesion Molecule-3)으로 명명된 신규의 세포 부착 분자의 발견에 근거한다. 본 발명은 추가로 ICAM-3의 작용성 유도체, 항-ICAM-3 항체, 이 항체 단편을 인체에 적용시킨 항-ICAM-3 항체, 및 ICAM-3에 결합할 수 있고 그것의 생물학적 기능을 억제할 수 있는 기타 분자들에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 분자들 모두에 대한 진단 용도 및 치료 용도를 포함한다.
세부적으로는, 본 발명은 ICAM-3, 또는 천연 오염물이 실질적으로 없는 ICAM-3의 작용성 유도체를 포함한다.
본 발명은 ICAM-3를 암호화하거나 또는 발현시킬 수 있는 재조합 또는 합성 DNA 분자, 또는 이것의 작용성 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 ICAM-3 및 이것의 작용성 유도체로 구성된 군에서 선택된 분자에 결합할 수 있는 항체 및 특히 단일 클론 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 단일 클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 제공한다.
본 발명은 ICAM-3 또는 이것의 작용성 유도체에 결합할 수 있는 항체를 생산하는 목적 하이브리도마 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 단계들을 포함한다 :
(a) 실질적으로 순수한 ICAM-3, ICAM-3를 발현시키는 세포, ICAM-3를 발현시키는 세포의 막, 담체에 결합된 ICAM-3, ICAM-3의 펩티드 단편, 또는 담체에 결합된 ICAM-3의 펩티드 단편으로 구성된 군에서 선택되는 면역원으로 동물을 면역화시키는 단계,
(b) 상기 면역화된 동물에서 분리된 비장 세포를 골수종 세포주와 융합시키는 단계,
(c) 융합된 비장 및 골수종 세포가 항체 분비 하이브리도마 세포를 형성하게 하는 단계, 및
(d) 하이브리도마 세포들 중에서 항-ICAM-3 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 검색하는 단계.
본 발명은 또한 세포의 ICAM-3 매개 생물학적 작용을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 그러한 작용 조절을 요하는 환자에게 효과적인 양의 ICAM-3 조절 작용제를 제공하는 것을 포함하며, 이 때 ICAM-3 조절 작용제는 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 ; ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편 ; ICAM-3 ; ICAM-3의 작용성 유도체 ; 및 ICAM-1, ICAM-2 또는 CD-18 분자족의 일원과는 다른 ICAM-3의 비-면역글로불린 길항제로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 인간 및 기타 포유류에서 특이적 염증을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이러한 치료를 요하는 환자에게 염증을 억압시키기에 충분한 양의 항-염증 작용제를 제공하는 것을 포함하며, 이 때 상기 항-염증 작용제는 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 ; ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편 ; 실질적으로 순수한 ICAM-3 ; ICAM-3의 작용성 유도체, 또는 ICAM-3의 비-면역글로불린 길항제로 구성된 군에서 선택되며, 상기 염증은 고체성 기관 이식(예: 신장), 비고체성 기관 이식(예: 골수) 또는 조직 이식의 결과이다.
본 발명은 또한 인간 및 기타 포유류에서 비특이적 염증을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이러한 치료를 요하는 환자에게 염증을 억압시키기에 충분한 양의 항-염증 작용제를 제공하는 것을 포함하며, 이 때 상기 항-염증 작용제는 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 ; ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편 ; 실질적으로 순수한 ICAM-3 ; ICAM-3의 작용성 유도체, 또는 ICAM-3의 비-면역글로불린 길항제로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 추가로 염증을 치료하는 상기 방법을 제공하는데, 이 때 염증은 성인성 호흡 곤란 증후군 ; 패혈증에 종속하는 다발성 기관 손상 증후군 ; 패혈증, 출혈 또는 외상에 종속하는 다발성 기관 손상 증후군 ; 심근 조직 및 기타 조직의 재관류 손상 ; 급성 사구체신염 ; 반응성 관절염 ; 급성 염증 부위를 가진 피부병 ; 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추 신경계 염증 질환(예: 발작) ; 열 손상 ; 혈액투석 ; 백혈구 제거혈 수혈 ; 궤양성 대장염 ; 크론병 ; 괴사성 소장 결장염 ; 과립구 수혈 관련 증후군 ; 및 사이토카인-유도 독성으로 구성된 군에서 선택된 상태와 관계된다.
본 발명은 또한 조혈성 종양 세포, 즉 이동을 위해 CD-18의 일원(특히 LFA-1)을 이용하는 세포의 전이를 억압하는 방법을 포함하는데, 이 방법은 그러한 전이의 억압을 요하는 환자에게 상기 전이를 억압하기에 충분한 양의 작용제를 제공하는 것을 포함하며, 이 때 상기 작용제는 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 ; 이 항체의 독소-유도체 ; ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편 ; 상기 단편의 독소-유도체 ; 실질적으로 순수한 ICAM-3 ; 독소-유도된 ICAM-3 ; ICAM-3의 작용성 유도체 ; ICAM-3의 상기 작용성 유도체의 독소-유도체 ; 또는 CD-18 분자족의 일원과는 다른 ICAM-3의 비-면역 글로불린 길항제로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 ICAM-3 발현 종양 세포의 증식을 억압하는 방법을 포함하는데, 이 방법은 그러한 증식의 억압을 요하는 환자에게 상기 증식을 억압하기에 충분한 양의 작용제를 제공하는 것을 포함하며, 이 때, 상기 작용제는 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 ; 이 항체의 독소-유도체 ; ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편 ; 상기 단편의 독소-유도체 ; CD-18 분자족의 독소-유도된 일원 ; 또는 CD-18 분자족의 일원의 독소-유도된 작용성 유도체로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 ICAM-3를 발현시키는 세포의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 하기 단계를 포함한다 :
(a) ICAM-3 mRNA에 혼성화될 수 있는 핵산 분자의 존재하에 세포 또는 세포 추출물을 항온 처리하는 단계 ; 및
(b) 핵산 분자가 상기 세포에 또는 상기 세포의 상기 추출물에 존재하는 상보적인 핵산 분자에 혼성화되었는지를 결정하는 단계.
본 발명은 또한 생물학적 체액 샘플내 ICAM-3의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 하기 단계를 포함한다 :
(a) 상기 샘플을 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편과 함께 항온처리하는 단계 ; 및
(b) 상기 항체가 상기 샘플에 결합되었는지를 검출하는 단계.
본 발명은 또한 (a) ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 ; ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편 ; 실질적으로 순수한 ICAM-3 ; ICAM-3의 작용성 유도체 ; 또는 CD-18 분자족의 일원과는 다른 ICAM-3의 비-면역글로불린 길항제로 구성된 군에서 선택된 작용제 또는 (b) 면역 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
[제1도 정제된 LFA-1에 세포주의 부착]
정제된 LFA-1에 세포주(A) 및 림프구(B)의 부착은 ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3에 의해 설명된다. LFA-1, ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3에 특이적인 차단 MAb의 존재하에 LFA-1-피복된 미세역가 웰상에 BCECF-표지된 세포의 결합을 나타낸다. 대조용 웰은 LFA-1 없이 피복되었다.
[제2도 세포 ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3 발현의 유동 혈구 계산 분석]
(A) 림프 아세포 세포주를 MAb RR1/1(항-ICAM-1, MAb CB-IC2/1(항-ICAM-2)). MAb CBR-IC3/1(항-ICAM-3) 또는 비-결합 대조용 MAb X63(가는 선)의 포화량으로 표지하고, FITC-항-생쥐 면역 글로불린으로 표지시켰다.
(B) 인간 휴지 백혈구 및 3일간 pHA-활성화된 림프구를 ICAM 발현에 대해 상기한 바와 같이 분석하였다.
[제3도 ICAM-3의 면역 침강 반응]
(A)125I-표지된 세포 용해물을 비-결합 대조용 X63 또는 MAb CB-IC3/1(항-ICAM-3)로 면역 침강시켰다.
(B)125I-표지된 SKW3 세포 용해물을 N-글리카나제로 처리하거나 또는 처리하지 않고, 비-결합 대조용 MAb X63, MAb W6/32(항-HLA-A,B,C), MAb RR1/1(항-ICAM-1), MAb CBR-IC2/1(항-ICAM-2) 또는 MAb CB-IC3/1(항-ICAM-3)로 면역 침강시켰다.
[제4도 상이한 공급원으로부터 ICAM-3의 면역 침강 반응]
mAb-결합된 세파로즈를 사용하여 I125-표지된 림프구 및 호중구 용해물로부터 ICAM-3를 면역 침강시켰다. 면역 침강된 ICAM-3를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 분리하였다. 다른 mAb를 사용하여 다른 세포 표면 분자를 면역 침강시켰다. 인간 1g 세파로즈(대조용 레인), CBR-IC2/1(ICAM-2), CBR-IC3/1(ICAM-3), TS2/4(LFA-1), LM2/1(MAC-1).
[제5도 SKW3 이 ICAM-1 및 ICAM-3에 결합하는데 있어서 PMA의 영향]
SKW3 세포가 정제된 ICAM-1 및 ICAM-3에 결합하는 능력, 및 이 결합의 PMA 자극의 효과를 종래에 개시된 대로 시험하였다(더스틴 등의 네이쳐 341:619(1989) ; 말린 등의 세포 51:813-819(1987)). 하나의 대표 실험을 나타내었고, 오차 막대는 하나의 표준 편차(SD)를 나타낸다.
[제6도 PMA 자극된 SKW3 세포 부착의 항체 차단]
여러 항체들을 그들이 정제된 ICAM-1 또는 ICAM-3에 결합하는 것으로부터 PMA 자극된 SKW3 세포를 차단하는 능력에 대해 종래 개시된 대로 시험하였다(더스틴 등의 네이쳐 341:619(1989) ; 말린 등의 세포 51:813-819(1987)). 하나의 대표 실험을 나타내었고, 오차 막대는 하나의 SD를 나타낸다.
[제7도 정제된 ICAM에 COS 세포 형질전환체의 결합]
COS 세포를 LFA-1 발현 벡터로 종래에 개시된 대로 형질감염시켰다(드푸거로울즈 등의 J. Exp. Med. 175:185-190(1992)). 형질감염된 세포를 그들이 항-LFA-1 항체(TS1/22)의 존재 및 부재하에 고정화된 ICAM-1 및 ICAM-3에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 하나의 대표 실험을 나타내었고, 오차 막대는 하나의 SD를 나타낸다.
[제8도 PMA 자극된 SKW3이 ICAM에 결합하는데 있어서의 온도 의존도]
PMA 자극된 SKW3 세포가 정제된 ICAM-1 및 ICAM-3에 결합하는 능력을 종래 개시된 대로 4, 16, 22 및 37℃에서 시험하였다(말린 등의 세포 51:813-819(1987)). LFA-1 mAb(TS1/22)의 존재 또는 부재하에 분석하였다. 하나의 대표 실험을 나타내었고, 오차 막대는 하나의 SD를 나타낸다.
[제9도 PHA 자극된 T 세포 분열의 항체 차단]
다양한 항체들을 그들이 PHA 자극된 T 세포 분열을 차단하는 능력에 대해 종래 개시된 대로 시험하였다(크렌스키 등의 J. Immunol. 131:611-616(1983)).
[제10도 혼합 림프구 반응에 항-ICAM 항체의 영향]
여러 항체들을 그들이 혼합 림프구 반응을 차단하는 능력에 대해 종래 개시된 대로 시험하였다(크렌스키 등의 J. Immunol. 131:611-616(1983)).
[제11도 ICAM-3의 펩티드 단편의 기체 크로마토그래프]
ICAM-3를 정제하고, Lys-C로 분해시켰다. 펩티드 단편은 고실행도 액체 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다.
[제12도 클론 11.2의 도식적 표현]
클론 11.2의 도식적 표현이다. NK-10 및 NK-17 펩티드의 위치, 이렇게 얻어진 다양한 DNA 서열, 및 횡단막 영역을 나타낸다.
[제13도 인간 ICAM-1과 NK-10으로 프라이밍된 서열의 서열 비교]
GAP 프로그램을 사용하여 NK-10으로 프라이밍된 서열과 인간 ICAM-1 단백질의 서열 상동성을 동정하였다.
[제14도 RM13으로 프라이밍된 서열과 인간 ICAM-1의 서열 비교]
GAP 프로그램을 사용하여 RM13으로 프라이밍된 서열과 인간 ICAM-1의 서열 상동성을 동정하였다.
[제15도 RM13으로 프라이밍된 서열과 인간 ICAM-2의 서열 비교]
GAP 프로그램을 사용하여 RM13으로 프라이밍된 서열과 인간 ICAM-2의 서열 상동성을 동정하였다.
[제16도 T7으로 프라이밍된 서열과 인간 ICAM-2의 서열 비고]
GAP 프로그램을 사용하여 T7으로 프라이밍된 서열과 인간 ICAM-1의 서열 상동성을 동정하였다.
[제17도 T7으로 프라이밍된 서열과 인간 ICAM-2의 서열 비교]
GAP 프로그램을 사용하여 T7으로 프라이밍된 서열과 인간 ICAM-2의 서열 상동성을 동정하였다.
[제18도 ICAM-3의 부분 서열]
클론 11.2의 DNA 서열은 표준 방법을 사용하여 결정하였다.
A. ICAM-3의 5' 말단에서 얻는 서열. 이들 서열은 클론 11.2를 T7프로이머로 프라이밍시켜 얻었다.
B. ICAM-3 유전자내에서 얻은 서열. 이들 서열은 클론 11.2를 NK-10 프라이머로 프라이밍시켜 얻었다.
C. ICAM-3의 3' 단부에서 얻은 서열. 이들 서열은 클론 11.2를 역 RM13 프라이머로 프라이밍시켜 얻었다.
[바람직한 구체 양태의 설명]
본 발명은 LFA-1에 대한 종래 동정되지 않은 결합 리간드의 발견을 근거로 한다. CD-18 족 분자들과 같은 분자들은 세포 부착 과정에 관여하는 것으로서 "부착 분자"로 언급된다.
[Ⅰ. LFA-1]
백혈구 부착 분자 LFA-1은 면역 및 염증에서 광범위한 림프구, 단구, 천연 킬러 세포 및 과립구의 기타 세포와의 상호작용을 매개한다(스프링거, T. A. 등의 Ann. Rev. Immunol. 5:223-252(1987)).
LFA-1은 ICAM-1, ICAM-2 및 새로이 동정된 ICAM-3(본원에 개시됨)에 대한 수용체이다. 이들 표면 분자는 일부 조직에서 구조적으로 발현되며, 기타 조직의 염증에서 유도된다(말린, S. D. 등의 세포 51:813-819(1987) ; 더스틴, M. L. 등의 J. Immunol. 137:245-254(1986) ; 더스틴, M. L. 등의 Immunol. 투데이 9:213-215(1988) ; 미합중국 특허 출원 일련 번호 제 07/019,440호(1987. 2. 26 출원) 및 미합중국 특허 출원 일련 번호 제 07/250,446호(1988. 9.28 출원), 상기 두 출원을 본원에 참고로 인용함.)
LFA-1은 항원-특이적이고 항원-무관성인 T세포 독성의 T 헬퍼, 천연 킬러, 과립구 및 단구의 기타 세포형과의 상호 작용에서 기능한다(스프링거, T. A. 등의 Ann. Rev. Immunol. 5:223-252(1987), 키시모토, T. K. 등의 Adv. Immunol. (1988, 출판).
[Ⅱ. ICAM-1]
ICAM-1은 상이한 세포형에서 76-114KD로 질량이 다른 단일쇄 당단백질이며, 5개 C-유사 도메인을 가진 1g 상과(superfamily)의 일원이다(더스틴, M. L. 등의 Immunol. 투데이 9:213-215(1988) ; 스톤튼, D. E. 등의 세포 52:925-933(1988) ; 시몬스, D. 등의 네이쳐 331:624-627(1988)). ICAM-1은 광범위한 세포 유형상에서 IFN-g, TNF 및 IL-1을 포함한 사이토카인으로 대량으로 유도시킬 수 있다(더스틴, M. L. 등의 Immunol. 투데이 9:213-215(1988)). 상피 세포, 내피 세포 및 섬유 아세포 상에서 ICAM-1의 유도는 림프구의 LFA-1 의존성 부착을 매개한다(더스틴, M. L. 등의 Immunol. 투데이 137:245-254(1986) ; 더스틴, M. L. 등의 J. Cell. Biol. 107:321-331(1988) ; 더스틴, M. L. 등의 J. Exp. Med. 167:1323-1340(1988)). LFA-1 MAb에 의한 림프구의 예비 처리에 의해 또는 ICAM-1 MAb에 의한 기타 세포의 예비 처리에 의해 부착이 차단된다(더스틴, M. L. 등의 J. Immunol. 137:245-254(1986) ; 더스틴, M. L. 등의 J. Cell. Biol. 107:321-331(1988) ; 더스틴, M. L. 등의 J. Exp. Med. 167:1323-1340(1988)). 인공막내에 또는 페트리 접시상에 정제된 ICAM-1을 이용한 동일한 결과는 LFA-1 및 ICAM-1이 서로에 대한 수용체임을 입증한다(말린, S. D. 등의 세포 51:813-819(1987) ; 막고바, M. W. 등의 네이쳐 331:86-88(1988)). 분명히 하면, 그들은 본원에서 각각 "수용체"와 "리간드"로 언급된다. ICAM-1의 추가 설명은 미합중국 특허 출원 일련 번호 제 07/045,963 호 ; 제 07/115,798호 ; 제 07/155,943 호 ; 제 07/189,815 호 또는 제 07/250,446 호에 제공되어 있으며, 상기 출원들을 본원에 참고로 인용하였다.
[Ⅲ. ICAM-2]
ICAM-1과 구별되는 기타 LFA-1 리간드가 가정되었다(로드라인, R. 등의 J. Immunol. 137:1270-1274(1986) ; 막고바, M. W. 등의 Eur. J. Immunol. 18:637-640(1988) ; 더스틴, M. L. 등의 J. Cell. Biol. 107:321-331(1988)). 동정된 제 2 LFA-1 리간드를 ICAM-2로 명명한다.
ICAM-2는 세포 분포에서 그리고 사이토카인 유도의 결핍에서 ICAM-1과 상이하다. ICAM-2는 2개의 Ig-유사 도메인을 가진 통합막 단백질이고, 반면에 ICAM-1은 5개의 Ig-유사 도메인을 가진다(스톤튼, D. E. 등의 세포 52:925-933(1988) ; 시몬스, D. 등의 네이쳐 331:624-627(1988)). 놀랍게도, ICAM-2는 ICAM-1 또는 ICAM-2가 Ig 상과의 다른 일원에 대한 것보다 ICAM-1의 2개의 대부분의 N-말단 도메인과 매우 밀접(34% 동일성)한 관계가 있는데, 이것은 ICAM-2가 동일한 인테그린족 수용체에 결합하는 Ig-유사 리간드의 아-족임을 입증한다. ICAM-2의 추가 설명은 미합중국 특허 출원 일련 번호 제 07/454,294호에 제공되어 있으며, 본원에 참고로 인용하였다.
[Ⅳ. ICAM-3]
본 발명은 ICAM-3로 명명된 제 3의 LFA-1 리간드의 발견과 관계된다.
ICAM-2에 대한 MAb의 개발은 여러가지 종래의 LFA-1의존성, ICAM-1-비의존성 현상을 분석 가능하게 하였으며, LFA-1에 대한 제 3의 리간드가 존재한다는 것을 제안하였다. 상피 세포 및 내피 세포와 같은 여러 세포 유형의 정제된 LFA-1에의 결합은 ICAM-1과 ICAM-2 MAb의 조합으로 완전히 차단될 수 있고, 반면에 LFA-1에의 부착의 ICAM-1, ICAM-2-비의존성 경로가 T세포 림프종 세포주, SKW3을 포함하여 많은 림프구 세포주에 존재하였다(제 1 도).
이러한 부착 경로를 특성화하기 위해, 항-ICAM-1 및 항-ICAM-2 MAb와 함께 SKW3에 대해 MAb를 형성시키고, 상기 세포주가 정제된 LFA-1에 결합하는 것을 억제하는 능력에 대해 검색하였다. 하나의 MAb 인 CBR-IC3/1를 선별하였는데, 이것은 상기 신규의 부착 경로를 완전히 억제하였다(제 1 도). 정제된 LFA-1에의 SKW3의 부착은 차단 항-ICAM-1 및 항-ICAM-2 MAb의 조합에 의해 약간만 억제되었다. 항-ICAM-3 MAb 인 CB-IC3/1만을 첨가한 경우, 그것은 부착을 크게 억제하였으며, 이 억제는 차단 항-ICAM-2 MAb와 조합될 때 완전하였다.
따라서, 정제된 LFA-1에의 SKW3의 부착은 주로 ICAM-3에 의해 매개되고, 또한 부분적으로는 ICAM-2에 의해서도 매개되었다. LFA-1에 부착할 때, 4개 세포주 각각은 상이한 정도로 3개 ICAM을 이용하였는데, 이것은 MAb억제의 상이한 유형에 의해 입증되었다. B 림프 아세포 세포주인 JY의 부착은 주로 ICAM-1 경로를 통해, 그리고 약간은 ICAM-2 및 ICAM-3 경로를 통해 일어났다. 다른 B 림프 아세포 세포주인 SLA는 ICAM-1 및 ICAM-3를 둘다 이용하였는데, 그것은 부착이 ICAM-1 또는 ICAM-3 MAb 각자에 의해서는 억제되지 않고, 상기 MAb 둘다에 의해서는 거의 완전히 억제되었기 때문이다. 흉선종 세포주인 Jurkat는 ICAM-2 및 ICAM-3 부착 경로 둘다를 이용하였고, ICAM-1 경로를 약간 이용하였다. 휴지 T 림프구, 및 파이토헤마글루티닌(PHA)로 활성화된 림프구 둘다의 부착 역시 조사하였다(제 1b 도). 휴지 림프구는 종래에 정제된 LFA-1에 강하게 결합하는 것으로 알려져 있으며(더스틴 등의 네이쳐 341:619-624(1989)), 이 결합은 주로 ICAM-3-의존성으로 밝혀졌다. PHA로 활성화할 때, ICAM-1 발현이 유도되고, LFA-1에의 부착은 주로 ICAM-1을 통해, 그리고 부분적으로는 ICAM-3를 통해 일어났다. ICAM-1 및 ICAM-3의 존재에 의해 차폐되지만, 휴지 및 활성 T 세포 둘다에서 ICAM-2 부착 성분을 검출할 수 있었다. 각각의 세포에 대해서 2개 이상의 ICAM에 대한 MAb가 실질적인 억제를 이루는데 필요하므로, ICAM의 사용에 있어서 상당한 과다분이 있다. 이것에 대해 주목할 만한 예외는 LFA-1에의 휴지 림프구의 부착이며, 그것은 주로 ICAM-3에 의해 매개되었다. 모든 경우에, 모든 3개 항-ICAM-MAb의 조합은 항-LFA-1 MAb의 존재하에 나타나는 것과 비교되는 레벨로 LFA-1에 결합하는 것을 방지하였다.
LFA-1에 대한 3개 ICAM의 상대적 친화도는 상기에서 측정한 LFA-1을 결합시키는 작용과 면역 형광 유동 혈구 계산법에 의해 측정되는 세포 표면 발현을 비교하므로써 검사할 수 있다(제 2 도). ICAM의 표면 발현과 그들의 LFA-1 부착에의 작용의 비교는 ICAM-1이 LFA-1에 대해 가장 큰 친화도를 가지며, ICAM-2 및 ICAM-3는 유사하지만 낮은 친화도를 가짐을 나타내었다. 예를 들면, Jurkat 세포는 ICAM-2 및 ICAM-3를 유사한 레벨로 발현시켰고, 각각 LFA-1에의 결합에 작용하였다. ICAM-2 발현이 JY 세포상에서와 같은 ICAM-3의 발현보다 더 많이 발현되는 경우, LFA-1 부착의 ICAM-2 경로가 ICAM-3 보다 우세하였다. 대조적으로, SLA 및 SKW3 은 ICAM-2 보다 ICAM-3를 3-5배 더 발현시켰고, 예상대로 ICAM-3 부착 경로가 ICAM-2 경로보다 우세하였다. 휴지 T 림프구상에 ICAM-3가 존재할 경우 잘 발현되었으며, ICAM-1이 부재하면 LFA-1에의 부착은 주로 ICAM-3를 통해 매개되었다. ICAM-1이 잘 발현될 경우, SLA, JY 및 PHA-활성 T 세포의 경우와 마찬가지로 ICAM-1이 주요 부착 경로였다.
ICAM-3의 분포 유형은 여러 면에서 ICAM-1 및 ICAM-2의 분포 유형과 달랐다. ICAM-1 및 ICAM-2와는 달리, ICAM-3는 휴지 또는 자극된 내피상에서 발현되지 않았다(데이타 제시하지 않음). 이것은 휴지 및 자극된 내피에의 세포의 LFA-1의존성 결합이 ICAM-1 및 ICAM-2-의존성 현상이라는 발견과 일치하는 것이다. ICAM-3는 조혈 계통, 즉 몇 가지 예외는 있지만 림프구 및 단구 세포주에서 고도로 발현되는 것에 제한된다. 그러나, 모든 경우에 세포주에서 ICAM-3의 발현은 LFA-1-의존성, ICAM-1, ICAM-2-비의존성 부착 경로와 대동하였다. ICAM-1 및 ICAM-2를 통해서만 LFA-1을 결합하는 세포주(HUVEC, 라지)는 ICAM-3 발현을 나타내지 않았고, 반면에 상기 제 3의 부착 경로를 통해 약한 결합을 보인 세포주(JY, U937, Sup T)는 상응하여 낮은 ICAM-3 표면 발현을 가졌다(데이타 제시하지 않음).
ICAM-3는 백혈구상에서 그 발현에 있어 ICAM-1 및 ICAM-2와 크게 달랐다(제 2b 도). ICAM-3는 휴지 림프구, 단구 및 호중구 상에 고 레벨로 발현되었고, 반면에 ICAM-1 및 ICAM-2는 훨씬 약하게 발현되거나 또는 발현되지 않았다. 이와 비교하여, ICAM-1 및 ICAM-2는 단구상에서 약하게 발현되었으며, ICAM-2만이 휴지 림프구상에 존재하였다. ICAM-1과 ICAM-2는 어느 것도 호중구상에서는 발현되지 않았다. PHA로 림프구를 활성화할 때, ICAM-3 발현은 2-3배 증가하였고, 반면에 ICAM-1 발현은 크게 유도되었다(더스틴 등의 J. Immunol. 137:245-254(1986))(제 2b 도).
여러가지125I 표지된 세포주의 ICAM-3의 면역 침강물은 환원 조건하에서 124,000 Mr의 예리한 밴드를 나타내었으며, 비환원 조건하에서는 단지 약간만 이동성이 증가하였다(제 3a 도). N-글리카나제 처리는 Mr 87,000까지 ICAM-3 밴드를 감소시켰는데, 이것은 ICAM-3가 ICAM-1 및 ICAM-2와 마찬가지로 고도로 당첨가된 단백질이라는 것을 시시한다(제 3b 도). ICAM-3의 생화학적 특성, 발현 유형 및 작용성 성질은 종래에 개시된 부착 분자, 예를 들어 인간 회귀성 수용체 LAM-1(테더 등의 J. Immunol. 144:532-540(1990)). 유도성 내피 부착 분자 VACAM-1(라이스 등의 J. Exp. Med. 171:1369-1374(1990) ; 카를로스 등의 혈액(발행중)(1990) ; 오스본 등의 세포 59:1203-1211(1989)), 및 매트릭스 수용체의 VLA 족(헬머, M. E. 등의 Ann. Rev. Immunol. 8:365-400(1990))과 구별되며, 유사한 세포 분포를 가진 MAb는 제 4 차 백혈구 워크샵 데이타 베이스(질크스, W. R. 등의 백혈구 타이핑 데이타 베이스 IV. 옥스포드 유니버시티 프레스, 옥스포드, 영국(1990))에서 발견되었다.
3개 LFA-1 리간드의 존재는 LFA-1-의존성 백혈구 상호작용의 상이한 측면에 대한 특성화를 제시한다. ICAM-1은 내피 및 많은 상피 세포 유형에서 기본적으로 발현되며, 그것은 세포 국부화를 조절하고, 특이 항원 인지를 용이하게하는 염증 및 면역에서 강하게 유도된다(워릭 등의 Immunol. Rev. 108:135-161(1989)). ICAM-2는 휴지 내피에서 우세한 LFA-1 리간드이므로, 이 부착 경로가 조직 내피를 통해 LFA-1-보유 림프구의 정상적 재순환에 대해 중요한 결과를 가질 수 있다(하만 등의 J. Immunol. 140:693-699(1988) ; 멕케이 등의 J. Exp. Med. 171:810-817(1990) ; 팔스 등의 J. Immunol. 140:1851-1853(1988) ; 및 누노이 등의 Hum, Path. 19:753-759(1988)). 현재 호중구상에서 ICAM-3의 기능은 명확하지 않은데, 그것은 호중구의 동형성 응집이 LFA-1의 존재에도 불구하고 주로 Mac-1-의존성인 것 같기 때문이다(앤더슨 등의 J. Immunol. 137:15-27(1986) ; 패터로요 등의 Scand. J. Immunol. 22:619-631(1985)). 휴지 T 림프구의 LFA-1에의 부착이 주로 ICAM-3를 통해 일어난다는 발견은 ICAM-3가 단구 및 휴지 림프구상에 기타 LFA-1 리간드보다 훨씬 더 잘 발현된다는 사실과 함께 면역 반응의 개시에 중요한 역할을 암시한다. 사실, 항원 제공 세포와의 T 세포 부착은 LFA-1 : ICAM 상호 작용을 필요로 하며(드랜스필드 등의 Imm. Rev. 114:29-44(1990) ; 막고바 등의 Immunol. Today 10:417-422(1989)), ICAM-3는 그 자체가 ICAM-1과 ICAM-2 어느 것도 잘 발현되지 않는 휴지 T 림프구상에서 특히 역할을 할 수 있다. 사실, 알레르기 반응과 자가 유래성 혼합 림프구 반응에서 ICAM-1과는 다른 LFA-1 리간드에 대한 역할이 제안되어 있다(배그내스코 등의 Cell Immunol. 128:362-369(1990)). 게다가, ICAM-3는 T 및 B 림프구중 하나는 아직 활성화되지 않은 그 두 림프구 사이의 항원-특이적 상호작용에 중요한 것으로 예측될 수 있다.
ICAM-3는 또한 LFA-1에 의존성이나 ICAM-1에는 T 세포에 의한 특정 표적의 용해에 중요할 수 있다(막고바 등의 Eur. J. Immunol. 18:637-640(1988)).
다수 ICAM의 존재는 ICAM 또는 ICAM 유사체에 대한 MAb에 의한 임상 치료용으로 중요한 의미를 가진다. ICAM-1 MAb는 신장(코시미 등의 J. Immunol. 144:4604-4612(1990)) 및 심장(플라빈 등의 Transplant. Proc. 23:533-534(1991)) 동종 이식체의 지속에 있어 생체내에서 효과적이다. ICAM-3 MAb는 그것이 세포 유형의 분명한 서브 세트의 LFA-1-의존성 부착 상호 작용을 억제하기 때문에, 생체내 구별되고 중복되는 수의 면역 반응을 억제한다.
[Ⅴ. ICAM-3의 cDNA 클로닝]
다양한 방법중의 하나를 이용하여 ICAM-3 유전자를 클로닝할 수 있다. 그러한 한 가지 방법은 ICAM-3 유전자를 포함하는 삽입체의 존재에 대해 cDNA 삽입체의 왕복 벡터 라이브러리(ICAM-3 발현 세포로부터 유래됨)를 분석하는 것을 수반한다. 그러한 분석은 세포를 벡터로 형질감염시키고, ICAM-3 발현을 분석하므로써 수행될 수 있다.
ICAM-3 cDNA는 부착 분자의 리간드를 동정하기 위해 아루포 및 시드(시드, B. 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 84:3365-3369(1987)의 방법의 수정형을 사용하여 동정하는 것이 바람직하다. 이 방법에서, cDNA 라이브러리는 ICAM-3를 발현시키는 세포(예: SLA, Jurkat, 또는 SKW3 림프 아세포 세포주)로부터 제조된다. cDNA 라이브러리는 T-세포로부터 제조하는 것이 바람직하다. 이 라이브러리는 정상적으로 ICAM-3를 발현시키지 못하는 세포(예: Cos 또는 HeLa 세포)를 형질감염시키는데 사용된다. 형질감염된 세포를 사전에 LFA-1 또는 항-ICAM-3 항체를 피복시킨 페트리 접시속에 도입시킨다. ICAM-3 암호 서열을 포함하며, 이 리간드를 그들의 세포 표면상에서 발현시키는 형질감염된 세포는 페트리 접시 표면상에 LFA-1 또는 항-ICAM-3 항체에 부착할 것이다.
비-부착 세포는 세척해 내고, 부착 세포를 페트리 접시에서 옮겨 배양하였다. 옮겨진 이들 세포에서 재조합 ICAM-3 발현 서열을 결정한다.
LFA-1이 페트리 평판을 피복하는데 사용되는 경우, 항-ICAM-1 및 항-ICAM-2 특이 항체를 페트리 접시에 첨가하여 ICAM-1 또는 ICAM-2 발현 세포의 부착을 방지한다. 따라서, ICAM-1+또는 ICAM-2+형질감염체의 LFA-1 피복된 플라스틱에의 부착은 항-ICAM-1 MAb인 RR1/1 및 항-ICAM-2 MAb 인 CBR-IC2/2와 같은 항체로 억제시킬 수 있다. ICAM-3 형질감염된 세포의 LFA-1 피복된 페트리 평판에의 결합은 EDTA 및 항-LFA-1 MAb에 의해 억제되지만, 항-ICAM-1 또는 항-ICAM-2 MAb에 의해서는 억제되지 않는다. 그러므로 ICAM-1 또는 ICAM-2 발현 세포는 페트리 접시에 부착할 수 없고, 따라서 모든 기타 비-부착 세포와 함께 주로 세척되어 진다. 이것은 ICAM-3를 발현시키는 세포를 증가시킬 것이다.
ICAM-3을 암호화하는 유전자 서열을 제조하는 기타 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 당업자는 통상적으로 이들 방법중 하나를 채택하여 목적하는 유전자를 얻을 수 있다.
ICAM-3을 암호화하는 유전자 서열을 제조하는 상기 기타 방법중 하나는 올리고누클레오티드 탐침을 사용하여 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리를 검색하는 것이다. 이 방법에서, ICAM-3 단백질은 당 분야에 공지된 면역-정제 방법을 사용하여 정제하는 것이 바람직하며, 말단 아미노산 서열은 당분야에 공지된 방법중 하나를 사용하여 결정한다. 한편, 트립신 또는 Lys-C로 효소학적으로 세정된 ICAM-3 인 펩티드를 정제하고, 내부 단편중 하나의 아미노산 서열을 결정한다.
일단 부분적 아미노산 서열이 결정되면, 올리고누클레오티드 탐침을 그 유기체가 나타내는 코돈 선호도에 근거하여 만들거나, 퇴화 탐침을 모든 가능한 코돈 조합에 근거하여 만들거나, 또는 코돈 선호도, 공지된 ICAM-1 또는 ICAM-2 DNA 서열과의 상동성, 및 코돈 퇴화도의 조합을 사용하여 탐침을 제조한다. 그후 이 탐침을 사용하여 이 탐침에 혼성화하는 서열에 대한 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 검색한다.
상기한 것과 같거나 유사한 기술은 인간 알데히드 탈수소 효소(슈, L. C. 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 82:3771-3775(1985)), 피브로넥틴 (스즈끼, S. 등의 Eur, Mol. Biol, Organ. J. 4:2519-2524(1985)), 인간 에스트로겐 수용체 유전자(월터, P. 등의 Proc, Natl. Acad. Sci. 미합중국 82:7889-7893(1985)), 및 조직-유형 플라스미노겐 활성화 인자(페니카, D. 등의 네이쳐 301:214-221(1983))에 대한 유전자의 성공적인 클로닝을 가능하게 하였다.
ICAM-3 유전자를 클로닝하는 또 다른 방법에서는, ICAM-3를 발현시키는 세포로부터 게놈 DNA, 또는 보다 바람직하게는 cDNA를 클로닝하므로써 발현 라이브러리를 제조한다. 그 후 그 라이브러리를 항-ICAM-3 항체에 결합하는 단백질을 발현시킬 수 있는 일원에 대해 검색한다.
상술한 방법중 어느 하나를 사용하여 얻은 클로닝된 ICAM-3 유전자는 발현벡터에 작용적으로 연결시키고, 박테리아 세포 또는 진핵 세포내로 도입하여 ICAM-3 단백질을 생산할 수 있다. 그러한 조작 기술은 매니어티스, T 등의 문헌(상기 참조)에 개시되어 있으며, 당 분야에 널리 공지되어 있다.
PCR을 이용하여 ICAM-3 유전자를 클로닝하는 또 다른 방법에서는, ICAM-3가 ICAM-1, ICAM-2 또는 그 둘다에 상동성이 있다는 가정을 한다. ICAM-1 과 ICAM-2 사이에 보존된 서열에 근거한 퇴화 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 SKW3 또는 편도와 같은 ICAM-3 단백질을 발현시키는 것으로 알려진 세포로부터 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 cDNA 또는 mRNA 를 증폭시킨다(드푸거로울즈 등의 J. Exp. Med., 175:185-190(1990)). 클론들을 서열 결정하고, ICAM-1 및 ICAM-2와 구별되는 클론들을 사용하여 전 길이의 cDNA 클론을 수득한다.
전술한 방법에 있어, 클론의 존재 확인은 예를 들면 COS 세포에서 완전 길이 클론을 형질발현시키고 ICAM-3 mAb와의 반응성에 대해 시험해봄으로써 확인할 수 있다.
[Ⅵ.본 발명의 작용제:ICAM-3 및 그 작용성 유도체, 작용 물질 및 길항물질]
본 발명은 또한 ICAM-3, 그 "작용성 유도체", 그 "작용 물질" 및 "길항 물질"에 대한 것이다.
[A. ICAM-3의 작용성 유도체]
ICAM-3의 "작용성 유도체"는 ICAM-3의 생물학적 활성과 거의 유사한 생물학적 활성(작용성 및 구조적)을 보유한 화합물이다. 용어 "작용성 유도체"에는 본 ICAM-3 분자의 "단편", "변형체" 및 "화학적 유도체"가 포함된다.
ICAM-3의 "단편"은 그 분자의 임의의 폴리펩티드 서브셋트를 지칭한다. ICAM-3 활성을 가지며 가용성(즉, 막에 결합되지 않음)인 ICAM-3의 단편이 특히 바람직하다. 가용성 단편은 모체 분자의 막 경유 부위를 결실시키거나, 소수성 잔기에 대한 친수성 아미노산 잔기를 결실 또는 치환시킴으로써 바람직하게 산출될 수 있다. 이러한 잔기의 규명 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
임의의 수의 전체 Ig-유사 도메인을 포함하는 단편, 예컨대 도메인 1(D1), D1 및 D2, D1-3, D1-4 및 D1-5가 바람직하다.
ICAM-3의 "변형체"는 전체 분자 또는 그 단편과 구조 및 기능면에서 거의 유사한 분자를 지칭한다.
한 분자와 다른 분자가 거의 유사한 구조를 가지고 있거나 양 분자가 유사한 생물학적 활성을 보유하는 경우 상기 분자는 다른 분자와 "거의 유사한"것으로 언급된다. 따라서, 두 분자가 유사한 활성을 보유하고 있다면, 그중 한 분자가 다른 분자에게서 발견되지 않은 구조를 보유하고 있다거나 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않다 할지라도 이들은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 변형체인 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 한 분자가 정상적으로는 자생 분자의 일부가 아닌 추가의 화학적 부위를 포함할 때 이 분자는 다른 분자의 "화학적 유도체"인 것으로 언급된다. 이러한 부위는 분자의 용해도, 흡수성, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수도 있다. 이 부위는 이외에, 분자의 독성을 저하시키거나, 분자의 원치 않는 부작용을 제거 또는 약화시킬 수도 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 부위는 레밍턴의 "약제 과학(1980)"에 기술되어 있다.
"독소-유도된" 분자는 "화학적 유도체"의 특정 부류를 구성한다. "독소-유도된" 분자는 독소 부위에 공유 부착된 분자(예, ICAM-3 또는 항-ICAM-3항체)이다. 이러한 부위를 분자에 커플링하는 과정은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
세포에 이러한 분자를 결합시키는 것은 독소 부위를 세포에 근접시키며 이로 인해 세포사멸을 촉진시킨다. 임의의 적합한 독소 부위가 사용될 수도 있으나 ; 예컨대 리신 독소, 콜레라 독소, 디프테리아 독소, 방사성동위원소 독소 또는 막-채널 형성 독소와 같은 독소를 사용하는 것이 바람직하다.
약 100개 이하의 잔기를 갖는 ICAM-3의 작용성 유도체를 시험관내 합성에 의해 편리하게 제조할 수 있다. 필요에 따라, 이러한 단편은 정제된 또는 미정제된 단백질의 표적화된 아미노산을, 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기성 유도 작용제와 반응시킴으로써 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 변형시킬 수도 있다. 수득된 공유결합된 유도체는 생물학적 활성에 중요한 잔기를 규명하는데 사용될 수도 있다.
ICAM-3의 단편을 산출하고 분리시키는데 많은 방법들이 이용될 수 있다. 이작용성 작용제를 사용한 유도는 ICAM-3을 비수용성 지지체 매트릭스에 가교시키는데 사용될 수 있다. 대안으로 시아노겐 브로마이드-활성화된 탄수화물과 같은 반응성 비수용성 매트릭스 및 미합중국 특허 제 3,969,287 호 ; 제 3,691,016 호 ; 제 4,195,128 호 ; 제 4,247,642 호 ; 제 4,229,537 호 ; 및 제 4,330,440 호에 기재된 반응성 기질이 단백질 고정에 사용된다.
변경된 아미노산 서열을 가진 ICAM-3의 작용성 유도체는 ICAM-3을 암호화하는 DNA를 돌연변이시켜 제조할 수도 있다. 이러한 작용성 유도체에는 예를 들면 ICAM-3의 아미노산 서열내 잔기를 결실, 삽입 또는 치환시킨 것이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 이용하여 최종 구성체를 산출할 수도 있는데, 단 이때 최종 구성체는 목적하는 활성을 보유해야 한다. 작용성 유도체를 암호화하는 DNA에서 이루어질 돌연변이는 해독틀의 밖에 서열을 배치하지 말아야 하며, 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적인 부위를 산출하지 않는 것이 바람직하다(유럽 특허 출원 공고 제 75,444호 참조).
유전적 수준에서, ICAM-3을 암호화하는 DNA의 부위-지향성 돌연변이 유발에 의해 작용성 유도체를 제조하고, 작용성 유도체를 암호화하는 DNA를 생성하고 그 후 재조합 세포 배양물에서 DNA를 형질발현시킬 수 있다.
아미노산 서열내에서 변이를 도입하기 위한 부위를 사전결정되지만, 돌연변이 자체는 사절결정될 필요가 없다. 예컨대, 주어진 부위에서 돌연변이의 수행을 최상으로 하기 위해서는, 링커 스캐닝 돌연변이 유발과 같은 무작위 돌연변이 유발을 표적 코든 또는 표적 영역에서 수행하여 다수의 유도체를 산출한 후 이를 형질발현시키고 목적하는 활성의 최적 조합에 대해 검색한다. 서열이 공지된 DNA 내 소정의 부위에서 돌연변이를 일으키는 방법은 잘 알려져 있으며, 그 예로는 부위-지향성 돌연변이 유발법이 있다.
본 발명에 따라 ICAM-3의 작용성 유도체를 제조하는 것이 ICAM-3 또는 사전 제조된 ICAM-3의 작용성 유도체를 암호화하는 DNA의 부위-지향성 돌연변이 유발에 의해 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 부위-특이적 돌연변이 유발의 기법은 본 명세서내에 참고로 인용된 문헌인 "매니어티스, T. 등의 분자 클로닝, 실험실 매뉴얼, 콜드스프링 하버, 뉴욕(1982)"에 예시된 바와 같이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 부위-지향성 돌연변이유발은 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하여 ICAM-3 작용성 유도체를 제조하는 것을 가능하게 한다.
부위-지향성 돌연변이 유발을 이용하여 아미노산 결실, 삽입 또는 치환을 수행할 수 있다. 아미노산 서열 결실 범위는 일반적으로 약 1 내지 30 잔기, 더욱 바람직하게는 1 내지 10잔기 및 통상 인접한다. 가장 바람직한 결실은 ICAM-3의 가용성 형태를 산출하도록 수행된 것이다. ICAM-3의 가용형은 ICAM-3의 막 경유부 또는 ICAM-3 내 소수성 잔기를 결실시킴으로써 산출하는 것이 가장 바람직하다.
아미노산 삽입은 ICAM-3 암호 서열내에 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 삽입 뿐 아니라, 거의 무제한 길이의 폴리펩티드와의 말단 융합도 포함한다. 서열내 삽입(즉, 완전 ICAM-3 분자 서열내 삽입) 범위는 일반적으로 약 1 내지 10 잔기, 더욱 바람직하게는 1 내지 5일 수 있다. 말단 삽입의 일례에는 재조합 숙주로부터 유도체의 분비를 촉진시키기 위한 목적으로 분자의 N-말단부에 숙주세포에 이종 또는 동종인 시그날 서열을 융합시키는 것이 포함된다.
제 3 군의 작용성 유도체는 ICAM-3 내 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입될 것이다. 이러한 치환은 ICAM-3 분자의 특성을 미세하게 조정하는 것이 바람직한 경우 하기 표 1에 따라 수행하는 것이 바람직하다.
작용적 또는 면역적 동일성면에서의 본질적인 변화는 표 1 내에 제시된 것보다 보존성이 낮은 치환을 선택함으로써, 즉 (a) 치환 지역내 폴리펩티드 골격의 구조 예컨대 시이트 배위 또는 나선 배위 (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 측쇄의 용적을 유지하는데 미치는 효과를 더욱 크게 하는 잔기를 선택함으로써 수행된다. 일반적으로 보존성이 낮은 치환은 (a) 글리신프롤린, 또는 그 둘다가 다른 아미노산에 의해 치환되거나 결실 또는 삽입되는 경우 ; (b) 소수성 잔기가 친수성 잔기로 치환되는 경우 ; (c) 임의의 다른 잔기가 시스테인 잔기로 치환되거나 그 반대로 치환되는 경우 ; (d) 전기 음성 전하를 가진 잔기가 전기양성의 측쇄를 가진 잔기로 치환되거나 그 반대로 치환되는 경우 ; 또는 (e) 용적이 큰 측쇄를 갖지 않은 잔기가 이러한 측쇄를 가진 잔기로 치환되거나 그 반대로 치환되는 경우이다.
ICAM-3의 용해도에 영향을 끼치는 치환이 가장 바람직하다. 이는 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환함으로써 가장 바람직하게 이루어진다.
ICAM-3의 친화성을 증대시키도록 고안된 돌연변이는 ICAM-1 또는 ICAM-2 내상동 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 도입시킴으로써 유도될 수도 있다. 유사하게, ICAM-1 또는 ICAM-2 내 상동 위치에서서 N-연결된 CHO가 결설된 이러한 돌연변이체 ICAM-3 분자가 제조될 수도 있다.
이에 앞서, ICAM-3의 생물학적 활성에 특정 치환, 결실 또는 삽입이 미치는 효과를 정확히 예견하는 것은 어렵다. 그러나, 당해 기술 분야의 전문가라면 통상의 검색 분석에 의해 그 효과를 평가하는 것이 가능할 것이다. 예를 들면, 유도체는 통상 천연 ICAM-3 분자를 암호화하는 DNA의 링커 스캐닝 부위-지향성 돌연변이 유발에 의해 제조한다. 그후 이 유도체를 재조합 숙주내에서 형질발현시키고 예를 들면 면역친화 크로마토크래피에 의해 세포 배양물로부터 임의로 정제한다.
그후, 세포 용균물 또는 정제된 유도체의 활성을 목적하는 특성에 대해 적합한 검색 분석으로 검색한다. 예를 들면, 주어진 항체에 대한 친화성과 같은 작용성 유도체의 면역 특성면에서의 변화를 경쟁식 면역분석법에 의해 측정한다.
적절한 분석에 의해 면역 조절 활성면에서의 변화를 측정한다. 산화환원 또는 열 안정성, 생물학적 반감기, 소수성, 단백질 분해 효소에 의한 분해에 대한 감수성 또는 담체와 함께 응집되거나 다량체로 응집되는 경향과 같은 단백질 특성의 변형은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 분석한다.
[B. ICAM-3의 작용 물질 및 길항 물질]
ICAM-3의 "작용 물질"은 ICAM-3가 생물학적 작용을 수행할 수 있는 능력을 향상시키거나 증대시키는 화합물이다. 이러한 작용 물질의 예는 세포 수용체에 결합할 수 있는 ICAM-3의 능력을 증대시키는 작용제이다.
ICAM-3의 "길항 물질"은 ICAM-3가 생물학적 작용을 수행할 수 있는 능력을 감소시키거나 저해하는 화합물이다. 이러한 길항 물질의 예로는 ICAM-1 및 ICAM-2, ICAM-1 및 ICAM-2의 작용성 유도체, 항-ICAM-3 항체, 항-LFA-1 항체 등이 포함된다.
본 명세서내에 참고로 인용된 출원들인 미합중국 특허 출원 일련 번호 제 07/045,963 호 ; 제 07/115,798 호 ; 제 07/155,943 호 ; 제 07/189,815 호 또는 제 07/250,446 호에 기술된 세포 응집 분석에 의해 LFA-1 의존성 응집을 측정할 수 있으며, 따라서 이를 이용하여 ICAM-3 /LFA-1 응집에 영향을 줄 수 있는 작용제를 규명할 수 있다. 즉, 이러한 분석법을 이용함으로써 ICAM-3의 작용물질 및 길항 물질을 규명할 수 있다. 길항 물질은 응집을 매개하는 LFA-1 또는 ICAM-3 능력에 손상을 줌으로써 작용할 수도 있다. 그외에, 진술한 분석법을 이용하여 비-면역글로불린(즉, 화학적) 작용제를 검사하여 이것이 ICAM-3 /LFA-1 매개된 응집의 작용 물질 또는 길항 물질 인지의 여부를 결정할 수도 있다. 이러한 응집 분석법은 통상 PMA로 자극시킨 말초 T-세포를 이용하여 수행한다.
즉, LFA-1에 대한 말초 혈구의 결합을 이용하여 ICAM-3 매개된 응집을 분석한다.
[C. 항-ICAM-3 항체]
본 발명의 바람직한 면역글로불린 길항 물질은 본 명세서에 개시된 CBR-IC3/1과 같은 ICAM-3에 대한 항체이다. 다른 적합한 항-ICAM-3 항체는 각종 방법에 의해 수득할 수 있다.
ICAM-3(또는 ICAM-3의 작용성 유도체)에 대한 항체는 복수 클론 또는 단일 클론 항체일 수 있다. 또한 본 출원의 항체는 당해 기술 분야에 공지된 과정에 의해 또는 1991 년 4월 22일자로 미합중국 수리 관청에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US91/02942 및 PCT/US91/02946에 의해 인체화될 수도 있다.
항-ICAM-3 항체는 ICAM-3 또는 그 펩티드 단편을 적합한 포유동물내로 도입시켜 제조할 수도 있다. 면역화된 동물은 이러한 노출에 대한 응답반응으로 복수 클론 항체를 생성할 것이다. ICAM-3의 펩티드 단편을 사용하면 동물을 면역화하는데 사용된 펩티드 단편내에 포함된 에피토프(들)와만 반응하는 영역 특이적 항체를 수득할 수 있다.
대안으로, 항-ICAM-3 항체는 원래 림프구의 표면상에 형질발현되는 ICAM-3를 사용하여 제조할 수도 있다. 복강내 주사와 같은 방법에 의해 적합한 동물내로 상기 세포를 도입하면 결과적으로 ICAM-3 또는 CD-18 분자족의 일원에 결합할 수 있는 항체를 생성할 것이다. 필요에 따라, 동물의 혈청을 분리하여, 이들 분자에 결합할 수 있는 복수 클론 항체의 공급원으로서 사용할 수도 있다. 대안으로, 항-ICAM-3 항체는 셀든, R.F. (유럽 특허 출원 공개 제 289,034 호) 또는 셀든, R.F. 등(사이언스 236:714-718(1987))의 방법을 적용하여 생성할 수도 있다. 구체적으로, 적합한 동물(예, 생쥐)의 세포를 천연 ICAM-3 분자 또는 그 단편을 형질발현할 수 있는 벡터로 형질감염시킨다.
형질감염시킨 동물 세포에서 ICAM-3를 생성함으로써 동물내에 면역 반응이 유도될 것이며 동물에 의해 항-ICAM-3 항체가 생성될 것이다.
그러나 ICAM-3와 결합할 수 있는 단일 클론 항체를 산출하기 위해서는 전술한 방식중 하나로, 면역시킨 동물중에서 비세포를 제거하는 것이 바람직하다.
전술한 방식으로 수득한 하이브리도마 세포는 각종 방법에 의해 검색하여 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 규명할 수 있다. 바람직한 검색 분석에서, 이러한 분자는 ICAM-3-형질 발현 세포, ICAM-1 및 ICAM-2-비형질발현 세포의 응집을 억제할 수 있는 능력에 의해 확인된다. 이러한 응집을 억제할 수 있는 항체는 그후 추가로 검색하여 ICAM-3 또는 CD-18 분자족에 대한 결합에 의해 이러한 응집을 억제하는 지의 여부를 결정한다. CD-18 분자족으로부터 ICAM-3을 판별할 수 있는 임의의 수단이 상기 스크린에 사용될 수도 있다. 따라서, 예를 들면, 항체에 결합된 항원은 면역침강 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수도 있다. LFA-1은 형질발현하나 ICAM-3은 형질발현하지 않은(또는 역으로) 세포에 결합할 수 있는 항체의 능력에 대해 검색함으로써 ICAM-3에 결합하는 세포로부터 CD-18 분자족의 일원에 결합하는 항체를 판별하는 것이 가능하다. LFA-1은 형질발현하나 ICAM-3은 형질발현하지 않는 세포에 결합할 수 있는 항체의 능력은 당업자에게 통상 이용되는 방법에 의해 검출할 수도 있다. 이러한 방법에는 면역분석법(특히, 면역형광법을 사용), 세포 응집, 필터 결합 연구, 항체 침전 등이 포함된다.
바람직한 방법에 있어, ICAM-3을 형질발현하는 세포에는 결합하나, ICAM-3를 형질발현하지 않는 세포에는 결합하지 않는 능력에 대해 항체를 선별한다.
전술한 ICAM-3의 작용 물질 및 길항 물질 외에, 염증, HIV 감염, 천식 등의 치료에 본 발명에 따라 사용될 수 있는 기타 작용제에는 항-ICAM-3 항체에 대한 항-이디오타입형 항체 및 ICAM-3에 결합할 수 있는 수용체 분자, 또는 이러한 분자의 단편이 포함된다.
본 발명에 있어 관심의 항-이디오타입형 항체는 ICAM-3와 경쟁적으로(또는 ICAM-3를 배제하고)결합할 수 있다. 이러한 항체는 예를 들면 항-ICAM-3항체에 대한 항체를 발생시킨 후, ICAM-3의 천연 결합 리간드중 하나에 결합할 수 있는 능력에 대해 항체를 검색함으로써 수득할 수 있다.
CD-18 족의 분자는 ICAM-3에 결합할 수 있기 때문에, 이러한 분자(예를 들면 알파 및 베타 서브유닛을 가진 헤테로다이머로서 또는 알파 또는 베타 서브유닛만으로 구성된 분자로서 또는 서브유니트중 하나 또는 양자의 단편을 가진 분자)의 투여는 세포상에 존재하는 ICAM-3에 대한 결합에 대해 세포와 경쟁할 것이다.
본 발명의 항-응집 항체는 각종 방식으로 규명하고 적정할 수 있다. 예를 들면, ICAM-3을 형질발현하는 세포(예, T-세포)에 차별적으로 결합할 수 있는 항체의능력 및 ICAM-3을 형질발현하지 못하는 세포에 결합하지 않는 능력을 측정할 수 있다. 이러한 세포 응집 분석은 본 명세서에 참고로 인용된 출원인 미합중국 특허 출원 일련번호 제 07/045,963 호 ; 제 07/115,798 호 ; 제 07/155,943 호 ; 제 07/189,815 호 또는 제 07/250,446 호에 개시되어 있다. 대안 방법으로, ICAM-3 또는 ICAM-3의 펩티드 단편에 결합할 수 있는 항체의 능력을 측정할 수 있다. 당업자가 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 각각 CD-18 분자족의 일원에 비해 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체를 규명하고 판별할 수 있는 각종의 가능한 검색 분석을 제공하기 위한 목적으로, 상기 분석을 변형시키거나 상이한 순서로 실시할 수도 있다.
[D. 본 발명 작용제의 제조]
본 발명의 작용제는 천연적인 방법에 의해(예를 들면, ICAM-3의 비-면역글로불린 길항 물질을 생산하도록 동물, 식물, 진균, 박테리아 등을 유도하거나 ICAM-3에 결합할 수 있는 단일 클론 항체를 생산하도록 동물을 유도함으로써) ; 합성 방법에 의해(예를 들면, ICAM-3, ICAM-3의 작용성 유도체 또는 ICAM-3의 단백질 길항 물질(면역글로불린 또는 비-면역글로불린)을 합성함으로써) ; 하이브리도마 기술에 의해(예를 들면, ICAM-3에 결합할 수 있는 단일 클론 항체 생산 목적으로) ; 또는 재조합 기술에 의해(예를 들면, 재조합 플라스미드 또는 비루스성 벡터를 사용하여 각종 숙주(즉, 효모, 박테리아, 진균, 배양 포유동물 세포 등)에서 본 발명의 작용제를 생산하기 위한 목적으로) 수득할 수도 있다. 사용 방법의 선택은 용이성, 목적하는 수율 등과 같은 요인에 따른다. 그러나, 특정 소염제를 생산하기 위해 전술한 방법, 과정 또는 기술중 단지 한 가지만을 사용할 필요는 없으며 ; 전술한 과정, 방법 및 기술을 병용하여 특정 작용제를 수득할 수도 있다.
[Ⅶ. ICAM-3 및 그 작용성 유도체, 작용 물질 및 길항 물질의 용도]
본 발명의 작용제를 사용하여 ICAM-3에 의해 매개된 다양한 생물학적 활성을 조절할 수 있다.
[A. 염증 억제]
본 발명의 한 양태는 CD-18 분자족의 수용체, 특히 LFA-1과 상호작용할 수 있는 ICAM-3 및 그 작용성 유도체의 능력으로부터 유래된다. 당단백질의 CD-18족의 일원과 상호작용할 수 있는 ICAM-3의 능력에 의해, ICAM-3은 염증을 억압(즉, 방지 또는 약화)하는데 사용될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "염증"은 특이적 방어계의 반응 및 비-특이적 방어계의 반응 둘다를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "특이적 방어계"는 특이적 항원의 존재에 대해 반응하는 면역계의 성분을 지칭한다. 염증이 특이적 방어계의 반응에 의해 야기되거나 매개되거나 관련있는 경우, 이는 특이적 방어계의 반응으로부터 초래되는 것으로 언급된다. 특이적 방어계의 반응으로부터 초래되는 염증의 예로는 루벨라 비루스(rubella virus)와 같은 항원에 대한 반응, 자가면역 질환 및 T-세포에 의해 매개된 지연형 과민성 반응(예를 들면 만토우(Mantaux) 시험에서 "양성"으로 시험된 개체에서 관찰됨)이 포함된다. 고체성 이식 조직 및 기관(예, 신장 및 골수 이식체)의 거부 반응 및 만성 염증 질환은 특이적 방어계의 염증 반응 또 다른 일례이다.
본 명세서에서 사용된 "비-특이적 방어계"의 반응은 면역적 기억력이 없는 백혈구에 의해 매개된 반응을 지칭한다. 이러한 세포에는 과립구 및 대식 세포가 포함된다. 본 명세서에서 사용된 염증은 비-특이적 방어계의 반응에 의해 야기되거나 매개되거나 관련된 경우, 비-특이적 방어계의 반응으로부터 초래된 것으로 언급된다.
적어도 일부가 비-특이적 방어계의 반응으로부터 초래된 염증에는 성인성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 패혈증, 외상 또는 출혈에 종속하는 다발성 기관 손상 증후군 ; 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상; 급성 사구체 신염 ; 반응성 관절염 ; 급성 염증 부위를 가진 피부병 ; 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추 신경계 염증 질환(예; 발작) ; 열손상 ; 혈액투석 ; 백혈구 제거혈 수혈 ; 궤양성 대장염 ; 크론병 ; 괴사성 소장결장염 ; 과립구 수혈 관련 증후군 ; 및 사이토카인-유발 독성과 같은 상태와 관련된 염증이 포함된다.
상기 논의된 바와 같이, CD-18 분자족의 일원에 대한 ICAM-3 분자의 결합은 세포 부착에 매우 중요하다. 부착 과정을 통해, 림프구는 외래 항원의 존재에 대해 동물을 지속적으로 모니터할 수 있다. 이들 과정은 보통 바람직하지만, 또한 고체성 기관 이식 거부 반응(예, 신장), 비-고체성 기관 이식 거부 반응(예, 골수), 조직 이식 거부반응 및 많은 자가면역 질환의 원인이 된다. 따라서, 세포 부착을 약화시키거나 억제할 수 있는 임의의 수단이 고체성 기관 이식체(특히 신장 이식체), 비-고체성 기관 이식체(특히, 골수 이식체), 조직 이식체의 수용자 또는 자가면역 환자에게 있어 특히 요망된다.
CD-18 분자족의 일원에 대한 단일 클론 항체는 내피에 대한 결합(해스카드, D. 등, J. Immunol. 137:2901~2906(1986)), 동형성 부착(로들라인, R. 등, J. Exp. Med. 163:1132-1149(1986)). 림프구의 항원 및 마이토겐 유발된 증식(데이비그넌, D. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 미합중국 78:4535-4539(1981)), 항체 형성(피셔, A. 등, J. Immunol. 136:3198-3203(1986)), 및 세포독성 T 세포(크렌스키, A. M. 등, J. Immunol.132:2180-2182(1984)), 대식구(스트라스먼, G. 등, J. Immunol. 136:4328-4333(1986)), 및 항체-의존성 세포의 세포독성 반응에 관여하는 세포(코올, S. 등, J. Immunol. 133:2972-2978(1984))의 용균 활성과 같은 모든 백혈구의 효과인자 기능을 비롯한 백혈구의 많은 부착 의존성 기능을 억제한다. 상기 모든 기능에 있어, 항체는 결합과 관련된 생체 기능을 억제하는 적합한 세포 기질에 부착할 수 있는 백혈구의 능력을 억제한다.
이러한 기능은, ICAM-3/LFA-1 상호 작용을 포함하는 정도까지 항-ICAM-3 항체에 의해 억제될 수 있다.
따라서, ICAM-3에 결합할 수 있는 단일 클론 항체는 포유 동물 환자에서 소염제로서 사용될 수 있다. 이러한 작용제는 선택적으로 부착을 억제할 수 있고 통상의 작용제에서 발견되는 신독성과 같은 다른 부작용을 제공하지 않는다는 점에서 일반적인 소염제와 상이하다.
특히 가용형의 ICAM-3은 CD-18 족 분자의 일원에 대한 항체와 동일한 방식으로 작용할 수 있으므로, 이는 염증을 억압하는데 사용될 수도 있다. 또한, ICAM-3의 작용성 유도체 및 길항 물질도 또한 염증을 억압하는데 사용될 수 있다.
1. 지연형 과민 반응의 억제 인자
ICAM-3은 부분적으로 지연형 과민성 반응과 같은 염증 반응을 개시하는데 필요한 부착 과정을 매개한다. 따라서, ICAM-3에 결합할 수 있는 항체(특히, 단일 클론 항체)는 상기 반응을 약화시키거나 배제하는데 있어 치료적 가능성을 가진다.
이와 다르게, ICAM-3은 ICAM-1/LFA-1 상호 작용의 길항 물질이므로, ICAM-3(특히 가용형) 또는 그 작용성 유도체는 지연형 과민성 반응을 억제하는데 사용될 수 있다.
이러한 잠재적 치료제 용도는 다음 두 방안중 한 방안으로 개발될 수 있다. 첫째로, 항-ICAM-3 단일 클론 항체 또는 ICAM-3의 가용성 유도체를 포함한 조성물은 지연형 과민성 반응을 나타내는 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은 아이비독, 오크독 등과 같은 항원과 접촉한 바 있는 개채에게 제공될 수 있다. 다른 구체예에 있어, ICAM-3에 결합할 수 있는 단일 클론 항체는 후속 염증 반응을 방지하기 위해 항원과 함께 환자에게 투여한다. 따라서, 항-ICAM-3 항체와 함께 항원을 추가로 투여하면 그 항원의 후속 제공에 대해 일시적으로 개체에게 내성을 부여하도록 작용할 수 있다.
2. 만성 염증 질환의 치료
LFA-1이 부족한 LAD 환자는 염증 반응을 개시하지 않으므로, LFA-1의 천연 리간드의 길항 작용도 또한 염증 응답반응을 억제하는 것 같다. 염증을 억제할 수 있는 ICAM-3에 대한 항체의 능력은 동상 홍반성 루푸스, 자가면역 갑상선염, 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE), 다발성 경화증, 일부 당노병 형태, 레이노드 증후군, 류마티스성 관절염 등과 같은 자가면역 질환 및 만성 염증성 질환의 치료에 있어 치료 용도에 대한 근거가 된다. 이러한 항체는 건선 치료시 치료제로서 사용될 수도 있다.
일반적으로, 본 발명의 항-ICAM-3 항체는 현재 스테로이드 치료를 통해 치료가능한 질환의 치료에 단독으로, 또는 항-ICAM-1, 항-ICAM-2 항체, 또는 그 둘다와 함께 투여될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 염증 및 면역 거부 반응은 치료를 요하는 환자에게 염증 억압에 충분한 양의 소염제를 제공함으로써 억압(즉, 방지 또는 약화)될 수도 있다. 적합한 소염제에는 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 ; ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편 ; 거의 순수한 ICAM-3 ; ICAM-3의 작용성 유도체 ; ICAM-3의 비-면역글로불린 길항 물질 또는 LFA-1 외의 ICAM-3의 비-면역글로불린 길항 물질이 포함된다. ICAM-3의 가용성의 작용성 유도체로 구성된 소염제가 특히 바람직하다. 이러한 소염제 치료는 LFA-1에 결합할 수 있는 항체 ; LFA-1의 비-면역글로불린 길항 물질 ; 거의 순수한 ICAM-1 및/또는 ICAM-2 또는 그 유도체, 또는 항-ICAM-1 및/또는 항-ICAM-2 항체 또는 그 단편으로 구성된 그룹중에서 선택된 작용제를 추가로 투여하는 것을 포함할 수도 있다.
본 발명은 면역 억제제가 추가로 환자에게 제공되는, 특이적 방어계의 염증 반응을 억압하는 전술한 방법을 또한 포함한다. 이러한 작용제는 보통 요구되는 양보다 낮은(즉, "최적 용량이하")으로 제공되는 것이 바람직하다. 본 발명 작용제의 상승 효과 때문에 최적 용량이하의 용량을 사용하는 것도 가능하다. 적합한 면역 억제제의 예로는 덱사메타손, 아자티오프린, ICAM-1, ICAM-2 또는 시클로스포린 A가 포함되나 이들로만 국한되지 않는다.
3. 비-특이적 염증의 치료
많은 염증 반응은 "비-특이적 방어계"의 반응에 기인하며 면역적 기억력이 없는 백혈구에 의해 매개된다. 이러한 세포에는 과립구 및 대식구가 포함된다. 본 명세서에서 사용된 "염증"은 비-특이적 방어계의 반응에 의해 야기되거나 매개되거나 관련있는 경우, 비-특이적 방어계의 반응으로부터 초래된 것으로 언급된다. 적어도 일부가 비-특이적 방어계의 반응으로부터 초래된 염증에는 성인성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 패혈증, 외상 또는 출혈에 종속하는 다발성 기관 손상 증후군 ; 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상 ; 급성 사구체 신염 ; 반응성 관절염 ; 급성 염증 부위를 가진 피부병 ; 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추 신경계 염증 질환(예: 발작) ; 열손상 ; 혈액투석 ; 백혈구 제거혈 수혈 ; 궤양성 대장염 ; 크론병 ; 괴사성 소장결장염 ; 과립구 수혈 관련 증후군 ; 및 사이토카인-유발 독성과 같은 상태와 관련된 염증이 포함된다.
본 발명의 소염제는 내피 세포와 과립구상의 CD-18 착물의 상호 작용을 특이적으로 길항할수 있는 화합물이다. 이러한 길항제에는 ICAM-3 ; ICAM-3의 작용성 유도체 ; ICAM-1, ICAM-2, 또는 CD-18 분자족의 일원외에 ICAM-3의 비-면역글로불린 길항 물질이 포함된다.
[B. 기관 및 조직 거부 반응의 억제 인자]
특히, 가용형의 ICAM-3은 CD-18 족 분자의 일원에 대한 항체와 동일한 방법으로 작용할 수 있으므로, 세포 부착-의존성 작용에 의해 야가된 기관 또는 조직 거부 반응을 억압하는데 사용될 수도 있다. 또한, 항-ICAM-3 항체, ICAM-3의 작용성 유도체 및 ICAM-3의 길항 물질도 또한 상기 거부 반응을 억압하는데 사용될 수 있다.
ICAM-3 및 항-ICAM-3 항체는 고체성 기관 또는 조직 거부반응(예, 신장), 비-고체성 기관 거부 반응(예, 골수)을 방지하거나 포유 동물 환자에게 있어, 자가면역 반응을 변형시키는데 사용할 수 있다. ICAM-3을 인지할 수 있는 단일 클론 항체를 상요함으로써 HLA 미스매치를 가진 개체간에도 기관 이식을 수행할 수 있다는 것은 중요하다.
[C. 치료용 또는 진단용으로 투여되는 항원성 물질의 도입을 위한 보조제]
소의 인슐린, 인터페론, 조직-형 플라스미노겐 활성 인자 또는 쥐의 단일 클론 항체와 같은 치료제 또는 진단제에 대한 면역 반응은 이러한 작용제의 치료 또는 진단 효과에 상당한 손상을 주며, 몇몇 경우에는 혈청병과 같은 질환을 유발시킨다. 이러한 증세는 본 발명의 항체를 사용함으로써 치유될 수 있다.
본 발명의 구체예에 있어, 항-13 항체가 치료제 또는 진단제와 함께 투여된다. 항체의 첨가는 수용자가 상기 작용제를 인지하지 못하도록 하므로, 수용자가 이에 대해 면역 반응을 개시하는 것을 방해한다. 이러한 면역 반응이 일어나지 않으므로써 환자는 치료제 또는 진단제를 추가로 투여 받을 수 있게 된다.
ICAM-3(특히, 가용형) 또는 그 작용성 유도체는 질환 치료시 단독으로, 또는 ICAM-1 나 ICAM-2 또는 LFA-1 에 결합할 수 있는 항체와 함께 사용될 수도 있다. 따라서, 용해된 형태의 상기 분자들은 기관 또는 이식 거부 반응을 억제하는데 사용될 수도 있다. ICAM-3 또는 그 작용성 유도체는 치료제 또는 진단제의 면역원성을 감소시키는데 항-ICAM-3 항체와 동일한 방법으로 사용될 수 있다.
[D. 종양 전이의 억압 인자]
본 발명의 작용제는 이동을 위해 CD-18 족의 작용성 일원을 필요로 하는, 조혈성 종양 세포의 전이를 억압하는데 사용될 수도 있다. 본 발명의 본 구체예에 따르면, 상기 치료를 요하는 환자에게 상기 전이를 억제하기에 충분한 양의 작용제(예, ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 ; 상기 항체의 독소 유도체 ; ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편 : 상기 단편의 독소-유도체 ; 거의 순수한 ICAM-3 ; ICAM-3의 작용성 유도체 ; 또는 ICAM-1 또는 ICAM-2 이외에 ICAM-3의 비-면역글로불린 길항 물질)를 제공한다.
본 발명의 추가 구체예에서는, ICAM-3-형질발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 구체적으로, 상기 방법은 치료를 요하는 환자에게 상기 성장을 억압하기에 충분한 양의 작용제를 제공하는 것을 포함한다. 적합한 작용제에는 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 ; 상기 항체의 독소-유도체 ; ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편 ; 상기 단편의 독소-유도체 ; CD-18 분자족의 독소-유도체 일원 ; 또는 CD-18 분자족의 일원의 독소-유도된 작용성 유도체가 포함된다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, LFA-1-형질발현 종양 세포의 성장을 억압하는 방법이 제공된다. 구체적으로, 상기 방법은 치료를 요하는 환자에게 상기 성장을 억제하기에 충분한 양의 독소를 제공하는 것을 포함한다. 적합한 독소에는 독소-유도된 ICAM-3 또는 ICAM-3의 독소 유도된 작용성 유도체가 포함된다.
[E. HIV 감염의 억압 및 HIV 감염된 세포의 전파 방지]
본 발명의 추가 구체예에 있어서, HIV의 감염을 억압하는 방법이 제공된다. 구체적으로, 상기 방법은 HIV-감염된 개체에게 유효량의 HIV 감염 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 특히 HIV-1 감염을 억압하는 방법에 관한 것이지만, 본 방법은 본 발명의 작용제에 의해 억압될 수 있는 방식으로, 세포를 감염시킬 수 있는 임의의 HIV 변형체(예, HIV-2)에도 적용될 수 있다. 이러한 변형체는 본 발명의 목적을 위해 HIV-1와 동동하게 취급된다.
본 발명의 한 양태는 LFA-1 및 몇몇 경우에서는 HIV 감염에 의해 자극된 LFA-1의 결합 리간드의 형질발현은 비감염 세포로 감염된 접촉 시간을 증대시킬 수 있는 세포-세포 부착 반응을 촉진시켜 감염된 세포로부터 비감염 세포로의 바이러스 전이를 용이하게 할 수 있다는 인식으로부터 유래된다. 따라서, LFA-1/리간드 상호작용을 조절할 수 있는 본 발명의 제제는 HIV 및 특히 HIV-1에 의한 감염을 억압할 수 있다. LFA-1/리간드 상호 작용을 억제하는 분자가 HIV 감염을 억압할 수 있는 방법 중 하나는 건강한 T 세포의 CD11/CD18 수용체에 결합할 수 있는, HIV-감염된 세포에 의해 형질발현되는 LFA-1 리간드의 능력을 손상시키는 것이다. 대안 방법으로, FLA-1 리간드 상호작용을 억제할 수 있는 분자는 건강한 T 세포의 LFA-1에 결합할 수 있는 HIV-감염된 세포에 의해 형질발현된 CD11/CD18 수용체의 능력을 손상시킬 수도 있다. CD11a/CD18 수용체 또는 LFA-1 결합 리간드에 결합할 수 있는 세포의 능력에 손상을 주기 위해서는, ICAM-3, ICAM-3의 단편, ICAM-3의 작용성 유도체 또는 항-ICAM-3 항체를 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 제제는 HIV 감염을 억압하기에 충분한 양으로 수용환자에게 제공된다. 이 양은 작용제의 투여 용량, 투여 경로 등이 HIV 감염을 악화시키거나 방지하기에 충분한 것이라면 HIV 감염을 "억압" 하기에 충분한 것으로 언급된다. 이 작용제는 HIV 감염에 노출되거나 HIV 감염에 의해 영향받은 환자에게 제공된다.
본 발명의 작용제는 HIV 감염 치료시 "예방용" 또는 "치료용"으로 사용될 수있다. 예방용으로 제공될 때, 이 작용제는 바이러스 감염 증상에 앞서(예를 들면, 감염이전, 감염시 또는 감염직후) 제공된다. 작용제의 예방용 투여는 후속되는 HIV 감염을 예방하거나 약화시키는 역할을 한다. 치료용으로 제공될 때, 작용제는 바이러스 감염된 세포 검출시(또는 직후)에 제공된다. 작용제의 치료용 투여는 이후 HIV 감염을 약화시키는 역할을 한다.
따라서, 본 발명의 제제는 바이러스 감염 발병전(예상되는 HIV 감염 억제 목적으로) 또는 바이러스 감염된 세포의 실제 검출후(이후 감염의 억제 목적으로)에 제공될 수 있다.
또 다른 양태로, 본 발명은 AIDS에 대한 개선된 치료법, 및 HIV 감염, 특히 HIV-1 감염을 억압하기 위한 향상된 수단을 제공하는데, 그것은 (Ⅰ)ICAM-3, 가용성 ICAM-3 유도체, CD11(CD11a, CD11b 또는 CD11c), 가용성 CD11 유도체, CD18, 가용성 CD18 유도체, 또는 CD11/CD18 헤테로다이머, 또는 CD11/CD18 헤테로다이머의 가용성 유도체, 및/또는 (Ⅱ)ICAM-3에 결합할 수 있는 항체, (Ⅲ)세포 또는 입자와 연계된 CD4 또는 CD4의 가용성 유도체, 및/또는 (Ⅳ)CD4에 결합할 수 있는 분자(바람직하게는 항체 또는 항체 단편)를 공동 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태로, HIV-감염된 세포의 이동을 억합하는 방법이 제공된다. 구체적으로 말하면, 상기 방법은 효과적인 양의 항-이동 작용제를 HIV-감염된 개인에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 항-이동 작용제로는 ICAM-3, ICAM-3의 단편, ICAM-3의 작용성 유도체, 또는 HIV-감염된 T 세포가 LFA-1 리간드에 결합하는 능력을 손상시킬 수 있는 항-ICAM-3 항체가 있다. ICAM-3에 결합하는 항체는 HIV-감염된 T 세포에 의해 발현된 ICAM-3가 CD11/CD18 수용체를 발현시키는 세포에 결합하는 능력을 손상시키기 위해서는, ICAM-3에 결합할 수 있는 항체를 이용하는 것이 가능하다.
본 발명의 작용제는 HIV로 (또는 기타 비루스로) 감염된 T 세포의 이동을 억압하기에 충분한 양으로 수용 환자에게 제공되어져야 한다. 작용제의 투여량, 투여 경로 등이 그러한 이동을 약화시키거나 또는 방해하기에 충분하다면 T 세포의 이동을 "억압하기에" 충분한 양이라고 말한다.
상기 화합물의 투여는 "예방" 또는 "치료"를 목적으로 할 수 있다. 예방용으로 제공될 경우, 본 발명의 작용제는 비루스 감염의 어떠한 증상이 나타나기 전에(예를 들면, 상기 감염의 전에, 감염시에, 또는 감염 직후에, 그러나 상기 감염의 어떠한 증상이 나타나기 전에) 제공된다. 상기 작용제의 예방적 투여는 비루스 감염된 T 세포의 어떠한 후속적 이동도 방해하거나 약화시키는 역할을 한다. 치료용으로 제공될 경우, 상기 작용제는 비루스 감염된 T 세포의 검출시에(또는 검출 직후에) 제공된다. 상기 작용제의 치료적 투여는 상기 T 세포의 어떠한 부가적 이동도 약화시키는 역할을 한다.
따라서, 본 발명의 작용제는 비루스 감염의 발병전에(감염된 T 세포의 예측된 이동을 억압하기 위해) 또는 상기 비루스 감염 세포의 실질적 검출후에 제공될 수 있다.
[F. 천식의 치료]
본 발명의 또 다른 구체 양태로 LFA-1/ICAM-3 상호 작용을 조절할 수 있는 작용제가 천식의 치료에 사용된다. 구체적으로 말하면, 이 방법은 이 치료를 요하는 환자에게 효과적인 양의 항-천식 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 항-천식 작용제는 ICAM-3, ICAM-3 단편, ICAM-3의 작용성 유도체, 또는 세포가 LFA-1에 결합하는 능력을 손상시킬 수 있는 항-ICAM-3 항체가 있다. ICAM-3에 결합하는 항체는 호산구에서 발현되는 ICAM-3가 CD11/CD18 수용체를 발현시키는 세포에 결합하는 능력을 손상시키므로써 호산구의 이동을 억압할 것이다.
본 발명의 항-천식 작용제는 천식 증상의 심도, 정도 또는 지속 기간을 약화시키기에 충분한 양으로 수용 환자에게 제공되어야 한다.
본 발명의 작용제는 단독으로, 또는 하나 이상의 부가적 항-천식 작용제, 예를 들어 메틸크산틴(예: 테오필린), 베타-아드레날린성 작용 물질(예: 카테콜아민, 레소르시놀, 살리제닌 및 에피드린), 글루코코르티코이드(예: 히드로코르티손), 크로몬(예: 나트륨크로몰린) 및 항콜린작용약(예; 아트로핀)을 함께 투여하여 천식 증상을 치료하는데 필요한 상기 작용제의 양을 감소시킬 수 있다.
상기 화합물의 투여는 "예방" 또는 "치료"를 목적으로 할 수 있다. 예방용으로 제공될 경우, 본 발명의 작용제는 천식의 어떠한 증상이 나타나기 전에 제공된다. 상기 작용제의 예방적 투여는 어떠한 후속 천식 반응도 방해하거나 약화시키는 역할을 한다. 치료용으로 제공될 경우, 상기 작용제는 천식 증상의 발병시에(또는 발병 직후에) 제공된다. 상기 작용제의 치료적 투여는 어떠한 실질적 천식 에피소드를 약화시키는 역할을 한다.
따라서, 본 발명의 작용제는 예측된 천식 에피소드의 발병전에(에피소드의 예측된 심도, 지속시간 또는 정도를 약화하기 위해) 또는 상기 에피소드의 개시후에 제공될 수 있다.
[G. 진단 및 예후적 응용]
ICAM-3에 결합할 수 있는 단일 클론 항체를 환자내 ICAM-3 발현 및 염증 부위를 형상화 또는 시각화하는 수단으로 이용할 수 있다. 그러한 용도로, 항-ICAM-3 단일 클론 항체는 방사성 동위원소, 친화성 표지물(예: 비오틴, 아비딘 등), 형광성 표지물 또는 상자성 원자를 사용하여 검출 가능하도록 표지된다.
이러한 표지화를 수행하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 그 후 표지된 항체는 진단학적 형상화에 사용될 수 있다. 진단적 형상화에 있어 항체의 임상적 응용은 문헌[그로스먼, H. B. 의 Urol. Clin. North Amer. 13:465-474(1986), 엉거, E. C. 등의 Invest. Radiol. 20:693-700(1985), 및 코오, B. A. 등의 사이언스 209:295-297(1980)]에 검토되어 있다.
ICAM-3 발현의 존재는 또한 ICAM-3를 발현시키는 세포에 존재하는 혼성화 탐침, 예를 들어 mRNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 ICAM-3 유전자 서열에 또는 ICAM-3 mRNA 서열에 결합하는 합성 올리고누클레오티드 탐침을 사용하여 검출할 수 있다. 그러한 혼성화 분석을 실시하는 기술은 문헌[매니어티스, T. 등의 분자 클로닝, 실험실 매뉴얼, 콜드스프링 하버, 뉴욕(1982), 및 헤임즈, B. D. 등의 헥산 혼성화, 실제적 접근, IRL 프레스, 워싱턴, DC(1985), 본원에 참고로 인용함]에 개시되어 있다.
표지된 항체 또는 핵산 탐침을 사용한 ICAM-3 발현 지점의 검출은 종양 발달의 진단에 사용될 수 있다. 하나의 진단 양태에서, 조직 또는 혈액 샘플을 환자로부터 제거하여 검출 가능하도록 표지되거나 될 수 있는 항체 존재하에 항온처리한다. 바람직한 양태에서 이 기술은 자성 형상화, 형광 사진법 등을 사용하여 비-침해적 방법으로 행해진다. 그러한 진단학적 시험은 기관 이식 수용체(예: 신장)를 잠재적 조직 거부의 초기 신호에 대해 모니터하는 데에 이용할 수 있다. 그러한 분석은 또한 류마티스성 관절염 또는 기타 만성 염증 질환에 대한 개인의 편증을 측정하기 위한 시도로 수행될 수 있다.
예를 들면, 항-ICAM-3 항체 또는 항체 단편을 방사성 표지시키므로써 방사성 면역 분석을 사용하여 항원을 검출하는 것이 가능하다. 방사성 면역 분석(RIA)에 대해 양호한 설명은 "분자 생물학에 있어서 실험실 기술 및 생화학, 워크, T. S. 등, 노오쓰 홀랜드 퍼블리싱 컴퍼니, 뉴욕(1978)"에서 찾을 수 있으며, 특히 "방사성 면역 분석 및 관련 기술에의 소개, 차아드, T" 라는 제목의 장을 본원에 참고로 인용하였다. 한편, 항체는 형광성 화합물, 효소, 또는 당분야에서 공지된 기타 적합한 표지물로 표지시킬 수 있다.
염증 부위를 국부화하는 것 외에도 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체는 체액 분석에 통상 이용되는 배지중의 하나를 사용하여 순환 ICAM-3의 존재에 대해 생물학적 체액을 분석하는데 이용할 수 있다. 체액 샘플내 순환 ICAM-3의 존재는 염증 반응 또는 기타 ICAM-3 매개 생물학적 작용의 표시이다. 또한, 양수내 ICAM-3의 존재는 임신중 생기는 합병증과 관계된다. 임의의 생물학적 체액을 분석에 사용할 수 있다. 그러나, 바람직한 생물학적 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 활액, 양수, 척수액 또는 요(尿)이다.
[Ⅷ 본 발명의 조성물의 투여]
ICAM-3의 치료학적 효과는 전체 ICAM-3 분자, 또는 이것의 치료 활성이 있는 임의 펩티드의 단편을 환자에게 제공하므로써 수득할 수 있다. 특히 관심을 끄는 것은 가용성 ICAM-3의 치료 활성이 있는 펩티드 단편이다.
ICAM-3 및 이것의 작용성 유도체는 재조합 DNA 기술을 사용하여 합성하므로써, 단백질 분해에 의해, 또는 그러한 방법들의 조합에 의해 수득할 수 있다. ICAM-3의 치료학적 이점을 담체에의 결합을 증가시키거나 또는 ICAM-3의 활성을 증가시키기 위해 첨가된 부가 아미노산 잔기를 가지는 ICAM-3의 작용성 유도체를 사용하여 증가시킬 수 있다. 본 발명의 범위는 특정 아미노산 잔기가 결핍되고, 변형된 아미노산 잔기를 가진 ICAM-3의 작용성 유도체를 포함하며, 그것은 이러한 유도체가 ICAM-3의 생물학적 또는 약학적 활성을 소유하거나 또는 상기 활성에 영향을 끼치는 한에 있어서 그러하다.
본 발명의 항체 및 본원에 기술된 ICAM-3 분자는 이들 생성물과 정상적으로 천연적으로 함께 발견되는 물질이 이 생성물을 함유하는 제조물에 거의 없다면, "천연 오염물이 거의 없는" 것이라고 말할 수 있다.
본 발명은 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체, 및 이의 생물학적 활성 단편(복수 클론 또는 단일 클론일 수 있음)도 포함된다. 이런 항체는 동물이나 조직배양, 또는 DNA 재조합법에 의해 생성될 수 있다.
ICAM-3, 또는 ICAM-3에서 유도된 분자는 단독으로, 또는 ICAM-1 또는 ICAM-2와 함께 투여할 수 있다. 항-ICAM-3 항체, 또는 ICAM-3 이나 ICAM-3 에서 유도된 분자에서 결합할 수 있는 다른 분자는 단독으로 투여하거나 또는 항-ICAM-1 항체, 항-ICAM-2 항체, 또는 그 둘다와 함께 투여할 수 있다. 환자에게 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체, 또는 항체 단편을 제공하는데 있어서, 또는 수용환자에게 ICAM-3 (또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체)을 제공할 때, 투여되는 작용제의 투여량은 환자의 연령, 체중, 신장, 성별, 일반적인 의료 조건, 종래의료 경력등과 같은 요인들에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 약 1pg/kg 내지 10mg/kg (환자 체중) 범위내에 항체 투여량을 수용자에게 제공하는 바람직하나, 이보다 적거나 많은 투여량이 투여될 수 있다. 환자에게 ICAM-3 분자 또는 이들의 작용성 유도체를 제공할 때에는 이 분자들을 약 1pg/kg 내지 10mg/kg (환자체중) 범위내의 투여량으로 투여하는 것이 바람직하나 이보다 적거나 많은 투여량으로도 또한 투여될 수 있다. 전술한 바와 같이, 항-ICAM-3 항체가 항-LFA-1 항체, 항-ICAM-1 항체 및 1 또는 항-ICAM-2 항체와 함께 투여된다면, 치료적 유효량은 경감될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 2가지 화합물이 환자의 혈청내에서 동시에 검출될 정도로 그 두 화합물이 거의 동시에 투여된다면, 한 화합물이 제 2의 화합물과 함께 부가적으로 투여된다고 할 수 있다.
ICAM-3에 결합할 수 있는 항체 및 ICAM-3 그 자체는 환자에게 정맥내, 근육내, 피하, 장내, 국소적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 항체 또는 ICAM-3를 주입으로 투여할 때, 연속 주입이나 하나의 환괴 또는 다수 환괴로 투여될 수 있다.
본 발명의 작용제는 "생리적으로 효과적"이기에 충분한 양으로 수용 검체에 제공될 것이다. 그 작용제의 투여량, 투여경로 등이 ICAM-3과 관련된 생리적 영향을 약화시키거나 방지하기에 충분하다면, 그 양은 생리적으로 유효한 것이라고 할 수 있다.
예를 들면, 염증을 억제시키고자 환자에게 제공하는 본 발명의 작용제들중 하나가 염증을 "억압"시키기에 충분한 투여량으로 제공된다면 생리적으로 효과적인 것이라고 할 수 있다.
또한 항-ICAM-3 항체, 또는 이의 단편을 단독으로, 또는 하나 이상의 부가적인 면역억작용제와 함께(특히 기관이나 조직이식을 받는 수용체에게) 투여될 수 있다. 그런 화합물(들)의 투여는 "예방용"이거나 "치료용"일 수 있다. 예방용으로 제공되는 경우, 면역억제성 화합물(들)은 임의의 염증 반응이나 증상이 나타나기 전에 제공된다(예를들면, 기관이나 조직이식 전이나, 이식할때, 또는 이식 직후이지만, 기관 거부의 증상이 나타나기 전에 즉시 제공될 수 있다). 화합물(들)의 예방적 투여는 임의의 연속적인 염증반응(예를 들면, 이식된 기관이나 조직의 거부 등)을 예방하거나 약화시킨다.
치료용으로 제공되는 경우, 그 화합물(들)은 실제적인 염증 증상(예를들면, 기관이나 조직 거부)이 발병될 때(발병후 즉시)제공된다. 그 화합물(들)의 치료적 투여량은 임의의 실제적인 염증(예를들면, 신장과 같은 이식된 고체성 기관이나 조직, 또는 골수와 같은 비-고체성 기관의 거부)을 약화시킨다.
본 발명의 항-염증제는 따라서 염증의 발병 전(예상되는 염증을 억제시키기 위해)이나 염증의 발병 후에 제공될 수 있다. 한 조성물의 투역 수용환자에게 견딜만한 것이라면 그 조성물은 "약학적 허용성"이라고 할 수 있다. 그런 작용제가 투여되는 양이 생리적으로 상당한 양이라면 "치료적 유효량"으로 투여되었다고 할 수 있다. 그런 작용제의 투여가 수용 환자의 생리학에 검출가능할 정도의 변화를 초래한다면 생리학적으로 중요한 것이다.
본 발명의 항체 및 ICAM-3 분자는 약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라 조제될 수 있고, 이로써 이 물질이나 이들의 작용성 유도체는 약학적 허용성 담체 부형제와 혼합될 수 있다. 인간 혈청 알부민과 같은 다른 인체 단백질을 포함하는 적합한 부형제 및 이들의 조제물은 예를들어 문헌[레밍턴의 약제 과학, 제 16 판, Osol, A., Ed., 맥, 이스턴 PA(1980)]에 기술되어 있다. 효과적인 투여에 적합한 약학적 허용성 조성물을 형성하기 위해, 그 조성물들은 적당량의 담체와 함께 본 발명의 작용제를 유효량 함유할 것이다. 또한, 본 발명의 항체는 환자에게 더욱 "약학적 허용성"이 되도록 키메라화 또는 CDR 이식술에 의해 인체화될 수 있다. 항체, 특히 항-ICAM-1 항체를 키메라화하는 방법은 상기 문헌외에도 문헌[미합중국 수리 관청에 1991년 4월 27일 출원된 영국 특허 출원 번호 제 9009548.0호와 제 9009549.8호 및 PCT 출원 번호 PCT/US91/02942 및 PCT/US91/02946]에 기술되어 있으며, 이 문헌들은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
작용의 지속을 조절하기 위해 부가적인 약학적 방법이 사용될 수 있다. 조절 방출형 제제는 본 발명의 작용제를 복합시키거나 흡수시키기 위한 중합체를 사용함으로써 수득될 수 있다. 조절된 전달 속도 및 전달 지속은 적합한 거대분자 매트릭스를 선택하고, 혼입되는 거대분자의 농도, 및 혼입 방법을 변화시킴으로써 임의의 정도로 조절될 수 있다. 조절 방출형 제제에 의한 작용의 지속을 조절하기 위한 또 다른 방법은 본 발명의 작용제를 폴리에스테르, 폴리아미노산, 히드로겔, 폴리(락트산) 또는 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체 물질의 입자내로 혼입시키는 것이다. 또한 이 작용제들을 중합체 입자내로 혼입시키는 대신 이 재료들을 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기법이나 계면중합법에 의해, 또는 젤라틴이나 폴리(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐법에 의해 제조된 미소캡슐이나, 또는 예를 들어 리포좀, 알부민 미소구, 미세유탁액, 나노입자, 및 나노캡슐과 같은 콜로이드성 약제 전달계, 또는 거대 유탁액내에 포획시킬 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 항 염증제(ICAM-3에 결합시킬 수 있는 항체; ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편 ; ICAM-3 ; ICAM-3의 작용성 유도체; 또는 ICAM-1 및 ICAM-2 이외의 다른 ICAM-3의 비-면역글로불린 길항제), 및 (b) 하나 이상의 면역억작용제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 적합한 면억억작용제의 예로는 덱사메타손, 아자티오프린 및 시클로스포린 A를 포함한다. 지금까지 본 발명을 일반적으로 기술하였고 본 발명을 제한하는 것이 아니라 구체적으로 예시하기 위해 제공된 하기 실시예를 참조함으로써 본 발명의 작용제 및 이를 수득하는 방법을 더욱 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
[실시예 1]
[LFA-1에 대한 새로운 부착 리간드인 ICAM-3의 특징 규명]
LFA-1 피복된 평판에 세포주 및 림프구의 부착(더스틴 등, 콜드스프링 하버 Symp. Qunat. Biol. 54:753-765(1989))은 종래 기술된 바와 같이 실행되었다. JY 용해물로부터 정제된 LFA-1을 96 웰의 미량역가 평판(Linbro-titertek) 위의 1100 부위/ ㎛2에 흡착시켰다. 비-특이적인 결합 부위는 1% BSA로 차단시켰고 PBS / 5% FBS / 2mM MgCl2/ 0.5% HSA (분석액)으로 세정했다.
LFA-1의 특이적인 억제는 TS1 / 22 (항-LFA-1α) 복수(ascites)의 1/200 희석액과 함께 미량역가 웰을 RT 에서 30분 동안 항온 배양함으로써 수득되었다. 휴지기의 T 세포는 총혈액으로부터 플라스틱 부착법 및 나일론울 여과법에 의해 분리되었고 91% CD2+였으며, 이에 반해 PHA-아세포는 세포를 10㎍ / ml 파이토헤마글루티닌(PHA)의 존재하에 배양함으로써 생성되었다. 세포를 형광색소 BCECF(Molecular Probes Inc.)로 표지하고, 세정한 뒤 분석액내에 재현탁시켰다. 세포의 MAb 예비처리는 105세포를 각 웰에 전이시킨 후 1/200 복수 희석액과 4℃에서 45분간 항온처리함으로써 이루어졌다. 37℃에서 1 시간동안 고상 LFA-1에 세포주를 부착시켰고, 비-부착성 세포를 6개의 23 게이지 침 흡인술로 제거했고, 림프구는 30xg 에서 5분 동안 회전시킨 후 37℃에서 30분 동안 항온 배양했다.
평판에서 배지를 8회 100φ로 가볍게 쳐서 비결합된 림프구를 각 세정 사이 마다 첨가했다. 평판을 가볍게 침으로써 크기가 작아 제거하기가 더욱 어려웠던 비결합된 T 림프구를 철저히 제거하는데 더욱 효과적이었다. 형광성 농도 분석기(Baxte)를 사용함으로써 96 웰 평판으로부터 형광성이 직접 정량되었다. 모든 MAb는 포화 농도(1/200 복수 희석액)로 사용했고, TS1 / 22(항-CD 11a, 1gG1)(산체즈-마드리드 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 79:7489-7493(1982)), RR 1 / 1(항-ICAM-1, IgG1)(로들라인 등, J. Immunol. 137:1270-1274(1986)), CBR-IC 2/ 2 (항-ICAM-2, IgG2a)(드 푸거로울즈 등, J. Exp. Med. 제출됨(1991)(출판증)), 및 CBR-IC 3 / 1(항-ICAM-3, IgG1)을 포함한다. CBR-IC 3 / 1 은 SKW 3-주입된 Balb / c 생쥐로부터의 비장 세포와 쥐의 골수종 P3 × 63 Ag 8.653의 융합에 의해 유도되었고(게프터 등. Som. Cell Gen. 3:231-236(1977)), 정제된 LFA-1에 대한 SKW3 결합을 억제하는 능력에 대해 600 개의 하이브리도마를 검색했다. CRB-IC 3 / 1은 정제 LFA-1에 대해 반응하지 않았고, ICAM-1, ICAM-2 또는 LFA-1 cDNA로 형질감염된 COS 세포에도 반응하지 않았다(데이타는 제시되지 않았음). 4가지 대표적인 실험중 하나를 나타내었고 오차 막대는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
[실시예 2]
[세포의 ICAM-, ICAM-2, 및 ICAM-3 형질 발현의 유동 세포 측정 분석법]
사용된 세포주는 모두 문헌[힙스 등, J. Clin. Invest. 85 : 674-681(1990))에 기술되어 있다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 덱스트란 침강법 및 피콜-하이패크(Ficoll-Hypaque)(1.077) 원심분리법에 의해 수득되었고, 이 방법은 문헌[더스틴 등, J. Cell. Biol. 107 : 321-331(1988)]에 기술되어 있다. 호중구는 세포 펠렛으로부터 회수되었고 오염물인 적혈구는 저장성 용해로 제거되었다. 림프구 및 단구는 전방 및 수직의 광 산란기를 사용하여 세포측정 분석법으로 림프구 및 단구를 분리했고 단구 및 T 세포 특이적인 MAb에 의해 확인되었다. 플라스틱-부착성은 PBMC에서 림프구를 증식시키는데 사용되었고 세포는 10㎍ / ml 파이토헤마글루티닌(PHA)의 존재하에 배양되었다. 샘플을 EPICS V 유동 세포 측정기를 사용하여 분석했고, 세포 측정기의 눈금을 정(定)하기 위한 EPICS Immune-Brite 형광 비이드(Coulter)를 사용하여 형광성을 정량 분석했다. 휴지기 림프구 상에서 ICAM-3의 형질 발현은 CD3 이나 LFA-1 보다 2-3배 더 컸고 단구는 LFA-1보다 3-4배 더 많은 ICAM-3을 형질 발현했다. 호중구상에서 ICAM-3의 형질 발현 양은 Mac-1(CD11b / CD 18)의 것과 동일하였다. 포스포리파제 C 에 의한 세포의 처리는 존재하는 ICAM-3의 PI-연결된 형태를 전혀 나타내지 않았다.
* 재료 및 방법에서 요약된 면역형광 유동 세포 측정법에 의해 측정된 막 형질 발현. 값은 2회 이상의 실험에 의한 측정값이다. 1 유니트가 약 103플루오레세인 당량이 되도록 세포측정기의 눈금을 정하는데 형광비이드를 사용했다(Coulte Diagnostics, Hialeah, FL).
** 기타 세포주로는 인간 제정맥 내피세포, huvec ; 인간 유방암, Hep G2 ; 인간 유상피 암세포주, HeLa ; 인간 횡문근육종, RD 3 / 5 ; 인간 섬유성육종, 및 FS 1,2,3 ; 인간 신경 고아종을 포함한다.
[실시예 3]
[ICAM-3의 면역 침강법]
125I에 의한 세포의 표면 표지화는 요오도겐을 사용하여 문헌[키시모토 등, J. Biol. Chem. 264 :3588(1989)]에 기술된 바와 같이 실행했다. 세포를 트리톤 × -100(1%)으로 용해시켰다. 이 용해물을 소 1gG 결합된-세파로즈로 예비세정한 다음, 적절한 MAb- 결합된 세파로즈와 함께 2시간동안 항온 처리했다. 비이드를 세정하고 50mM 트리스, 1% SDS 및 1% 2-머캅토에탄올을 함유하는 샘플 완충액중에서 가열처리했다. 비환원성 샘플은 2-머캅토에탄올이 결실된 완충액중에서 가열처리한 다음 20mM 요오드아세트아미드로 처리했다. 샘플은 문헌[라엠리, U. K., 네이쳐 227:680-685(1970)]에 기술된 바와 같이 7% 수직 슬랩 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석했고, 단백질을 자동방사능 사진술로 시각화했다. 문헌[타렌티노 등, 생화학 24 ; 4665-4671(1985)]에 기술된 바와 같이 농도(10 유니트/ml, 37℃, 18h)를 사용하여 N-글리카나제(Genzyme)로 샘플을 처리하면 펩티드 골격에서 N-결합된 올리고당 모두를 절단시키는데 최적인 것으로 측정되었다. MHC 1 군은 N-결합된 탄수화물을 포함하는 반면, ICAM-2 (mr60,000, 6개 N-결합부위, 골격의 Mr 28,383)는 고도로 당부가되어 있다.
[실시예 4]
[ICAM-3의 분포]
본 발명의 항-ICAM-3 항체가 유동세포 측정기를 사용하여 ICAM-3 단백질의 조직내 분포를 측정하기 위하여 사용되었다. 표 3은 ICAM-3의 표면 형질발현을 나타내는 세포 종류를 요약한 것이다. ICAM-3의 형질발현은 조혈성 세포에 제한되는 것으로 나타난다. 유동 세포측정 데이타는 표지된 항-ICAM-3 항체를 사용하여 조직 절편의 면역조직 화학적 염색법을 실행함으로써 확인되었다. 유동 세포측정 데이터에서와 같이, 면역조직화학 연구는 ICAM-3 형질 발현이 조혈성 세포에 제한되는 것으로 나타남을 증명했다.
* 재료 및 방법에서 요약된 면역형광 유동 세포 측정법에 의해 측정된 막 형질 발현. 값은 2회 이상의 실험에 의한 측정값이다. 1 유니트가 약 103플루오레세인 당량이 되도록 세포측정기의 눈금을 정하는데 형광 비이트를 사용했다(Coulte Diagnostics, Hialeah, FL).
** 기타 세포주로는 인간 제정맥 내피세포, HUVEC ; 인간 유방암, Hep G2 ; 인간 유상피 암세포주, HeLa ; 인간 횡문근육종, RD 3 / 5 ; 인간 섬유성육종, 및 FS 1,2,3 ; 인간 신경 교아종을 포함한다.
[실시예 5]
[ICAM-3의 정제]
ICAM-3은 항-ICAM-3 항체 CBR-IC 3 / 1이 당업계에 공지된 방법으로 매트릭스상에 고정화된 면역친화성 크로마트그래피를 사용함으로써 정제되었다. ICAM-3을 분리하는 출발 물질로서 수 많은 원천이 사용되어 왔다. 이 출발 물질로는 비제한적으로 SKW3, 인간 흉선종 세포주, 및 인간 편도를 포함한다. ICAM-3을 정제하는데 사용된 방법은 거의 문헌[드 푸거로울즈 등의 J. Exp. Med. 175 : 185-190(1992)]에 기술된 것이다. 당업자들은 세척 및 용출 시약이 정제될 각 항원과 면역친화성 크로마토그래피에 사용될 각 항체마다 조금씩 달라진다는 것을 인지하고 있을 것이다.
하기에 언급하는 바와 같이, SKW3 세포 또는 인간 편도 세포로부터 정제된 ICAM-3 은 약 120 내지 124 kD의 분자량을 갖는 것으로 나타나는 반면, 호중구 유래의 용해물로부터 정제된 ICAM-3은 약 120 내지 150 kD의 분자량을 나타내는 넓은 밴드를 산출했다.
이런 방식으로 정제된 ICAM-3은 다양한 세포상의 항-ICAM-3 항체, 및 LFA-1에 결합하는 능력을 유지하는 것으로 밝혀졌다(제 6 도 및 제 7 도).
[실시예 6]
[여러가지 분자량을 지닌 ICAM-3의 동정]
면역 침강법 및 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의한 분석은 다양한 세포 종류에 있어서의 ICAM-3의 분자량을 측정하는데 사용되었다. 호중구로부터 면역침전된 ICAM-3의 분자량은 림프구로부터 면역침강된 것과는 다른 것으로 밝혀졌다. 림프구 및 림프구 유사 세포주에서 분리된 ICAM-3은 약 120 내지 124kD의 분자량을 지닌 밴드로서 나타난다. 호중구에서 분리된 ICAM-3의 분자량은 림프구 유사 세포에 의해 형질 발현된 것보다 다소 높았고, 약 120 kD 내지 150 kD의 확산 밴드로서 나타났다(제 4 도).
상기의 크기 변화는 당단백질의 ICAM 족의 일원에서는 일반적이지 않은 것이다. ICAM-1은 분자량에 있어서 유사한 변이를 상이한 세포 유형 사이에서 입증한다. ICAM-1에서 나타난 분자량의 변화는 당부가의 정도가 변화함으로써 유발되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, ICAM-3의 분자량의 변화도 당부가의 차이로 인해 유발될 가능성이 가장 많다. 당업자라면 호중구에서 분리된 ICAM-3을 다양한 글리코시다제 및 기타 효소 처리하고, 이것이 분자량에 미치는 영향을 관찰함으로써 쉽게 확인할 수 있다.
ICAM-1의 당부가 정도에 따른 변화는 MAC-1(CD 11b / CD 18) 결합에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 따라서, ICAM-3의 당부가의 정도를 변화시킴으로써, ICAM-3의 여러가지 리간드에 결합하는 변형된 친화성을 갖는 ICAM-3 유도체를 생성시킬 수 있으며, 예를 들면 당단백질의 CD11 / CD18 족의 일원이다.
[실시예 7]
[ICAM-3 항체]
전술한 바와 같이 SKW3 또는 편도 세포로부터 정제된 ICAM-3 단백질 및 보조제 혼합물을 생쥐에게 주입시켰다. 면역화된 동물의 단일 클론 항체는 당업계에 공지된 절차를 사용함으로써 생성되었다.
표 4는 수득된 여러가지 항-ICAM-3 항체를 요약한 것이다. 다수의 항체들은 ELISA에 의해 정제된 고정 ICAM-3에 반응하는 능력에 근거하여 동정되었다. 양성 mAb는 ICAM-3 양성인 것으로 주지된 여러가지 세포주 상에서 검색되었고 그 다음 방사능 표지된 ICAM-3 양성 세포 용해물에서 면역침강되었다. mAb는 또한 항-ICAM-1 및 항 ICAM-2 항체의 존재하에 PMA-유도된 SKW3 세포 응집을 차단하는 능력에 대해 시험되었다. 또한, 항-ICAM-3 항체는 고정화된 정제 ICAM-3에 SKW3 세포의 결합을 억제하는 능력에 의해 동정될 수 있다.
LFA-1의 제 3의 리간드가 존재한다는 증거들 중 하나는 PMA-자극된 SKW3 세포 응집에 대한 ICAM-1 / ICAM-22 독립적인 경로의 존재이다. 본 발명자들은 이런 응집을 생쥐 항-ICAM-3 복수클론 항혈청이나 CBR-IC 3 / 1 및 CBR-IC 3 / 2 의 혼합물로 차단시킬 수 있었다.
[실시예 8]
[항-ICAM-3 항체를 사용한 면역학적 분석]
항-ICAM-1 항체(RR 1 / 1), 항-ICAM-2 항체(CBR-IC 2 / 2) 및 항-ICAM-3 항체(CBR-IC 3 / 1 및 CBR-IC 3 / 2의 혼합물)를 (1) 정제된 ICAM에 대한 PMA-자극된 SKW3 세포 부착성 ; (2) 세포 분열에 대한 파이토헤마글루티닌(PHA)의 자극, 및 (3) 혼합된 림프구 반응(MLR)을 차단하는 능력에 대해 시험했다.
PMA는 LFA-1을 활성화시킬 수 있으며, 이로써 ICAM-1에 결합하는 능력을 증가시킨다는 것이 종래 밝혀진 바 있다(더스틴 등, 네치쳐 341:619(1989)). 제 5도는 유사한 활성화 기작이 LFA-1 / ICAM-3 결합시에 존재한다는 것을 나타낸다.
정제된 ICAM-1 및 ICAM-3에 대한 PMA 자극된 SKW3 세포의 결합을 차단시키는 여러가지 항체들의 능력에 대해 조사했다(제 6 도). 항체 CBR-IC 3 / 1 및 CBR-IC 3 / 2가 단독으로 존재할 때에는 정제된 ICAM-3에 대해 PMA 자극된 SKW3 세포의 결합을 효과적으로 차단시키지 못한다. 그러나, ICAM-3에 대한 PMA 자극된 SKW3 세포 결합은 상기 2가지 항체의 혼합물을 사용할 때 차단될 수 있다. 문헌[드푸거로울즈의 J. Exp. Med.]에 공지된 바와 같이, CBR-IC3/1 단일 클론 항체 그 자체는 정제된 LFA-1 에 대한 ICAM-3의 결합을 차단시킬 수 있었다.
ICAM-3에 대해 PMA 자극된 SKW3 세포의 결합은 이것이 온도 의존적인지 양이온 의존적인지를 결정하기 위해 추가 분석되었다. ICAM-1에서와 같이, ICAM-3 / LFA-1 결합은 온도 의존적(제 8 도) 및 양이온 의존적(데이타 제시되지 않음)인 것으로 밝혀졌다.
제 9 도는 세포 분열의 PHA 자극에 대한 여러가지 항체들의 효과를 요약한 것이다. 종래 공지된 바와 같이(크렌스키 등. J. Immunol. 131:611-616(1983)), PHA는 항-ICAM-1 항체내의 항-LFA-1으로 억제될 수 있는 방식으로 세포 증식을 자극하나, 항-ICAM-2 항체, 또는 항-ICAM-1 및 항-ICAM-2 항체의 혼합물은 PHA 자극된 세포 분열에 거의 영향을 미치지 않았다. 그러나, 1) 항-ICAM1, 항-ICAM-2, 및 항-ICAM-3 항체의 혼합물, 2) 2가지 항-ICAM-3 항체(IC3/1 및 IC3/2) 및 3) 항-ICAM-1 및 항-ICAM-3 항체의 혼합물은 PHA 자극된 세포 분열을 차단하는데 효과적이었다.
[실시예 9]
[혼합된 림프구 반응]
MLR 분석은 면역학적 반응성을 평가하는데 사용된다. 그 분석은 기본적으로 여러 개체(반응 세포)로부터 PBL을 함유하는 용액에 화학적으로 고정된 외래 세포(자극 세포)를 첨가하고, 지표로서 반응 세포의 증식을 사용하여 반응성의 정도를 측정하는 것을 포함하며, 종래 공지된 바 있다(크렌스키 등, J. Immunol. 131:611-616(1983)]. 이 분석법은 이식 거부를 치료하는데 유용한 조성물을 동정하는데 있어서의 제 1 단계이다.
MLR 반응에 대한 여러가지 항체 및 항체 혼합물의 효과는 제 10 도에 제시되어 있다. 요약하자면, 항-ICAM-3 단독 사용의 경우 낮은 효과를 나타냈다. 그러나, 항-ICAM-1 과 항-ICAM-3 항체 혼합물을 사용하면 MLR을 차단하는데 커다란 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 수득되는 가장 높은 반응은 항-ICAM-1, 항-ICAM-2 및 항-ICAM-3 항체의 혼합물을 사용할때였다.
[실시예 10]
[ICAM-3의 펩티드 서열]
실시예 5에 기술된 바와 같이 면역친화성 크로마토그래피에 의해 인간 편도 세포로부터 ICAM-3을 정제했다. 정제된 ICAM-3은 공지된 방법으로 Lys-C 효소로 효소적으로 절단시키고 펩티드 단편을 HPLC로 분리했다. 제 11 도는 일반적인 분해에서 관찰된 여러가지 단백질 피크를 기체 크로마토그래피로 나타낸 것이다. 피크 10 및 17은 서열 결정될 충분한 크기 및 구조의 펩티드 단편을 포함하는 것으로서 확인되었다(이후에는 각각 NK-10 및 NK-17 펩티드로 명명).
NK-17 및 NK-10 펩티드의 아미노산 서열은 표준 절차를 사용하여 측정했다. NK-10 단백질의 서열은 KIDRATCPQHLK(서열 동정 번호 1)인 것으로 밝혀졌다. 이 서열에서 표시된 제1의 리신(K) 잔기는 Lys-C 가 리신잔기 다음의 단백질을 절단하므로 존재하는 것으로 추정되었다.
NK-17 펩티드의 서열은 KIALETSLSK(서열 동정 번호 2)인 것으로 밝혀졌다. NK-10 단백질에서와 같이, 제 1의 리신 잔기가 추정되었고, 그후에 DNA 서열 분석으로 확인되었다.
공지된 ICAM-1 및 ICAM-2 서열과 NK-10 및 NK-17 단백질의 서열 비교는 높은 상동성을 나타냈다. NK-17 펩티드는 ICAM-2의 제 1의 Ig 도메인내에 함유된 서열에 대해 상당한 상동성을 나타낸다. NK-10 펩티드는 ICAM-1의 도메인 4내의 서열에 대해 약한 상동성을 나타낸다.
[실시예 11]
[ICAM-3의 cDNA 클로닝]
퇴화성 올리고뉴클레오티드 탐침은 상기 수득한 펩티드 서열을 기초로 하여 생성되었다. 그 탐침은 ICAM-1 및 ICAM-2 뉴클레오티드 서열내에서 관찰된 상기 동정된 코돈 선호도를 포함하도록 추가 고안되었다. NK-17 및 NK-10 단백질의 아미노산 서열을 기초로한 탐침의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
NK-17 프로브. 2N(이노신)을 함유하는 24배 퇴화도를 지닌 올리고 23 합체.
NK-10 탐침. 5N(이노신)을 함유하는 8배 퇴화도를 지닌 25 합체.
cDNA 형질 발현 라이브러리는 전술한 바와 같이 편도 RNA로부터 생성되었다(웡 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 82:7711-7716(1985)). 그 라이브러리는 UK-17 프로브를 사용하여 검색했고, 양성 혼성화를 나타내는 플라크를 NK-10 탐침을 사용하여 재검색했다. 하나의 클론인, 클론 11.2가 1.6 내지 1.8kb 길이의 삽입물을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다. 클론 11.2의 도식적 표현과 NK-10 및 NK-17 펩티드의 위치를 제 12 도에 나타낸다.
삽입물의 말단은 인접 벡터에서 유래된 프라이머를 사용하여 당업자에게 공지된 절차로 서열결정했고, 이에 반해 NK-10 탐침은 내부 서열 결정용 프라이머로서 사용되었다. 이렇게 하여 수득된 것은 한 가닥 상에서만 판독된 서열을 제공한다. 당업자라면 그런 서열이 통상의 실험으로 확인될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.
제 18 도에 제시된 것은 상기 수득된 서열을 요약한 것이다. 그 서열로 여러가지 사실을 알 수 있다. 첫째, ICAM-1의 횡단막 영역과 높은 상동성을 지닌 서열이 동정되었다. 따라서, ICAM-3의 가용성 단편을 생성하고자 한다면 제 12도에 제시된 횡단막 영역의 출발후 모든 서열을 결실시켜야 할 것이다. 둘째, 클론 11.2의 5' 말단에서 수득된 서열은 ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3 사이에 존재하는 서열 상동성에 의해 추정되는 바와 같이 자연 발생적인 유전자의 5' 말단과 매우 가깝다는 것이다.
[실시예 12]
[여러가지 ICAM 분자 사이의 서열 상동성]
상기 수득한 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 NK-10 및 NK-17 펩티드의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 ICAM-1 및 ICAM-2의 공지된 서열과 비교했다(제 13-17 도).
그 결과는 ICAM-3이 ICAM-1 및 ICAM-2와 높은 상동성을 나타낸다는 것을 보여준다. ICAM-1 및 ICAM-3 사이의 서열 상동성은 ICAM-1의 횡단막 도메인 및 세포질 도메인의 일부(제 13 도 및 제 14 도) 뿐만 아니라 ICAM-1의 제 1 도메인(제 16도) 및 제 4 / 제 5 도메인내에서 발견되었다. 유전자 은행의 데이타 베이스를 추가 탐색하였으나 ICAM-3에서 수득된 것과 동일하거나 유사한 다른 서열은 전혀 밝혀지지 않았다. ICAM-3과 ICAM-2의 제 1 도메인사이에 현저한 상동성이 관찰되었다(제 17 도). 클론 11.2는 라이브러리를 추가 검색하는데 사용되었다. 약 2 내지 2.4kD의 cDNA 삽입물을 수득하기 위해 추가의 클론이 탐색되었다. 지금까지 보다 큰 크기가 동정되지 않았으므로 이들이 총 길이의 cDNA 클론을 나타내는 것으로 추정된다.
서열 목록
(1) 일반적 정보 :
(ⅰ) 출원인 : 드푸거로울즈, 안토닌 알
스프링거, 티모씨 에이
(ⅱ) 발명의 명칭 : 세포간 부착 분자-3 및 이의 결합 리간드
(ⅲ) 서열수 : 6
(ⅳ) 주소 :
(A) 수신인 : 스턴, 케슬러, 골드스타인 앤드 폭스
(B) 스트리트 : 노오쓰 웨일즈, 콘네티컷 애비뉴 1225
(C) 도시 : 워싱톤
(D) 주 : 디. 씨.
(E) 국가 : 미합중국
(F) 우편번호 : 20036
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 형태 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : Patent In Release #1,0, 버젼 #1.25
(ⅵ) 현출원인 데이타 :
(A) 출원번호 : US
(B) 출원일 : 1992 년 6월 11일
(C) 분류
(ⅶ) 종래 출원 데이타 :
(A) 출원 번호 : US 07/712,879
(B) 출원일 : 1991 년 6월 6일
(ⅷ) 변리사 / 대리인 정보 :
(A) 성명 : 폭스, 사무엘 엘.
(B) 등록번호 : 30,353
(C) 참조 / 도켓 번호 : 1101.069PC01
(ⅸ) 통신 정보 :
(A) 전화 : (202) 833-7533
(B) 팩스 : (202) 833-8716
(2) 서열 동정 번호 1에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 152 염기쌍
(B) 종류 : 헥산
(C) 가닥수 : 2가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자 종류 : DNA
(ix) 특징 :
(A) 명칭/주요어 : CDS
(B) 위치 : 2..152
(xi) 서열 설명 : 서열 동정 번호 1 :
(2) 서열 동정 번호 2에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 50 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자 종류 : 단백질
(xi) 서열 설명 : 서열 동정 번호 2 :
(2) 서열 동정 번호 3에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 189 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥수 : 2가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자 종류 : DNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 / 주요어 : CDS
(B) 위치 : 2..189
(xi) 서열 설명 : 서열 동정 번호 3 :
(2) 서열 동정 번호 4에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 62 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자 종류 : 단백질
(xi) 서열 설명 : 서열 동정 번호 4 :
(2) 서열 동정 번호 5에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 113 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥수 : 2가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자 종류 : DNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 / 주요어 : CDS
(B) 위치 : 1..113
(xi) 서열 설명 : 서열 동정 번호 5 :
(2) 서열 동정 번호 6에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 37아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자 종류 : 단백질
(xi) 서열 설명 : 서열 동정 번호 6 :

Claims (49)

  1. a) 도 18a의 아미노산 서열;
    b) 도 18b의 아미노산 서열; 및
    c) 도 18c의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 하나이상을 포함하는 ICAM-3.
  2. a) 도 18a의 아미노산 서열;
    b) 도 18b의 아미노산 서열; 및
    c) 도 18c의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 하나이상을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며 ICAM-3을 암호할 수 있는 재조합 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 18a, 18b 및 18c의 아미노산 서열을 암호하는 재조합 핵산 분자.
  4. 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자가
    a) 도 18a의 뉴클레오티드 서열;
    b) eh 18b의 뉴클레오티드 서열; 및
    c) 도 18c의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열 하나 이상을 포함하는 재조합 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 재조합 핵산 분자가 클론 11.2인 재조합 핵산 분자.
  6. 세포의 ICAM-3 매개 생물학적 작용을 조절하는 방법으로서, 상기 작용 조절을 요하는, 사람을 제외한 포유류 환자에게 유효량의 ICAM-3 조절 제제를 제공하는 것을 포함하며, 이때 상기 ICAM-3 조절 제제가 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체, ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, 및 ICAM-3로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 ICAM-3 매개 생물학적 작용이 염증 반응이며, 상기 ICAM-3 조절 제제를 상기 염증을 억압하기에 충분한 양으로 상기 사람을 제외한 포유류 환자에게 제공하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 염증 지연형 과민 반응, 건선 증상, 자가면역 질병, 기관 이식편, 또는 조직이식 거부로 구성된 군에서 선택된 상태에 반응하는 특이 염증 반응인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 기관 이식편이 고체성 기관 이식편인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 기관 이식편이 신장 이식편인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 기관 이식편이 비(非)고체성 기관 이식편인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 비(非)고체성 기관 이식편이 골수 이식편인 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 자가면역 질병이 레이노드(Reynaud) 증후군, 자가면역 갑상선염, 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE), 다발성 경화, 류마티스성 관절염 및 동상 홍반성 루푸스로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 염증 반응이 성인성 호흡 곤란 증후군(ARDS); 패혈증, 외상 또는 출혈에 종속하는 다발성 기관 손상 증후군; 심근 조직 및 기타 조직의 재관류손상; 급성 사구체신염; 반응성 관절염; 급성 염증 부위를 가진 피부병; 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추 신경계 염증 질환(예: 발작); 열 손상; 혈액 투석; 백혈구 제거혈 수혈; 궤양성 대장염; 크론병; 괴사성 소장 결장염; 과립구 수혈 관련 증후군; 및 사이토카인-유도 독성으로 구성된 군에서 선택된 상태에 반응하는 비(非)특이적 염증 반응인 방법.
  15. 제6항에 있어서, 상기 ICAM-3 매개 생물학적 작용이 조혈성 종양 세포, 즉 이동을 위해 CD-18족의 작용성 일원을 필요로 하는 세포의 전이이며, 상기 제제가 상기 전이를 억압하기에 충분한 양으로 사람을 제외한 포유류 환자에게 제공되는 방법.
  16. 제6항에 있어서, 상기 ICAM-3 매개 생물학적 작용이 비루스 감염된 백혈구의 혈관외 이동이며, 상기 ICAM-3 조절 제제를 상기 백혈구를 가지는 사람을 제외한 포유류 환자에게 상기 백혈구의 이동을 억압하기에 충분한 양으로 투여하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 비루스 감염된 세포가 HIV로 감염된 것인 방법.
  18. 제6항에 있어서, 상기 ICAM-3 매개 생물학적 작용이 천식 반응과 관계된 세포의 이동이며, 상기 ICAM-3 조절 제제를 천식과 관계된 세포의 이동을 억압하기에 충분한 양으로 사람을 제외한 포유류 환자에게 제공하는 방법.
  19. HIV에 의한 백혈구의 감염을 억압하는 방법으로서, HIV에 노출되거나 감염된 사람을 제외한 포유류 환자에게 유효량의 HIV-1 감염 억압 제제를 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 제제는 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체, 이 항체의 독소 유도체, ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, 상기 단편의 독소 유도체, 및 ICAM-3로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 HIV가 HIV-1인 방법.
  21. ICAM-3 발현 종양 세포의 증식을 억압하는 방법으로서, ICAM-3 발현 종양 세포의 증식 억압을 요하는, 사람을 제외한 포유류 환자에게 상기 증식을 억압하기에 충분한 양의 독소를 제공하는 것을 포함하며, 이때 상기 독소가 ICAM-3에 결합할 수 있는 항체, 이 항체의 독소 유도체, ICAM-3에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, 및 상기 단편의 독소 유도체로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  22. LFA-1 발현 종양 세포의 증식을 억압하는 방법으로서, LFA-1 발현 종양세포의 증식 억압을 요하는, 사람을 제외한 포유류 환자에게 상기 증식을 억압하기에 충분한 양의 독소를 제공하는 것을 포함하며, 이때 상기 독소가 독소 유도된 ICAM-3인 방법.
  23. 제6항에 있어서, LFA-1에 결합할 수 있는 항체, LFA-1에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, ICAM-1에 결합할 수 있는 항체, ICAM-1에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, ICAM-2에 결합할 수 있는 항체, ICAM-2에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제제의 투여를 부가적으로 포함하는 방법.
  24. 제6항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 소장 경유 수단, 비경구적 수단, 국소적 수단, 흡입 수단 또는 비강 경유 수단에 의해 투여되는 방법.
  25. 제6항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 예방용으로 투여되는 방법.
  26. 제6항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 치료용으로 투여되는 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 비경구적 수단이 근육내, 정맥내 또는 피하적 수단인 방법.
  28. 제6항에 있어서, 면역 억제제를 부가적으로 투여하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 하나 이상의 다른 면역 억제제를 함께 투여하는 방법.
  30. ICAM-3에 결합할 수 있으며 검출 가능하도록 표지된 형태인 항체 분자 또는 이것의 단편을 포함하는 ICAM-3 검출용 진단 조성물.
  31. (a) 엄격한 조건(stringent condition)하에서 ICAM-3 mRNA에 혼성화될 수 있으며 도 18a, 18b 또는 18c에 나타난 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함하는 핵산 분자의 존재하에 세포 또는 세포 추출물을 항온 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 핵산 분자가 상기 세포에 또는 상기 세포 추출물에 존재하는 상보적인 핵산 분자에 혼성화되었는지를 결정하는 단계를 포함하는, ICAM-3을 발현시키는 세포의 존재를 검출하는 방법.
  32. (a) ICAM-3을 발현시키는 세포에 결합할 수 있는 항체, 또는 이것의 단편을 포함하는 조성물과 함께 사람을 제외한 포유류 환자의 조직 샘플을 항온 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 세포에 결합된 상기 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 사람을 제외한 포유류 환자내 염증을 진단하는 방법.
  33. (a) ICAM-3에 결합할 수 있는 항체, 또는 이것의 단편을 포함하는 조성물과 함께 포유류 환자의 요(尿) 체액 샘플을 항온처리하는 단계 ; 및
    (b) 상기 요에 결합된 상기 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 포유류 환자에게서 채취한 요 샘플내의 ICAM-3의 존재를 확인하는 방법.
  34. LFA-1에의 ICAM-3의 결합을 조절할 수 있는 제제를 동정하는 방법으로서, 상기 제제의 존재하에 ICAM-3을 LFA-1과 접촉시키는 단계, 및 ICAM-3/LFA-1 결합의 조절을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 LFA-1과 상기 ICAM-3이 자연적으로 존재하는 오염물이 없도록 정제된 것인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 LFA-1이 세포 표면상에서 발현되고, 상기 ICAM-3이 자연적으로 존재하는 오염물이 없도록 정제된 것인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 ICAM-3이 세포 표면상에서 발현되고, 상기 LFA-1이 자연적으로 존재하는 오염물이 없도록 정제된 것인 방법.
  38. 제19항에 있어서, LFA-1에 결합할 수 있는 항체, LFA-1에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, ICAM-1에 결합할 수 있는 항체, ICAM-1에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, ICAM-2에 결합할 수 있는 항체, ICAM-2에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제제의 투여를 부가적으로 포함하는 방법.
  39. 제21항에 있어서, LFA-1에 결합할 수 있는 항체, LFA-1에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, ICAM-1에 결합할 수 있는 항체, ICAM-1에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, ICAM-2에 결합할 수 있는 항체, ICAM-2에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제제의 투여를 부가적으로 포함하는 방법.
  40. 제22항에 있어서, LFA-1에 결합할 수 있는 항체, LFA-1에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, ICAM-1에 결합할 수 있는 항체, ICAM-1에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편, ICAM-2에 결합할 수 있는 항체, ICAM-2에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제제의 투여를 부가적으로 포함하는 방법.
  41. 제19항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 소장 경유 수단, 비경구적 수단, 국소적 수단, 흡입 수단 또는 비강 경유 수단에 의해 투여되는 방법.
  42. 제21항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 소장 경유 수단, 비경구적 수단, 국소적 수단, 흡입 수단 또는 비강 경유 수단에 의해 투여되는 방법.
  43. 제22항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 소정 경유 수단, 비경구적 수단, 국소적 수단, 흡입 수단 또는 비강 경유 수단에 의해 투여되는 방법.
  44. 제19항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 예방용으로 투여되는 방법.
  45. 제21항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 예방용으로 투여되는 방법.
  46. 제22항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 예방용으로 투여되는 방법.
  47. 제19항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 치료용으로 투여되는 방법.
  48. 제21항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 치료용으로 투여되는 방법.
  49. 제22항에 있어서, 상기 ICAM-3 조절 제제가 치료용으로 투여되는 방법.
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