KR20220131293A

KR20220131293A - 항-e-셀렉틴 항체, 조성물 및 사용 방법

Info

Publication number: KR20220131293A
Application number: KR1020227028674A
Authority: KR
Inventors: 제임스 리즈너 아프가; 셰릴 루비오 볼리; 조앤 엘리자베스-아이리스 엘웰; 라우라 린; 자틴 나룰라; 추엔레이 파릉; 데브라 드넹 피트만; 스왑닐 라케; 치히 빈센트 유
Original assignee: 화이자 인코포레이티드
Priority date: 2020-01-24
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2022-09-27
Also published as: US20240076386A1; US20210246213A1; CA3168704A1; EP4093508A1; JP7449390B2; BR112022014417A2; AU2021210669A1; MX2022009130A; PE20221902A1; TW202140558A; WO2021148983A1; US11597770B2; CN115190814A; IL294921A; CO2022010244A2; JP2023503714A

Abstract

본 발명은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명은 항체 및 그의 항원-결합 단편의 용도 및 이를 사용하는 연관된 방법을 포함한다.

Description

항-E-셀렉틴 항체, 조성물 및 사용 방법

관련 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2020년 1월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/965,688, 2020년 10월 22일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/104,213 및 2020년 12월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/121,467을 우선권 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2021년 1월 6일에 생성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 PC072498A_Sequence_Listing_ST25.txt이고, 크기가 1,048,576 바이트이다.

발명의 분야

본 발명은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편, 및 겸상 적혈구 질환 (SCD)과 연관된 혈관-폐쇄성 발증 (VOC)의 치료 및 예방을 포함한, SCD를 치료하기 위한 본 개시내용의 항체의 용도를 포함한, 그의 조성물, 방법 및 용도에 관한 것이다.

겸상 적혈구 질환 (SCD)은 미국 (US) 단독에서만 100,000명이 넘는 사람들에게 이환되는 중증 희귀 유전 장애이다 (질환 통제 예방 센터). 이는 높은 미충족 의료 필요를 갖는 집단에서의 이환율 및 사망률이 상당한 만성 상태이다. SCD를 갖는 개체는 진행성 기관 손상을 앓고, 대략 56년의 중앙 생존기간으로 기대 수명이 현저히 단축된다 (Gardner et al., Blood 2016; 128(10)1436-38).

SCD는 비정상적 형태의 헤모글로빈 (Hb) - 겸상 헤모글로빈 (HbS)의 존재를 특징으로 한다. β-글로빈 유전자 (HBB)에서의 단일 뉴클레오티드 치환은 잔기 6 (HBS 대립유전자)에서의 1개의 아미노산 치환 (글루탐산을 발린으로 치환)을 유발한다. HBS에 대해 동형접합성인 개체는 가장 흔하고 가장 중증인 형태의 겸상 적혈구 질환 (SCD-SS)을 갖는다. SCD의 변이체 형태는 개체가 HBS의 하나의 카피 및 또 다른 HBB 유전자에서의 돌연변이의 하나의 카피를 갖는 경우에 발생한다. 1 카피의 HBS 대립유전자 및 1 카피의 헤모글로빈 C 대립유전자 (HBC)를 갖는 개체는 SC 질환 (SCD-SC)을 갖는다. 개체가 1 카피의 HBS 및 1 카피의 β-지중해빈혈 대립유전자를 갖는 경우에, SCD의 중증도는 종종 Hbβ⁺-지중해빈혈 대립유전자 (SCD-Sβ+-thal) 또는 또 다른 상호작용 HB 변이체 (SCD-S변이체)보다 더 중증인 Hbβ°-지중해빈혈 결실을 갖는 β-지중해빈혈 대립유전자 (SCD-Sβ°-thal)의 중증도에 의존한다 (Frenett & Atweh J. Clin. Invest. 2007; 117:850-858).

SCD의 분자 발병기전에서의 1차 사건은 낮은 산소 분압의 조건 하에 HbS가 중합되어 적혈구 (RBC)가 강성 및 겸상 형상이 되는 경향이다 (Fabry & Nagel Blood 1982; 60(6)1370-77). 미세모세관 정맥 층에서의 저산소증은 내피의 염증 및 호중구의 부착, 및 호중구 롤링 및 유속의 감소를 유도한다. 이들 세포 응집체는 내피 세포와의 상호작용을 통해 혈관계에 포획된다. 겸상 RBC, 백혈구 및 내피 세포의 부착 상호작용은 혈관계를 폐쇄하여 혈관-폐쇄로 이어진다 (Zhang et al., Blood 2016:127:801-809; Okpala, 2006; Frenette & Atweh, J. Clin. Invest. 2007; 117:850-858). 조절이상 산화질소 항상성은 SCD에서 혈관 기능장애에 기여한다 (Aslan & Freeman, 2007). 혈액 세포 응집체는 중증 통증의 에피소드로서 임상적으로 나타나는 혈관 폐쇄, 기관 경색 및 허혈의 에피소드를 유도한다. 빈혈은 혈관 내피와 겸상 RBC, 백혈구 및 혈소판 사이의 상호작용에 의해 촉발되는 혈관 폐쇄 및 용혈로 인한 단축된 적혈구 수명에 따른 결과이다 (Rees et al., Lancet 2010; 376:2018-31).

혈관-폐쇄성 발증 (VOC)은 SCD의 가장 흔한 임상 징후이고, 일상 기능의 중단과 함께 SCD에서의 이환율의 주요 원인이다 (Ballas & Lusardi, Am. J. Hematol. 2005; 79:17-25; Piel et al., New Engl. J. Med. 2017; 376:1561-1573; Darbari et al., PloS One 2013; 8(11):e79923). VOC는 산소 분압이 가장 낮은 모세관후 세정맥에서 겸상 RBC와 혈관 내피 사이의 상호작용에 의해 개시된다 (Manwani & Frenette, Blood 2013; 122(24):3892-8). 이는 내피 손상으로 이어져 염증 반응을 촉발하고 백혈구, 혈소판 및 추가의 RBC가 염증 부위로 동원되도록 한다 (Zhang et al., Blood 2016; 127(7):801). 이들 세포 응집체는 혈관 폐쇄 (Turhan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2002; 99(5):3047-51) 및 모세관후 세정맥에서의 혈류의 둔화를 유도하여 국부 조직 저산소증 및 추가의 조직 염증을 유발한다. 이는 RBC의 보다 많은 탈산소화 및 겸상적혈구화, 및 때때로 겸상 적혈구 및 폐쇄 혈관의 2차 동원으로 불리는 폐쇄의 전파를 유발한다 (Stuart & Nagel, Lancet 2004; 364(9942):1343-60).

VOC는 청소년 또는 성인에서보다 어린 영유아에서 상당히 덜 흔하긴 하지만, 이르게는 생후 6개월의 SCD 환자에서 나타날 수 있다 (Benjamin et al., Amer. Pain Soc. 1994; vol.1, 94pp). 동형접합 SCD를 갖는 환자의 대략 60%는 연간 적어도 1회의 중증 VOC 에피소드를 갖지만, 소정 비율의 환자는 더 많은 에피소드를 갖는다 (Platt et al., N. Engl. J. Med. 1991; 325(1);11-6). 이러한 동일한 연구에서, SCD 유전자형을 갖는 환자의 5.2%는 연간 3-10건의 중증 VOC 에피소드를 가졌고, 적은 비율 (>1%)의 환자는 연간 10건 이상의 에피소드를 가졌다.

통증은 초기 및 진행중인 혈관 폐쇄 및 허혈의 임상 징후이며 (Ballas, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2005; 19(5):785-802), 이는 SCD-SS 유전자형을 갖는 환자에 대해 특히 중증일 수 있고, 이러한 환자는 또한 다른 유전자형보다 더 높은 사망을 겪는 것으로 관찰되었다 (Platt et al., N. Engl. J. Med. 1994; 330(23);1639-44).

혈관 내피 손상 영역으로의 백혈구의 동원은 셀렉틴 패밀리의 부착 분자: E-셀렉틴 (또한 CD62E로도 공지됨); P-셀렉틴 (또한 CD62P로도 공지됨); 및 L-셀렉틴 (또한 CD62L로도 공지됨)을 수반하며, 이들 모두는 염증 반응의 일부로서 조절된다 (Ernst & Magnani Nat. Rev. Drug Discov. 2009; 8(8):661-77; Morikis et al., Blood 2017; 130(19):2101-10). 구조가 유사하지만, 각각의 셀렉틴은 병리학적 및 생리학적 기능 둘 다에서 상이한 분포, 리간드 결합 동역학 및 다양성을 나타낸다.

셀렉틴 패밀리의 부착 분자 및 그의 리간드는 겸상 적혈구 및 활성화된 내피 세포에서의 변경에 의해 촉진된 SCD에서의 염증유발 반응의 일부이다. 셀렉틴은 또한 세포-세포 부착의 초기 접촉, 내피 상에서의 백혈구 롤링 및 세포의 인테그린 활성화 및 이행을 조절하는 데 결정적 역할을 한다. 염증발생 내피 및 순환 세포 응집체에 대한 백혈구의 부착은 SCD에서의 특징적인 사건이다.

셀렉틴 패밀리의 탄수화물 결합 단백질은 유사한 구조를 공유하며, 각각은 Ca²⁺-의존성 (C 유형) 렉틴에 특징적인 N-말단 탄수화물-인식 도메인, 이어서 표피 성장 인자 (EGF)-유사 도메인, 상보체 조절 도메인에 대한 상동성을 갖는 일련의 짧은 컨센서스 반복부, 막횡단 도메인 및 짧은 세포질 꼬리를 갖는다 (McEver & Zhu, 2010). 셀렉틴 및 그의 리간드는 혈액으로부터 혈관 내피로의 혈소판 및 백혈구의 동원을 매개하여 만성 염증유발 환경의 생성에 기여한다.

SCD의 병리생리학은 복잡하고 불균질하다. 증상은 통증 발증, 만성 빈혈, 급성 흉부 증후군, 졸중, 비장 격리, 혈관-폐쇄성 급성 통증 사건 또는 발증, 신장 기능장애 및 박테리아 감염에 대한 감수성을 포함한다 (Ashley-Koch et al., Am. J. Epidemiol. 2000; 151:839-845; Steinberg, New Engl. J. Med. 1999; 340:1021-1030; Piel et al., New Engl. J. Med. 2017; 376:1561-1573). SCD와 연관된 급성 종말 기관 합병증은 급성 흉부 증후군, 급성 졸중, 지속발기증, 간담도 합병증, 비장 격리 및 급성 신부전을 포함할 수 있다. SCD의 누적 손상으로부터의 만성 합병증은 무혈관성 괴사, 폐고혈압, 신장 합병증, 안과 합병증, 다리 궤양 및 재발성 지속발기증을 포함한다 (Yawn et al., JAMA 2014; 312:1033-48).

히드록시우레아가 SCD의 예방 요법에 대해 승인되어 있다. 기계론적으로, 히드록시우레아는 태아성 헤모글로빈 (HbF) 농도를 증가시키고, 통증 발증의 횟수를 감소시킨다 (Charache et al., New Engl. J. Med. 1995; 332:1317-1322). 히드록시우레아가 VOC의 예방에서 표준 관리로 간주되지만, 이는 ~30-35%의 실패율을 갖고 급성 VOC 동안 증상을 치료하는 데 비효과적이다. 엔다리(ENDARI) (L-글루타민)가 최근에 예방적 SCD 치료에 대해 승인되었지만, 작용 메카니즘이 불확실하고, 임상 이익은 보통이다 (Quinn, Blood 2018; 132:689-693). 급성 VOC 에피소드에 대한 현행 치료는 주로 오피오이드 진통제, 수화, 산소 및 수혈을 사용한 지지적 치료이다. 추가로, 대부분의 환자는 가정에서 VOC를 치료하고, 직접적인 의학적 개입을 추구하지 않는다 (Smith et al., Ann. Intern. Med. 2008; 148:94-101; Callaghan et al., Blood 2017; 130:973).

SCD의 예방 및 치료 및 특히 환자에서의 재발 및 쇠약 VOC의 기저 병리생리상태 (예를 들어, 염증 및 세포 응집의 감소)를 다루기 위한 유의한 필요가 남아있다. 본 발명은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하고 E-셀렉틴의 기능적 활성을 중화시킬 수 있는 신규 치료 항체를 제공한다. 이들 항체는 SCD에 대한 예방적 치료로서 이용되는 경우에 VOC를 방지하거나 또는 그의 발생을 감소시키기 위해, 및 SCD를 갖는 환자에서 VOC의 지속기간을 감소시키거나 (예를 들어, VOC를 해소하는 시간의 감소), 그의 강도 및/또는 중증도를 감소시킴으로써 급성 VOC를 치료하는 데 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편, 뿐만 아니라 용도 및 연관된 방법을 제공한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용에 지나지 않는 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 실시양태 (E)에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

E1. E-셀렉틴 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E2. E1에 있어서, 서열식별번호: 8, 23, 52, 63, 77, 92, 111, 125, 9, 24, 29, 38, 41, 44, 53, 64, 78, 93, 112, 126, 10, 54, 65, 79, 94, 113 및 127로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E3. E1-E2 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 2, 18, 47, 68, 82, 97, 106, 9, 24, 29, 38, 41, 44, 53, 64, 78, 93, 112, 126 10, 54, 65, 79, 94, 113 및 127로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E4. E1-E3 중 어느 하나에 있어서, (a)-(f) 중 1개 이상을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편:

(a) 서열식별번호: 2, 18, 47, 68, 82, 97 및 106의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR-1 아미노산 서열;

(b) 서열식별번호: 3, 19, 48, 69, 83, 98, 107 및 120의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR-2 아미노산 서열;

(c) 서열식별번호: 4, 20, 49, 70, 84, 99, 108 및 121의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR-3 아미노산 서열;

(d) 서열식별번호: 8, 23, 52, 63, 77, 92, 111 및 125의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR-1 아미노산 서열;

(e) 서열식별번호: 9, 24, 29, 38, 41, 44, 53, 64, 78, 93, 112 및 126의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR-2 아미노산 서열; 및

(f) 서열식별번호: 10, 54, 65, 79, 94, 113 및 127의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR-3 아미노산 서열.

E5. E1-E4 중 어느 하나에 있어서, 하기 중 1개 이상을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편:

서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-1,

서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-2,

서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-3,

서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-1,

서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-2 및

서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-3.

E6. E1-E5 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 11, 25, 30, 35, 39, 42, 45, 55, 60, 66, 75, 80, 90, 95, 104, 114, 118 및 128로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서열의 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E7. E1-E6 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 5, 21, 27, 32, 50, 57, 71, 73, 85, 87, 100, 102, 109, 116 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서열의 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E8. E1-E7 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 7, 13, 22, 28, 34, 37, 40, 43, 51, 59, 62, 74, 76, 89, 91, 103, 110, 117 및 124로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서열의 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E9. E1-E8 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1, 17, 26, 31, 46, 56, 67, 72, 81, 86, 96, 101, 105, 115 및 119로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서열의 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E10. E1-E9 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 11의 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E11. E1-E10 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 5의 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E12. E1-E11 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 7 또는 13의 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E13. E1-E12 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1의 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E14. E1-E13 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-1, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-2, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-3, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-2 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E15. E1-E4 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-1, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-2, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E16. E1-E15 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-2 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E17. E1-E16 중 어느 하나에 있어서, IGKV1-12*01, IGKV1-13*02, IGKV1-33*01, IGKV1-39*01, IGKV1-5*01, IGKV3-11*01, IGKV3-15*01, IGKV3-20*01, IGKV3D-20*02 및 IGKV4-1*01로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 배선 VL 서열로부터 유래된 VL 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E18. E1-E17 중 어느 하나에 있어서, IGHV1-2*02, IGHV1-3*01, IGHV1-46*01, IGHV1-69*01, IGHV1-69*02, IGHV1-8*01, IGHV3-7*01, IGHV3-13*01, IGHV3-23*01, IGHV3-23*04, IGHV3-30*01, IGHV3-30*18, IGHV5-10-1*01, IGHV5-10-1*04 및 IGHV5-51*01로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 배선 VH 서열로부터 유래된 VH 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E19. E1-E18 중 어느 하나에 있어서, IGHV1-39*01 VL 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E20. E1-E19 중 어느 하나에 있어서, IGHV3-07*01 VH 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E21. E1-E20 중 어느 하나에 있어서, VL 프레임워크 서열 및 VH 프레임워크 서열을 포함하며, 여기서 VL 프레임워크 서열은 그것이 유래된 인간 배선 서열에 대해 적어도 72% 동일한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E22. E1-E21 중 어느 하나에 있어서, VL 프레임워크 서열 및 VH 프레임워크 서열을 포함하며, 여기서 VL 프레임워크 서열은 그것이 유래된 인간 배선 서열에 대해 적어도 72%, 74%, 75%, 77%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E23. E1-E22 중 어느 하나에 있어서, VL 프레임워크 서열 및 VH 프레임워크 서열을 포함하며, 여기서 VH 프레임워크 서열은 그것이 유래된 인간 배선 서열에 대해 적어도 53% 동일한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E24. E1-E23 중 어느 하나에 있어서, VL 프레임워크 서열 및 VH 프레임워크 서열을 포함하며, 여기서 VH 프레임워크 서열은 그것이 유래된 인간 배선 서열에 대해 적어도 53%, 58%, 60%, 63%, 71%, 72%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E25. E1-E24 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 11에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E26. E1-E25 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 11에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E27. E1-E26 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E28. E1-E27 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 5에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E29. E1-E28 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 5에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E30. E1-E29 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하거나 또는 그로 이루어진 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E31. E1-E30 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 VH 도메인 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E32. E1-E31 중 어느 하나에 있어서, Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E33. E32에 있어서, Fc 도메인이 IgA (예를 들어 IgA₁ 또는 IgA₂), IgD, IgE, IgM 또는 IgG (예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 도메인인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E34. E33에 있어서, Fc 도메인이 IgG의 Fc 도메인인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E35. E34에 있어서, IgG가 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 및 IgG₄로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E36. E35에 있어서, IgG가 IgG₁인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E37. E1-E36 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E38. E1-E37 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E39. E1-E38 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E40. E1-E39 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 22, 28, 34, 37, 40, 43, 51, 59, 62, 74, 76, 89, 91, 103, 110, 117 및 124 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E41. E1-E40 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E42. E1-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E43. E1-E42 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 LC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E44. E1-E43 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E45. E1-E45 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 17, 26, 31, 1, 46, 56, 67, 72, 81, 86, 96, 101, 105, 115 및 119 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E46. E1-E45 중 어느 하나에 있어서, ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E47. E1-E46 중 어느 하나에 있어서, ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E48. E1-E47 중 어느 하나에 있어서, ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드 내의 삽입물에 의해 코딩되는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E49. E1-E48 중 어느 하나에 있어서, ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드 내의 삽입물에 의해 코딩되는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E50. E1-E49 중 어느 하나에 있어서, ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드 내의 삽입물에 의해 코딩되는 HC 아미노산 서열 및 ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드 내의 삽입물에 의해 코딩되는 LC 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E51. E1-E50 중 어느 하나에 있어서, Fc 융합 단백질, 모노바디, 맥시바디, 이중기능적 항체, scFab, scFv, 펩티바디인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E52. E1-E52 중 어느 하나에 있어서, 인간 E-셀렉틴에 대략 약 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 175 nM, 150 nM, 125 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900pM, 800pM, 700pM, 600pM 및 500pM으로 이루어진 군으로부터 선택된 값 또는 그 미만의 K_D로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E53. E1-E52 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대략 약 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 175 nM, 150 nM, 125 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900pM, 800pM, 700pM, 600pM 및 500pM로 이루어진 군으로부터 선택된 값 또는 그 미만의 K_D로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E54. E1-E53 중 어느 하나에 있어서, 인간 E-셀렉틴에 약 10 nM 내지 약 200 nM의 K_D로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E55. E1-E54 중 어느 하나에 있어서, 인간 E-셀렉틴에 약 68.4 +/- 3.18 nM의 K_D로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E56. E1-E55 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 약 10 nM 내지 약 200 nM의 K_D로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E57. E1-E56 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 약 64.9 +/- 1.13 nM의 K_D로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E58. E1-E57 중 어느 하나에 있어서, 항-E-셀렉틴 항체가 인간 E-셀렉틴에 약 92.85 nM, 약 70.3 nM, 약 65.2 nM, 약 61.8 nM, 약 60.5 nM, 약 68.0 nM, 약 21.6 nM, 약 324 nM, 약 54.4 nM, 약 628.5 nM 및 2940 nM로 이루어진 군으로부터 선택된 K_D로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E59. E1-E58 중 어느 하나에 있어서, 항-E-셀렉틴 항체가 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 약 138.5 nM, 약 78.3 nM, 약 76.5 nM, 약 81.5 nM, 약 67.8 nM, 약 45.8 nM, 약 243.5 nM, 약 45.4 nM, 약 492 nM 및 3145 nM의 군으로부터 선택된 K_D로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E60. E1-E59 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 원숭이에서의 평균 반감기가 10 mg/kg의 용량으로의 IV 투여 후 적어도 약 14.4일 (345시간)인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E61. E1-E60 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 원숭이에서의 평균 반감기가 3 mg/kg의 용량으로의 IV 투여 후 적어도 약 12일 (287시간)인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E62. E1-E61 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 원숭이에서의 평균 반감기가 3 mg/kg의 용량으로의 SC 투여 후 약 21.5일 (518시간)인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E63. E1-E62 중 어느 하나에 있어서, 항-약물 항체를 유도하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E64. E1-E63 중 어느 하나에 있어서, t-레지토프 (T-Reg) 조정된 점수에 의해 나타내어지는 항체의 예측된 면역원성 잠재력이 약 -30 미만인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E65. E1-E64 중 어느 하나에 있어서, t-레지토프 (T-Reg) 조정된 점수에 의해 나타내어지는 항체의 예측된 면역원성 잠재력이 약 -45 미만이고, 비-배선 T 세포 에피토프가 0개인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E66. E1-E65 중 어느 하나에 있어서, T-Reg 조정된 점수에 의해 나타내어지는 항체의 예측된 면역원성 잠재력이 약 -24, -26, -27, -30, -32, -33, -34, -35, -36, -37, -38, -39, -40, -41, -42, -43, -44, -45, -46, -47 및-48로 이루어진 군으로부터 선택된 T-Reg 조정된 점수 미만인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E67. E1-E66 중 어느 하나에 있어서, T-Reg 조정된 점수에 의해 나타내어지는 항체의 예측된 면역원성 잠재력이 약 -45 또는 -46인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E68. E1-E67 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 AC-SINS 검정, DNA 결합 검정 및/또는 인슐린 결합 검정에 의해 측정 시, 다반응성 위험이 낮은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E69. E1-E68 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 동적 광 산란 (DLS)에 의해 25℃에서 측정 시, 약 23 mg/mL의 농도에서 약 7.97 +/- 1.83 cP, 약 48 mg/mL의 농도에서 약 12.38 +/- 5.28 cP, 약 90 mg/mL의 농도에서 약 4.26 +/- 0.6 cP, 약 102 mg/mL의 농도에서 약 5.58 +/- 0.99 cP, 약 121 mg/mL의 농도에서 약 8.44 +/- 1.54 cP, 약 140 mg/mL의 농도에서 약 9.78 +/- 2.32 cP, 약 158 mg/mL의 농도에서 약 17.47 +/- 3.24 cP 및 약 188 mg/mL의 농도에서 약 37.99 +/- 7.03 cP로 이루어진 군으로부터 선택된 점도를 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E70. E1-E69 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 DLS에 의해 25℃에서 측정 시, 약 150 mg/mL 내지 약 190 mg/mL의 농도에서 약 15 cP 내지 40 cP의 점도를 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E71. E1-E70 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 안톤 파르(Anton Parr) 방법에 의해 25℃에서 측정 시, 185.7 mg/mL에서 33.4 cP의 점도를 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E72. E1-E71 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 옥테트(Octet) 바이오센서를 사용한, 예를 들어 경쟁 검정에 의해 결정 시, 인간 E-셀렉틴의 3개의 에피토프 중 적어도 1개에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E73. E72에 있어서, 에피토프 중 적어도 2개가 중첩되는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E74. E1-E73 중 어느 하나에 있어서, T7, E8, A9, M10, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E88, E92, Y94, R97, N105, E107, R108, S110, K111, K112, K113 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개의 아미노산 잔기와 상호작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E75. E1-E74 중 어느 하나에 있어서, T7, E8, A9, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E92, Y94, N105, E107, R108, S110, K111, K112 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 3.8 Å 이내의 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개의 아미노산 잔기와 상호작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E76. E1-E75 중 어느 하나에 있어서, T7, E8, A9, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E88, E92, Y94, R97, E107, R108, S110, K111, K112, K113 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 매립된 표면적 (Å²)이 >5 Å²인 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개의 아미노산 잔기와 상호작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E77. E1-E76 중 어느 하나에 있어서, E8, S47, N82, N83, E88, E92, Y94, N105, E107, R108, S110, K112 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개의 아미노산 잔기와 수소 결합을 통해 상호작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E78. E1-E77 중 어느 하나에 있어서, K111, K112 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개의 아미노산 잔기와 염 가교를 통해 상호작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E79. E1-E78 중 어느 하나에 있어서, R97, K112 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개의 아미노산 잔기와 물-매개 수소 결합을 통해 상호작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E80. E1-E79 중 어느 하나에 있어서, Y48, N82, N83, E92, Y94, R97, N105, E107 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, sLex 아미노산 잔기의 3.8A 이내에서 또한 상호작용하는 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개의 아미노산 잔기와 상호작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E81. E1-E80 중 어느 하나에 있어서, HMMS의 백분율 및/또는 LMMS의 백분율이 20 mM 트리스 (pH 7.5), 20 mM 히스티딘 (pH 5.8) 및 20 mM 글루탐산 (pH 4.5)으로 이루어진 군으로부터 선택된 용액 중에서 40℃에서 4주 동안 저장 후 5% 미만이고, 임의로 분석이 aSEC에 의해 수행되는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E82. E1-E81 중 어느 하나에 있어서, HMMS의 백분율이 20 mM 트리스, 8.5% 수크로스 (pH 7.5), 20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로스, 0.005% EDTA (pH 5.8) 및 20 mM 글루탐산, 8.5% 트레할로스 (pH 4.5)로 이루어진 군으로부터 선택된 용액 중에서 4℃ 또는 25℃에서 6주 이하 동안 저장 후 5% 미만이고; 항체가 약 150 mg/ml의 농도이고; 임의로 분석이 aSEC에 의해 수행되는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E83. E1-E82 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 열량측정법에 의해 측정 시, 용융 온도 (T_m1) 또는 항체의 C_H2가 50% 언폴딩되는 온도가 약 65℃ 이상인 열 안정성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E84. E1-E83 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 열량측정법에 의해 측정 시, 용융 온도 (T_m1) 또는 항체의 C_H2가 50% 언폴딩되는 온도가 65℃ 내지 72℃인 열 안정성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E85. E1-E84 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 열량측정법에 의해 측정 시, 용융 온도 (T_m1) 또는 항체의 C_H2가 50% 언폴딩되는 온도가 약 71.7℃인 열 안정성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E86. E1-E85 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 열량측정법에 의해 측정 시, 용융 온도 (T_m2) 또는 항체의 Fab가 50% 언폴딩되는 온도가 약 74℃ 이상인 열 안정성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E87. E1-E86 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 열량측정법에 의해 측정 시, 용융 온도 (T_m2) 또는 항체의 Fab가 50% 언폴딩되는 온도가 74℃ 내지 78℃인 열 안정성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E88. E1-E87 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 열량측정법에 의해 측정 시, 용융 온도 (T_m2) 또는 항체의 Fab가 50% 언폴딩되는 온도가 약 78.2℃인 열 안정성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E89. E1-E88 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 열량측정법에 의해 측정 시, 용융 온도 (T_m3) 또는 항체의 C_H3이 50% 언폴딩되는 온도가 약 82℃ 이상인 열 안정성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E90. E1-E89 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 열량측정법에 의해 측정 시, 용융 온도 (T_m3) 또는 항체의 C_H3이 50% 언폴딩되는 온도가 82℃ 내지 86℃인 열 안정성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E91. E1-E90 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 열량측정법에 의해 측정 시, 용융 온도 (T_m3) 또는 항체의 C_H3이 50% 언폴딩되는 온도가 약 84.3℃인 열 안정성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E92. E1-E91 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 EC₅₀으로 표현되는 결합 친화도가 50 nM 이하, 예를 들어 48 nM, 45 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.75 nM, 0.5 nM, 0.25 nM 또는 0.1 nM 이하인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E93. E1-E92 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 EC₅₀으로 표현되는 결합 친화도가 약 0.66 nM인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E94. E1-E93 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 EC₅₀으로 표현되는 결합 친화도가 50 nM 이하, 예를 들어 48 nM, 45 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.75 nM, 0.5 nM, 0.25 nM 또는 0.1 nM 이하인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E95. E1-E94 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 P-셀렉틴에 대한 EC₅₀으로 표현되는 결합 친화도가 350 nM 이상, 예를 들어 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM 또는 그 초과 수치 이상인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E96. E1-E95 중 어느 하나에 있어서, 가용성 래트, 마우스 또는 토끼 E-셀렉틴 또는 가용성 인간 L- 또는 P-셀렉틴에 대한 약한 결합을 갖거나 결합이 없는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E97. E1-E96 중 어느 하나에 있어서, 세포-표면 발현된 인간 P-셀렉틴에 대한 약한 결합을 갖거나 결합이 없는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E98. E1-E97 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 SPR에 의해 측정 시, 405 nM까지 래트, 마우스 또는 토끼 E-셀렉틴 또는 가용성 인간 L- 또는 P-셀렉틴에 대한 결합을 나타내지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E99. E1-E98 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 직접 결합 ELISA에 의해 측정 시, 인간 또는 래트 E-셀렉틴에 대한 결합보다 약 >100 x 더 낮은 가용성 마우스 또는 래트 E-셀렉틴에 대한 약한-포화불가능한 결합을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E100. E1-E99 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 직접 결합 ELISA에 의해 측정 시, 133.3 nM까지 가용성 마우스 또는 래트 E-셀렉틴에 대한 약한-포화불가능한 결합을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E101. E1-E100 중 어느 하나에 있어서, 가용성 인간 E-셀렉틴에 2 nM 이하, 예를 들어 0.010 nM, 0.015 nM, 0.020 nM, 0.025 nM, 0.030 nM, 0.035 nM, 0.040 nm, 0.045 nM, 0.05 nM, 0.055 nM, 0.06 nM, 0.065 nM, 0.070 nM, 0.075 nM, 0.080 nM, 0.085 nM, 0.090 nM, 0.10 nM, 0.12 nM, 0.15 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 0.9 nM, 0.95 nM, 1.0 nM 1.5 nM, 18 nM 또는 1.9 nM 이하의 EC₅₀으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E102. E1-E101 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 직접 결합 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 약 0.085 nM 내지 약 0.12 nM의 EC₅₀으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E103. E1-E102 중 어느 하나에 있어서, 가용성 시노몰구스 E-셀렉틴에 1 nM 이하, 예를 들어 0.010 nM, 0.015 nM, 0.020 nM, 0.025 nM, 0.030 nM, 0.035 nM, 0.040 nm, 0.045 nM, 0.05 nM, 0.055 nM, 0.06 nM, 0.065 nM, 0.070 nM, 0.075 nM, 0.080 nM, 0.085 nM, 0.090 nM, 0.10 nM, 0.12 nM, 0.15 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 0.9 nM 또는 0.95 nM 이하의 EC₅₀으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E104. E1-E103 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 직접 결합 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 시노몰구스 E-셀렉틴에 0.071 nM 내지 0.093 nM의 EC₅₀으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E105. E1-E104 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 중 유리 가용성 인간 E-셀렉틴에 약 1 nM 내지 약 3 nM의 IC₅₀, 바람직하게는 약 1.2 nM의 IC₅₀으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E106. E1-E105 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 중화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E107. E1-E106 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 약 2.87 nM 내지 약 3.01 nM의 IC₅₀으로 중화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E108. E1-107 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 중화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E109. E1-E108 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 약 2.39 nM 내지 약 2.91 nM의 IC₅₀으로 중화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E110. E1-E109 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 중화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E111. E1-E110 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 약 1.88 nM 내지 약 2.89 nM의 IC₅₀으로 중화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E112. E1-E111 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 중화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E113. E1-E112 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 약 1.47 nM 내지 약 2.65 nM의 IC₅₀으로 중화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E114. E1-E113 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E115. E1-E114 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 약 3.36 nM 내지 약 4.7 nM의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E116. E1-E115 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정적 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 약 3.84 nM의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E117. E1-E116 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM 또는 2 nM 이하의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E118. E1-E117 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 약 4.25 nM 내지 약 4.56 nM의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E119. E1-E118 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대?? E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 약 4.32 nM 내지 약 4.35 nM의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E120. E1-E119 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 300 nM 이하, 예를 들어 290 nM, 280 nM, 270 nM, 260 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 90 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 20 nM, 20 nM, 5 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E121. E1-E120 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 약 13.28 nM 내지 약 15.94 nM의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E122. E1-E121 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 활성화된 인간 호중구 (예를 들어, TNF-α 활성화됨)의 부착을 약 9.45 nM 내지 약 16.33 nM의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E123. E1-E122 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 활성화된 인간 호중구 (예를 들어, TNF-α 활성화됨)의 부착을 약 2.87 nM 내지 약 4.65 nM의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E124. E1-E123 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 SCD 환자로부터의 혈액 세포의 부착을 약 6.17 nM 내지 약 18.66 nM의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E125. E1-E124 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 SCD 환자로부터의 혈액 세포의 부착을 약 12.4 nM의 IC₅₀으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

E126. E1-E125 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.

E127. E1-E125 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 적어도 1개의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.

E128. 서열식별번호: 136의 핵산 서열, 서열식별번호: 137의 핵산 서열 또는 둘 다를 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL, VH 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산 분자.

E129. 서열식별번호: 136의 핵산 서열, 서열식별번호: 137의 핵산 서열 또는 둘 다를 포함하거나 또는 그로 이루어진 단리된 핵산 분자.

E130. 서열식별번호: 136으로서 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 단리된 핵산 분자.

E131. 서열식별번호: 137로서 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 단리된 핵산 분자.

E132. 서열식별번호: 136, 144, 146, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 핵산 서열을 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH를 코딩하는 단리된 핵산 분자.

E133. 서열식별번호: 136, 144, 146, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산을 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH를 코딩하는 단리된 핵산 분자.

E134. 서열식별번호: 137, 145, 147, 149, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172 및 174로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 핵산 서열을 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL을 코딩하는 단리된 핵산 분자.

E135. 서열식별번호: 137, 145, 147, 149, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172 및 174로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산을 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL을 코딩하는 단리된 핵산 분자.

E136. 서열식별번호: 206 또는 138의 핵산 서열; 서열식별번호: 139의 핵산 서열; 또는 둘 다를 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄, 중쇄 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산 분자.

E137. 서열식별번호: 206 또는 138의 핵산 서열; 서열식별번호: 139의 핵산 서열; 또는 둘 다를 포함하거나 또는 그로 이루어진 단리된 핵산 분자.

E138. 서열식별번호: 206 또는 138의 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 단리된 핵산 분자.

E139. 서열식별번호: 139의 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 단리된 핵산 분자.

E140. ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자.

E141. ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자.

E142. ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열 및 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자.

E143. ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.

E144. ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.

E145. ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열 및 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.

E146. E126-E145 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터.

E147. E126-E145 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 E146의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

E148. E147에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.

E149. E147 또는 E148에 있어서, CHO 세포, HEK-293 세포, NS0 세포, PER.C6® 세포 또는 Sp2.0 세포인 숙주 세포.

E150. E147-E149 중 어느 하나의 숙주 세포를 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.

E151. E150에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.

E152. E1-E125 및 E221 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.

E153. E152에 있어서, 1.12 mg/mL L-히스티딘, 2.67 mg/mL L-히스티딘 히드로클로라이드 1수화물, 85 mg/mL 수크로스, 0.05 mg/mL 에데테이트 디소듐 2수화물, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80 (pH 5.8)을 포함하는 제약 조성물.

E154. E152 또는 E153에 있어서, 20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로스 및 0.02% 폴리소르베이트 80, 0.005% EDTA (pH 5.8)를 포함하는 제약 조성물.

E155. E152-E154 중 어느 하나에 있어서, 약 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/ml 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물.

E156. E155에 있어서, 약 100 mg/mL 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물.

E157. E152-E156 중 어느 하나에 있어서, 용량이 1 mL 용량인 제약 조성물.

E158. E152-E157 중 어느 하나에 있어서, SC 및/또는 IV 투여에 적합한 제약 조성물.

E159. E152-E158 중 어느 하나에 있어서, i) 서열식별번호: 11의 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 서열 및 서열식별번호: 5의 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 서열; ii) 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 iii) 서열식별번호: 7 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물.

E160. E152-E159 중 어느 하나에 있어서, L-글루타민 (예를 들어, 엔다리(ENDARI)), 항-P-셀렉틴 항체 (예를 들어, 크리잔리주맙 (아다크베오(ADAKVEO))), HbS를 그의 R 상태 (즉, 산소화)로 유지하도록 조정하는 화합물, 예를 들어 2-아미노퀴놀린 및 WO 2020/109994 (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것, HbS의 산소 친화도를 조정하는 화합물 (예를 들어, 복셀로터 (옥스브리타(OXBRYTA))), 2,3-디스포스포글리세르산의 생성을 조정함으로써 HbS 중합을 표적화하는 화합물, 태아성 헤모글로빈의 발현을 유도함으로써 HbS 중합을 표적화하는 화합물 (예를 들어, 히드록시우레아, 예를 들어 드록시아(DROXIA), 히드레아(HYDREA)), 기능장애성 세포 부착, 혈관 기능장애 및/또는 염증을 표적화하는 화합물 (예를 들어, 포스포디에스테라제-9 억제제), 혈액 중 산화질소의 수준을 증가시키는 화합물 (예를 들어, 가용성 구아닐레이트 시클라제 자극제, 예를 들어 IW-1701, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS)), 정맥내 IG, 응고항진을 표적화하는 화합물 (예를 들어, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS)), 아픽사반 (엘리퀴스(ELIQUIS)), 리바록사반 (자렐토(XARELTO))), NMDA 수용체 결합을 차단하는 화합물 (예를 들어, 메만틴 (나멘다(NAMENDA))) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 치료 활성 화합물을 포함하는 제약 조성물.

E161. E152-E159 중 어느 하나에 있어서, 폐렴구균 감염을 예방하기 위한 페니실린 예방제, 히드록시우레아 (예를 들어, 드록시아(DROXIA), 히드레아(HYDREA)), L-글루타민 (예를 들어, 엔다리(ENDARI)), 크리잔리주맙 (아다크베오(ADAKVEO)), 복셀로터 (옥스브리타(OXBRYTA)), 아픽사반 (엘리퀴스(ELIQUIS)), 리바록사반 (자렐토(XARELTO)), 비-스테로이드성 항염증 약물, 일반적으로 진통제, 오피오이드 진통제, IW-1701, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS)), 티카그렐로르 (브릴린타(BRILINTA)), 메만틴 (나멘다(NAMENDA)) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 치료 활성 화합물을 포함하는 의 제약 조성물.

E162. E-셀렉틴 활성의 감소 또는 억제를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 E1-E125 및 E221 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E152-E161 중 어느 하나의 제약 조성물을 투여하고, 투여 전의 E-셀렉틴의 활성을 항체 투여 후의 E-셀렉틴 활성의 수준과 비교함으로써 E-셀렉틴의 활성을 감소시키는 것을 포함하는, E-셀렉틴 활성을 감소 또는 억제하는 방법.

E163. E162에 있어서, E-셀렉틴 활성을 감소 또는 억제하는 것이 E-셀렉틴 활성의 제거, 억제 또는 감소에 의해 개선, 호전, 억제 또는 예방되는 질환, 장애 또는 상태를 치료하는 것인 방법.

E164. E162-E163 중 어느 하나에 있어서, E-셀렉틴의 활성이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법:

(a) 내피 세포에 대한 백혈구 테더링;

(b) 내피 세포에 대한 안정한 부착의 활성화;

(c) 정지하기 위한 백혈구의 느린 롤링;

(d) 백혈구의 효율적인 경내피 이동;

(e) CD18 인테그린의 친화도 및 결합력;

(f) 급성 염증 부위로의 백혈구의 트래픽킹;

(g) 시토졸 칼슘의 증가;

(h) p38 MAP 키나제 및 Syk 키나제를 활성화시키는 티로신 인산화의 증가;

(i) 혈액으로부터 혈관 내피로의 혈소판 및 백혈구의 동원; 및

(j) 염증유발 환경의 생성.

E165. 유리 E-셀렉틴 수준의 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 E1-E125 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E152-E161 중 어느 하나의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 유리 E-셀렉틴 수준을 감소시키는 방법.

E166. E-셀렉틴 발현 및/또는 리간드에 대한 E-셀렉틴 결합과 연관되거나 그에 의해 매개되는 질환, 장애 및/또는 상태의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 E1-E125 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E152-E161 중 어느 하나의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환, 장애 및/또는 상태를 치료 및/또는 예방하는 방법.

E167. E166에 있어서, 질환, 장애 및/또는 상태가 SCD, 혈관-폐쇄성 발증 (VOC), 통증, 기관 경색, 허혈, 졸중, 종말 기관 기능장애, 급성 흉부 및 혈관 폐쇄, 피부 질환 (예를 들어, 건선), 염증성 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염) 및 당뇨병의 합병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 방법.

E168. E167에 있어서, VOC가 SCD와 연관된 것인 방법.

E169. E166-E168 중 어느 하나에 있어서, VOC의 발생을 예방 또는 감소시키는 것에 의한 SCD에 대한 예방적 치료를 포함하는 방법.

E170. E167-E169 중 어느 하나에 있어서, VOC의 지속기간을 감소시키는 것 (예를 들어, VOC를 해소하는 시간의 감소) 및 강도를 감소시키는 것에 의한 SCD에 대한 급성 치료를 포함하는 방법.

E171. E166-E170 중 어느 하나에 있어서, 치료가 예방적 치료인 방법.

E172. E166-E171 중 어느 하나에 있어서, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상, 예를 들어 심흉계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 만성 제한성 폐 질환, 좌심실 확장기 질환, 폐고혈압, 급성 흉부 증후군, 부정맥, 돌연사, 혈관-폐쇄성 발증), 신경계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 출혈성 졸중, 정맥동 혈전증, 뇌의 침묵 뇌경색, 만성 통증, 뇌의 급성 허혈성 졸중, 증식성 망막병증, 안와 경색, 인지 장애), 세망내피계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 비장 격리, 기능적 비장기능저하증, 빈혈, 용혈), 근골격계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 무혈관성 괴사, 피부 궤양화), 비뇨생식기계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 유두상 괴사, 단백뇨, 신부전, 혈뇨, 야간 야뇨증, 지속발기증) 및 위장계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 담석증, 담관병증, 간병증, 장간막 혈관-폐쇄)을 치료, 예방 및/또는 호전시키는 방법.

E173. E166-E172 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간인 방법.

E174. E166-E173 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 SCD를 갖는 환자인 방법.

E175. E166-E174 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 HBSS, HBSC, HBS/β°thal, HBS/β⁺thal 또는 HBS-변이체 유전자형을 갖는 것인 방법.

E176. E166-E175 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물이 피하로 투여되는 것인 방법.

E177. E166-E176 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물이 정맥내로 투여되는 것인 방법.

E178. E166-E177 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물이 약 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회, 1개월 2회, 1개월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 7개월마다 1회, 8개월마다 1회, 9개월마다 1회, 10개월마다 1회, 11개월마다 1회 또는 12개월마다 1회 투여되는 것인 방법.

E179. E166-E177 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물이 1개월 1회 투여되는 것인 방법.

E180. E166-E179 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물이 1주 1회 투여되는 것인 방법.

E181. E66-E180 중 어느 하나에 있어서, 치료 유효량이 약 1 mg 내지 약 800 mg 용량의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것인 방법.

E182. E181에 있어서, 용량이 초기 고정 용량인 방법.

E183. E181-E182 중 어느 하나에 있어서, 용량이 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 약 1 mg 내지 약 10 mg, 약 10 mg 내지 약 20 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 30 mg 내지 약 40 mg, 약 40 mg 내지 약 50 mg, 약 50 mg 내지 약 60 mg, 약 60 mg 내지 약 70 mg, 약 70 mg 내지 약 80 mg, 약 80 mg 내지 약 90 mg, 약 90 mg 내지 약 100 mg, 약 100 mg 내지 약 150 mg, 약 150 mg 내지 약 200 mg, 약 200 mg 내지 약 300 mg, 약 300 mg 내지 약 400 mg, 약 400 mg 내지 약 500 mg, 약 500 mg 내지 약 600 mg, 약 600 mg 내지 약 700 mg 또는 약 700 mg 내지 약 800 mg인 방법.

E184. E181-E183 중 어느 하나에 있어서, 용량이 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 약 15 mg, 40 mg, 100 mg, 150 mg, 300 mg, 500 mg 또는 600 mg인 방법.

E185. E181-E184 중 어느 하나에 있어서, 용량이 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 약 150 mg인 방법.

E186. E81-E185 중 어느 하나에 있어서, 용량을 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월 1회, 2개월마다 1회 또는 그의 조합으로 투여하는 것을 포함하는 방법.

E187. E162-E186 중 어느 하나에 있어서, 항체가 항체 1444이고, 항원-결합 단편이 항체 1444의 단편인 방법.

E188. E162-E187 중 어느 하나에 있어서, 투여가 피하 또는 정맥내 투여인 방법.

E189. E162-E188 중 어느 하나에 있어서, i) 서열식별번호: 11의 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 서열 및 서열식별번호: 5의 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 서열; ii) 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 iii) 서열식별번호: 7 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는 방법.

E190. E162-E188 중 어느 하나에 있어서, i) 서열식별번호: 11의 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 서열 및 서열식별번호: 5의 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 서열; ii) 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 iii) 서열식별번호: 7 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.

E191. E162-E190 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 SCD를 갖는 환자인 방법.

E192. SCD의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 i) 서열식별번호: 11의 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 서열 및 서열식별번호: 5의 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 서열; ii) 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 iii) 서열식별번호: 7 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 투여하는 것을 포함하는, SCD를 치료하는 방법.

E193. E192에 있어서, SCD를 치료하는 것이 VOC를 포함한 SCD의 적어도 1종의 증상을 치료하는 것을 포함하는 것인 방법.

E194. E192-E193 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 SCD를 갖는 환자인 방법.

E195. E192-E194 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 피하로 및/또는 정맥내로 투여하는 것을 포함하는 방법.

E196. E192-E195 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 약 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회, 1개월 2회, 1개월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 7개월마다 1회, 8개월마다 1회, 9개월마다 1회, 10개월마다 1회, 11개월마다 1회 또는 12개월마다 1회 투여되는 것인 방법.

E197. E192-E196 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물이 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 1개월 1회 또는 그의 조합으로 투여되는 것인 방법.

E198. E192-E197 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 약 1 mg 내지 약 800 mg의 용량으로 투여되는 것인 방법.

E199. E192-198 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물이 약 15 mg, 약 40 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 300 mg, 약 500 mg 및 약 600 mg으로 이루어진 군으로부터 선택된 용량으로 투여되는 것인 방법.

E200. E192-E199 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 치료 유효량의 1종 이상의 추가의 치료 활성 화합물 또는 치료 양식과 조합되어 투여되는 것인 방법.

E201. E192-E200 중 어느 하나에 있어서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양 및 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 치료 활성 화합물 또는 치료 양식의 양이 함께 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에서 상승작용적 효과를 달성하는 양으로 투여되는 것인 방법.

E202. E192-E201 중 어느 하나에 있어서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양 및/또는 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 치료 활성 화합물 또는 치료 양식의 양이 각각 조합되지 않은 경우 투여될 양보다 더 낮은 투여량으로 투여되는 것인 방법.

E203. E192-E202 중 어느 하나에 있어서, 추가의 치료 활성 화합물이 폐렴구균 감염을 예방하기 위한 페니실린 예방제, 히드록시우레아 (예를 들어, 드록시아(DROXIA), 히드레아(HYDREA)), L-글루타민 (예를 들어, 엔다리(ENDARI)), 크리잔리주맙 (아다크베오(ADAKVEO)), 복셀로터 (옥스브리타(OXBRYTA)), 아픽사반 (엘리퀴스(ELIQUIS)), 리바록사반 (자렐토(XARELTO)), 비-스테로이드성 항염증 약물, 일반적으로 진통제, 오피오이드 진통제, IW-1701, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS)), 티카그렐로르 (브릴린타(BRILINTA)), 메만틴 (나멘다(NAMENDA)) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.

E204. E192-E203 중 어느 하나에 있어서, 추가의 치료 활성 화합물이 L-글루타민 (예를 들어, 엔다리(ENDARI)), 항-P-셀렉틴 항체 (예를 들어, 크리잔리주맙 (아다크베오(ADAKVEO))), HbS를 그의 R 상태 (즉, 산소화)로 유지하도록 조정하는 화합물, 예를 들어 2-아미노퀴놀린 및 WO 2020/109994 (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것, HbS의 산소 친화도를 조정하는 화합물 (예를 들어, 복셀로터 (옥스브리타(OXBRYTA))), 2,3-디스포스포글리세르산의 생성을 조정함으로써 HbS 중합을 표적화하는 화합물, 태아성 헤모글로빈 (HbF)의 발현을 유도함으로써 HbS 중합을 표적화하는 화합물 (예를 들어, 히드록시우레아, 예를 들어 드록시아(DROXIA), 히드레아(HYDREA)), 기능장애성 세포 부착, 혈관 기능장애 및/또는 염증을 표적화하는 화합물 (예를 들어, 포스포디에스테라제-9 억제제), 혈액 중 산화질소의 수준을 증가시키는 화합물 (예를 들어, 가용성 구아닐레이트 시클라제 자극제, 예를 들어 IW-1701, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS)), 정맥내 IG, 응고항진을 표적화하는 화합물 (예를 들어, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS)), 아픽사반 (엘리퀴스(ELIQUIS)), 리바록사반 (자렐토(XARELTO))), NMDA 수용체 결합을 차단하는 화합물 (예를 들어, 메만틴 (나멘다(NAMENDA))) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.

E205. E192-204 중 어느 하나에 있어서, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에 유용한 치료 활성 치료 양식이 보충 산소, 임의로 철 킬레이트화를 동반한 수혈, 골수 이식, 유전자 요법 (예를 들어, 렌티글로빈(LentiGlobin)®), CRISPR에 의한 유전자 편집 요법 (예를 들어, CTX001) 또는 아연 핑거 기술 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.

E206. E200-E205 중 어느 하나에 있어서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 치료 활성 화합물 또는 치료 양식이 공동-투여되는 것인 방법.

E207. E200-E206 중 어느 하나에 있어서, 조합 요법이 동일한 투여 요법에 따라 투여되거나 (예를 들어, 둘 다의 요법이 매일 투여됨) 또는 상이한 투여 요법에 따라 투여되는 것인 (예를 들어, 하나의 요법은 매일 투여되고, 다른 요법은 매주 투여됨) 방법.

E208. E200-E207 중 어느 하나에 있어서, 조합 요법이 대상체에게 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 투여되는 것인 방법.

E209. E-셀렉틴에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태 (예를 들어, SCD)를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 E152-E161 중 어느 하나의 제약 조성물의 용도.

E210. E-셀렉틴 발현 및/또는 리간드에 대한 E-셀렉틴 결합과 연관되거나 그에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의 E1-E125 또는 E221 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도.

E211. E-셀렉틴 발현 및/또는 리간드에 대한 E-셀렉틴 결합과 연관되거나 그에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의 E152-E161 중 어느 하나의 제약 조성물의 용도.

E212. E1-E125, E152-E161 및 E221 중 어느 하나에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.

E213. E1-E125, E152-E161 및 E221 중 어느 하나에 있어서, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.

E214. E213에 있어서, SCD의 증상이 VOC인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.

E215. E213-214 중 어느 하나에 있어서, 치료 및/또는 예방이 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 추가의 치료제, 예컨대 비제한적으로 적어도 1종의 다른 치료 활성 화합물 또는 치료 양식을 추가로 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.

E216. E215에 있어서, 추가의 치료제가 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 예방 및/또는 치료를 위한 표준 관리인 작용제 (예를 들어, L-글루타민, 히드록시우레아, 수혈 및 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 요법)인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.

E217. E215-216 중 어느 하나에 있어서, 치료 및/또는 예방이 i) 상승작용적 치료 유효량의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 ii) 상승작용적 치료 유효량의 추가의 치료제를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.

E218. E215 또는 E216에 있어서, 치료 및/또는 예방이 i) 상승작용적 치료 유효량의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 ii) 상승작용적 치료 유효량의 치료 양식을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.

E219. E152-E161 중 어느 하나에 있어서, SCD를 갖는 환자에게 투여하기 위한 조합물에 사용되는 각각의 화합물의 적절한 양이 연령, 체중, 전반적 건강, 투여되는 화합물, 투여 경로, SCD의 치료의 성질 및 진전 및 다른 의약의 존재로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 인자를 고려함으로써 결정되는 것인 제약 조성물.

E220. E152-E161 중 어느 하나에 있어서, E-셀렉틴에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태 (예를 들어, SCD)를 치료하기 위한 의약으로서 사용하기 위한 제약 조성물.

E221. 항체 0039, 0164, 0158, 0159, 0170, 0180, 0841, 1282 1284, 1444 또는 1448인, E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체.

도 1은 말단절단된 인간 E-셀렉틴과 공동-결정화된 항-E-셀렉틴 항체 0164의 Fab의 예시적인 결정 구조를 도시한다. E-셀렉틴은 회색 표면으로서 제시된다 (우측의 분자). 0164 Fab (좌측의 분자)는 담회색의 VL 및 암회색의 VH를 갖는 리본으로서 제시된다.
도 2는 시간 0 (T0)에서 및 트리스 완충제 (TrisT4), 히스티딘 완충제 (HisT4) 또는 글루탐산 (Glu4) 완충제 중 40℃에서 4주 동안의 저장 후에 최적화된 항-E-셀렉틴 항체 0841의 3-부분 질량 분광 분석으로부터의 예시적인 데이터를 도시한다.
도 3은 강제 분해 후 항체 841 (또한 0841로도 공지됨)의 예시적인 경쟁 ELISA 분석을 도시한다. 항체 841을 시간 0 (0wk)에서 및 Tris, His 또는 Glu 완충제 중 40℃에서 2주 (2wk) 또는 4주 (4wk) 동안 인큐베이션한 후에 분석하였다.
도 4는 인간화 항체 0841의 VH 및 VL 영역에 대한 예측된 비-배선 T-세포 에피토프를 도시한다. 인간 배선에서 발견되지 않는 T-세포 에피토프를 포괄하는, 에피박스/ISPRI 또는 IEDB에 의해 예측된 아미노산 잔기는 밑줄표시된다.
도 5는 인간 E-셀렉틴을 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 대한 시알릴 루이스 A 리간드 부착의 예시적인 중화를 도시한다. 시험된 항체는 항-E-셀렉틴 항체 164 (또한 0164로도 공지됨), 1282, 1284, 1444 및 1448 및 IgG 이소형 대조군을 포함하였다.
도 6은 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 시알릴 루이스 X 리간드 부착의 예시적인 중화를 도시한다. 시험된 항체는 항-E-셀렉틴 항체 164 (또한 0164로도 공지됨), 1282, 1284, 1444, 1448 및 IgG 이소형 대조군을 포함하였다.
도 7은 항체 1282, 1284, 1444, 1448 및 164 (또한 0164로도 공지됨)에 의한, 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 HL-60 세포 부착의 예시적인 중화를 도시한다.
도 8은 시간 0 (상단 패널)에서 및 Tris, His 또는 Glu 완충제 중 40℃에서 4주 동안 저장 후에 최적화된 항-E-셀렉틴 항체 1444의 3-부분 질량 분광 분석으로부터의 예시적인 데이터를 도시한다.
도 9a-9d는 강제 분해 후 항체 1282 (도 9a), 1284 (도 9b), 1444 (도 9c) 및 1448 (도 9d)의 예시적인 경쟁 ELISA 분석을 도시한다. 항체를 시간 1 (T0)에서 및 Tris, His 또는 Glu 완충제 중 40℃에서 2주 (T2) 또는 4주 (T4) 동안 인큐베이션한 후에 분석하였다.
도 10a-10d는 최적화된 항-E-셀렉틴 항체 샘플의 고농도 샘플의 aSEC 분석을 도시한다. 150 mg/mL 농도의 항체를 시간 0 (0)에서 및 Tris/Suc, His/Suc 또는 Glu/Tre 완충제 중 4℃ 또는 25℃에서 1, 2, 4, 6 및 7주 동안 저장한 후에 분석하였다. 고분자량 종의 백분율 (% HMMS)을 정량화하였다. 도 10a는 항체 1282에 대한 결과를 도시하고; 도 10b는 항체 1284에 대한 결과를 도시하고; 도 10c는 항체 1444에 대한 결과를 도시하고; 도 10d는 항체 1448에 대한 결과를 도시한다.
도 11은 최적화된 항-E-셀렉틴 항체의 예시적인 점도 곡선을 도시한다. 최적화된 항체 1282, 1284, 1444 및 1448의 점도를 DLS 비드-기반 방법을 사용하여 측정하였다. 안톤 파르 콘 및 플레이트 방법을 사용하여 각각에 대해 추가의 단일 데이터 포인트를 제공한다.
도 12는 인간 E-셀렉틴 (rhE-셀렉틴), 상동체 P-셀렉틴 및 L-셀렉틴, 및 토끼, 래트, 마우스 (muE-셀렉틴) 및 시노몰구스 원숭이 (rcyE-셀렉틴)의 종 상동체에 대한 최적화된 항체 1444 결합의 예시적인 SPR 분석을 도시한다.
도 13은 고정화된 인간 L-셀렉틴 및 인간 P-셀렉틴에 대한 항-E-셀렉틴 항체 (0841, 1282, 1284, 1444 및 1448)의 예시적인 결합을 도시한다. 항-L-셀렉틴 대조군 항체 및 항-P-셀렉틴 대조군 항체는 각각 인간 L-셀렉틴 및 인간 P-셀렉틴에 결합하였다.
도 14는 생리학적 유동 하에 재조합 E-셀렉틴에 대한 SCD 환자 세포 (공여자 11253 및 공여자 22358)의 부착의 예시적인 중화를 도시한다.

본 개시내용은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하고, E-셀렉틴 활성을 감소시키거나 억제하는, 예컨대 비제한적으로 E-셀렉틴이 당단백질 또는 당지질 상에 시알릴 루이스 (sLex) 결정기를 갖는 탄수화물 구조를 포함하는 리간드와 상호작용 (예를 들어, 결합)하는 능력을 감소시키거나 억제하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 개시내용은 또한 항-E-셀렉틴 항체의 제조, 제작 또는 생산 방법을 제공한다. 본 개시내용의 항체는 SCD, 혈관-폐쇄성 발증, 통증, 기관 경색, 허혈, 졸중 및 혈관 폐쇄를 포함하나 이에 제한되지는 않는, E-셀렉틴 활성 (예를 들어, 결합)에 의해 매개되거나 그와 연관된 장애 또는 상태의 진단, 예방 및/또는 치료에 유용하다. 본 개시내용은 추가로 항체의 발현, 및 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물, 예컨대 항체의 사용을 위한 의약의 제조 및 제작을 포괄한다.

E-셀렉틴 또는 그의 항원-결합 단편에 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 항-E-셀렉틴 항체를 발현하는 숙주 세포가 제공된다. E-셀렉틴에 대한 항체를 사용하는 치료 방법이 제공된다. 이러한 방법은 SCD, 혈관-폐쇄성 발증, 통증, 기관 경색, 허혈, 졸중, 종말 기관 기능장애, 급성 흉부 및 혈관 폐쇄를 포함하나 이에 제한되지는 않는, E-셀렉틴 발현 및/또는 sLex 리간드에 대한 E-셀렉틴 결합과 연관되거나 그에 의해 매개되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 셀렉틴 패밀리의 부착 분자 (예를 들어, E-셀렉틴) 및 그의 리간드는 세포-세포 부착의 초기 접촉, 내피 상에서의 백혈구 롤링, 세포의 인테그린 활성화 및 이행, 중증 통증 또는 혈관-폐쇄성 발증의 에피소드 (예를 들어, 혈관 폐쇄, 기관 경색 및 허혈 포함)로서 임상적으로 나타나는 SCD에서의 염증유발 반응의 모든 부분을 조절하는 데 있어서 결정적 역할을 한다. 따라서, 본 개시내용의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 혈관계에서 E-셀렉틴 활성 및 결합의 선택적 길항작용을 가능하게 하여, 대상체에서 혈관-폐쇄를 감소시킨다. 본원의 실시예에 개시된 일부 실시양태에서, E-셀렉틴에 대한 항체 및 그의 항원-결합 단편은, E-셀렉틴이 용액 중에 있거나 세포 (예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 호중구 및/또는 SCD를 갖는 환자로부터의 혈액 세포) 상에서 발현되고 그의 리간드(들)가 용액 중에 있거나 세포 (예를 들어, HL-60 세포, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC), 시노몰구스 원숭이 폐 미세혈관 내피 세포 (CLMEC)) 상에서 발현되는 경우에, E-셀렉틴의 그의 리간드에 대한 결합을 억제하거나, 중화시키거나 또는 감소시키는 것으로 제시되었다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (인간화 항체 포함)은 단독으로 또는 제2의 요법과 조합되어, 혈관-폐쇄성 발증, 통증, 기관 경색, 허혈, 졸중 및 혈관 폐쇄를 포함한 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 예방, 치료 및/또는 호전에 사용될 수 있다.

본원에 사용된 섹션 표제는 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

특허 출원, 특허 공개, 유니프롯KB 수탁 번호를 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌은, 각각의 개별 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 그 전문이 참조로 포함되는 것으로 나타내어진 바와 같이, 본원에 참조로 포함된다.

본원에 기재되거나 언급된 기술 및 절차는, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 그의 업데이트된 버전에 기재된 널리 이용되는 방법론과 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 널리 이해되고 통상적인 방법론을 이용하여 통상적으로 사용된다.

본 개시내용은 본 발명의 예시적인 실시양태의 하기 상세한 설명 및 그에 포함된 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 수 있다.

본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 군분류의 관점에서 기재되는 경우, 본 발명은 총괄적으로 열거된 전체 군, 뿐만 아니라 상기 군의 개별적인 각각의 구성원 및 주요 군의 모든 가능한 하위군, 뿐만 아니라 군 구성원 중 하나 이상이 부재하는 주요 군을 포괄한다. 본 발명은 또한 청구된 발명에서 임의의 군 구성원 중 하나 이상의 명확한 배제를 고려한다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.

추가로, 문맥상 달리 요구되거나 명백하게 나타내지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.

본 발명의 넓은 범주를 제시하는 수치 범위 및 파라미터는 근사치이지만, 특정 실시예에 제시된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 본질적으로 그의 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필수적으로 발생하는 특정 오차를 함유한다. 더욱이, 본원에 개시된 모든 범위는 그에 포함된 임의의 및 모든 하위범위를 포괄하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, "1 내지 10"의 언급된 범위는 1의 최소값과 10의 최대값 사이의 (및 이들 값 포함) 임의의 및 모든 하위범위; 즉, 1 이상의 최소값, 예를 들어 1 내지 6.1로 시작하여 10 이하의 최대값, 예를 들어 5.5 내지 10으로 끝나는 모든 하위범위를 포함하는 것으로 간주될 것이다.

본원에 사용된 단수 형태는 달리 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안적인 "또는"으로 해석되는 경우에 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.

본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 측정가능한 값, 예컨대 생물학적 활성의 양, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 길이, G 및 C 뉴클레오티드의 함량, 코돈 적응 지수, CpG 디뉴클레오티드의 수, 용량, 시간, 온도 등을 지칭하고, 달리 언급되지 않는 한, 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 또는 이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외하고는, 명시된 양의 어느 한 방향으로의 (초과 또는 미만의) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 변동을 포괄하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 용어 "호전시키다"는 대상체의 질환, 장애 또는 상태 (예를 들어, SCD) 또는 그의 증상 (예를 들어, 혈관-폐쇄성 발증) 또는 기저 세포성 반응에서의 검출가능한 또는 측정가능한 개선을 의미한다. 검출가능한 또는 측정가능한 개선은 질환, 장애 또는 상태, 그에 의해 유발되거나 그와 연관된 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 지속기간의 주관적 또는 객관적 감소, 하락, 억제, 저하, 한계 또는 제어, 그의 증상의 개선 또는 그의 역전을 포함한다.

본원에 사용된 "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 초과를 의미할 수 있다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.

본원에 사용된 용어 "연관된"은 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것과 상관관계가 있는 경우의 서로를 지칭한다. 예를 들어, 특정한 엔티티 (예를 들어, 폴리펩티드, 유전자 시그너쳐, 대사물, 미생물 등)는 그의 존재, 수준 및/또는 형태가 (예를 들어, 관련 집단에 걸쳐) 질환, 장애 또는 상태의 발생률 및/또는 그에 대한 감수성과 상관관계가 있는 경우에, 특정한 질환, 장애 또는 상태와 연관된 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 엔티티는 이들이 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여 이들이 서로 물리적으로 근접해 있고/거나 근접하게 유지되는 경우에 서로 물리적으로 "회합"된다. 일부 실시양태에서, 서로 물리적으로 회합된 2개 이상의 엔티티는 서로 공유 연결되고; 일부 실시양태에서, 서로 물리적으로 회합된 2개 이상의 엔티티는 서로 공유 연결되지 않지만, 예를 들어 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자성 및 그의 조합에 의해 비-공유 회합된다.

본원에 사용된 용어 "코딩 서열"은 특정한 단백질을 코딩하는 서열 또는 "코딩 핵산"을 지칭하며, 이는 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓이는 (그에 작동가능하게 연결되는) 경우에 시험관내 또는 생체내에서 (DNA의 경우에) 전사되고 (mRNA의 경우에) 폴리펩티드로 번역되는 핵산 서열을 나타낸다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3' (카르복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형, 및 단어 "갖는/포함한"은 언급된 정수 또는 정수의 군의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 군의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 용어 "예를 들어" 또는 "예를 들면"에 이어지는 임의의 예(들)는 총괄적이거나 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 실시양태가 본원에서 용어 "포함하는"으로 기재되는 모든 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"의 용어로 기재된 다른 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 용어 "보존적 치환"은 하나의 아미노산의 생물학적으로, 화학적으로 또는 구조적으로 유사한 잔기에 의한 대체를 지칭한다. 생물학적으로 유사한은 치환이 생물학적 활성을 파괴하지 않는다는 것을 의미한다. 구조적으로 유사한은 아미노산이 알라닌, 글리신 및 세린과 같이 유사한 길이 또는 유사한 크기를 갖는 측쇄를 갖는다는 것을 의미한다. 화학적 유사성은 잔기가 동일한 전하를 갖거나 또는 둘 다 친수성 또는 소수성인 것을 의미한다. 특정한 예는 소수성 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또 다른 것으로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 또 다른 것으로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환, 세린의 트레오닌으로의 치환 등을 포함한다. 보존적 치환의 특정한 예는 소수성 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 서로의 것으로의 치환, 극성 잔기의 또 다른 것으로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 전형적으로, 예를 들어 하기 군 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. "보존적 치환"은 또한 비치환된 모 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.

본원에 사용된 용어 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 임의의 하나 이상의 유익하거나 목적하는 결과에 영향을 미치는 데 충분한 양이다. 보다 구체적인 측면에서, 유효량은 질환, 예를 들어 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 예방, 완화 및/또는 호전시킨다. 예방적 사용의 경우에, 유익하거나 목적하는 결과는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 그의 합병증 및 질환의 발생 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함한 질환의 위험을 제거하거나 감소시키는 것, 그의 중증도를 경감시키는 것 또는 그의 발병을 지연시키는 것을 포함한다. 치료적 사용의 경우에, 유익하거나 목적하는 결과는 E-셀렉틴-매개 질환, 장애 또는 상태의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 감소시키는 것, 질환을 치료하는 데 요구되는 다른 의약의 용량을 감소시키는 것, 또 다른 의약의 효과를 증진시키는 것 및/또는 환자의 질환의 진행을 지연시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 예방적 또는 치유적 치료를 직접적으로 또는 간접적으로 달성하기에 충분한 양이다. 임상 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 함께 달성될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, "유효 투여량"은 1종 이상의 치료제의 투여와 관련하여 고려될 수 있고, 단일 작용제는 1종 이상의 다른 작용제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우에 유효량으로 주어지는 것으로 간주될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "기능적"은 생물학적 분자가 특징으로 하는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태인 경우 그러한 생물학적 분자를 지칭한다. 생물학적 분자는 2개의 기능을 갖거나 (즉, 이중기능적) 또는 많은 기능을 가질 수 있다 (즉, 다중기능적).

본원에 사용된 용어 "글리코실화 패턴"은 단백질 (예를 들어, 당형태) 뿐만 아니라 당형태(들)가 단백질의 펩티드 백본, 보다 구체적으로 이뮤노글로불린 단백질에 공유 부착된 부위(들)에 공유 부착된 탄수화물 단위의 패턴을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "상동" 또는 "상동성"은 주어진 영역 또는 단편에 걸쳐 적어도 부분적인 동일성을 공유하는 2개 이상의 참조 엔티티 (예를 들어, 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열)를 지칭한다. 예를 들어, 2개의 펩티드 내의 아미노산 위치가 동일한 아미노산에 의해 점유되는 경우에, 펩티드는 그 위치에서 상동이다. 특히, 상동 펩티드는 비변형 또는 참조 펩티드와 연관된 활성 또는 기능을 보유할 것이고, 변형된 펩티드는 일반적으로 비변형 서열의 아미노산 서열과 "실질적으로 상동"인 아미노산 서열을 가질 것이다. 폴리펩티드, 핵산 또는 그의 단편을 언급하는 경우에, "실질적 상동성" 또는 "실질적 유사성"은 또 다른 폴리펩티드, 핵산 (또는 그의 상보적 가닥) 또는 그의 단편과 적절한 삽입 또는 결실을 두고 최적으로 정렬하였을 때, 서열의 적어도 약 95% 내지 99%에서 서열 동일성이 존재한다는 것을 의미한다. 2개의 서열 사이의 상동성 (동일성)의 정도는 컴퓨터 프로그램 또는 수학적 알고리즘을 사용하여 확인될 수 있다. 퍼센트 서열 상동성 (또는 동일성)을 계산하는 이러한 알고리즘은 일반적으로 비교 영역 또는 구역에 걸친 서열 갭 및 미스매치를 설명한다. 예시적인 프로그램 및 알고리즘이 하기에 제공된다.

본원에 사용된 용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)에 대한 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 의미한다. 숙주 세포는 "형질전환체", "형질전환된 세포" 및 "형질도입된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 또는 형질도입된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 숙주 세포 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 (형태에 있어서 또는 게놈 DNA 상보체에 있어서) 원래 모 세포와 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 항-E-셀렉틴 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)에 의해 생체내 형질감염 및/또는 형질전환된 세포를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "동일성" 또는 "동일한"은 중합체 분자 사이의, 예를 들어 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이의 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전체 관련성을 지칭한다. "동일성"은 컴퓨터 프로그램의 특정한 수학적 모델 (즉, "알고리즘")에 의해 다루어지는 갭 정렬을 갖는 2개 이상의 서열 사이의 동일한 매치의 퍼센트를 측정한다.

일부 실시양태에서, 중합체 분자는 그의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 경우에 서로 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다.

2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 퍼센트 동일성의 계산은, 예를 들어 최적 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다 (예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 비-동일 서열은 무시될 수 있음). 특정 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다. 이어서, 상응하는 위치의 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열 내의 한 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 잔기 (예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산)에 의해 점유되는 경우에, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.

퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 월드 와이드 웹 ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 상에서 이용가능한 BLAST를 포함한 방법 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 정렬될 수 있다. 다른 정렬 프로그램은 생물정보학 소프트웨어의 레이저진(Lasergene)® 스위트 (디엔에이스타(DNASTAR)®, 인크., 위스콘신주 매디슨)의 메그얼라인(MegAlign)® 프로그램을 포함한다. 또 다른 정렬 알고리즘은 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨팅 그룹 (GCG) 패키지에서 이용가능한 FASTA이다. 정렬을 위한 다른 기술은 문헌 [Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc.]에 기재되어 있다. 서열에 갭을 허용하는 정렬 프로그램이 특히 관심 대상이다. 스미스-워터맨(Smith-Waterman)은 서열 정렬에 갭을 허용하는 알고리즘의 한 유형이다. 문헌 [Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997)]을 참조한다. 또한, 니들만 및 분쉬(Needleman and Wunsch) 정렬 방법을 사용하는 GAP 프로그램이 서열을 정렬하는 데 이용될 수 있다. 문헌 [J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)]을 참조한다.

또한, 서열 동일성을 결정하는 데 문헌 [Smith and Waterman (1981, Advances in Applied Mathematics 2:482-489)]의 국부 상동성 알고리즘을 사용하는 베스트핏 프로그램이 관심 대상이다. 갭 생성 페널티는 일반적으로 1 내지 5, 통상적으로 2 내지 4의 범위일 것이고, 일부 실시양태에서 3일 것이다. 갭 연장 페널티는 일반적으로 약 0.01 내지 0.20의 범위일 것이고, 일부 경우에 0.10일 것이다. 프로그램은 비교되도록 입력된 서열들에 의해 결정된 디폴트 파라미터를 갖는다. 바람직하게는, 서열 동일성은 프로그램에 의해 결정된 디폴트 파라미터를 사용하여 결정된다. 이 프로그램은 또한 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨팅 그룹 (GCG) 패키지로부터 이용가능하다.

또 다른 관심 프로그램은 FastDB 알고리즘이다. FastDB는 문헌 [Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1988, Alan R. Liss, Inc.]에 기재되어 있다. 퍼센트 서열 동일성은 하기 파라미터에 기초하여 FastDB에 의해 계산된다: 미스매치 페널티: 1.00; 갭 페널티: 1.00; 갭 크기 페널티: 0.33; 및 연결 페널티: 30.0.

본원에 사용된 용어 "증가시키다", "개선시키다", "감소시키다" 또는 "경감시키다"는 기준선 측정치, 예컨대 본원에 기재된 치료의 개시 전 동일한 개체에서의 측정치 또는 본원에 기재된 치료의 부재 하의 대조군 개체 (또는 다수의 대조군 개체)에서의 측정치에 비교한 값을 나타낸다. 일부 실시양태에서, "대조군 개체"는 치료될 개체와 동일한 형태의 질환 또는 손상을 앓는 개체이다. 일부 실시양태에서, "대조군 개체"는 치료될 개체와 동일한 형태의 질환 또는 손상을 앓지 않는 개체이다.

본원에 사용된 용어 "단리된 분자" (여기서 분자는, 예를 들어 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편임)는 그의 유래 기원 또는 공급원에 의해 (1) 그의 천연 상태에서 동반되는 자연 회합 성분과 회합되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 분자가 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연에서 발생하지 않는 분자를 의미한다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 또는 그것이 자연적으로 기원한 세포와 상이한 세포 시스템에서 발현되는 분자는 그의 자연적으로 회합된 성분으로부터 "단리될" 것이다. 분자는 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 정제 기술을 사용하는 단리에 의해 자연적으로 회합된 성분이 실질적으로 없게 될 수 있다. 분자 순도 또는 균질성은 관련 기술분야에 널리 공지된 다수의 수단에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 샘플의 순도는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 폴리펩티드를 가시화하기 위한 겔의 염색을 사용하여 검정될 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위한 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 수단을 사용함으로써 보다 높은 해상도가 제공될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "리더 펩티드" 또는 "리더 서열" 또는 "리더 신호 서열" 또는 "신호 서열" (본원에서 상호교환가능하게 사용됨)은 핵산 분자의 5' 말단 상에 및/또는 폴리펩티드의 N-말단에 또는 그 근처에 존재할 수 있는 임의의 핵산 서열 또는 그에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 의미하며, 이는 존재하는 경우에, 세포로부터의 폴리펩티드의 분비를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 목적지 소기관으로의 폴리펩티드의 수송을 매개할 수 있다. 이러한 리더 서열은, 예를 들어 ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC (서열식별번호: 140) 및 ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTGGCAACAGCTACAGGCGTGCACTCC (서열식별번호: 141)를 포함하는 핵산 서열 및 그에 의해 코딩되는 아미노산 서열, 예컨대 비제한적으로 MGWSCIILFLVATATGVHS (서열식별번호: 129) 및 MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (서열식별번호: 130) 또는 다른 리더 서열, 예컨대 MGWSCIILFLVATATGAHS (서열식별번호: 131)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 폴리펩티드를 목적하는 소기관, 예를 들어 내형질 세망으로 수송하고/거나 세포로부터 분비될 수 있는, 관련 기술분야에 공지되어 있거나 확인될 이들 및 임의의 다른 리더 신호 (핵산 및 아미노산 서열)를 포괄한다. 일반적으로, 신호 펩티드는 성숙 폴리펩티드로부터 제거되고/거나 그에 존재하지 않는다.

본원에 사용된 용어 "잔기"는 단백질 및 그의 연관된 아미노산 정체에서의 위치를 의미한다. 예를 들어, 아스파라긴 297 (또한 Asn297로도 지칭됨, 또한 N297로도 지칭됨)은 인간 항체 IgG1 내의 잔기이다.

용어 "유사성"은 "동일성"에 관련된 개념이지만, 그와는 대조적으로 동일한 매치 및 보존적 치환 매치 둘 다를 포함하는 유사성의 척도를 지칭한다. 보존적 치환은 폴리펩티드에 적용되고 핵산 분자에는 적용되지 않기 때문에, 유사성은 폴리펩티드 서열 비교에만 적용된다. 2개의 폴리펩티드 서열이, 예를 들어 20개 중 10개의 동일한 아미노산을 가지며, 나머지는 모두 비-보존적 치환이라면, 퍼센트 동일성 및 유사성은 둘 다 50%일 것이다. 동일한 예에서, 보존적 치환이 있는 위치가 5개 더 있다면, 퍼센트 동일성은 여전히 50%이지만 퍼센트 유사성은 75%일 것이다 (20개 중 15개). 따라서, 보존적 치환이 있는 경우에, 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 유사성 정도는 그 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성보다 더 클 것이다.

본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다. 포유동물은 또한 농장 동물 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 닭 등), 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 E-셀렉틴의 그의 리간드에 대한 결합에 의해 매개되거나 그와 연관된 질환, 장애 또는 상태의 위험이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 질환, 장애 또는 상태, 예를 들어 SCD를 갖는 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 환자)는 SCD, SCD의 변이체 또는 SC 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 환자)는 HBSS, HBSC, HBS/β°thal, HBS/β⁺thal, HBS/HPHP, HBSE 또는 HBS-변이체 유전자형을 갖는다.

본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은, 대상 종이 존재하는 우세한 종이고 (즉, 몰 기준으로 조성물 중의 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부함), 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획은, 대상 종 (예를 들어, 항체 또는 수용체를 포함한 당단백질)이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50 퍼센트 (몰 기준)를 차지하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80 퍼센트 초과, 보다 바람직하게는 약 85%, 90%, 95% 및 99% 초과를 차지할 것이다. 가장 바람직하게는, 대상 종은 본질적으로 균질하게 정제되며 (오염물 종은 통상적인 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없음), 여기서 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 순수한 물질은 적어도 50% 순수하고 (즉, 오염물이 없음), 보다 바람직하게는 적어도 90% 순수하고, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수하고, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수하다.

본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체 "단편" 또는 "부분"은 말단절단에 의해, 예를 들어 폴리펩티드의 N 및/또는 C-말단 단부로부터 1개 이상의 아미노산의 제거에 의해 제조될 수 있다. 1, 2, 3, 4, 5개, 최대 10개, 최대 20개, 최대 30개, 최대 40개 또는 그 초과의 아미노산이 이러한 방식으로 N 및/또는 C 말단으로부터 제거될 수 있다. 단편은 또한 1개 이상의 내부 결실에 의해 생성될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 단량체 뉴클레오티드로 구성되거나 또는 그를 포함하는 임의의 분자를 상호교환가능하게 지칭한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA (예를 들어, 게놈 DNA, cDNA, 안티센스 DNA, mRNA, tRNA, rRNA 등)일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 화학적으로 변형될 수 있거나 인공적일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 펩티드 핵산 (PNA), 모르폴리노 및 잠금 핵산 (LNA), 뿐만 아니라 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)을 포함한다. 각각의 이들 서열은 분자의 백본에 대한 변화에 의해 자연 발생 DNA 또는 RNA와 구별된다. 또한, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 다른 데옥시뉴클레오티드 유사체는 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트, N3'-P5'-포스포르아미데이트 및 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트 및 그의 2'-0-알릴 유사체 및 2'-0-메틸리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트를 포함하며, 이는 본 개시내용의 뉴클레오티드 서열에 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "핵산 구축물"은 재조합 DNA 기술의 사용으로부터 생성된 비-자연 발생 핵산 분자 (예를 들어, 재조합 핵산)를 지칭한다. 핵산 구축물은 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합되고 배열된 핵산 서열의 절편을 함유하도록 변형된, 단일 또는 이중 가닥의 핵산 분자이다. 핵산 구축물은 "벡터" (예를 들어, 플라스미드), 즉 외인적으로 생성된 DNA를 숙주 세포 내로 전달하도록 설계된 핵산 분자일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 기능적 관계로의 폴리뉴클레오티드 (또는 폴리펩티드) 요소의 연결을 지칭한다. 핵산은 그가 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓이는 경우에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터 또는 다른 전사 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)은 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 작동가능하게 연결된은 연결된 핵산 서열이 인접한 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 작동가능하게 연결된은 핵산 서열이 인접하게 연결된 것을 의미하지 않고, 오히려 연결된 핵산 서열 사이에 개재 서열이 존재한다.

본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" (또한 본원에서 "핵산 분자"로도 지칭됨)는 포스포디에스테르 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 본원에서 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산 (DNA) 분자 또는 리보핵산 (RNA) 분자일 수 있고, 이중 가닥 분자, 단일 가닥 분자, 소형 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로 RNA, 소형 또는 짧은 간섭 RNA (siRNA), 트랜스-스플라이싱 RNA, 안티센스 RNA와 같은 모든 형태의 핵산을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 DNA 분자인 경우에, 그러한 분자는 유전자, cDNA, 안티센스 분자 또는 상기 분자 중 임의의 것의 단편일 수 있다. 뉴클레오티드 염기는 본원에서 단일 문자 코드로 표시된다: 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C), 이노신 (I) 및 우라실 (U). 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 폴리뉴클레오티드 (핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열)에 의해 코딩된, 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 자연 발생 단백질과 같은 전장 천연 서열, 뿐만 아니라 기능적 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체가 천연 전장 단백질의 기능성을 어느 정도 보유하는 한 그러한 기능적 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체를 지칭한다. 본 개시내용의 방법 및 용도에서, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 이러한 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 유전자 요법으로 치료되는 대상체에서 결함이 있거나 또는 그의 발현이 불충분하거나 또는 결핍되어 있는 내인성 단백질과 동일할 수 있지만, 동일할 것이 요구되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "예방하다" 또는 "예방"은 특정한 질환, 장애 또는 상태 (예를 들어, SCD)의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상 (예를 들어, 혈관-폐쇄성 발증, 통증)의 발병의 지연 및/또는 빈도 및/또는 중증도의 감소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 예방은, 특정한 질환, 장애 또는 상태에 걸리기 쉬운 집단에서 질환, 장애 또는 상태의 1종 이상의 증상의 발생, 빈도 및/또는 강도의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되는 경우에 작용제가 특정한 질환, 장애 또는 상태를 "예방"하는 것으로 간주되도록, 집단 기준으로 평가된다. 예방은 질환, 장애 또는 상태의 발병이 미리 정의된 기간 동안 지연된 경우에 완료된 것으로 간주될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "재조합"은 클로닝, 제한 또는 라이게이션 단계 (예를 들어, 그 안에 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련됨)의 다양한 조합 및/또는 자연에서 발견되는 생성물과 구별되는 구축물을 생성하는 다른 절차의 생성물인 벡터, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 특정한 질환, 장애 및/또는 상태 (예를 들어, SCD)의 1종 이상의 증상, 특색 및 원인을 부분적으로 또는 완전히 완화시키고/거나, 호전시키고/거나, 경감시키고/거나, 억제하고/거나, 그의 발병을 지연시키고/거나, 그의 중증도를 감소시키고/거나, 그의 발생률을 감소시키는 요법을 투여하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 목적하는 임상 결과는 하기 중 1개 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 개선된 생존율 (감소된 사망률), 조직 섬유증 양의 감소, 질환으로부터의 손상 정도의 감소, 질환 지속기간의 감소, 및/또는 질환과 관련된 증상의 수, 정도 또는 지속기간의 감소. 상기 용어는 질환의 증상, 합병증 또는 생화학적 징후의 발병을 방지 또는 지연시키거나, 증상을 완화시키거나 또는 질환, 상태 또는 장애의 추가 발생을 정지 또는 억제하기 위한 본 발명의 화합물 또는 작용제의 투여를 포함한다. 치료는 예방적 (질환의 발병을 방지 또는 지연시키거나 또는 그의 임상 또는 준임상 증상의 징후를 방지하기 위함) 또는 질환의 징후 후 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환, 상태 또는 장애는 SCD이다.

항체

"항체" 또는 "Ab"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 특이적 표적 또는 항원 (Ag), 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등을 인식하고 그에 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 주어진 항원 (예를 들어, E-셀렉틴)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 항원-결합 단편 (또는 부분), 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 임의의 유형의 항체를 포괄할 수 있다.

항체는 임의의 부류, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM (또는 그의 하위부류)의 항체를 포함하고, 항체는 임의의 특정한 부류일 필요는 없다. 중쇄의 불변 영역 (HC)의 항체 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5종의 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 나뉠 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체는 IgG1 항체이다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 널리 공지되어 있다.

항체는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 마우스, 래트 (예를 들어, 스프라그 돌리 래트) 등 또는 다른 동물, 예컨대 조류 (예를 들어, 닭), 어류 (예를 들어, 상어) 및 낙타류 (예를 들어, 라마)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 포유동물로부터 유래될 수 있다.

용어 "항원"은 면역적격 척추동물을 면역화시켜 항원을 인식하는 항체를 생산하거나 또는 발현 라이브러리 (예를 들어, 특히 파지, 효모 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하는 데 사용되는 분자 엔티티를 지칭한다. 본원에서, 항원은 보다 광범위하게 명명되고, 일반적으로 항체에 의해 특이적으로 인식되는 표적 분자를 포함하는 것으로 의도되며, 따라서 항체를 생성하기 위한 면역화 과정 또는 항체를 선택하기 위한 라이브러리 스크리닝에 사용되는 분자의 단편 또는 모방체를 포함한다. 따라서, E-셀렉틴에 결합하는 본 발명의 항체의 경우, 포유동물 종 (예를 들어, 인간, 원숭이 (시노몰구스 원숭이 포함), 마우스, 토끼 및 래트)으로부터의 전장 E-셀렉틴 (그의 단량체 및 다량체, 예컨대, 이량체, 삼량체 등 포함), E-셀렉틴의 말단절단된 변이체 및 다른 변이체 (예를 들어, 세포외 도메인), 뿐만 아니라 가용성 E-셀렉틴 및 세포 표면 발현된 E-셀렉틴이 본원에서 항원으로 지칭된다.

항체의 "항원-결합 단편"은 항원에 특이적으로 (바람직하게는 실질적으로 동일한 결합 친화도로) 결합하는 능력을 보유하는, 전장 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 제시되었다. 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., Nature 1989; 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 디술피드-연결된 Fv (dsFv) 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 및 인트라바디를 포함한다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨)로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있으며; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., Science 1988; 242:423-426 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1988 USA 85:5879-5883]을 참조한다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디가 또한 포괄된다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인이 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하게 하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하는 2가의 이중특이적 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:6444-6448; Poljak et al., Structure 1994; 2:1121-1123] 참조).

항체 "가변 도메인"은 항체 경쇄의 가변 영역 (VL) 또는 항체 중쇄의 가변 영역 (VH)을 단독으로 또는 조합으로 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 3개의 "상보성 결정 영역" (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어지고, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 특히 CDR 영역 외부의 (즉, 프레임워크 영역 내의) 아미노산 잔기에서의 치환을 갖는 대상 가변 영역의 변이체가 요망되는 경우에, 대상 가변 영역을 대상 가변 영역과 동일한 정규 부류의 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변 영역과 비교함으로써 적절한 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 확인할 수 있다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196(4): 901-917).

가변 도메인 내의 잔기는 전형적으로 카바트에 따라 넘버링되며, 이는 항체 컴파일링의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용되는 넘버링 시스템을 제공한다. 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]을 참조한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 그 내로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따라 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따라 잔기 82a, 82b 및 82c)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체에 대해 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬함으로써 결정될 수 있다. 카바트 넘버링을 배정하기 위한 다양한 알고리즘이 이용가능하다. 예를 들어, 아비시스(Abysis)의 버전 2.3.3 출시물 (www.abysis.org)에서 구현된 알고리즘을 사용하여 카바트 넘버링을 가변 영역 LCDR-1, LCDR-2, LCDR-3, HCDR-2 및 HCDR-3에 배정할 수 있고, 이어서 AbM 정의를 HCDR-1에 사용할 수 있다.

특정 실시양태에서, CDR의 명확한 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 항체의 구조를 해석하고/거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해석함으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 기술, 예컨대 X선 결정학에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 다양한 분석 방법이 CDR 영역을 확인하거나 근사화하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예는 카바트 정의, 코티아 정의, AbM 정의, 접촉 정의 및 입체형태적 정의를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"상보성 결정 영역" (CDR)은 카바트, 코티아의 정의, 카바트 및 코티아 둘 다의 축적, AbM, 접촉, 노스 및/또는 입체형태적 정의 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 CDR 결정 방법에 따라 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. (초가변 영역); Chothia et al., Nature 1989; 342:877-883 (구조적 루프 구조)]을 참조한다. CDR을 구성하는 특정한 항체 내의 아미노산 잔기의 정체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. CDR의 AbM 정의는 카바트와 코티아 사이의 절충안이고, 옥스포드 몰레큘라 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (엑셀리스(Accelrys)®)를 사용한다.

CDR의 "접촉" 정의는 문헌 [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 1996; 262:732-745]에 제시된 관찰된 항원 접촉에 기초한다. CDR의 "입체형태적" 정의는 항원 결합에 엔탈피 기여를 하는 잔기에 기초한다 (예를 들어, 문헌 [Makabe et al., J. Biol. Chem., 2008; 283:1156-1166] 참조). 노스는 CDR 정의의 상이한 바람직한 세트를 사용하여 정규 CDR 입체형태를 확인하였다 (North et al., J. Mol. Biol. 2011; 406:228-256). 본원에서 CDR의 "입체형태적 정의"로 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 엔탈피 기여를 하는 잔기로서 확인될 수 있다 (Makabe et al., J. Biol. Chem. 2008, 283:1156-1166). 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 카바트 CDR의 적어도 일부와 중첩될 것이며, 특정한 잔기 또는 잔기의 군 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수도 있다. 본원에 사용된 CDR은 접근법들의 조합을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 방법은 임의의 이들 접근법에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시양태에서, CDR (또는 항체의 다른 잔기)은 카바트, 코티아, 노쓰, 연장, AbM, 접촉 및/또는 입체형태적 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.

항체 또는 그에 의해 특이적으로 결합된 항원과 관련하여 본원에 사용된 "접촉 잔기"는 동족 항체/항원 상에 존재하는 아미노산 잔기의 중원자의 4 Å 이하 이내에 있는 적어도 1개의 중원자 (즉, 수소가 아님)를 포함하는 항체/항원 상에 존재하는 아미노산 잔기를 지칭한다.

"프레임워크" (FR) 잔기는 CDR 잔기 이외의 다른 항체 가변 도메인 잔기이다. VH 또는 VL 도메인 프레임워크는 하기 구조에서 CDR 사이에 배치된 4개의 프레임워크 하위영역인 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 단독으로 또는 조합으로 지칭한다.

본원에 상호교환가능하게 사용된 용어 "IgG Fc 영역", "Fc 영역", "Fc 도메인" 및 "Fc"는 이뮤노글로불린 (Ig) 분자의 파파인 소화에 의해 수득된 결정화가능한 단편과 상관관계가 있는 Ig 분자의 부분을 지칭한다. 본원에 사용된 상기 용어는 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역에 관한 것이고, 추가로 그 영역의 부분에 관한 것이다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대해 N-말단인 가요성 힌지, 또는 그의 부분을 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다.

IgG의 경우, Fc는 이뮤노글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 (C 감마 2 및 C 감마 3) 및 Cγ1 (C 감마 1)과 Cγ2 (C 감마 2) 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 잔기 C226 또는 P230에서 그의 카르복실-말단까지를 포함하는 것으로 정의되며, 여기서 넘버링은 문헌 [Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1969; 63(1):78-85]의 EU 인덱스에 따르고 문헌 [Kabat et al., 1991]에 기재된 바와 같다. 전형적으로, Fc 도메인은 인간 IgG1 불변 도메인의 아미노산 잔기 약 236에서 약 447을 포함한다. 예시적인 인간 야생형 IgG1 Fc 도메인 아미노산 서열은 서열식별번호: 16 및 서열식별번호: 15 (임의적인 말단 리신 (K) 잔기 포함)에 제시된다. Fc 폴리펩티드는 단리된 이 영역을 지칭할 수 있거나, 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 Fc 융합 단백질의 맥락에서의 이 영역을 지칭할 수 있다.

중쇄 불변 도메인은 Fc 영역을 포함하고, 추가로 IgG 중쇄의 CH1 도메인 및 힌지뿐만 아니라 CH2 및 CH3 (및 임의로 IgA 및 IgE의 CH4) 도메인을 포함한다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 1개의 이펙터 기능을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향-조절, B 세포 활성화 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인 또는 그의 항원-결합 단편)과 조합될 것을 요구하고, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.

본원에 사용된 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 일부 실시양태에서, FcγR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하며, 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 1997; 15:203-234] 참조). FcR은, 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 1991; 9:457-92; Capel et al., Immunomethods 1994; 4:25-34; 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 1995; 126:330-41]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함한 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 (Guyer et al., J. Immunol. 1976; 117:587 및 Kim et al., J. Immunol. 1994; 24:249) 및 이뮤노글로불린의 항상성의 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward., Immunol. Today 1997; 18(12):592-598; Ghetie et al., Nature Biotechnology, 1997; 15(7):637- 640; Hinton et al., J. Biol. Chem. 2004; 279(8):6213-6216]; WO 2004/92219 참조).

"인간 이펙터 세포"는 1개 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.

본원에 사용된 "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR) 상에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하도록 하고 후속적으로 표적 세포를 세포독소로 사멸시키도록 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 5,500,362, 5,821,337 또는 6,737,056에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1998; 95:652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 및 증가 또는 감소된 ADCC 활성을 갖는 추가의 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,923,538 및 미국 특허 번호 7,994,290에 기재되어 있다.

"증진된 ADCC 활성"을 갖는 항체는 모 항체와 비교하여 시험관내 또는 생체내에서 ADCC를 매개하는 데 더 효과적인 항체를 지칭하며, 여기서 항체 및 모 항체는 적어도 1개의 구조적 측면에서 상이하고, 검정에 사용되는 이러한 항체 및 모 항체의 양은 본질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 항체 및 모 항체는 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 항체는 비-푸코실화된 반면, 모 항체는 푸코실화된다. 일부 실시양태에서, ADCC 활성은 본원에 개시된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 사용하여 결정될 것이지만, 예를 들어 동물 모델 등에서 ADCC 활성을 결정하기 위한 다른 검정 또는 방법이 고려된다. 일부 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항체는 Fc 감마 RIIIA에 대해 증진된 친화도를 갖는다.

"변경된" FcR 결합 친화도 또는 ADCC 활성을 갖는 항체는 모 항체와 비교하여 증진 또는 감소된 FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성을 갖는 것이며, 여기서 항체 및 모 항체는 적어도 1개의 구조적 측면에서 상이하다. FcR에 대해 "증가된 결합을 나타내는" 항체는 모 항체보다 더 나은 친화도로 적어도 1개의 FcR에 결합한다. FcR에 대해 "감소된 결합을 나타내는" 항체는 모 항체보다 더 낮은 친화도로 적어도 1개의 FcR에 결합한다. FcR에 대해 감소된 결합을 나타내는 이러한 항체는 FcR에 대해 인지가능한 결합을 거의 또는 전혀 보유하지 않을 수 있고, 예를 들어 천연 서열 IgG Fc 영역과 비교하여 FcR에 대해 0-20 퍼센트 결합을 보유할 수 있다.

"FcγRIIIA에 대한 증진된 친화도"는 모 항체보다 FcγRIIIA에 대해 더 큰 친화도를 갖는 항체를 지칭하며, 여기서 항체 및 모 항체는 적어도 1개의 구조적 측면에서 상이하다.

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전형적 보체 경로의 활성화는 그의 동족 항원에 결합되는 (적절한 하위부류의) 항체에 대한 보체계의 제1 성분 (Clq)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 1996; 202:163]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 및 증가 또는 감소된 Clq 결합 능력을 갖는 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, 미국 특허 번호 7,923,538, 미국 특허 번호 7,994,290 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체가 중쇄 폴리펩티드 상에 C-말단 리신 (K) 아미노산 잔기를 포함하는 (예를 들어, 인간 IgG1 중쇄가 말단 리신을 포함하는) 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 리신 잔기가 클립핑되어 C-말단 리신 잔기가 결여된 중쇄를 갖는 항체가 생성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가적으로, 항체 중쇄는 리신을 코딩하지 않는 핵산을 사용하여 생산될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 그렇지 않으면 존재할 말단 리신이 존재하지 않는 중쇄를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인은 IgA (예를 들어, IgA₁ 또는 IgA₂), IgD, IgE, IgM 또는 IgG (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 및 IgG 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444)는 IgG₁ 항체이다.

"Fc 융합" 단백질은 1종 이상의 폴리펩티드가 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 단백질이다. Fc 융합체는 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 융합 파트너와 조합한 것이다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 1개의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함하지만, 천연 서열 Fc 영역의 적어도 1개의 이펙터 기능을 보유한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 동일성을 보유할 것이다.

"에피토프"는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 통상적인 면역검정에 의해 또는 본 개시내용의 실시예 9 및 10에 기재된 바와 같이 결정 시, 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 구역 또는 영역, 예를 들어 항체와 상호작용하는 잔기를 포함하는 구역 또는 영역을 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조의 해석, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함한, 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하고 특징화하기 위한 많은 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 추가의 예에서, 에피토프 맵핑을 사용하여 항-E-셀렉틴 항체가 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급원, 예를 들어 펩스캔 시스템즈(Pepscan Systems) (네덜란드 8219 PH 렐리스타트 에델헤르트베크 15)로부터 상업적으로 입수가능하다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특징화는 바람직한 에피토프에 관한 정보를 규명할 수 있다. 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 대한 결합을 알아보기 위해 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 접근법은 E-셀렉틴에의 결합에 대해 서로 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체, 예를 들어 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 찾아내기 위한 경쟁 및 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다.

추가로, 항-E-셀렉틴 항체가 결합하는 에피토프는 E-셀렉틴 (예를 들어, 인간 E-셀렉틴 서열)으로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하고 항체에 의한 결합을 측정하는 것에 의한 체계적 스크리닝에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, E-셀렉틴을 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 무작위로 또는 특이적 유전자 구축에 의해 단편화될 수 있고, 발현된 E-셀렉틴 단편과 시험될 항체의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은, 예를 들어 PCR에 의해 생성된 다음, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관내에서 전사되고 단백질로 번역될 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 E-셀렉틴 단편에 대한 항체의 결합이 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다.

파지 입자 (파지 라이브러리) 또는 효모 (효모 디스플레이)의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리를 사용함으로써 특정 에피토프가 또한 확인될 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 규정된 라이브러리가 간단한 결합 검정에서 시험 항체에의 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가의 예에서, 항원의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 에피토프 결합에 요구되고/거나 충분하고/거나 필요한 잔기를 확인할 수 있다.

그의 가장 상세한 수준에서, 항원과 항체 사이의 상호작용에 대한 에피토프는 항원-항체 상호작용에 존재하는 원자 접촉을 규정하는 공간 좌표, 뿐만 아니라 결합 열역학에 대한 그의 상대 기여도에 대한 정보에 의해 규정될 수 있다. 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 항원과 항체 사이의 원자 접촉을 규정하는 공간 좌표에 의해 특징화될 수 있다. 추가의 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 특정 기준에 의해, 예를 들어 항체 및 항원 내의 원자 (예를 들어, 중원자, 즉 비-수소 원자) 사이의 거리에 의해 규정되는 바와 같은, 그것이 포함하는 아미노산 잔기에 의해 특징화될 수 있다. 추가의 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 기능을 통해, 예를 들어 다른 항체와의 경쟁 결합에 의해 특징화될 수 있다. 에피토프는 또한 보다 일반적으로, 또 다른 아미노산에 의한 치환이 항체와 항원 사이의 상호작용의 특징을 변경시킬 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 정의될 수 있다 (예를 들어 알라닌 스캐닝 사용).

사용된 에피토프 맵핑 방법에 따라 에피토프의 설명 및 정의가 상이한 상세 수준에서 수득된다는 사실로부터, 동일한 항원 상의 상이한 항체에 대한 에피토프의 비교가 상이한 상세 수준에서 유사하게 수행될 수 있다는 결론이 나온다.

아미노산 수준에서 기재된, 예를 들어 X선 결정학, 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법, 수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (H/D-MS)으로부터 결정된 에피토프는 이들이 동일한 세트의 아미노산 잔기를 함유하는 경우에 동일한 것으로 언급된다. 에피토프가 적어도 1개의 아미노산을 공유하는 경우에 에피토프는 중첩되는 것으로 언급된다. 에피토프가 아미노산 잔기를 전혀 공유하지 않는 경우에 에피토프는 별개의 (고유한) 것으로 언급된다.

항-E-셀렉틴 항체를 특징화하는 데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 동일한 항원에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체와의 경쟁 검정 (예를 들어, 본 개시내용의 실시예 9에 기재된 바와 같은 것)을 사용하여, 항-E-셀렉틴 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하는 것이다. 경쟁 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 경쟁 결합에 의해 특징화된 에피토프는 상응하는 항체의 결합이 상호 배타적인 경우에, 즉 하나의 항체의 결합이 다른 항체의 동시 또는 연속 결합을 배제하는 경우에 중첩되는 것으로 언급된다. 에피토프는 항원이 둘 다의 상응하는 항체의 결합을 동시에 수용할 수 있는 경우에 별개의 (고유한) 것으로 언급된다.

에피토프는 선형 또는 입체형태적일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자 (예컨대 항체) 사이의 상호작용의 모든 지점은 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생한다. "비선형 에피토프" 또는 "입체형태적 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원 단백질 내의 비인접 폴리펩티드 (또는 아미노산)를 포함한다.

항체의 결합 친화도는 특정한 항원-항체 상호작용의 해리율을 지칭하는 K_D 값으로 표현될 수 있다. K_D는 "온-레이트 (k_on)" 또는 "k_a"로도 불리는 회합률 대비 "오프-레이트 (k_off)" 또는 "k_d"로도 불리는 해리율의 비이다. 따라서, K_D는 k_off/k_on (또는 k_d/k_a)와 동일하고, 몰 농도 (M)로서 표현되며, K_D가 작을수록, 결합 친화도가 더 강하다. 항체에 대한 K_D 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. K_D를 측정하기 위한 하나의 예시적인 방법은 전형적으로 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(BIACORE)® 시스템을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)이다. 비아코어 동역학적 분석은 표면 상에 고정화된 분자 (예를 들어 에피토프 결합 도메인을 포함하는 분자)를 갖는 칩으로부터의 항원의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다. 항체의 K_D를 결정하는 또 다른 방법은 전형적으로 옥테트 기술 (옥테트 QKe 시스템(Octet QKe system), 포르테바이오(ForteBio))을 사용하는 생물층 간섭측정법을 사용하는 것이다. 대안적으로 또는 추가로, 사피다인 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments) (아이다호주 보이시)로부터 이용가능한 키넥사(KinExA) (동역학적 배제 검정) 검정이 또한 사용될 수 있다.

에피토프에 "우선적으로 결합"하거나 "특이적으로 결합" (본원에서 상호교환가능하게 사용됨)하는 항체는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법은 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 분자 (예를 들어, 단백질, 핵산, 항체 등)는 그것이 대안적 세포 또는 물질보다 특정한 세포 또는 물질과 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 긴 지속기간으로 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 회합하는 경우에, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 용이하게 및/또는 더 긴 지속기간으로 결합하는 경우에, 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, E-셀렉틴 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 P-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 에피토프를 포함한 다른 E-셀렉틴 에피토프 또는 비-E-셀렉틴 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 용이하게 및/또는 더 긴 지속기간으로 특정한 에피토프에 결합하는 항체이다. 따라서, 지정된 검정 조건 하에, 명시된 결합 모이어티 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 수용체 또는 그의 리간드 결합 단편)가 특정한 표적 분자에 우선적으로 결합하며, 시험 샘플 중에 존재하는 다른 성분에는 유의한 양으로 결합하지 않는다. 일반적으로, 반드시는 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.

다양한 검정 포맷이 관심 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩티드를 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항원 또는 수용체와 특이적으로 반응하는 항체, 또는 동족 리간드 또는 결합 파트너와 특이적으로 결합하는 그의 리간드 결합 단편을 확인하는 데 사용될 수 있는 많은 검정 중에서, 고체-상 ELISA 면역검정 (경쟁 결합 ELIA 포함), 알파리사(AlphaLISA)® 면역검정 (퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)), 면역침전, 비아코어™ (지이 헬스케어(GE Healthcare), 뉴저지주 피스카타웨이), 형광-활성화 세포 분류 (FACS), 옥테트™ (포르테바이오, 인크., 캘리포니아주 멘로 파크) 및 웨스턴 블롯 분석이 있다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈의 적어도 2배, 보다 전형적으로 배경의 10배 초과, 배경의 50배 초과, 배경의 1000배 초과 또는 그 초과일 것이다. 항체는 평형 해리 상수 (K_D)가 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 100 pM인 경우에, 항원에 "특이적으로 결합"하는 것으로 언급된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 E-셀렉틴 (예를 들어, 인간 E-셀렉틴)에 <70 nM (예를 들어, 68.4 +/- 3.18 nM)의 K_D로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 E-셀렉틴 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴)에 <68 nM (예를 들어, 64.9 +/- 1.13 nM)의 K_D로 결합한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 인간 E-셀렉틴에 약 92.85 nM, 약 70.3 nM, 약 65.2 nM, 약 61.8 nM, 약 60.5 nM, 약 68.0 nM, 약 21.6 nM, 약 324 nM, 약 54.4 nM, 약 628.5 nM 및 2940 nM로 이루어진 군으로부터 선택된 K_D로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 약 138.5 nM, 약 78.3 nM, 약 76.5 nM, 약 81.5 nM, 약 67.8 nM, 약 45.8 nM, 약 243.5 nM, 약 45.4 nM, 약 492 nM 및 3145 nM의 군으로부터 선택된 K_D로 결합한다.

항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다"는 항원에 대한 제1 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합이 제2 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의한 동일한 항원의 후속 결합을 감소시킨다는 것을 의미한다. 제2 항체의 항원에 대한 결합이 또한 제1 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 대안이 있을 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 즉, 제2 항체가 제1 항체의 그의 각각의 에피토프에 대한 결합을 억제하지 않으면서 제1 항체가 제2 항체의 항원에 대한 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 동일한 정도로든, 보다 큰 정도로든 또는 보다 적은 정도로든 검출가능하게 억제하는 경우에, 항체는 그의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체 둘 다가 본 발명에 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 발생하는 메카니즘 (예를 들어, 입체 장애, 입체형태적 변화, 또는 공통 에피토프 또는 그의 단편에 대한 결합)에 관계없이, 통상의 기술자는 본원에 제공된 교시에 기초하여, 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포괄되고 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.

표준 경쟁 검정을 사용하여 2종의 항체가 서로 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다. 항체 경쟁에 대한 하나의 적합한 검정은, 전형적으로 바이오센서 시스템 (예컨대 비아코어 시스템)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술을 사용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기술의 사용을 수반한다. 예를 들어, SPR은 하나의 항체가 제2 항체의 결합을 억제하는 능력을 결정하기 위한 시험관내 경쟁적 결합 억제 검정에 사용될 수 있다. 항체 경쟁을 측정하기 위한 또 다른 검정은 ELISA-기반 접근법을 사용한다.

추가로, 경쟁에 기초하여 항체를 "비닝"하기 위한 고처리량 과정이 국제 특허 출원 번호 WO2003/48731에 기재되어 있다. 하나의 항체 (또는 단편)가 E-셀렉틴에 대한 또 다른 항체 (또는 단편)의 결합을 감소시키는 경우에 경쟁이 존재한다. 예를 들어, 순차적 결합 경쟁 검정이 사용될 수 있으며, 상이한 항체가 순차적으로 첨가된다. 제1 항체는 포화에 근접한 결합에 도달할 때까지 첨가될 수 있다. 이어서, 제2 항체가 첨가된다. 제2 항체의 E-셀렉틴에 대한 결합이 검출되지 않거나 또는 제1 항체 부재 하의 병행 검정 (이 값은 100%로 설정될 수 있음)과 비교하여 유의하게 감소 (예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90% 감소)되는 경우에, 2종의 항체는 서로 경쟁하는 것으로 간주된다.

용어 "파라토프"의 정의는 상기 "에피토프"의 정의로부터 관점을 역전시킴으로써 유래된다. 따라서, 용어 "파라토프"는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 상의 구역 또는 영역, 즉 본원의 다른 곳에서 "접촉"으로서 정의된 바와 같이 항원 (E-셀렉틴 또는 그의 단편)과 접촉하는 항체 상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 주어진 항체/항원 쌍에 대한 파라토프는 상용 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 항체 및 표적 분자가 조합될 수 있고, 항체/항원 복합체가 결정화될 수 있다. 복합체의 결정 구조가 결정될 수 있고, 이를 사용하여 항체와 그의 표적 사이의 상호작용의 특이적 부위가 확인될 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체는 "변이체 항체"이다. 변이체 항체는 본원, 특히 표 2에 개시된 구체적 서열 및 단편으로부터 1, 2, 3, 4, 5개, 최대 10개, 최대 20개, 최대 30개 또는 그 초과의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. "결실" 변이체는 개별 아미노산의 결실, 작은 아미노산 군, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 결실, 또는 보다 큰 아미노산 영역의 결실, 예컨대 특정 아미노산 도메인 또는 다른 특징부의 결실을 포함할 수 있다. "삽입" 변이체는 개별 아미노산의 삽입, 작은 아미노산 군, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 삽입, 또는 보다 큰 아미노산 영역의 삽입, 예컨대 특정 아미노산 도메인 또는 다른 특징부의 삽입을 포함할 수 있다. "치환" 변이체는 바람직하게는 1개 이상의 아미노산을 동일한 수의 아미노산으로 대체하고 보존적 아미노산 치환을 만드는 것을 수반한다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 특성을 갖는 대안적 아미노산, 예를 들어 또 다른 염기성 아미노산, 또 다른 산성 아미노산, 또 다른 중성 아미노산, 또 다른 하전된 아미노산, 또 다른 친수성 아미노산, 또 다른 소수성 아미노산, 또 다른 극성 아미노산, 또 다른 방향족 아미노산 또는 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다.

치환 변이체는 항체 분자 내의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것이다. 치환 돌연변이유발을 위한 가장 큰 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 변경이 또한 고려된다. 보존적 치환이 표 1에 제시되어 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 유발한다면, 하기에 제시되거나 또는 아미노산 부류와 관련하여 하기에 추가로 기재된 바와 같은 "예시적인 치환"으로 명명된 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물이 스크리닝될 수 있다.

표 1

아미노산 및 치환

항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 치환 구역에서 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어 베타-시트 또는 나선 입체형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통 측쇄 특성에 기초하여 하기 군으로 나뉜다:

i. 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

ii. 비하전 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

iii. 산성 (음으로 하전됨): Asp, Glu;

iv. 염기성 (양으로 하전됨): Lys, Arg;

v. 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

vi. 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.

비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것에 의해 이루어진다.

예를 들어, 이루어질 수 있는 한 유형의 치환은 화학적으로 반응성일 수 있는 항체 내의 1개 이상의 시스테인을 또 다른 잔기, 예컨대 비제한적으로 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 예를 들어, 비-정규 시스테인의 치환이 있을 수 있다. 치환은 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 정규 시스테인이다. 항체의 적절한 입체형태를 유지하는데 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한, 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교를 방지하기 위해, 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에, 그의 안정성을 개선시키기 위해 시스테인 결합(들)이 항체에 부가될 수 있다.

"배선화"로 공지된 과정에서, VH 및 VL 서열 내의 특정 아미노산이 배선 VH 및 VL 서열에서 자연적으로 발견되는 것과 매칭되도록 돌연변이될 수 있다. 특히, VH 및 VL 서열 내의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 항체가 투여되는 경우에 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 배선 서열과 매칭되도록 돌연변이될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "배선"은 항체 유전자 및 유전자 절편이 배세포를 통해 모체로부터 자손으로 전달될 때 그의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 지칭한다. 이러한 배선 서열은 B 세포 성숙 과정 동안 재조합 및 과다돌연변이 사건에 의해 변경된 성숙 B 세포에서 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 구별된다. 특정한 배선을 "이용하는" 항체는 그러한 배선 뉴클레오티드 서열과 또는 그것이 구체화하는 아미노산 서열과 가장 가깝게 정렬되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 항체는 배선 서열과 비교하여 빈번하게 돌연변이된다. 인간 VH 및 VL 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, "Vbase" 인간 배선 서열 데이터베이스 참조; 또한 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 1992; 227:776-798; 및 Cox et al., Eur. J. Immunol. 1994; 24:827-836] 참조).

E-셀렉틴에 대한 항체

본 개시내용은 E-셀렉틴에 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. E-셀렉틴은 또한 CD62 항원-유사 패밀리 구성원 E (CD62E), 내피-백혈구 부착 분자 1 (ELAM-1) 또는 백혈구-내피 세포 부착 분자 2 (LECAM2)로도 공지되어 있다.

본원에 사용된 용어 "E-셀렉틴"은 인간 E-셀렉틴의 변이체, 이소형, 상동체, 오르토로그 및 파라로그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 이외의 다른 종으로부터의 E-셀렉틴, 예컨대 시노몰구스 원숭이의 E-셀렉틴, 뿐만 아니라 상이한 형태의 E-셀렉틴과 교차-반응한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 E-셀렉틴에 대해 완전히 특이적일 수 있고, 종 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있거나 (예를 들어, 마우스 E-셀렉틴에 결합하지 않음) 또는 다른 유형의 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다 (예를 들어, P-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴에 결합하지 않음). 본원에 사용된 용어 E-셀렉틴은 문맥상 달리 지시되지 않는 한 자연 발생 인간 E-셀렉틴을 지칭한다. 따라서, "E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편", "항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편" 또는 다른 유사한 명칭은 E-셀렉틴, 그의 이소형, 단편 또는 유도체와 특이적으로 및/또는 우선적으로 회합, 결합 또는 반응하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (본원에 정의된 바와 같음)을 의미한다. 유니프롯KB/스위스-프롯 수탁 번호 P16581 (아미노산 22-610)로 나타내어지는 전장 성숙 형태의 인간 E-셀렉틴은 본원에서 서열식별번호: 132로 제공된다. 유니프롯KB/스위스-프롯 수탁 번호 Q00690 (아미노산 22-612)으로 나타내어지는 전장 성숙 형태의 마우스 E-셀렉틴은 본원에서 서열식별번호: 134로 제공된다. 유니프롯KB/스위스-프롯 수탁 번호 G8F370 (아미노산 22-610)으로 나타내어지는 전장 성숙 형태의 시노몰구스 E-셀렉틴은 본원에서 서열식별번호: 201로 제공된다.

E-셀렉틴은 내피 세포 상에서 발현되고, L-셀렉틴은 백혈구 미세융모 상에서 구성적으로 발현되고, P-셀렉틴은 혈소판의 α-과립 및 내피 세포의 바이벨-펠라드 소체에 저장된다 (Tedder et al., FASEB J. 1995; 9:866-873; Kanas et al., Blood 1996; 88:3259-3287). 이들은 모두 당단백질 또는 당지질 상에 시알릴 루이스 (sLex) 결정기를 갖는 탄수화물 구조에 결합한다 (Chase et al., Ann. Biomed. Eng. 2012; 40(4):849-885). P- 및 L-셀렉틴은 또한 최적의 결합을 위해 리간드 상의 황산화를 요구하는 반면, 리간드에 대한 E-셀렉틴 결합은 시알릴 루이스 결정기만을 요구하면서 보다 허용적이다. P-셀렉틴 당단백질 리간드-1 (PSGL-1)은 백혈구 상에서 발현되고, 모든 셀렉틴에 결합한다. E-셀렉틴은 또한 L-셀렉틴 리간드, CD44 및 E-셀렉틴 리간드-1 (ESL-1)을 포함한 리간드와 상호작용한다 (Chase et al., Ann. Biomed. Eng. 2012; 40(4):849-885; Hidalgo et al., Immunity 2007; 26(4):477-489).

내피 세포에 의한 E-셀렉틴의 발현은 저산소증 또는 염증성 자극에 반응하여 새로운 단백질 합성을 요구한다. E-셀렉틴은 내피에 대한 호중구 부착 및 활성화된 αMβ2 인테그린의 분극화된 발현을 일으키는 내피 상의 활성화 신호 파의 생성에 중요하다 (Hidalgo et al., Nat. Med. 2009; 15:384-391; Pruenster et al., Nat. Commun. 2015; 6:6915; Manwani, & Frenette, Blood 2014; 122:3892-3898). E-셀렉틴-결핍 마우스는 야생형 마우스와 구별가능한 명백한 표현형을 나타내지 않는다 (Labow et al., Immunity 1994; 1:709-720).

내피 세포 E-셀렉틴에 추가로, 가용성 E-셀렉틴 (sE-셀렉틴)이 순환계에서 발견된다. 순환계 내로의 sE-셀렉틴 방출 메카니즘은 효소적 절단일 수 있거나 또는 손상되거나 활성화된 내피 세포의 쉐딩(shedding)으로부터 유발될 수 있으나; 정확한 메카니즘은 공지되어 있지 않다 (Roldan et al., Thromb. Haemost. 2003; 90:1007-1020). sE-셀렉틴의 농도는 내피 세포의 표면 상에서의 그의 발현과 상관관계가 있는 것으로 보이며, 따라서 혈장 sE-셀렉틴 농도는 내피 세포 손상 또는 활성화의 마커일 수 있다 (Leeuwenberg et al., Immunology 1992; 77(4):543-549; Roldan et al., Thromb. Haemost. 2003; 90:1007-1020). 순환 가용성 E-셀렉틴 수준의 증가된 수준은 고혈압, 당뇨병 및 고지혈증을 포함한 다수의 질환 상태에서 발견되었다 (Roldan et al., Thromb. Haemost. 2003; 90:1007-1020). 카토(Kato) 등은 160명의 SCD 환자 및 41명의 대조군 대상체를 연구하였고, 가용성 E-셀렉틴이 대조군과 비교하여 SCD 환자의 혈장에서 유의하게 상승하였다는 것을 발견하였다 (중앙값 74.6, 41.5 ng/mL, p<0.001) (British J. Haem. 2005; 130:943-953). 경도 및 중등도 수준의 폐고혈압은 sE-셀렉틴의 선형 농도와 유의하게 연관되었고, SCD 환자에서 초기 사망에 대한 상대 위험이 증가되었다 (RR 4.2; 95% CI 2.0, 8.9) (Kato et al.).

바람직하게는, 본 개시내용의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 E-셀렉틴에 결합하지만, 다른 셀렉틴 (예를 들어, P-셀렉틴, L-셀렉틴)에는 결합하지 않거나 또는 보다 낮은 친화도로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하고, 보다 바람직하게는 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 특이적으로 결합한다. 본 개시내용은 또한 이러한 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 치료 및 제약 용도를 포함한 이러한 항체의 용도를 제공한다.

항-E-셀렉틴 항체, 바람직하게는 고친화도 항체 (예를 들어, 특이적 항체)는 혈관계 및 다중 조직 구획에서 효과적일 수 있으며, 여기서 E-셀렉틴은 내피 세포의 표면 상에서 발현되거나 또는 가용성 형태로 발견되고, E-셀렉틴 리간드를 발현하는 표적 세포 (예를 들어, 호중구, 단핵구, 호산구, 기억-이펙터 T-유사 림프구, 자연 킬러 세포, 골수 세포)와 상호작용하는 것으로 생각된다. 본 개시내용의 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 시알릴 루이스 (sLex) 결정기 (예를 들어, α2,3 시알릴화 및 α1,3 또는 α1,4 푸코실화 테트라사카라이드 시알릴 루이스 x)를 갖는 당단백질 또는 당지질, 시알릴 루이스 A 결정기, E-셀렉틴 리간드-1 (ESL-1), L-셀렉틴, CD44, P-셀렉틴 당단백질 리간드-1 (PSGL-1), 리소솜-연관 막 단백질 1 (LAMP1), 리소솜-연관 막 단백질 2 (LAMP2), 사멸 수용체-3 (DR3) 및 αMβ2 인테그린 (CD11b/CD18; Mac-1)을 포함한 리간드에 대한 E-셀렉틴의 결합을 억제하는 잠재력을 갖는다 (Chase et al., Annals Biomed. Engin. 2012; 40(4): 849-859). 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, E-셀렉틴 세포 리간드 상호작용의 차단은 내피에 대한 백혈구 (예를 들어, 호중구) 부착을 억제함으로써 세포 응집체가 혈류를 차단하여 VOC로 이어지는 것을 방지한다.

중화 또는 "차단" 항체는 E-셀렉틴에 대한 그의 결합이 (i) E-셀렉틴 또는 E-셀렉틴 단편과 E-셀렉틴 리간드, 예컨대 sLex 결정기 사이의 상호작용을 방해하거나, 제한하거나 또는 억제하고/거나; (ii) E-셀렉틴 결합의 적어도 1개의 생물학적 기능의 억제를 유발하는 항체를 지칭한다. 본 개시내용의 항체에 의한 중화를 결정하기 위한 검정은 본원의 다른 곳에 기재되어 있고, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

E-셀렉틴의 "생물학적 기능" 또는 "생물학적 활성"은 백혈구 테더링, 느린 롤링 및 내피 세포에 대한 백혈구의 안정한 부착의 활성화, 염증 부위에서의 선택적이고 효율적인 혈관외유출 신호전달을 포함하는 것으로 의도된다. E-셀렉틴의 "생물학적 기능" 또는 "생물학적 활성"은 현재 관련 기술분야에 공지되어 있거나 나중에 확인될 것 중에서도 특히, PMN 감속을 지지하는 CD18 인테그린의 친화도 및 결합력, 및 급성 염증 부위로의 트래픽킹, 시토졸 칼슘, p38 MAP 키나제 및 Syk 키나제를 활성화시키는 티로신 인산화의 증가를 매개하는 것을 포함한다. E-셀렉틴의 생물학적 기능 또는 생물학적 활성은 E-셀렉틴과 그의 리간드 사이의 상호작용에 의해 매개될 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다.

본 개시내용은 E-셀렉틴의 생물학적 활성을 조정할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 즉, 본 발명은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하여 (a) 내피 세포에 대한 백혈구 테더링을 감소시키고/거나; (b) 내피 세포에 대한 안정한 부착의 활성화를 감소시키고/거나; (c) 정지하기 위한 백혈구의 느린 롤링을 감소시키고/거나; (d) 백혈구의 효율적인 경내피 이동을 감소시키고/거나; (e) CD18 인테그린의 친화도 및 결합력을 감소시키고/거나; (f) 급성 염증 부위로의 백혈구의 트래픽킹을 감소시키고/거나; (g) 시토졸 칼슘을 감소시키고/거나; (h) p38 MAP 키나제 및 Syk 키나제를 활성화시키는 티로신 인산화를 감소시키고/거나; (i) 혈액으로부터 혈관 내피로의 혈소판 및 백혈구의 동원을 감소시키고/거나; (j) 염증유발 환경을 생성하지 않도록 적어도 1종의 검출가능한 E-셀렉틴 활성을 조정하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.

E-셀렉틴의 생물학적 활성은 E-셀렉틴 (예를 들어, 가용성 E-셀렉틴 또는 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포) 및 리간드 (예를 들어, 가용성 시알릴 루이스 리간드 또는 세포 표면 발현 리간드 (예를 들어, HL-60 세포 상))를 사용하는 시험관내 정적 중화 결합 검정에서 평가될 수 있다. E-셀렉틴의 결합은 또한 관련 기술분야에 공지되고 본 개시내용의 실시예 섹션에 제시된 생리학적 유동 검정에서 가용성 또는 세포 표면 발현된 단백질을 사용하여 평가될 수 있다. E-셀렉틴 결합을 방지하는 중화 항체의 능력은 또한 증가하는 농도의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 부재 또는 존재 하에 E-셀렉틴 (예를 들어, 인간, 시노몰구스 원숭이)을 발현하는 세포를 가용성 (시알릴 루이스 항원) 또는 세포 표면 발현된 (예를 들어, HL-60 세포, HUVEC, CLMEC 상) E-셀렉틴 리간드와 함께 인큐베이션함으로써 평가될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체는 서열식별번호: 11로 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 서열식별번호: 5로 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 인간 E-셀렉틴에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포괄한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 E-셀렉틴의 적어도 1종의 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, 시알릴 루이스 (sLex) 결정기 (예를 들어, α2,3 시알릴화 및 α1,3 또는 α1,4 푸코실화 테트라사카라이드 시알릴 루이스 x)를 갖는 당단백질 또는 당지질, 시알릴 루이스 A 결정기, ESL-1, L-셀렉틴, CD44, PSGL-1, LAMP1, LAMP2, DR3 및 αMβ2 인테그린 (CD11b/CD18; Mac-1))에 대한 결합을 억제하거나 감소시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포괄한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 E-셀렉틴과 리간드의 결합을 억제하는 데 있어서, 서열식별번호: 11로 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 서열식별번호: 5로 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포괄한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG1 중쇄 불변 영역, 예를 들어 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13 (C-말단 리신 부재)으로 제시된 항-E-셀렉틴 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 카파 경쇄 불변 영역, 예를 들어 서열식별번호: 1로 제시된 항-E-셀렉틴 경쇄를 포함한다.

본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 단편 (예를 들어, 도메인 항체)을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유 변형된 항체를 포함한, 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 구성의 이뮤노글로불린 분자를 포괄할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간 또는 임의의 다른 기원 (키메라 또는 인간화 항체 포함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 키메라 항체이다.

표 2는 본원에서 기재된 바와 같은 키메라 및 인간화 항-E-셀렉틴 항체에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일반적으로, 구체적으로 나타내지 않는 한, 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체는 1개 이상의 CDR의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체는 표 2에 제시된 바와 같은 1개 이상의 VH 및/또는 VL 서열과 표 3의 서열식별번호로 정의된 특정한 항체의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 VH 및 VL의 CDR은 연장된 H1와 함께 카바트 정의를 사용하여 정의되었다. HCDR-1의 경우, 마지막 잔기는 H36 위치 앞의 임의의 삽입물 (즉, H35a, H35b, H35c 등)을 포함한다. CDR은 하기와 같이 정의되었다: HCDR-1 (H26 내지 H35c), HCDR-2 (H50 내지 H65), HCDR-3 (H95 내지 H102), LCDR-1 (L24 내지 L34), LCDR-2 (L50 내지 L56) 및 LCDR-3 (L89 내지 L87).

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 925, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HC, LC, VL 도메인 및/또는 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 2의 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 925, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열에 의해 코딩되는 HC, LC, VL 도메인 및/또는 VH 도메인을 포함한다.

표 2. E-셀렉틴 펩티드, 항-E-셀렉틴 항체 및 그의 단편의 서열.

표 3. 항-E-셀렉틴 항체.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 11의 아미노산을 포함하거나 또는 그로 이루어진 VH 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 11, 25, 30, 35, 39, 42, 45, 55, 60, 66, 75, 80, 90, 95, 104, 114, 118 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 11, 25, 30, 35, 39, 42, 45, 55, 60, 66, 75, 80, 90, 95, 104, 114, 118 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있는 VH 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 VL 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5, 21, 27, 32, 50, 57, 71, 73, 85, 87, 100, 102, 109, 116 및 122 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5, 21, 27, 32, 50, 57, 71, 73, 85, 87, 100, 102, 109, 116 및 122 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있는 VL 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 39, 42 또는 45 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 122의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 128의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5, 21, 27, 32, 50, 57, 71, 73, 85, 87, 100, 102, 109, 116 및 122 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열식별번호: 11, 25, 30, 35, 39, 42, 45, 55, 60, 66, 75, 80, 90, 95, 104, 114, 118 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5, 21, 27, 32, 50, 57, 71, 73, 85, 87, 100, 102, 109, 116 및 122 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 11, 25, 30, 35, 39, 42, 45, 55, 60, 66, 75, 80, 90, 95, 104, 114, 118 및 128 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 LCDR-1, LCDR-2, LCDR-3 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 2의 아미노산을 포함하는 LCDR-1, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-2 및 서열식별번호: 4의 아미노산을 포함하는 LCDR-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 8의 아미노산을 포함하는 HCDR-1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-2 및 서열식별번호: 10의 아미노산을 포함하는 HCDR-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-1, 서열식별번호: 38, 41 또는 44 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-2 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 2, 18, 47, 68, 82, 97 또는 106 중 어느 하나의 아미노산을 포함하는 LCDR-1, 서열식별번호: 3, 19, 48, 69, 83, 98, 107 또는 120 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-2 및 서열식별번호: 4, 20, 49, 70, 84, 99, 108 또는 121의 아미노산을 포함하는 LCDR-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 8, 23, 52, 63, 77, 92, 111 또는 125의 아미노산을 포함하는 HCDR-1, 서열식별번호: 9, 24, 29, 38, 41, 44, 53, 64, 78, 93, 112 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-2 및 서열식별번호: 10, 54, 65, 79, 94, 113 또는 127의 아미노산을 포함하는 HCDR-3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ATCC에 기탁된 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ATCC에 기탁된 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ATCC에 기탁된 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 아미노산 서열 및 ATCC에 기탁된 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ATCC에 기탁된 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ATCC에 기탁된 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ATCC에 기탁된 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ATCC에 기탁된 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.

LC는 서열식별번호: 1, 17, 26, 31, 46, 56, 67, 72, 81, 86, 96, 101, 105, 115 또는 119 중 어느 하나의 아미노산 서열에 적어도 90, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 LC는 서열식별번호: 1, 17, 26, 31, 46, 56, 67, 72, 81, 86, 96, 101, 105, 115 또는 119 중 어느 하나를 포함하거나 또는 그로 이루어진 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7 또는 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7 또는 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 HC를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7, 13, 22, 28, 34, 37, 40, 43, 51, 59, 62, 74, 76, 89, 91, 103, 110, 117 또는 124 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 HC는 서열식별번호: 7, 13, 22, 28, 34, 37, 40, 43, 51, 59, 62, 74, 76, 89, 91, 103, 110, 117 또는 124 중 어느 하나를 포함하거나 또는 그로 이루어진 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 LC 및 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 HC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이펙터 기능이 결여되어 있다 (즉, 이펙터 널).

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 11, 25, 30, 35, 39, 42, 45, 55, 60, 66, 75, 80, 90, 95, 104, 114, 118 및 128 중 어느 하나 (예를 들어, 서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 추가로 IgG1 불변 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 15 또는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 불변 도메인)을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 추가로 서열식별번호: 15 또는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 11의 아미노산 서열로 이루어진 VH 도메인을 포함하고, 추가로 서열식별번호: 15 또는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열로 이루어진 IgG1 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 이펙터 기능(들)이 결여되어 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 (예를 들어, 인간) 카파 경쇄 불변 영역 (예를 들어, 서열식별번호: 14의 아미노산 서열에 의해 코딩됨) 또는 람다 경쇄 불변 영역으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 갖는다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5, 21, 27, 32, 50, 57, 71, 73, 85, 87, 100, 102, 109, 116 및 122 중 어느 하나 (예를 들어, 서열식별번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 추가로 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 카파 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열로 이루어진 VL 도메인을 포함하고, 추가로 서열식별번호: 14의 아미노산 서열로 이루어진 카파 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 불변 영역은 항체의 특성을 변형시키기 위해 (예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능 및/또는 보체 기능 중 1개 이상을 증가 또는 감소시키기 위해) 변경, 예를 들어 돌연변이될 수 있다.

일부 측면에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체는 전장 중쇄 (예를 들어, 서열식별번호: 7 또는 13의 아미노산 서열의 HC) 및/또는 전장 경쇄에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 측면에서, 변이체 항체는 전장 중쇄와 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하고, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합한다. 추가 측면에서, 변이체 항체는 전장 경쇄 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열의 LC)와 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하고, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합한다.

배선 치환

매우 다양한 수용자 인간 배선 서열이 이용가능하고, 인간에서 사용하기 위해 비-인간 종 항체를 "인간화"하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 또한 본원의 다른 곳에서 논의된다. 따라서, 통상의 기술자는 마우스, 래트 등으로부터의 상기 CDR 서열이 인간 가변 도메인 아미노산 서열의 맥락에 놓일 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그렇게 함에 있어서, 수용자 인간 배선 서열에 대한 변화는 일반적으로 항체 결합 및 원래 모 (즉, 공여자) 항체의 다른 바람직한 특징을 보존하도록 이루어진다. CDR 및 프레임워크 영역 (FW) 둘 다는 하기와 같이 조작될 수 있다.

특정 실시양태에서, 치환은, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2017/0073395 및 문헌 [Townsend et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2015; 112(50):15354-15359] (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 인간 아미노산 함량을 증가시키고 항체의 면역원성을 잠재적으로 감소시키기 위해, (공여자) CDR 잔기가 상응하는 인간 배선 (수용자) 잔기로 대체된 인간 배선 치환이다.

항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 배선 VH 프레임워크 서열을 포함하는 VH 프레임워크를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 하기 배선으로부터의 VH 프레임워크가 사용될 수 있다: IGHV1-2*02, IGHV1-3*01, IGHV1-46*01, IGHV1-69*01, IGHV1-69*02, IGHV1-8*01, IGHV3-7*01, IGHV3-13*01, IGHV3-23*01, IGHV3-23*04, IGHV3-30*01, IGHV3-30*18, IGHV5-10-1*01, IGHV5-10-1*04 또는 IGHV5-51*01 (배선 명칭은 IMGT 배선 정의에 기초함). 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 배선 IGHV3-7*01 (서열식별번호: 202)로부터의 VH 프레임워크를 사용한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR 영역에 대해 배선 IGHV3-7*01 (서열식별번호: 202) 및 프레임워크 영역에 대해 IGHJ4*01 (서열식별번호: 203)로부터의 VH 프레임워크를 사용한다.

바람직한 인간 배선 경쇄 프레임워크는 Vκ 또는 Vλ 배선으로부터 유래된 프레임워크이다. 일부 측면에서, 하기 배선으로부터의 VL 프레임워크가 사용될 수 있다: IGKV1-12*01, IGKV1-13*02, IGKV1-33*01, IGKV1-39*01, IGKV1-5*01, IGKV3-11*01, IGKV3-15*01, IGKV3-20*01, IGKV3D-20*02 및 IGKV4-1*01 (배선 명칭은 IMGT 배선 정의에 기초함). 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 배선 IGHV1-39*01 (서열식별번호: 204)로부터의 VL 프레임워크를 사용한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR 영역에 대해 배선 IGHV1-39*01 (서열식별번호: 204) 및 프레임워크 영역에 대해 IGKJ1*01 (서열식별번호: 205)로부터의 VL 프레임워크를 사용한다.

대안적으로 또는 추가로, 프레임워크 서열은 인간 배선 컨센서스 프레임워크 서열, 예컨대 인간 Vλ1 컨센서스 서열, Vκ1 컨센서스 서열, Vκ2 컨센서스 서열, Vκ3 컨센서스 서열, VH3 배선 컨센서스 서열, VH1 배선 컨센서스 서열, VH5 배선 컨센서스 서열 또는 VH4 배선 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 프레임워크의 서열은 다양한 공중 데이터베이스, 예컨대 V-베이스, IMGT, NCBI 또는 아비시스로부터 이용가능하다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 배선 VL 프레임워크 서열을 포함하는 VL 프레임워크를 포함할 수 있다. VL 프레임워크는 그것이 유래된 배선과의 기능적 및 구조적 유사성을 여전히 보유하면서 1개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, VL 프레임워크는 인간 배선 VL 프레임워크 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 배선 VL 프레임워크 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 VL 프레임워크를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실은 단지 프레임워크 영역에만 존재한다. 일부 실시양태에서, 퍼센트 동일성은 본원에서 CDR로 정의된 부분을 제외한 VL 도메인과의 유사성에 기초한다.

인간 배선 VL 프레임워크는, 예를 들어 IGKV1-39*01의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는, 예를 들어 IGKV1-33*01의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 Vλ, Vλ1, Vλ3, Vκ, Vκ1, Vκ2 또는 Vκ3을 포함한 인간 컨센서스 서열 중 어느 하나의 프레임워크일 수 있다.

일부 실시양태에서, VL 프레임워크는 IGK-39*01_IGKJ1*01이다. 서열식별번호: 2-4, 18-20, 47-49, 68-70, 82-84, 97-99, 106-108, 120 및 121의 CDR; 및 IGKV1-12*01, IGKV1-13*02, IGKV1-33*01, IGKV1-39*01, IGKV1-5*01, IGKV3-11*01, IGKV3-15*01, IGKV3-20*01, IGKV3D-20*02 및 IGKV4-1*01 중 어느 하나의 프레임워크 영역에 대해 각각 99%, 97%, 97%, 96%, 80%, 76%, 74% 및 66% 동일성을 포함할 수 있는 하기 VL 아미노산 서열: 서열식별번호: 5, 21, 27, 32, 50, 57, 71, 73, 85, 87, 100, 102, 109, 116, 122에 의해 명시된 CDR을 포함하는 다른 유사한 프레임워크 영역이 또한 본 발명의 유리한 항체를 전달할 것으로 예측된다. 일부 실시양태에서, 퍼센트 동일성은 본원에서 CDR로 정의된 부분을 제외한 VL과의 유사성에 기초한다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 배선 VH 프레임워크 서열을 포함하는 VH 프레임워크를 포함할 수 있다. VH 프레임워크는 그것이 유래된 배선과의 기능적 및 구조적 유사성을 여전히 보유하면서 1개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, VH 프레임워크는 인간 배선 VH 프레임워크 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 배선 VH 프레임워크 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 VH 프레임워크를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실은 단지 프레임워크 영역에만 존재한다. 일부 실시양태에서, 퍼센트 동일성은 본원에서 CDR로 정의된 부분을 제외한 VH 도메인과의 유사성에 기초한다.

인간 배선 VH 프레임워크는, 예를 들어 IGHV3-7*01의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는, 예를 들어 IGHV1-46*01의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는, 예를 들어 IGHV1-69*01일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 인간 VH 배선 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 VH3, VH5, VH1 또는 VH4를 포함한 인간 배선 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다.

일부 실시양태에서, VH 프레임워크는 IGHV3-7*01이다. 다른 유사한 프레임워크 영역은 또한 서열식별번호: 8-10, 23, 24, 29, 38, 41, 44, 52-54, 63-65, 77-79, 92-94, 111-113, 125-127의 CDR; 및 각각 DP-54의 FW 영역에 대해 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 동일성 및 공통 구조적 특징부 (카바트 넘버링)에 1개 이하의 아미노산 차이를 포함할 수 있는, IGHV1-2*02, IGHV1-3*01, IGHV1-46*01, IGHV1-69*01, IGHV1-69*02, IGHV1-8*01, IGHV3-7*01, IGHV3-13*01, IGHV3-23*01, IGHV3-23*04, IGHV3-30*01, IGHV3-30*18, IGHV5-10-1*01, IGHV5-10-1*04 또는 IGHV5-51*01을 포함한 하기 VH 아미노산 서열: 서열식별번호: 11, 25, 30, 35, 39, 42, 45, 55, 60, 66, 75, 80, 90, 95, 104, 114, 118, 128 중 임의의 것에 의해 명시된 CDR을 포함하는 본 발명의 유리한 항체를 전달할 것으로 예측된다. 일부 측면에서, 퍼센트 동일성은 CDR로서 본원에 정의된 부분을 제외한 VH 도메인과의 유사성로 한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 서열식별번호: 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및/또는 (ii) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 66%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 이들 VL 및 VH 서열의 임의의 조합은 또한 본 발명에 의해 포괄된다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HC; 및/또는 (ii) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함한다. 이들 HC 및 LC 서열의 임의의 조합은 또한 본 발명에 의해 포괄된다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인은 IgA (예를 들어, IgA₁ 또는 IgA₂), IgG, IgE 또는 IgG (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체는 IgG1 항체이다.

항-E-셀렉틴 항체의 생물학적 활성

E-셀렉틴 상의 에피토프에 결합하는 것에 추가로, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 생물학적 활성을 매개할 수 있다. 즉, 본 개시내용은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하고, 하기로부터 선택된 적어도 1종의 검출가능한 활성을 매개하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다:

(i) 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합함;

(ii) 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 특이적으로 결합함;

(iii) 가용성 E-셀렉틴 (예를 들어, 인간, 시노몰구스)과 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, 시알릴-루이스 A 및/또는 시알릴-루이스 X 리간드) 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 감소, 억제 및/또는 중화시킴;

(iv) 세포 표면 발현된 E-셀렉틴 (예를 들어, 인간, 시노몰구스)과 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, 시알릴-루이스 A 및/또는 시알릴-루이스 X 리간드) 사이의 상호작용 (예를 들어, 결합)을 감소, 억제 및/또는 중화시킴;

(v) 세포 표면 발현된 E-셀렉틴 (예를 들어, 인간, 시노몰구스)과 세포 표면 발현된 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, HL-60 세포 상의, 예를 들어 시알릴-루이스 A 및/또는 시알릴-루이스 X 리간드) 사이의 상호작용 (예를 들어, 부착)을 감소, 억제 및/또는 중화시킴;

(vi) E-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 (예를 들어, HL-60)에 대한 가용성 E-셀렉틴의 상호작용 (예를 들어, 부착)을 감소, 억제 및/또는 중화시킴;

(vii) 정적 및 생리학적 유동 조건 하에 E-셀렉틴을 발현하는 세포에 대한 E-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 (예를 들어, HL-60)의 부착을 감소, 억제 및/또는 중화시킴;

(viii) 생리학적 유동 조건 하에 E-셀렉틴 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스)을 발현하는 세포에 대한 활성화된 인간 호중구의 부착을 감소, 억제 및/또는 중화시킴;

(ix) 인간 E-셀렉틴의 T7, E8, A9, M10, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E88, E92, Y94, R97, N105, E107, R108, S110, K111, K112 및 K113으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 잔기에 결합함;

(x) 25℃에서 약 187 mg/mL의 농도에서 약 38 +/- 7 cP의 점도를 가짐;

(xi) 3 mg/kg의 용량으로 SC 투여된 경우에 약 21.5일 (518시간)의 반감기를 가짐;

(xii) 고도의 열 안정성 및 고농도에서의 최소 응집을 포함한 적합한 제제화 특성을 나타냄; 및

(xiii) 대규모 제조 조건에서 재현가능한 발현 및 순도를 나타낼 수 있음.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 K_D로 표현되는 결합 친화도가 200 nM 이하, 예를 들어 195 nM, 190 nM, 180 nM, 160 nM, 140 nM, 120 nM, 110 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 50 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SPR에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 K_D로 표현되는 결합 친화도가 200 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 SPR에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 K_D로 표현되는 결합 친화도가 약 61.8 내지 약 68.4 +/- 3.18 nM이다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 가용성 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 K_D로 표현되는 결합 친화도가 200 nM 이하, 예를 들어 195 nM, 190 nM, 180 nM, 160 nM, 140 nM, 120 nM, 110 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 50 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 SPR에 의해 측정 시, 가용성 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 K_D로 표현되는 결합 친화도가 약 64.9 +/- 1.13 nM 내지 약 81.5 nM이다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 EC₅₀으로 표현되는 결합 친화도가 50 nM 이하, 예를 들어 48 nM, 45 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.75 nM, 0.5 nM, 0.25 nM 또는 0.1 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 EC₅₀으로 표현되는 결합 친화도가 약 0.66 nM이다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 EC₅₀으로 표현되는 결합 친화도가 50 nM 이하, 예를 들어 48 nM, 45 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.75 nM, 0.5 nM, 0.25 nM 또는 0.1 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 EC₅₀으로 표현되는 결합 친화도가 약 0.75 nM이다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 P-셀렉틴에 대한 EC₅₀으로 표현되는 결합 친화도가 350 nM 이상, 예를 들어 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM 이상이다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 가용성 래트, 마우스 또는 토끼 E-셀렉틴 또는 가용성 인간 L- 또는 P-셀렉틴에 대한 약한 결합을 갖거나 결합이 없다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 SPR에 의해 측정 시, 405 nM까지 가용성 래트, 마우스 또는 토끼 E-셀렉틴 또는 가용성 인간 L- 또는 P-셀렉틴에 대한 결합을 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 직접 결합 ELISA에 의해 측정 시, 133.3 nM까지 가용성 마우스 또는 래트 E-셀렉틴에 대한 약한-포화불가능한 결합 (예를 들어, >100x 더 낮음)을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 가용성 인간 E-셀렉틴에 2 nM 이하, 예를 들어 0.010 nM, 0.015 nM, 0.020 nM, 0.025 nM, 0.030 nM, 0.035 nM, 0.040 nm, 0.045 nM, 0.05 nM, 0.055 nM, 0.06 nM, 0.065 nM, 0.070 nM, 0.075 nM, 0.080 nM, 0.085 nM, 0.090 nM, 0.10 nM, 0.12 nM, 0.15 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 0.9 nM, 0.95 nM, 1 nM, 1.5 nM, 1.8 nM 또는 1.9 nM 이하의 EC₅₀으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 직접 결합 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 약 0.085 nM 내지 약 0.12의 EC₅₀으로 결합한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 알파리사 균질 경쟁 검정에 의한 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 2 nM 이하, 예를 들어 0.010 nM, 0.015 nM, 0.020 nM, 0.025 nM, 0.030 nM, 0.035 nM, 0.040 nm, 0.045 nM, 0.05 nM, 0.055 nM, 0.06 nM, 0.065 nM, 0.070 nM, 0.075 nM, 0.080 nM, 0.085 nM, 0.090 nM, 0.10 nM, 0.12 nM, 0.15 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 0.9 nM, 0.95 nM, 1 nM, 1.5 nM, 1.8 nM 또는 1.9 nM 이하의 EC₅₀으로 중화시킨다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 가용성 시노몰구스 E-셀렉틴에 1 nM 이하, 예를 들어 0.010 nM, 0.015 nM, 0.020 nM, 0.025 nM, 0.030 nM, 0.035 nM, 0.040 nm, 0.045 nM, 0.05 nM, 0.055 nM, 0.06 nM, 0.065 nM, 0.070 nM, 0.075 nM, 0.080 nM, 0.085 nM, 0.090 nM, 0.10 nM, 0.12 nM, 0.15 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 0.9 nM 또는 0.95 nM 이하의 EC₅₀으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 직접 결합 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 시노몰구스 E-셀렉틴에 0.071 nM 내지 0.093 nM의 EC₅₀으로 결합한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 혈청 중 유리 가용성 인간 E-셀렉틴에 약 1 nM 내지 약 3 nM의 IC₅₀, 바람직하게는 약 1.2 nM의 IC₅₀으로 결합한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 중화시킨다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 약 2.87 nM 내지 약 3.01 nM의 IC₅₀으로 중화시킨다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 중화시킨다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 약 2.39 nM 내지 약 2.91 nM의 IC₅₀으로 중화시킨다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 50 nM 이하, 예를 들어 48 nM, 45 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 중화시킨다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 약 1.88 nM 내지 약 2.89 nM의 IC₅₀으로 중화시킨다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 중화시킨다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 약 1.47 nM 내지 약 2.65 nM의 IC₅₀으로 중화시킨다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 약 3.36 nM 내지 약 4.7 nM의 IC₅₀으로 억제한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 정적 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 약 3.84 nM의 IC₅₀으로 억제한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 100 nM 이하, 예를 들어 95 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 약 4.25 nM 내지 약 4.56 nM의 IC₅₀으로 억제한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 약 4.32 nM 내지 약 4.35 nM의 IC₅₀으로 억제한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 300 nM 이하, 예를 들어 290 nM, 280 nM, 270 nM, 260 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 90 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 20 nM, 20 nM, 5 nM, 2 nM 또는 1 nM 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 약 13.28 nM 내지 약 15.94 nM의 IC₅₀으로 억제한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 또는 세포 표면 발현된 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 활성화된 인간 호중구의 부착을 약 2.87 nM 내지 약 4.65 nM 또는 9.45 nM 내지 약 16.33 nM의 IC₅₀으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 호중구는 TNF-α에 의해 활성화된다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 SCD 환자로부터의 혈액 세포의 부착을 약 6.17 nM 내지 약 18.66 nM의 IC₅₀으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 SCD 환자로부터의 혈액 세포의 부착을 약 12.4 nM의 IC₅₀으로 억제한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 옥테트 바이오센서를 사용한, 예를 들어 경쟁 검정에 의해 결정 시, 인간 E-셀렉틴의 3개의 에피토프 중 적어도 1개에 결합한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, T7, E8, A9, M10, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E88, E92, Y94, R97, N105, E107, R108, S110, K111, K112, K113 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그 초과의 아미노산 잔기에 결합한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, 인간 E-셀렉틴의 아미노산 잔기 T7, E8, A9, M10, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E88, E92, Y94, R97, N105, E107, R108, S110, K111, K112 및 K113과 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, T7, E8, A9, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E92, Y94, N105, E107, R108, S110, K111, K112 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 3.8 Å 이내의 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그 초과의 아미노산 잔기와 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, 3.8 Å 이내의 인간 E-셀렉틴의 아미노산 잔기 T7, E8, A9, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E92, Y94, N105, E107, R108, S110, K111 및 K112와 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, T7, E8, A9, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E88, E92, Y94, R97, E107, R108, S110, K111, K112, K113 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 매립된 표면적 (Å²)이 >5 Å²인 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그 초과의 아미노산 잔기와 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, 매립된 표면적 (Å²)이 >5 Å²인 인간 E-셀렉틴의 아미노산 잔기 T7, E8, A9, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E88, E92, Y94, R97, E107, R108, S110, K111, K112 및 K113과 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, E8, S47, N82, N83, E88, E92, Y94, N105, E107, R108, S110, K112 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그 초과의 아미노산 잔기와 수소 결합을 통해 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, 인간 E-셀렉틴의 아미노산 잔기 E8, S47, N82, N83, E88, E92, Y94, N105, E107, R108, S110 및 K112와 수소 결합을 통해 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, K111, K112 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개의 아미노산 잔기와 염 가교를 통해 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, 인간 E-셀렉틴의 아미노산 잔기 K111 및 K112와 염 가교를 통해 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, R97, K112 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개의 아미노산 잔기와 물-매개 수소 결합을 통해 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, 인간 E-셀렉틴의 아미노산 잔기 R97 및 K112와 물-매개 수소 결합을 통해 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, Y48, N82, N83, E92, Y94, R97, N105, E107 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, sLex 아미노산 잔기 접촉의 3.8Å 이내에서 또한 상호작용하는 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 그 초과의 아미노산 잔기와 상호작용한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 임의로 결정 구조에 따라, sLex 아미노산 잔기 접촉의 3.8Å 이내에서 또한 상호작용하는 인간 E-셀렉틴의 아미노산 잔기 Y48, N82, N83, E92, Y94, R97, N105 및 E107과 상호작용한다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 인간 E-셀렉틴의 적어도 1개 이상의 아미노산 잔기의 결합 또는 상호작용은 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 결합된 분자의 결정 구조의 분석을 포함한 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 AC-SINS 검정, DNA 결합 검정 및/또는 인슐린 결합 검정에 의해 측정 시, 다반응성 위험이 낮다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 낮은 면역원성 위험을 가지며, 예를 들어 약 -44, -45, -46 또는 -47의 T-reg 조정된 점수를 갖는다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IV 투여된 경우 (i) 약 0.15 mL/h/kg 내지 약 0.39 mL/h/kg의 전신 클리어런스; (ii) 22 mL/kg 내지 36 mL/kg의 정상 상태에서의 겉보기 분포 부피; (iii) 약 102시간 내지 약 345시간의 평균 반감기로부터 선택된 적어도 1종의 예측된 인간 약동학 (PK) 파라미터를 나타냈다. 일부 실시양태에서, SC 투여된 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 약 243 내지 약 518시간의 반감기를 나타낸다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 평균 반감기는 0.3 mg/kg 용량의 IV 투여 후 적어도 약 102시간 (약 4.25일)이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 평균 반감기는 0.6 mg/kg 용량의 IV 투여 후 적어도 약 264시간 (약 11일)이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 평균 반감기는 1.0 mg/kg 용량의 IV 투여 후 적어도 약 188시간 (약 7.8일)이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 평균 반감기는 10 mg/kg 용량의 IV 투여 후 적어도 약 345시간 (약 14.4일)이다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 평균 반감기는 1.0 mg/kg 용량의 SC 투여 후 적어도 약 243시간 (약 10일)이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 평균 반감기는 3.0 mg/kg 용량의 SC 투여 후 적어도 약 518시간 (약 21.5일)이다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 동적 광 산란 (DLS)에 의해 25℃에서 측정 시, 약 23 mg/mL의 농도에서 약 7.97 +/- 1.83 cP, 약 48 mg/mL의 농도에서 약 12.38 +/- 5.28 cP, 약 90 mg/mL의 농도에서 약 4.26 +/- 0.6 cP, 약 102 mg/mL의 농도에서 약 5.58 +/- 0.99 cP, 약 121 mg/mL의 농도에서 약 8.44 +/- 1.54 cP, 약 140 mg/mL의 농도에서 약 9.78 +/- 2.32 cP, 약 158 mg/mL의 농도에서 약 17.47 +/- 3.24 cP 및 약 188 mg/mL의 농도에서 약 37.99 +/- 7.03 cP로 이루어진 군으로부터 선택된 점도를 갖는다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 DLS에 의해 25℃에서 측정 시, 약 150 mg/mL 내지 약 190 mg/mL의 농도에서 약 15 cP 내지 40 cP의 점도를 갖는다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 안톤 파르 방법에 의해 25℃에서 측정 시, 185.7 mg/mL에서 33.4 cP의 점도를 갖는다.

면역원성

면역원성은 항체 및 Fc 융합 단백질을 포함한 단백질 치료제의 개발 및 이용에 대한 주요 장벽이다. 단백질 서열, 투여 경로 및 빈도, 및 환자 집단을 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 인자가 단백질 면역원성에 기여할 수 있다. 면역 반응은 전형적으로 비-인간 단백질, 예컨대 뮤린 항체에 대해 가장 심하지만, 대부분 또는 전적으로 인간 서열 함량을 갖는 치료제도 면역원성일 수 있다. 면역원성은 외래로서 인지되는 물질에 대한 복잡한 일련의 반응이고, 중화 및 비-중화 항체의 생산, 면역 복합체의 형성, 보체 활성화, 비만 세포 활성화, 염증 및 아나필락시스를 포함할 수 있다. 원치않는 면역 반응은 항원 인식을 직접적으로 방해하거나, 이펙터 분자와의 상호작용을 변경시키거나, 또는 치료제의 혈청 반감기 또는 조직 분포를 교란시킴으로써 항체 및 Fc 융합 단백질 치료제의 효능을 감소시킬 수 있다.

단백질 치료제는 에피박스, 인크.(Epivax, Inc.) (로드아일랜드주 프로비던스)에 의해 제공된 것과 같은 상업적으로 입수가능한 서비스를 사용하여 잠재적 면역원성 에피토프의 존재를 예측하기 위해 분석될 수 있다. 잠재적 면역원성 에피토프는 또한 IEDB 컨센서스 방법과 같은 방법을 사용하여 예측될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인 실리코 알고리즘은 부류 II MHC 분자에 결합하는 에피토프를 예측할 수 있다. 이러한 알고리즘을 사용한 폴리펩티드의 데이터 세트의 분석은 예측된 에피토프를 제공한다. 예측된 에피토프는 자동화 펩티드 합성 또는 재조합 DNA 기술의 표준 방법에 의해 제조되는 펩티드를 제작하는데 사용된다. 에피박스로부터 제공된 점수화 정보는 예측된 에피토프가 집단에서 얼마나 널리 인식되는지에 대한 지표를 제공할 수 있다. 보다 낮은 점수는 보다 낮은 면역원성 잠재력을 예측한다.

본원에 사용된 "T-레지토프"는 천연 조절 T 세포를 잠재적으로 활성화시키고 원치않는 면역 반응을 감소시킬 수 있는 모노클로날 항체 프레임워크 영역 내의 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원 결합-단편은 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 비-배선 T-세포 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 낮은 면역원성 위험을 가지며, 예를 들어 약 -45.11, -45.32, -46.16 또는 -46.26의 T-reg 조정된 점수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은 약 -45.11의 T-reg 조정된 점수 및 0개의 비-배선 T-세포 에피토프를 갖는다.

항-E-셀렉틴 항체를 코딩하는 핵산

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 항체 부분 및 변형된 항체를 포함한 본 발명의 항체 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 폴리뉴클레오티드가 제조될 수 있고 단백질이 발현될 수 있다.

목적하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 이러한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산의 서열은 표준 서열분석 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 목적하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 분자는 재조합 생산 및 특징화를 위해 다양한 벡터 (예를 들어, 클로닝 및 발현 벡터) 내로 삽입될 수 있다. 중쇄 또는 중쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 분자 및 경쇄 또는 경쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 분자는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 항-E-셀렉틴 항체 및 그의 항원-결합 단편 중 임의의 것의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다: 항체 1444, 0841, 0978, 0164, 1448, 1284, 1282, 0525, 0039, 0265_0254, 0158, 0929_548, 0159, 0955_0300, 0170, 0564, 0180 및 0027. 한 실시양태에서, 본 발명은 항-E-셀렉틴 항체 1444 및 그의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 7, 13, 22, 28, 34, 37, 40, 43, 51, 59, 62, 74, 76, 89, 91, 103, 110, 117 및 124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 1종 이상의 항-E-셀렉틴 항체 HC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 항-E-셀렉틴 항체 HC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1, 17, 26, 31, 46, 56, 67, 72, 81, 86, 96, 101, 105, 115 및 119로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 1종 이상의 항-E-셀렉틴 항체 LC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 항-E-셀렉틴 항체 LC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 11, 25, 30, 35, 39, 42, 45, 55, 60, 66, 75, 80, 90, 95, 104, 114, 118 및 128로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 1종 이상의 항-E-셀렉틴 항체 VH 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 항-E-셀렉틴 항체 VH 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 5, 21, 27, 32, 50, 57, 7, 73, 85, 87, 100, 102, 109, 116 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 1종 이상의 항-E-셀렉틴 항체 VL 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 항-E-셀렉틴 항체 VL 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 항체 1444의 HC 도메인을 코딩하는, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 항체 1444의 LC를 코딩하는, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 추가로, 본 발명은 항체 1444의 VH 도메인을 코딩하는, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 DNA 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 추가로 항체 1444의 VL 도메인을 코딩하는, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 항체 1444의 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3을 코딩하는, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열, 및 항체 1444의 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3을 코딩하는, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한 항체 1444의 VH 도메인을 코딩하는, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열, 및 항체 1444의 VL 도메인을 코딩하는, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한 항체 1444의 중쇄를 코딩하는, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열, 및 항체 1444의 경쇄를 코딩하는, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항-E-셀렉틴 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 변이체를 제공하며, 여기서 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는 표 2에 개시된 핵산 서열 중 임의의 것에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 핵산 서열 동일성을 공유한다. 이들 양은 제한적인 것으로 의도되지 않고, 언급된 백분율 사이의 증분은 본 개시내용의 일부로서 구체적으로 고려된다.

한 실시양태에서, VH 및 VL 도메인 또는 그의 항원-결합 단편 또는 전장 HC 또는 LC는 개별 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 대안적으로, VH 및 VL 둘 다 또는 그의 항원-결합 단편 또는 HC 및 LC는 단일 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 또한 본 개시내용에 의해 포괄된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 DNA 분자에 1-대-1 방식으로 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만 반드시 그러할 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있지만 반드시 그러할 필요는 없다.

폴리뉴클레오티드는 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있거나 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 결합 특징이 천연 항체 분자에 비해 감소되지 않도록 1개 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 변이체 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 결합 특징에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 임의의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 포함하지 않는 원래 (모) 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 98% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 나타낸다. 이들 퍼센트 동일성은 제한적인 것으로 의도되지 않고, 언급된 백분율 사이의 증분은 본 개시내용의 일부로서 구체적으로 고려된다.

2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 2개의 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 본원에 기재된 바와 같이 최대 상응성을 위해 정렬되었을 때 일치하는 경우에 "동일한" 것으로 언급된다. 2개의 서열 사이의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국부 영역을 확인하고 비교하기 위해 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에 사용된 "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 인접 위치, 통상적으로 30 내지 약 75개 또는 40 내지 약 50개의 인접 위치의 절편을 지칭하며, 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후에 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 동일하다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 VL 도메인은 서열식별번호: 137, 145, 147, 149, 154, 165, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172 및 174로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 VL 도메인은 서열식별번호: 137, 145, 147, 149, 154, 165, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172 및 174로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 VL 도메인은 서열식별번호: 137의 핵산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 VL 도메인은 서열식별번호: 137의 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 VH 도메인은 서열식별번호: 136, 144, 146, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 VH 도메인은 서열식별번호: 136, 144, 146, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 VH 도메인은 서열식별번호: 136에 대해 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 VH 도메인은 서열식별번호: 136의 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 HC는 서열식별번호: 206 또는 207에 대해 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 HC는 서열식별번호: 206 또는 138의 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 LC는 서열식별번호: 139에 대해 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 LC는 서열식별번호: 139의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

폴리뉴클레오티드 변이체는 또한 또는 대안적으로, 유전자 또는 그의 단편 또는 상보체에 대해 실질적으로 상동일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 중간 정도의 엄격한 조건 하에 항체를 코딩하는 자연 발생 DNA 서열 (또는 상보적 서열)에 혼성화할 수 있다.

적합한 "중간 정도의 엄격한 조건"은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액 중에서 사전세척하고; 약 50℃ 내지 65℃, 5X SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨)에서 밤새 혼성화하고; 이어서 0.1% SDS를 함유하는 각각의 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고 엄격도 조건"은 (1) 세척 동안 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 사용하거나; (2) 혼성화 동안 42℃에서 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 함유하는 50% (v/v) 포름아미드와 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 사용하거나; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5X SSC, 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5X 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/mL), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2X SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃에서 50% 포름아미드 중에서 세척하고, 이어서 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1X SSC로 이루어진 고엄격도 세척을 수행하는 것이다. 통상의 기술자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식할 것이다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 유전자 코드의 축중성으로 인해 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소의 상동성을 보유한다. 즉, 20개의 천연 아미노산을 코딩하는 64개의 상이한 코돈이 존재하며, 일부 아미노산은 이를 코딩하는 다수의 코돈을 갖는다 (예를 들어, 6개의 상이한 코돈이 류신을 코딩함). 따라서, 다수의 핵산 서열은 동일한 폴리펩티드 아미노산 서열을 코딩하는 2개의 핵산이 매우 낮은 핵산 서열 동일성을 공유할 수 있도록 동일한 단백질 서열을 코딩할 수 있다. 따라서, 코돈 용법에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 개시내용에 의해 구체적으로 고려된다.

추가로, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 개시내용의 범주 내에 속한다. 대립 유전자는 뉴클레오티드의 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경되는 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술 (예컨대 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 확인될 수 있다.

본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 상세하게 기재될 필요는 없다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 제공된 서열 및 상업적 DNA 합성기를 사용하여 목적하는 DNA 서열을 생성할 수 있다.

재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우에, 본원에 추가로 논의된 바와 같이, 목적하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 적합한 벡터 내로 삽입될 수 있고, 이어서 상기 벡터가 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 세포는 직접 흡수, 세포내이입, 형질감염, F-메이팅 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 비-통합 벡터 (예컨대 플라스미드)로서 유지되거나 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이와 같이 증폭된 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989]을 참조한다.

대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재현을 가능하게 한다. PCR 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202, 뿐만 아니라 문헌 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.

RNA는 적절한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하여 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득될 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되는 경우에, RNA는, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 제시된 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 단리될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에 1개 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들) (예를 들어, 항-E-셀렉틴 항체의 HC, LC, VH, VL 및/또는 그의 단편을 코딩하는 핵산)을 전달할 수 있는, 바람직하게는 이를 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터 (예를 들어 AAV), 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

적합한 클로닝 및 발현 벡터는 다양한 성분, 예컨대 프로모터, 인핸서, 및 다른 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 상이한 벡터 내로의 항체 가변 도메인의 후속 클로닝을 가능하게 하도록 구축될 수 있다. 적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구축될 수 있거나, 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기-복제 능력을 가질 것이고/거나 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트 (예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 상업적 판매업체, 예컨대 바이오라드(BioRad), 스트라타진(Stratagene) 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수가능하다.

발현 벡터가 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 이는 발현 벡터가 숙주 세포에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제가능해야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 1개 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열; 복제 기점; 1개 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현 (즉, 번역)을 위해, 1개 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 또한 통상적으로 요구된다.

일부 실시양태에서, 세포 (예를 들어, 단리된 세포 또는 유기체 내의 세포)는 이종 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 항-E-셀렉틴 항체의 HC, LC, VH 도메인, VL 도메인 또는 그의 항원-결합 단편) 및 AAV 캡시드를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 재조합 AAV (rAAV)로 형질도입된다. 재조합 핵산은 형질도입된 세포 내에서의 이종 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론, 엑손, 폴리A)를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 핵산은 바이러스 역전된 탠덤 반복부 (ITR) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 야생형 또는 재조합 AAV 캡시드이다. ITR 서열은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 야생형 또는 재조합 ITR 서열 (예를 들어, AAV2)일 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 항-E-셀렉틴 항체의 HC, LC, VH 도메인, VL 도메인 또는 그의 항원-결합 단편, 프로모터, AAV ITR 및 바이러스 캡시드를 코딩하는 재조합 핵산을 포함한다. 이러한 rAAV는 대상체 (예를 들어, 환자)에서 E-셀렉틴에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태 (예를 들어, SCD)를 치료 또는 예방하기 위해 세포에서의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현에 적합하다.

관심 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 그 자체를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘 또는 폴리에틸렌이민 (PEI), 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미세발사체 충격; 리포펙션; 및 감염 (예를 들어, 벡터가 감염원, 예컨대 백시니아 바이러스인 경우)을 포함하는 임의의 다수의 적절한 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특색에 좌우될 것이다.

일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 137, 145, 147, 149, 154, 165, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172 및 174로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 137의 핵산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 137의 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 136, 144, 146, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 136에 대해 적어도 70% 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 136의 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 벡터는 i) 서열식별번호: 136의 핵산 서열; ii) 서열식별번호: 137의 핵산; 또는 iii) 둘 다를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 206 또는 138에 대해 적어도 70% 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 206 또는 138의 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 139에 대해 적어도 70% 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 139의 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 벡터는 i) 서열식별번호: 206 또는 138의 핵산 서열; ii) 서열식별번호: 139의 핵산; 또는 iii) 둘 다를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터(들)에 대한 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 의미한다. 숙주 세포는 "형질전환체", "형질전환된 세포" 및 "형질도입된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 또는 형질도입된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 숙주 세포 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 (형태에 있어서 또는 게놈 DNA 상보체에 있어서) 원래 모 세포와 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 항-E-셀렉틴 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 또는 그를 포함하는 벡터에 의해 생체내 형질감염 및/또는 형질전환된 세포를 포함한다.

숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물 세포, 예컨대 영장류 또는 비-영장류 동물 세포; 진균 세포, 예컨대 효모; 식물 세포; 및 곤충 세포를 포함한다.

항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적합한 숙주 세포를 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있고, 이어서 이를 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 내로 도입하여, 재조합 숙주 세포에서 항체의 합성을 수득할 수 있다. 세포 배양 및 단백질 또는 폴리펩티드의 발현에 감수성인 임의의 숙주 세포가 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 입수가능한 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 비제한적 예시적인 포유동물 세포는 NS0 세포, HEK 293 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 그의 유도체, 예컨대 293-6E 및 CHO DG44 세포, CHO DXB11 및 포텔리젠트(Potelligent)® CHOK1SV 세포 (바이오와(BioWa)/론자(Lonza), 뉴저지주 알렌데일)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 포유동물 숙주 세포는 또한 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2), 새끼 햄스터 신장 (BHK, ATCC CCL 10) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS) 및 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포의 다른 비제한적 예는 인간 망막모세포 (PER.C6®; 크루셀(CruCell), 네덜란드 라이덴); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 293 (HEK 293) 또는 현탁 배양물에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포 (Graham et al., J. Gen Virol. 1997; 36:59); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 1980; 23:243-251); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1982; 383:44-68); MRC 5 세포; FS4 세포; 인간 간세포암 세포주 (Hep G2); 및 BALB/c 마우스 골수종 세포주 (NS0/1, ECACC 번호 85110503), NS0 세포 및 Sp2/0 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 골수종 세포주를 포함한다.

추가적으로, 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 임의의 수의 상업적으로 및 비상업적으로 입수가능한 세포주가 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 세포주가 상이한 영양 요건을 가질 수 있고/거나 최적 성장 및 폴리펩티드 또는 단백질 발현을 위해 상이한 배양 조건을 요구수 있다는 것을 인지할 것이며, 필요에 따라 조건을 변형시킬 수 있을 것이다.

용도

치료 방법

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 E-셀렉틴 활성을 감소 또는 억제하는 치료 방법을 제공한다. 치료되는 장애는 E-셀렉틴 활성의 제거, 억제 또는 감소에 의해 개선, 호전, 억제 또는 예방되는 임의의 질환 또는 이상 (예를 들어, SCD)이다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 치료 방법은 SCD, 혈관-폐쇄성 발증, 통증, 기관 경색, 허혈, 졸중, 종말 기관 기능장애, 급성 흉부 및 혈관 폐쇄를 포함하나 이에 제한되지는 않는, E-셀렉틴 발현 및/또는 리간드 (예를 들어, sLex A 및/또는 X 결정기)에 대한 E-셀렉틴 결합과 연관되거나 그에 의해 매개되는 질환, 장애 및 상태를 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 다른 질환, 장애 및 상태, 예컨대 피부 질환 (예를 들어, 건선), 염증성 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염) 및 당뇨병의 합병증을 치료 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

본 개시내용은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하고 E-셀렉틴의 기능적 활성을 중화시킬 수 있는 신규 치료 항체를 제공한다. 이들 항체는 SCD에 대한 예방적 치료로서 이용되는 경우에 VOC를 방지하거나 또는 그의 발생을 감소시키기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 VOC의 발생은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료되지 않은 대상체 또는 대상체 군 (예를 들어, SCD를 갖는 환자(들))에서의 VOC의 발생과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 VOC의 발생은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로의 치료 전 동일한 대상체에서의 VOC의 발생과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 VOC의 발생은 SCD를 갖지 않는 대상체 또는 대상체의 집단에서의 VOC의 발생과 유의하게 상이하지 않다. 일부 실시양태에서, VOC의 발생 (예를 들어, VOC 사건의 수)은 소정 기간에 걸쳐 측정된다. 일부 실시양태에서, VOC의 발생 (예를 들어, VOC 사건의 수)은 수일, 수주, 수개월 또는 수년에 걸쳐 측정된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항체-결합 단편은 연간 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 비율을 감소시킬 수 있다. 본원에 언급된 겸상 적혈구-관련 통증 발증은, 의료 시설 방문을 초래할 수 있고/거나 경구 또는 비경구 마약제 또는 비경구 비스테로이드성 항염증 약물로의 치료를 초래할 수 있는, 혈관-폐쇄성 사건 이외의 다른 의학적으로 결정된 원인이 없는 급성 통증 에피소드이다. 일부 실시양태에서, 급성 흉부 증후군, 간 격리, 비장 격리 및 지속발기증은 겸상 적혈구-관련 통증 발증으로 간주된다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 연간 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 비율은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료되지 않은 대상체 또는 대상체 군 (예를 들어, SCD를 갖는 환자(들))에서의 연간 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 비율보다 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 낮다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 연간 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 비율은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로의 치료 전 동일한 대상체에서의 연간 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 비율보다 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 낮다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 연간 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 비율은 SCD를 갖지 않는 대상체 또는 대상체의 집단에서의 연간 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 비율과 유의하게 상이하지 않다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 제1 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료되지 않은 대상체 또는 대상체 군 (예를 들어, SCD를 갖는 환자(들))에서의 제1 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간보다 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 길다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 제1 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로의 치료 전 동일한 대상체에서의 제1 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간보다 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 길다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 제1 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간은 SCD를 갖지 않는 대상체 또는 대상체의 집단에서의 제1 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간과 유의하게 상이하지 않다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 제2 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료되지 않은 대상체 또는 대상체 군 (예를 들어, SCD를 갖는 환자(들))에서의 제2 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간보다 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 길다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 제2 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로의 치료 전 동일한 대상체에서의 제2 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간보다 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 길다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 제2 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간은 SCD를 갖지 않는 대상체 또는 대상체의 집단에서의 제2 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간과 유의하게 상이하지 않다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 비합병성 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 중앙 비율은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료되지 않은 대상체 또는 대상체 군 (예를 들어, SCD를 갖는 환자(들))에서의 비합병성 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 중앙 비율보다 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 낮다. 일부 실시양태에서, 비합병성 발증은 급성 흉부 증후군, 간 격리, 비장 격리 및/또는 지속발기증 이외의 다른 발증이었다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 비합병성 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 중앙 비율은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로의 치료 전 동일한 대상체에서의 비합병성 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 중앙 비율보다 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 길다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 비합병성 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 중앙 비율은 SCD를 갖지 않는 대상체 또는 대상체의 집단에서의 비합병성 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 중앙 비율과 유의하게 상이하지 않다.

본 개시내용의 항체는 또한 SCD를 갖는 환자에서 VOC의 지속기간을 감소시키거나 (예를 들어, VOC를 해소하는 시간의 감소), 그의 중증도 및/또는 강도를 감소시킴으로써 급성 VOC를 치료하는 데 유리하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 VOC의 지속기간, 중증도 및/또는 강도는 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료되지 않은 대상체 또는 대상체 군 (예를 들어, SCD를 갖는 환자(들))에서의 VOC의 지속기간, 중증도 및/또는 강도와 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 감소된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 VOC의 지속기간, 중증도 및/또는 강도는 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로의 치료 전 동일한 대상체에서의 VOC의 지속기간, 중증도 및/또는 강도와 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료된 대상체 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에서의 VOC의 지속기간, 중증도 및/또는 강도는 SCD를 갖지 않는 대상체 또는 대상체의 집단에서의 VOC의 지속기간, 중증도 및/또는 강도와 유의하게 상이하지 않다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상, 예를 들어 심흉계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 만성 제한성 폐 질환, 좌심실 확장기 질환, 폐고혈압, 급성 흉부 증후군, 부정맥, 돌연사, 혈관-폐쇄성 발증), 신경계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 출혈성 졸중, 정맥동 혈전증, 뇌의 침묵 뇌경색, 만성 통증, 뇌의 급성 허혈성 졸중, 증식성 망막병증, 안와 경색, 인지 장애), 세망내피계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 비장 격리, 기능적 비장기능저하증, 빈혈, 용혈), 근골격계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 무혈관성 괴사, 피부 궤양화), 비뇨생식기계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 유두상 괴사, 단백뇨, 신부전, 혈뇨, 야간 야뇨증, 지속발기증) 및 위장계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 담석증, 담관병증, 간병증, 장간막 혈관-폐쇄)을 치료, 예방 및/또는 호전시키는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하여 (a) 내피 세포에 대한 백혈구 테더링을 감소시키고/거나; (b) 내피 세포에 대한 안정한 부착의 활성화를 감소시키고/거나; (c) 정지하기 위한 백혈구의 느린 롤링을 감소시키고/거나; (d) 백혈구의 효율적인 경내피 이동을 감소시키고/거나; (e) CD18 인테그린의 친화도 및 결합력을 감소시키고/거나; (f) 급성 염증 부위로의 백혈구의 트래픽킹을 감소시키고/거나; (g) 시토졸 칼슘을 감소시키고/거나; (h) p38 MAP 키나제 및 Syk 키나제를 활성화시키는 티로신 인산화를 감소시키고/거나; (i) 혈액으로부터 혈관 내피로의 혈소판 및 백혈구의 동원을 감소시키고/거나; (j) 염증유발 환경을 생성하지 않도록 적어도 1종의 검출가능한 E-셀렉틴 생물학적 활성을 조정하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.

본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 치료 방법은 예방적 및/또는 치유적 치료를 포함한다. 치료가 상태의 임상 징후 전에 투여되는 경우에, 치료는 예방적인 것으로 간주된다. 예를 들어, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여는 SCD에 대한 예방적 치료 (예를 들어, 소정 기간에 걸친 1회 이상의 용량)로서 이용되는 경우에 VOC를 예방하는 데 (예를 들어, VOC 사례의 빈도를 감소시키는 데) 사용될 수 있다. 치유적 치료는, 예를 들어 질환을 호전시키거나 또는 그의 중증도를 감소시키거나 또는 질환의 기간을 단축시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여는 SCD를 갖는 환자에서 VOC의 지속기간, 강도 및/또는 중증도를 감소시킴으로써 급성 VOC를 치료하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 치료될 대상체는 포유동물, 특히 인간 환자, 예를 들어 SCD를 갖는 환자일 수 있다. 대상체는 HBB 유전자의 코딩 서열 내의 1개 이상의 돌연변이로 인해 β-글로빈 단백질이 부적절하게 발현되기 때문에, 예를 들어 부정확한 아미노산 서열을 갖기 때문에 치료를 필요로 할 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여는 SCD (예를 들어, VOC), SCD의 변이체 또는 SC 질환의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여는 HBSS, HBSC, HBSE, HBS/β°thal, HBS/β⁺thal 또는 HBS-변이체 유전자형을 갖는 대상체에서 질환의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

본 개시내용은 추가로 정의된 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물을 포괄한다. 본원에 기재된 바와 같은 치료 및/또는 예방 방법을 언급하는 실시양태에서, 이러한 실시양태는 또한 그러한 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 또는 대안적으로 SCD의 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물에 관한 추가 실시양태를 포함한다.

조합 요법

본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 1종 이상의 추가의 치료 활성 화합물 또는 치료 양식과 조합되어 투여될 수 있다. 본 개시내용은 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 소정 양의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 양의 치료 활성 화합물 또는 치료 양식과 조합하여 투여하는 것을 포함하는, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포괄한다. 일부 실시양태에서, SCD의 증상을 치료하는 것은 급성 VOC의 지속기간 및 강도를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD의 증상을 예방하는 것은 VOC 사건의 빈도를 감소시키는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 소정 양의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 양의 치료 활성 화합물 또는 치료 양식을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 양은 함께 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 것인, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포괄한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 소정 양의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 양의 치료 활성 화합물 또는 치료 양식을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 양은 함께 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에서 상승작용적 효과를 달성하는 것인, 즉, 조합물은 "상승작용적"인 (즉, 조합물은 2종 이상의 개별 요법의 단순 상가적 효과보다 더 큰 효과를 제공하는 것인), SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이러한 상승작용적 조합 요법은 유리하게는 투여되는 치료제의 보다 낮은 투여량을 이용함으로써, 다양한 단독요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.

SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에 유용한 추가의 치료 활성 화합물은, 예를 들어 폐렴구균 감염을 예방하기 위한 페니실린 예방제, 히드록시우레아 (예를 들어, 드록시아(DROXIA), 히드레아(HYDREA)), L-글루타민 (예를 들어, 엔다리(ENDARI)), 크리잔리주맙 (아다크베오(ADAKVEO)), 복셀로터 (옥스브리타(OXBRYTA)), 아픽사반 (엘리퀴스(ELIQUIS)), 리바록사반 (자렐토(XARELTO)), 비-스테로이드성 항염증 약물, 일반적으로 진통제, 오피오이드 진통제, IW-1701, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS)), 티카그렐로르 (브릴린타(BRILINTA)), 메만틴 (나멘다(NAMENDA)) 및 그의 조합을 포함한다.

SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에 유용한 추가의 치료 활성 화합물은 화합물, 예컨대 항-P-셀렉틴 항체 (예를 들어, 크리잔리주맙 (아다크베오(ADAKVEO))), HbS를 조정하는 화합물, HbS의 산소 친화도를 조정하는 화합물 (예를 들어, 복셀로터 (옥스브리타(OXBRYTA))), 2,3-디스포스포글리세르산의 생성을 조정함으로써 HbS 중합을 표적화하는 화합물, 태아성 헤모글로빈 (HbF)의 발현을 유도함으로써 HbS 중합을 표적화하는 화합물 (예를 들어, 히드록시우레아), 기능장애성 세포 부착, 혈관 기능장애 및/또는 염증을 표적화하는 화합물 (예를 들어, 포스포디에스테라제-9 억제제), 혈액 중 산화질소의 수준을 증가시키는 화합물 (예를 들어, 가용성 구아닐레이트 시클라제 자극제, 예를 들어 IW-1701, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS))), 정맥내 IG, 응고항진을 표적화하는 화합물 (예를 들어, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS)), 아픽사반 (엘리퀴스(ELIQUIS)), 리바록사반 (자렐토(XARELTO))), NMDA 수용체 결합을 차단하는 화합물 (예를 들어, 메만틴 (나멘다(NAMENDA)))을 포함한다.

SCD (예를 들어, VOC)의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에 유용한 추가의 치료 활성 화합물은 HbS를 그의 R 상태 (즉, 산소화 상태)로 유지하도록 조정하는 화합물, 예컨대 WO 2020/109994에 기재되고 본원에 참조로 포함된 것이다. 일부 실시양태에서, HbS를 그의 R 상태로 유지하도록 조정하는 화합물은 2-아미노퀴놀린 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, HbS를 그의 R 상태로 유지하도록 조정하는 화합물은, 임의로 그의 아미드 호변이성질체 (S)-6-(1-((2-아미노-6-플루오로퀴놀린-3-일)옥시)에틸)-5-(1H-피라졸-1-일)피리딘-2(1H)-온으로서 고체 형태로 제조되는 6-{(1S)-1-[(2-아미노-6-플루오로퀴놀린-3-일)옥시]에틸}-5-(1H-피라졸-1-일)피리딘-2-올이다:

SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에 유용한 치료 활성 치료 양식은 보충 산소, 임의로 철 킬레이트화를 동반한 수혈, 골수 이식, 유전자 요법 (예를 들어, 렌티글로빈®), CRISPR에 의한 유전자 편집 요법 (예를 들어, CTX001), 아연 핑거 기술 및 그의 조합을 포함한다.

본 개시내용은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에 효과적인 치료 활성 화합물 또는 치료 양식, 및 SCD (예를 들어, VOC)의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 포괄한다. 본 개시내용은 상승작용적 치료 유효량의 항-E-셀렉틴 항체, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 상승작용적 치료 유효량의 치료 활성 화합물 또는 치료 양식, 및 SCD (예를 들어, VOC)의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 포괄한다. 조성물은 추가의 치료제, 예컨대 비제한적으로 SCD (예를 들어, VOC)의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 적어도 1종의 다른 치료 활성 화합물 또는 치료 양식을 추가로 포함할 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본원에 제공된 개시내용에 기초하여, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법이 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상 (예를 들어, VOC)을 치료 및/또는 예방하기 위한 적어도 1종의 추가의 치료제로 이전에 치료되었거나 또는 현재 그를 받고 있는 환자에게 상승작용적 치료 유효량의 항-E-셀렉틴 항체 및 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 상승작용적 치료 유효량의 치료 활성 화합물 또는 치료 양식을 투여하는 것을 포괄한다는 것을 이해할 것이다.

이러한 추가의 치료제는 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 표준 관리인 작용제를 포괄한다. 즉, 본 발명의 조합 요법은 L-글루타민, 히드록시우레아, 수혈 (임의로 철 킬레이트화를 동반함) 및 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 상이한 요법을 이미 받은 SCD 환자의 치료 요법에 추가될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 연령, 체중, 전반적 건강, 투여되는 화합물, 투여 경로, SCD의 치료의 성질 및 진전 및 다른 의약의 존재와 같은 인자를 고려하여, SCD를 갖는 환자에게 투여하기 위한, 본 개시내용의 조합물에 사용되는 각각의 화합물의 적절한 양, 용량 또는 투여량을 공지된 방법에 따라 결정할 수 있을 것이다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한 조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일한 제약 조성물로 투여될 수 있다 (예를 들어, 요법들이 공동-제제화됨). 대안적으로, 조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 개별 제약 조성물로 공동으로 투여될 수 있다 (예를 들어, 요법들이 공-투여됨). 조합 요법의 예방제 또는 치료제는 동일한 투여 요법에 따라 투여되거나 (예를 들어, 둘 다의 요법이 매일 투여됨) 또는 상이한 투여 요법에 따라 투여될 수 있다 (예를 들어, 하나의 요법은 매일 투여되고, 다른 요법은 매주 투여됨). 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 임의로 그의 아미드 호변이성질체 (S)-6-(1-((2-아미노-6-플루오로퀴놀린-3-일)옥시)에틸)-5-(1H-피라졸-1-일)피리딘-2(1H)-온으로서 고체 형태로 제조되는 6-{(1S)-1-[(2-아미노-6-플루오로퀴놀린-3-일)옥시]에틸}-5-(1H-피라졸-1-일)피리딘-2-올을 포함한 조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 개별 제약 조성물로 공동으로 투여될 수 있다 (예를 들어, 요법들이 공-투여됨). 조합 요법의 이러한 예방제 또는 치료제는 동일한 투여 요법에 따라 투여되거나 (예를 들어, 둘 다의 요법이 매일 투여됨) 또는 상이한 투여 요법에 따라 투여될 수 있다 (예를 들어, 하나의 요법은 매일 투여되고, 다른 요법은 매주 투여됨). 추가로, 이러한 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 임의로 그의 아미드 호변이성질체 (S)-6-(1-((2-아미노-6-플루오로퀴놀린-3-일)옥시)에틸)-5-(1H-피라졸-1-일)피리딘-2(1H)-온으로서 고체 형태로 제조되는 6-{(1S)-1-[(2-아미노-6-플루오로퀴놀린-3-일)옥시]에틸}-5-(1H-피라졸-1-일)피리딘-2-올을 포함한 예방제 또는 치료제는 대상체에서 VOC의 지속기간을 감소시키거나 (예를 들어, VOC를 해소하는 시간의 감소), 중증도 및/또는 강도를 감소시키고/거나, 연간 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 비율을 감소시키고/거나, 제1 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간을 증가시키고/거나, 제2 겸상 적혈구-관련 통증 발증까지의 중앙 시간을 증가시키고/거나, 비합병성 겸상 적혈구-관련 통증 발증의 중앙 비율을 감소시키기 위해 조합되어 투여될 수 있다.

본 개시내용은 추가로 정의된 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한 조합 요법의 예방제 또는 치료제를 포괄한다. 본원에 기재된 바와 같은 치료 및/또는 예방 방법을 언급하는 실시양태에서, 이러한 실시양태는 또한 그러한 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 또는 대안적으로 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상의 그러한 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물을 포함한 조합 요법에 관한 추가 실시양태를 포함한다.

본 개시내용은 본 개시내용의 E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 단독으로 또는 다른 요법과 조합하여 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 프로토콜을 제공한다. 본 개시내용의 조합 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 병용으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 조합 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 또한 주기적으로 투여될 수 있다. 주기 요법은 일정 기간 동안 제1 요법 (예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)의 투여에 이어서 일정 기간 동안 제2 요법 (예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)의 투여, 및 이러한 순차적 투여의 반복, 즉 요법 (예를 들어, 작용제) 중 하나에 대한 내성의 발생을 감소시키거나/거나, 요법 (예를 들어, 작용제) 중 하나의 부작용을 회피 또는 감소시키고/거나, 요법의 효능을 개선시키기 위한 주기를 수반한다.

본 개시내용의 조합 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 공동으로 투여될 수 있다. 용어 "공동으로"는 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)을 정확하게 동시에 투여하는 것으로 제한되지 않고, 오히려 본 개시내용의 E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물을, 본 개시내용의 항체 또는 그의 접합체가 다른 요법(들)과 함께 작용하여 이들을 달리 투여한 경우보다 증가된 이익을 제공할 수 있도록 하는 순서로 그러한 시간 간격 내에 대상체에게 투여한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 각각의 요법은 동시에 또는 상이한 시점에 임의의 순서로 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있지만; 동시에 투여되지 않을 경우에도, 이들은 목적하는 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기 위해 충분히 가까운 시간 내에 투여되어야 한다. 각각의 요법은 임의의 적절한 형태로 및 임의의 적합한 경로에 의해 대상체에게 개별적으로 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 15분 미만, 30분 미만, 1시간 미만 간격, 약 1시간 간격, 약 1시간 내지 약 2시간 간격, 약 2시간 내지 약 3시간 간격, 약 3시간 내지 약 4시간 간격, 약 4시간 내지 약 5시간 간격, 약 5시간 내지 약 6시간 간격, 약 6시간 내지 약 7시간 간격, 약 7시간 내지 약 8시간 간격, 약 8시간 내지 약 9시간 간격, 약 9시간 내지 약 10시간 간격, 약 10시간 내지 약 11시간 간격, 약 11시간 내지 약 12시간 간격, 24시간 간격, 48시간 간격, 72시간 간격 또는 1주 간격으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 2종 이상의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 동일한 환자 방문 내에서 투여된다.

조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일한 제약 조성물로 투여될 수 있다. 대안적으로, 조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 개별 제약 조성물로 공동으로 투여될 수 있다. 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.

진단 용도

본 발명의 항-E-셀렉틴 항체, 항체 조성물 및 방법은 E-셀렉틴 매개 장애의 진단 및 치료 평가를 위한 면역검정 및 용도를 포함한 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다. 본 방법은 E-셀렉틴의 존재와 연관된 장애를 앓는 인간 환자를 진단, 평가 및 치료하는 데 특히 적합하다. E-셀렉틴의 존재와 연관된 이러한 장애는 SCD, 피부 질환 (예를 들어, 건선), 염증성 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염) 및 당뇨병의 합병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 E-셀렉틴을 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 E-셀렉틴에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계 및 항체와 결합된 E-셀렉틴의 존재를 검출함으로써 샘플 중 E-셀렉틴을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중 E-셀렉틴의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 항체와 결합된 E-셀렉틴을 검출하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, E-셀렉틴을 고체 지지체에 결합시키고 샘플을 그에 첨가하여 항체가 샘플 중 E-셀렉틴에 결합하도록 하는 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 고체 지지체에 결합된 항체와 동일하거나 상이한 제2 E-셀렉틴 항체가 첨가되고, 이는 직접 표지화에 의해 (즉, 제2 항체가 검출가능한 표지에 접합됨) 또는 예를 들어 제2 항체의 불변 도메인과 반응하고 검출가능한 표지를 포함하는 또 다른 종으로부터의 제3 항체를 첨가함으로써 검출될 수 있다. 따라서, 검정은 샘플 중 E-셀렉틴의 존재 또는 부재를 검출하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 검출가능한 표지에 커플링된 E-셀렉틴을 포함하는 표지된 경쟁자를 제공하는 단계; E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하는 단계; 샘플, 항체 및 표지된 경쟁자를 합하는 단계이며, 여기서 샘플 중 E-셀렉틴은 항체에의 결합에 대해 표지된 경쟁자와 경쟁하는 것인 단계; 및 항체에 결합되지 않은 표지된 경쟁자의 양을 표지의 검출에 의해 측정함으로써 상기 샘플 중 E-셀렉틴의 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 샘플 중 E-셀렉틴의 농도를 결정하는 방법을 제공한다. 샘플의 부재 하에 항체에 결합된 표지된 경쟁자의 양은, 샘플이 첨가된 경우에 항체에 결합된 표지된 경쟁자의 양과 비교된다. 샘플 존재 하에 결합된 표지된-경쟁자의 감소량은 샘플 중에 존재하는 비-표지된 E-셀렉틴의 양의 지표이므로, 검정은 샘플 중 E-셀렉틴의 존재 및 수준을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, E-셀렉틴은 가용성 E-셀렉틴이다. 일부 실시양태에서, E-셀렉틴은 막 결합된 E-셀렉틴이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료를 투여하는 단계 및 치료 전 대상체로부터 수득된 샘플 중 E-셀렉틴의 수준을 치료 후 대상체로부터 수득된 다른 면에서는 동일한 샘플 중 E-셀렉틴의 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 샘플 중 E-셀렉틴의 수준은 E-셀렉틴 특이적 항체를 사용하여 평가되고, 추가로 여기서 치료 전 대상체로부터 수집된 샘플 중 E-셀렉틴의 수준과 비교하여 치료 후 대상체로부터 수집된 샘플 중 E-셀렉틴의 수준이 더 낮다는 것은 치료 과정의 유효성을 나타내는 것인, 대상체에서 E-셀렉틴의 증가된 수준과 연관된 질환 또는 장애에 대한 치료의 유효성을 평가하는 방법을 제공한다.

E-셀렉틴 특이적 항체 또는 표지된 경쟁자와 관련하여, 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 항체 또는 표지된 경쟁자에 커플링 (즉, 물리적으로 연결)시키는 직접 표지화, 뿐만 아니라 항체 또는 표지된 경쟁자를 직접 표지된 또 다른 시약과 커플링시키는 간접 표지를 포함한다. 간접 표지의 예는 형광-표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체의 검출을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전 및 면역형광을 포함한다.

용어 "샘플"은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 유체 (예를 들어, 혈액, CSF, 소변 등), 뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에 기재된 항체, 표지된 경쟁자 및 잠재적 치료 화합물은 또한 다양한 검출 시스템에 의한 다수의 다른 동종 및 이종 면역검정 중 임의의 것과 함께 사용하기에 적합하다.

조성물

본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 제약 조성물로서 제제화될 수 있다. 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 안정화제 (Remington: The Science and practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)를 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우에 성분이 생물학적 활성을 보유하도록 하고 대상체의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다.

예는 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 (PBS), 물, 생리 염수 (0.9%), 에멀젼 (예를 들어, 오일/물 에멀젼) 및 다양한 유형의 습윤제 중 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 PBS 및 생리 염수이다.

허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트란; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™, 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 80 (PS80), 폴리소르베이트 60 (PS60), 폴리소르베이트 20 (PS20)) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제가 본원에 추가로 기재되어 있다.

본 개시내용의 제약 화합물은 1종 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.

본 개시내용의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 다음을 포함한다: (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.

본 개시내용의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

이들 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시키는 것 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 추가로, 주사가능한 제약 형태의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.

제약 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 적합할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시키고, 이어서 멸균 마이크로여과함으로써 제조될 수 있다.

일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조 (동결건조)이다.

본 개시내용의 제약 조성물은 안과적 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어 수성 또는 유성 액체 담체 중 활성 성분의, 예를 들어 0.1%-1.0% (w/w) 용액 또는 현탁액을 포함한 점안제의 형태일 수 있다. 이러한 점안제는 완충제, 염 또는 본원에 기재된 추가의 성분 중 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 유용한 다른 안과적으로 투여가능한 제제는 미세결정질 형태 또는 리포솜 제제로 활성 성분을 포함하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 "추가의 성분"은 하기 중 1종 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 생리학상 분해성 조성물, 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 제약상 허용되는 중합체 또는 소수성 물질. 본 개시내용의 제약 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가의 성분"은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1985)] (이는 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 1 mL의 수성 완충 용액 중에 100 mg의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 바이알로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 1 mL의 수성 완충 용액 중에 150 mg의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 바이알로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 피하 투여를 위해 1 mL의 수성 완충 용액 중에 15 mg, 40 mg, 100 mg, 300 mg 또는 600 mg의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 바이알로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 정맥내 투여를 위해 1 mL의 수성 완충 용액 중에 500 mg의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 바이알로 제제화된다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/ml 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 100 mg/mL 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, SC 및/또는 IV 투여에 적합한 제약 조성물은 약 100 mg/mL 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 멸균 수용액으로서 정맥내 또는 피하 제제로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 멸균 수용액으로서 정맥내 또는 피하 제제로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 멸균 수용액으로서 정맥내 또는 피하 제제로 투여된다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편은 약 5 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL의 항체, 약 25 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 75 mg/ml, 약 100 mg/mL, 약 125 mg/mL 또는 약 150 mg/mL의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 멸균 수용액인 정맥내 또는 피하 제제로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 정맥내 또는 피하 제제는 약 5 내지 6 범위의 pH의 아세트산나트륨, 폴리소르베이트 80 및 염화나트륨을 포함하는 멸균 수용액이다. 일부 실시양태에서, 정맥내 제제는 pH 5.5의 20 mM 아세트산나트륨, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 140 mM 염화나트륨을 갖는 5 또는 10 mg/mL의 항체를 함유하는 멸균 수용액이다. 추가로, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 용액은 많은 다른 화합물 중에서도 특히, 글루탐산, 히스티딘, 만니톨, 수크로스, 트레할로스, 글리신, 폴리(에틸렌) 글리콜, EDTA, 메티오닌, 폴리소르베이트 80 및 그의 임의의 조합 및 관련 기술분야에 공지된 많은 다른 화합물을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 하기 성분을 포함한다: 50 mg/mL 또는 100 mg/mL의 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 항원-결합 단편, 20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로스 및 0.02% 폴리소르베이트 80, 0.005% EDTA, pH 5.8. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 하기 성분을 포함한다: 100 mg/mL의 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 항원-결합 단편, 10 mM 히스티딘, 5% 수크로스 및 0.01% 폴리소르베이트 80, pH 5.8.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 100 mg/mL의 농도의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 1444), 1.12 mg/mL L-히스티딘, 2.67 mg/mL L-히스티딘 히드로클로라이드 1수화물, 85 mg/mL 수크로스, 0.05 mg/mL 에데테이트 디소듐 2수화물 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80 (pH 5.8)을 1.0 mL의 공칭 충전 부피로 포함한다. 이러한 제약 조성물은 SC 또는 IV 투여에 적합하다.

이러한 제약 조성물은 액체 제제로서 또는 동결건조된 분말로 제공될 수 있다. 분말이 전체 부피로 재구성되는 경우에, 조성물은 동일한 제제를 보유한다. 대안적으로, 분말은 절반 부피로 재구성될 수 있으며, 이 경우에 조성물은 동일한 성분을 2배의 농도로 포함한다.

치료제와 관련하여, 작용제가, 예를 들어 조합 요법에 사용되는 소분자인 경우에, 이는 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 생리학상 허용되는 에스테르 또는 염의 형태로, 예컨대 생리학상 허용되는 양이온 또는 음이온과 조합되어 제약 조성물에 존재할 수 있다.

본원에 기재된 제약 조성물의 제제는 약리학 분야에서 공지되거나 이후에 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 1종 이상의 다른 보조 성분과 회합시키는 단계 및 이어서, 필요하거나 바람직한 경우에, 생성물을 목적하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 성형 또는 포장하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 내독소 및/또는 관련 발열성 물질이 실질적으로 없는 발열원-무함유 제제이다. 내독소는 미생물 내부에 국한되고 미생물이 분해되거나 사멸하는 경우에 방출되는 독소를 포함한다. 발열성 물질은 또한 박테리아 및 다른 미생물의 외막으로부터의 열-유도, 열안정성 물질 (당단백질)을 포함한다. 이들 물질은 인간에게 투여되는 경우에 열, 저혈압 및 쇼크를 유발할 수 있다. 잠재적 유해 효과로 인해, 정맥내로 투여된 제약 약물 용액으로부터 내독소를 적은 양이라도 제거하는 것이 유리하다. 미국 식품 의약품국 ("FDA")은 정맥내 약물 적용을 위해 단일 1-시간 기간 내에 체중 킬로그램당 용량당 5 내독소 단위 (EU)의 상한치를 설정하였다 (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). 치료 단백질이 체중 킬로그램당 수백 또는 수천 밀리그램의 양으로 투여되는 경우에, 내독소를 미량이라도 제거하는 것이 유리하다. 한 실시양태에서, 조성물 중 내독소 및 발열원 수준은 10 EU/mg 미만 또는 5 EU/mg 미만 또는 1 EU/mg 미만 또는 0.1 EU/mg 미만 또는 0.01 EU/mg 미만 또는 0.001 EU/mg 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 내독소 및 발열원 수준은 약 10 EU/mg 미만 또는 약 5 EU/mg 미만 또는 약 1 EU/mg 미만 또는 약 0.1 EU/mg 미만 또는 약 0.01 EU/mg 미만 또는 약 0.001 EU/mg 미만이다.

투약 및 투여

본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 항체는 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 (상기 참조)와 혼합된다. 치료제 및 진단제의 제제는 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와의 혼합에 의해, 예를 들어 동결건조된 분말, 슬러리, 수용액, 로션 또는 현탁액의 형태로 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.] 참조).

치료를 위한 투여 요법을 선택하는 것은 엔티티의 혈청 또는 조직 전환율, 증상의 수준, 엔티티의 면역원성 및 생물학적 매트릭스 내의 표적 세포의 접근성을 포함한 여러 인자에 좌우된다. 특정 실시양태에서, 투여 요법은 부작용의 허용되는 수준에 부합하도록 환자에게 전달되는 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로 특정한 엔티티 및 치료될 상태의 중증도에 좌우된다. 항체, 시토카인 및 소분자의 적절한 용량을 선택하는 데 있어서의 지침이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak, 1996, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.), 1991, Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.),1993, Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N. Y.; Baert, et al., New Engl. J. Med. 2003; 348:601-608; Milgrom, et al., New Engl. J. Med. 1999; 341:1966-1973; Slamon, et al., New Engl. J. Med. 2001; 344:783-792; Beniaminovitz, et al., New Engl. J. Med. 2000; 342:613-619; Ghosh, et al., New Engl. J. Med. 2003; 348:24-32; Lipsky, et al., New Engl. J. Med. 2000; 343:1594-1602] 참조).

적절한 용량의 결정은, 예를 들어 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 기술분야에 공지되거나 의심되는 또는 치료에 영향을 미칠 것으로 예측되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양으로 시작하고, 그 후에 임의의 부정적 부작용에 비해 목적하는 또는 최적 효과가 달성될 때까지 적은 증분으로 증가된다. 구체적 용량 프로토콜은 유의한 바람직하지 않은 부작용을 피하는 최대 용량 또는 용량 빈도를 수반하는 것일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "E-셀렉틴과의 상호작용을 감소, 중화 또는 억제하는"은 임의의 치료적 개입 전 상호작용의 수준과 비교하여 E-셀렉틴과 리간드의 상호작용을 감소, 경감, 중화 또는 억제하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 "유리 E-셀렉틴"은 또 다른 분자 (예를 들어, 유리 또는 세포 표면 발현된 E-셀렉틴 리간드)와 결합되지 않거나 또는 달리 복합체로 존재하지 않는 E-셀렉틴을 의미한다.

E-셀렉틴의 수준은 본원에 개시된 방법 또는 관련 기술분야에 공지된 유리 E-셀렉틴의 수준을 평가하기 위한 임의의 다른 방법을 사용하여 수준이 평가되는 대상체에서의 유리 E-셀렉틴의 수준을 포함한다.

한 실시양태에서, 유리 E-셀렉틴의 수준은 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체의 투여 전 대상체에서의 E-셀렉틴의 수준과 비교하여 감소된다. 한 실시양태에서, 유리 E-셀렉틴의 수준은 대상체가 유리 E-셀렉틴과 연관되거나 그에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태를 앓는다는 것을 나타내거나 또는 그와 연관된 유리 E-셀렉틴의 표준 수준과 비교하여 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 유리 E-셀렉틴의 수준을, 유리 E-셀렉틴에 의해 매개되거나 그와 연관된 검출가능한 유해 효과(들)의 감소 또는 완전한 결여가 있는 수준으로 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유효 용량의 항-E-셀렉틴 항체가 투여되어 다음과 같은 E-셀렉틴 기능적 활성을 중화시킨다: (a) 내피 세포에 대한 백혈구 테더링; (b) 내피 세포에 대한 안정한 부착의 활성화; (c) 정지하기 위한 백혈구의 느린 롤링; (d) 백혈구의 경내피 이동; (e) CD18 인테그린의 친화도 및 결합력; (f) 급성 염증 부위로의 백혈구의 트래픽킹; (g) 시토졸 칼슘의 증가; (h) p38 MAP 키나제 및 Syk 키나제를 활성화시키는 티로신 인산화의 증가; (i) 혈액으로부터 혈관 내피로의 혈소판 및 백혈구의 동원; 및/또는 (j) 염증유발 환경을 생성시키지 않는 것.

본원에 사용된 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효 투여량", "유효 용량", "유효량" 또는 "치료 유효량"은 임의의 1종 이상의 유익한 또는 목적하는 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 예방적 사용의 경우에, 유익하거나 목적하는 결과는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 그의 합병증 및 질환의 발생 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함한 질환의 위험을 제거하거나 감소시키는 것, 그의 발생 빈도를 감소시키는 것 (예를 들어, 소정 기간에 걸쳐, 예를 들어 매주, 매월, 매년), 그의 중증도를 경감시키는 것 및/또는 그의 발병을 지연시키는 것을 포함한다. 치료적 사용의 경우에, 유익하거나 목적하는 결과는 검출가능한 임상 결과, 예컨대 VOC의 비율을 감소시키거나 경감시키는 것 또는 E-셀렉틴의 발현으로 인한 1종 이상의 증상을 감소시키는 것, 질환을 치료하는 데 요구되는 다른 의약의 용량을 감소시키는 것, 또 다른 의약의 효과를 증진시키는 것 및/또는 환자의 질환의 진행을 지연시키는 것을 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 예방적 또는 치유적 치료를 직접적으로 또는 간접적으로 달성하기에 충분한 양이다. 임상 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 함께 달성될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, "유효 투여량"은 1종 이상의 치료제의 투여와 관련하여 고려될 수 있고, 단일 작용제는 1종 이상의 다른 작용제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우에 유효량으로 주어지는 것으로 간주될 수 있다.

일부 실시양태에서, 유효 용량의 항-E-셀렉틴 항체는 SCD, 피부 질환 (예를 들어, 건선), 염증성 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염) 및 당뇨병의 합병증에 걸린 환자에게 투여된다.

일부 실시양태에서, 유효 용량의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444)는 SCD, 혈관-폐쇄성 발증, 통증, 기관 경색, 허혈, 졸중, 종말 기관 기능장애, 급성 흉부 및 혈관 폐쇄를 포함하나 이에 제한되지는 않는, E-셀렉틴 발현 및/또는 리간드 (예를 들어, sLex A 및/또는 X 결정기)에 대한 E-셀렉틴 결합과 연관되거나 그에 의해 매개되는 질환, 장애 및 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 투여된다.

일부 실시양태에서, 유효 용량의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444)는 SCD에 대한 예방적 치료로서 이용되는 경우에 VOC를 방지하거나 또는 그의 발생을 감소시키기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444)의 예방적 투여는 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444)의 예방적 투여는 진행상황에 기초하여 투여된다 (예를 들어, 소정 기간에 걸쳐 1회 또는 1회 초과의 투여).

일부 실시양태에서, 유효 용량의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444)는 SCD를 갖는 환자에서 VOC의 지속기간, 강도 및/또는 중증도를 감소시킴으로써 급성 VOC를 치료하기 위해 투여된다.

일부 실시양태에서, 유효 용량의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444)는 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상, 예를 들어 심흉계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 만성 제한성 폐 질환, 좌심실 확장기 질환, 폐고혈압, 급성 흉부 증후군, 부정맥, 돌연사, 혈관-폐쇄성 발증), 신경계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 출혈성 졸중, 정맥동 혈전증, 뇌의 침묵 뇌경색, 만성 통증, 뇌의 급성 허혈성 졸중, 증식성 망막병증, 안와 경색, 인지 장애), 세망내피계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 비장 격리, 기능적 비장기능저하증, 빈혈, 용혈), 근골격계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 무혈관성 괴사, 피부 궤양화), 비뇨생식기계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 유두상 괴사, 단백뇨, 신부전, 혈뇨, 야간 야뇨증, 지속발기증) 및 위장계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 담석증, 담관병증, 간병증, 장간막 혈관-폐쇄)을 치료, 예방 및/또는 호전시키기 위해 투여된다.

일부 실시양태에서, 방법 또는 용도는 약 1 mg 내지 약 800 mg의 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법 또는 용도는 초기 고정 용량으로서 약 1 mg 내지 800 mg의 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법 또는 용도는 임의로 초기 고정 용량으로서 약 1 mg 내지 약 2 mg, 약 2 mg 내지 약 5 mg, 약 5 mg 내지 약 10 mg, 약 10 mg 내지 약 20 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 30 mg 내지 약 40 mg, 약 40 mg 내지 약 50 mg, 약 50 mg 내지 약 60 mg, 약 60 mg 내지 약 70 mg, 약 70 mg 내지 약 80 mg, 약 80 mg 내지 약 90 mg, 약 90 mg 내지 약 100 mg, 약 100 mg 내지 약 150 mg, 약 150 mg 내지 약 200 mg, 약 200 mg 내지 약 300 mg, 약 300 mg 내지 약 400 mg, 약 400 mg 내지 약 500 mg, 약 500 mg 내지 약 600 mg, 약 600 mg 내지 약 700 mg 또는 약 700 mg 내지 약 800 mg의 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법 또는 용도는 약 15 mg, 40 mg, 100 mg, 150 mg, 300 mg, 500 mg 또는 600 mg 용량의 본 발명의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용량은 초기 고정 용량이다.

일부 실시양태에서, 방법 또는 용도는 약 150 mg 용량의 본 발명의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법 또는 용도는 매주 기준으로 약 150 mg의 용량의 본 발명의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법 또는 용도는 매주 기준으로 약 150 mg의 용량의 본 발명의 항-E-셀렉틴 항체 (예를 들어, 항체 1444) 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 제약 조성물을 피하로 투여하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법 또는 용도는 임의로 초기 용량으로서 약 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량의 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 초기 용량 후 1회 이상의 후속 용량이 이어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 1회 이상의 후속 용량은 적어도 매주, 격주, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 10주마다, 11주마다 또는 12주마다 중 임의의 것으로 투여될 수 있다.

초기 용량 후 1회 이상의 후속 용량이 이어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 후속 용량은 초기 용량과 비교하여 동일한 용량, 더 낮은 용량 또는 더 높은 용량의 항-E-셀렉틴 항체이다. 일부 실시양태에서, 1회 이상의 후속 용량은 적어도 매주, 격주, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 10주마다, 11주마다 또는 12주마다 중 임의의 것으로 투여될 수 있다. 구체적 용량 프로토콜은 유의한 바람직하지 않은 부작용을 피하는 최대 용량 또는 용량 빈도를 수반하는 것이다.

본 개시내용의 제약 조성물은 또한 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 좌우될 것이다. 본 개시내용의 항체에 대해 선택된 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 비경구 투여는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 나타낼 수 있고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 본 개시내용의 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 피하로 투여된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 매주 기준으로 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 매주 기준으로 약 15 mg, 약 40 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 300 mg 또는 약 600 mg의 단위 용량으로 피하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 매주 기준으로 약 150 mg 또는 약 500 mg의 단위 용량으로 정맥내로 투여된다.

일부 실시양태에서, 대상체는 매주 기준으로 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 투여되고, 매일, 매주, 격주, 매월 또는 필요에 따라 질환 (예를 들어, SCD)의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 치료 활성 화합물 또는 치료 양식이 투여된다. 본 개시내용은 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 단독으로 또는 다른 요법과 조합하여 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 프로토콜을 제공한다. 본 개시내용의 조합 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 병용으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 조합 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 또한 주기적으로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 약 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회, 1개월 2회, 1개월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 7개월마다 1회, 8개월마다 1회, 9개월마다 1회, 10개월마다 1회, 11개월마다 1회 또는 12개월마다 1회 투여된다.

일부 실시양태에서, 용량의 일부는 정맥내 볼루스에 의해 투여되고, 용량의 나머지는 항체 제제의 주입에 의해 투여된다. 예를 들어, 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 0.01 mg/kg 정맥내 주사는 볼루스로 제공될 수 있으며, 항체 용량의 나머지는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 미리 결정된 용량은, 예를 들어 1시간 30분 내지 2시간 내지 5시간의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.

필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서의 통증을 완화하기 위한 국부 마취제, 예컨대 리도카인을 포함할 수 있다. 추가로, 폐 투여는, 예를 들어 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용 및 에어로졸화제를 사용한 제제에 의해 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540 및 4,880,078; 및 PCT 공개 번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 및 WO 99/66903을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

키트

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중 임의의 것 또는 모두를 포함하는 키트를 제공한다. 본 개시내용의 키트는 본원에 기재된 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 1개 이상의 용기 및 본원에 기재된 본 개시내용의 임의의 방법에 따른 사용에 대한 지침서를 포함한다. 일반적으로, 이들 지침서는 상기 기재된 치유적 치료를 위한 항체 투여의 설명을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일-용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트가 제공된다. 특정 실시양태에서, 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제제를 갖는 제2 용기 둘 다를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 어플리케이터, 예를 들어 단일 및 다중-챔버의 사전-충전된 시린지 또는 장치 (예를 들어, 액체 시린지 및 리오시린지)를 함유하는 키트가 포함된다.

일부 실시양태에서, 키트는 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 어플리케이터를 함유하며, 여기서 어플리케이터는 환자 (예를 들어, SCD를 갖는 환자)에 의한 자기-투여용으로 설계되거나 허용된다. 일부 실시양태에서, 자기-투여는 피하 투여에 의한 것이다.

항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로 (예를 들어, SC 또는 IV)에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 공급된 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지침서이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 보유된 지침서)가 또한 허용된다.

본 개시내용의 키트는 적합한 포장 내에 있다. 적합한 포장은 바이알, 병, 단지, 가요성 포장 (예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본 개시내용의 항-E-셀렉틴 항체이다. 용기는 추가의 치료제를 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 SCD의 증상을 치료 또는 예방하는 데 효과적인 제2 치료 활성 화합물 또는 치료 양식을 추가로 포함하는 키트를 포함하며, 여기서 항-E-셀렉틴 항체 및 제2 화합물 또는 양식의 양은 함께 SCD의 증상의 치료 또는 예방에서 상승작용적 효과를 달성하고, 즉, 조합물은 "상승작용적"이다 (즉, 조합물은 2종 이상의 개별 요법의 단순 상가적 효과보다 더 큰 효과를 제공함). 상승작용적 조합 요법을 포함하는 이러한 키트는 유리하게는 투여된 치료제의 보다 낮은 투여량을 이용함으로써, 다양한 단독요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.

일부 실시양태에서, 키트는, 예를 들어 페니실린, 히드록시우레아 (예를 들어, 드록시아(DROXIA), 히드레아(HYDREA)), L-글루타민 (예를 들어, 엔다리(ENDARI)), 크리잔리주맙 (아다크베오(ADAKVEO)), 복셀로터 (옥스브리타(OXBRYTA)), 아픽사반 (엘리퀴스(ELIQUIS)), 리바록사반 (자렐토(XARELTO)), 비-스테로이드성 항염증 약물, 일반적으로 진통제, 오피오이드 진통제, IW-1701, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS)), 티카그렐로르 (브릴린타(BRILINTA)) 또는 메만틴 (나멘다(NAMENDA))을 포함한, SCD의 징후 및/또는 증상의 치료 또는 예방에 유용한 적어도 1종의 추가의 치료 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다.

키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기 및 용기 상에 있거나 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 또는 모든 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 진단 키트를 제공한다. 진단 키트는, 예를 들어 샘플 중 E-셀렉틴의 존재를 검출하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 진단 키트는 E-셀렉틴-매개 질환, 장애 또는 상태가 발생할 위험에 처하게 될 수 있는 잠재성 질환, 장애 또는 상태를 갖는 개체를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진단 키트는 E-셀렉틴 매개 질환, 장애 또는 상태를 갖는 것으로 의심되는 개체에서 E-셀렉틴의 존재 및/또는 수준을 검출하는 데 사용될 수 있다.

본 개시내용의 진단 키트는 본원에 기재된 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 1개 이상의 용기 및 본원에 기재된 본 개시내용의 임의의 방법에 따른 사용에 대한 지침서를 포함한다. 일반적으로, 지침서는 SCD 및/또는 비정상적 형태의 β-글로빈 (HbS, HbC, Hbβ⁺-지중해빈혈, Hbβ°-지중해빈혈 또는 다른 Hb 변이체 포함)과 연관되거나 그에 의해 매개되는 임의의 다른 상태를 앓는 것으로 의심되거나 알려져 있는 환자에서의 VOC와 같이, E-셀렉틴 매개 질환, 장애 또는 상태를 가질 위험이 있거나 갖는 것으로 의심되는 개체에서 E-셀렉틴의 존재를 검출하기 위한 E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 사용에 대한 설명을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예시적인 진단 키트는 시약, 예컨대, 예를 들어 E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 음성 대조군 샘플, 양성 대조군 샘플 및 키트의 사용에 대한 지침서를 함유하도록 구성될 수 있다.

생물학적 기탁

항-E-셀렉틴 항체 1444의 중쇄 및 경쇄를 부다페스트 조약에 따른 조항 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)에 2019년 12월 6일에 기탁하였다.

기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 (부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 살아있는 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC로부터 이용가능할 것이고, 이는 화이자, 인크.(Pfizer, Inc.)와 ATCC 사이의 협정에 따르며, 상기 협정은 관련 미국 특허의 허여 시에 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개 시에 (이중 먼저 도래하는 시점에) 공공에 대한 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122 및 그에 대한 미국 특허상표청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정한 언급이 있는 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 따라 특허상표청장에 의해 자격이 인정된 것에 대한 자손의 이용가능성을 보장한다.

본 출원의 양수인은 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양될 때 사멸거나 손실되거나 파괴되는 경우에, 물질을 통지 하에 또 다른 동일한 것으로 신속하게 대체할 것에 동의하였다. 기탁 물질의 이용가능성은 특허법에 따른 임의의 정부의 권한 하에 보장된 권리에 반하여 본 발명을 실시하는 것에 대한 허가로 해석되지 않는다.

일반적 기술

본 발명은 특정 합성 제조 방법 (물론 달라질 수도 있음)에 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 그의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에 상세히 설명되어 있다.

효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 설명서에 따라, 관련 기술분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 생화학, 면역학, 분자 생물학, 합성 유기 화학 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 그의 실험실 절차 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 제약 제조, 제제화 및 전달 및 환자의 치료를 위해 표준 기술이 사용된다.

등가물

상기 설명 및 하기 실시예는 본 개시내용의 특정 구체적 실시양태를 상술하고, 본 발명자들에 의해 고려되는 최상의 방식을 기재한다. 그러나, 상기 내용이 본문에서 상세하게 나타날 수 있더라도, 본 개시내용은 많은 방식으로 실시될 수 있고, 본 개시내용은 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석될 것으로 인지될 것이다.

개시된 교시가 다양한 적용, 방법, 키트 및 조성물과 관련하여 기재되었지만, 본원의 교시 및 하기 청구된 개시내용으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있는 것으로 인지될 것이다. 하기 실시예는 개시된 교시를 보다 잘 예시하기 위해 제공되며, 본원에 제시된 교시의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 교시가 이들 예시적인 실시양태의 관점에서 기재되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이들 예시적인 실시양태의 수많은 변경 및 변형이 과도한 실험 없이 가능하다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 모든 이러한 변경 및 변형은 본 교시의 범주 내에 있다.

특허, 특허 출원, 논문, 교재 등을 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌, 및 이들이 이미 포함되어 있지는 않은 정도로, 그에 인용된 참고문헌은, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 정의된 용어, 용어 용법, 기재된 기술 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우에, 본 출원이 우선한다.

실시예

본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시 목적을 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1: 인간 E-셀렉틴에 결합하는 래트 모노클로날 항체의 단리

스프라그 돌리 래트를 래피드 IP 면역화 방법을 사용하여 가용성 인간 E-셀렉틴 세포외 도메인 (유니프롯 P16581 잔기 22-556; 서열식별번호: 133)으로 면역화시켰다. 하이브리도마 상청액을 직접 결합 HRP-ELISA를 사용하여 가용성 인간 (서열식별번호: 133) 및 마우스 (서열식별번호: 135) E-셀렉틴 세포외 도메인 및 말단절단된 인간 E-셀렉틴 (유니프롯KB P16581 잔기 22-178; 서열식별번호: 197) 및 말단절단된 마우스 E-셀렉틴 (유니프롯KB Q00690 잔기 22-178; 서열식별번호: 199)인 E-셀렉틴에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 결합제의 세트 중에서, 가용성 및 말단절단된 인간 E-셀렉틴에 결합된 6종의 항체 (0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180)를 선택하고, 가용성 및 말단절단된 마우스 E-셀렉틴에 결합된 1종의 항체 (0027)를 선택하였다. 이들 7종의 항체를 분자 클로닝 및 하위서열 분석을 위해 선택하였다.

실시예 2: 래트 항-E-셀렉틴 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 클로닝

인간 E-셀렉틴에 결합된 항-E-셀렉틴 항체 (항체 0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180) 또는 마우스 E-셀렉틴에 결합된 항-E-셀렉틴 항체 (항체 0027)의 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 가변 영역을 스마트(SMART)® cDNA 합성 시스템 (클론테크 래보러토리즈 인크.(Clontech Laboratories Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰)을 사용하여 클로닝하고, 이어서 PCR 증폭시켰다. RNEasy 키트 (퀴아젠(Qiagen)) 및 스마트® IIA 올리고 (클론테크 래보러토리즈 인크.)와 슈퍼스크립트(Superscript)™ III 리버스 트랜스크립타제 (인비트로젠)를 사용하여, 대략 500,000개의 하이브리도마 세포 (각각의 클론 0027, 0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180에 대해)로부터 단리된 1 μg의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 이어서, Q5® 하이-피델리티 2X 마스터 믹스 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 인크.(New England Biolabs Inc.))와 함께 스마트® IIA 올리고 서열에 어닐링하는 프라이머 및 래트 불변 영역-특이적 프라이머 (경쇄에 대해 래트 카파 및 중쇄에 대해 래트 IgG1)를 사용하여 PCR에 의해 cDNA를 증폭시켰다. 중쇄 및 경쇄 PCR 생성물을 pCR4-TOPO 벡터 (인비트로젠) 내로 서브클로닝하고, 핵산 서열을 결정하였다. 이 방법은 DNA 서열에 대한 사전 지식이 요구되지 않다는 점에서 유리하다. 추가로, 생성된 DNA 서열은 축중성 PCR 프라이머의 사용에 의해 변경되지 않는다.

가변 중쇄 영역 (항체 0039에 대한 VH (서열식별번호: 60의 아미노산 서열), 항체 0158에 대한 VH (서열식별번호: 75의 아미노산 서열), 항체 0159에 대한 VH (서열식별번호: 90의 아미노산 서열), 항체 0164에 대한 VH (서열식별번호: 35의 아미노산 서열), 항체 0170에 대한 VH (서열식별번호: 104의 아미노산 서열), 항체 0180에 대한 VH (서열식별번호: 118의 아미노산 서열) 및 항체 0027에 대한 VH (서열식별번호: 128의 아미노산 서열))을, 이펙터 기능을 제거하도록 돌연변이된 (Leu234Ala, Leu235Ala 및 Gly237Ala, EU 넘버링; 미국 특허 번호 5,624,821) 인간 IgG1 불변 영역 (서열식별번호: 15의 아미노산 서열)을 함유하는 pTT5 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하여 키메라 중쇄를 생산하였다. 가변 경쇄 영역 (항체 0039에 대한 VL (서열식별번호: 57의 아미노산 서열), 항체 0158에 대한 VL (서열식별번호: 73의 아미노산 서열), 항체 0159에 대한 VL (서열식별번호: 87의 아미노산 서열), 항체 0164에 대한 VL (서열식별번호: 32의 아미노산 서열), 항체 0170에 대한 VL (서열식별번호: 102의 아미노산 서열), 항체 0180에 대한 VL (서열식별번호: 116의 아미노산 서열) 및 항체 0027에 대한 VL (서열식별번호: 122의 아미노산 서열))을, 인간 카파의 불변 영역 (서열식별번호: 14의 아미노산 서열)을 함유하는 pTT5 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하여 키메라 경쇄를 생산하였다.

실시예 3: 항-E-셀렉틴 항체의 결합 및 중화

인간 E-셀렉틴 세포외 도메인 (서열식별번호: 133의 아미노산 서열 플러스 10개 His 정제 꼬리) 및 마우스 E-셀렉틴 세포외 도메인 (서열식별번호: 135의 아미노산 서열 플러스 10개 His 정제 꼬리)에 대한 항-E-셀렉틴 항체의 결합을, HPR 검출이 동반된 재조합 항원 결합 ELISA를 사용하여 측정하였다. 384-웰 맥시소르프 플레이트를 사용하여 인간 및 마우스 His-태그부착된 재조합 E-셀렉틴 폴리펩티드를 포획하였다. 폴리펩티드를 다양한 농도의 키메라 항체와 함께 인큐베이션하고, HRP-표지된 항-인간 IgG1 항체로 검출하였다. 항체 0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180은 인간 E-셀렉틴에 각각 0.02 nM, 0.03 nM, 0.02 nM, 0.02 nM, 0.01 nM 및 0.01 nM의 EC₅₀으로 결합하였다. 이들 항체 중 어떠한 것도 마우스 E-셀렉틴에 >133 nM의 EC₅₀으로 결합하지 않았다. 항체 0027은 마우스 E-셀렉틴에 0.02 nM의 EC₅₀으로 결합하였지만, 인간 E-셀렉틴에 >133 nM의 EC₅₀으로 결합하지 않았다.

항-E-셀렉틴 항체의 중화 능력을 알파리사 균질 경쟁 검정으로 측정하였다. 여기서 항체는 시알릴-루이스 A 리간드에 대한 인간 E-셀렉틴 세포외 도메인 (서열식별번호: 133의 아미노산 서열 플러스 10개 His 정제 꼬리), 마우스 E-셀렉틴 세포외 도메인 (서열식별번호: 135의 아미노산 서열 플러스 10개 His 정제 꼬리) 또는 시노몰구스 E-셀렉틴 세포외 도메인 (서열식별번호: 175의 아미노산 서열 플러스 10개 His 정제 꼬리)의 상호작용에 대해 경쟁하였다. 이 실험을 위해, 1 μL의 항체를 384-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 이어서 1 μL의 시알릴 루이스 A-PAA-비오틴을 1.75 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 이를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 이어서 1.4 μL의 인간, 마우스 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 7 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 이를 다시 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 여기에, 1.4 μL 알파리사 비드를 10 μg/mL의 최종 검정 농도를 위해 첨가하였다 (Ni-공여자/SA-수용자). 이를 암실 내 실온에서 적어도 10시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 알파리사 프로토콜 (엔비전(Envision))을 사용하여 판독하였다.

키메라 항-E-셀렉틴 항체 0027, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180에 대해 인간, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴의 중화의 EC₅₀을 측정하였다. 항체 0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180은 인간 E-셀렉틴에 대한 <1 nM의 EC₅₀ 값을 가졌고, 항체 0027은 인간 E-셀렉틴을 중화시키지 않았고 >133 nM의 EC₅₀을 가졌다. 항체 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180은 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 <1 nM의 EC₅₀ 값을 가졌고, 항체 0039는 시노몰구스 E-셀렉틴에 대한 >63 nM의 EC₅₀ 값을 가졌고, 항체 0027은 시노몰구스 E-셀렉틴을 중화시키지 않았고 >133 nM의 EC₅₀을 가졌다. 항체 0027은 마우스 E-셀렉틴에 대한 1 nM의 EC₅₀ 값을 가졌고, 항체 0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180은 마우스 E-셀렉틴을 중화시키지 않았고 >133 nM의 EC₅₀을 가졌다 (표 4).

표 4. HRP 결합 ELISA 및 알파리사 중화 검정을 사용한 인간, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 항-E-셀렉틴 키메라 항체의 결합 및 중화

실시예 4: 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용한 항-E-셀렉틴의 동역학적 평가

인간 (서열식별번호: 133의 아미노산 서열), 마우스 (서열식별번호: 135의 아미노산 서열) 및 시노몰구스 원숭이 (서열식별번호: 175의 아미노산 서열) E-셀렉틴 세포외 도메인 단백질을 제조하였다. 각각의 단백질은 정제에 이용되는 C-말단의 10개 히스티딘 잔기 태그를 함유하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 항-인간 IgG 항체 (카탈로그 번호 BR-1008-39, 지이 헬스케어)를 카르복시메틸화 덱스트란 코팅된 센서 칩 (CM5) (카탈로그 번호 BR100530, 지이 헬스케어)의 모든 4개의 유동 셀에 아민 커플링시킴으로써 항-인간 Fc 센서 칩을 제조하였다. 400 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 100 mM N-히드록시숙신이미드 (NHS)의 1:1 혼합물을 7분 동안 10 μL/분의 유량으로 주입함으로써 유동 셀을 활성화시켰다. 항-인간 IgG 항체를 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 중 25 μg/mL로 희석하고, 모든 유동 셀 상에 7분 동안 10 μL/분으로 주입하였다. 모든 유동 셀을 1M 에탄올아민-HCl (ETH)로 7분 동안 10 μL/분으로 차단하였다. 포획 항체의 최종 고정화 수준은 대략 10,000 공명 단위 (RU)였다. 고정화 및 동역학을 위한 구동 완충제는 HBS-EP+ (10 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES) pH 7.4, 150 mM 염화나트륨, 3 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 0.05% (v/v) 트윈-20)였다.

인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스 E-셀렉틴에 대한 항체의 결합을 특징화하기 위해, 항체를 HBS-EP+ 중 0.5 μg/mL로 희석하고, 유동 셀 2, 3 및 4 상에 고정화된 항-인간 IgG에 의해 30초 내지 1분 동안 10 μL/분의 유량으로 포획하여 70 내지 300 RU의 포획 수준을 달성하였다. 유동 셀 1을 참조 표면으로 사용하였다. 항체 포획 후, 유량을 50 μL/분으로 증가시키고, HBS-EP+ 중 15 nM 내지 405 nM 농도 범위의 E-셀렉틴 단백질 또는 완충제를 모든 유동 셀 상에 1.0분 회합 기간 동안 주입한 다음, 6 내지 15분 동안 해리되도록 하였다. 각각의 포획된 항체에 대해 주기 수집된 HBS-EP+ 완충제를 이중-참조에 사용하였다 (Myszka DG. J. Mol. Recognition 1999; 12(5):279-84). 각각의 주기 종료 시에, 전체 항-IgG 표면을 3 M MgCl₂의 30초 펄스 및 이온성 완충제 (1.83 M MgCl₂, 0.92 M 우레아, 1.83 M 구아니딘 HCl, pH 7.4)의 30초 펄스에 의해 재생시켰다 (Andersson K. Analy. Chem. 1999; 71(13): 2475-81). 비아코어™ T200 기기 (지이 헬스케어) 상에서 25℃에서 10 헤르츠 (Hz)의 수집 속도로 동역학적 검정을 수행하였다. 비아코어™ T200 평가 소프트웨어 버전 3.0 (지이 헬스케어)의 1:1 결합 모델에 데이터를 피팅함으로써 속도 상수 및 친화도를 결정하였다.

먼저 항체를 고정화된 항-인간 IgG에 결합시킴으로써 항체 0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180에 대해 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 결합 친화도 및 항체 0027에 대해 마우스 E-셀렉틴에 대한 결합 친화도를 결정하였다. 항체 포획 후, E-셀렉틴 단백질의 희석물을 유동시키고, 인간, 시노몰구스 및 마우스 E-셀렉틴에의 결합에 대해 회합률 상수 (ka), 해리율 상수 (kd), t1/2 및 K_D 값을 결정하였다 (표 5-7). 이러한 SPR 분석에서, 인간 E-셀렉틴에 대한 항체 0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180의 친화도 (K_D)는 각각 68.0 nM, 21.6 nM, 324 nM, 54.4 nM, 628 nM 및 2940 nM이었다. 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 키메라 항체 0039, 0159, 0164, 0170 및 0180의 친화도 K_D는 각각 45.8 nM, 243.5 nM, 45.4 nM, 492 nM 및 3145 nM이었다. 항체 0158은 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 결합을 나타내지 않았다. 마우스 E-셀렉틴에 대한 키메라 항체 0027의 친화도 K_D는 1.2 nM이었다.

표 5. 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 인간 E-셀렉틴에 대한 항-E-셀렉틴 항체의 친화도.

표 6. 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 항-E-셀렉틴 항체의 친화도.

ND: 검출되지 않음

표 7. 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 마우스 E-셀렉틴에 대한 항-마우스 E-셀렉틴 항체의 친화도.

실시예 5: 정적 결합 검정에서의 항-E-셀렉틴 항체의 리간드 결합의 중화

E-셀렉틴을 발현하도록 조작된 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에 대한 시알릴 루이스 항원의 중화를 평가하기 위해 경쟁 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하는 정적 중화 검정에서 리간드 결합을 중화시키는 항-E-셀렉틴 항체의 능력을 평가하였다.

간략하게, 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 배양 배지 (10% 투석된 태아 소 혈청, 100 nM 메토트렉세이트 및 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 MEM (최소 필수 배지) 알파 배지)에서 성장시키고, 96 웰 조직 배양 플레이트에 웰당 12,500개 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 인큐베이션하여 전면생장 단층을 형성하였다. 후속적으로, 플레이트를 200 μL의 칼슘 마그네슘 무함유 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 2회 세척하였다. 항-E-셀렉틴 항체 0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180 또는 IgG1 이소형 대조군을 비오티닐화 시알릴 루이스 A 폴리아크릴아미드 (카르보신트 엘엘씨(Carbosynth LLC); OS45446)와 스트렙타비딘/양고추냉이 퍼옥시다제 (총 100 μL)의 소형 합성 접합체의 존재 하에 검정에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 200 μL의 칼슘 마그네슘 무함유 PBS로 2회 세척하였다. 인큐베이션 후, 세포를 2 mM의 염화칼슘 (50 mM TRIS [트리스아미노메탄], 150 mM 염화나트륨; 0.05% 폴리소르베이트 20, pH 7.4; 2 mM의 염화칼슘)을 함유하는 200 μL의 세척 완충제로 2회 세척하였다. 100 μL의 1-스텝 울트라 TMB 기질 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 34028)을 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 신호를 발생시켰다. 반응을 2 M의 황산을 사용하여 정지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다 (스펙트라맥스 M5e). 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버전 8.0.2)를 사용하여 데이터를 분석하고 그래프화하였다. 추정 반수 최대 억제 농도 (IC₅₀) 값이 분석으로부터 유도되었다 (표 8).

시험된 항체는 세포 표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 리간드 결합을 용량-의존성으로 중화시켰다. 키메라 항체 0039, 0164, 0158, 0159, 0170 및 0180에 대한 중화 검정에서의 추정 IC₅₀ 값은 각각 3.76 nM, 2.77 nM, 2.87 nM, 3.24 nM, 2.3 nM 및 3.83 nM이었다. 항체 0027은 세포 표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴 루이스 A 폴리아크릴아미드 리간드 결합을 중화시키지 않았다. 인간 IgG 대조군 항체는 이들 검정에서 효과를 나타내지 않았다.

실시예 6: 항-E-셀렉틴 항체의 정적 부착 검정에서의 세포 결합의 억제

인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 E-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포의 정적 조건 하의 부착을 억제하는 키메라 항-E-셀렉틴 항체 0039, 0164, 0158, 0159, 0170 및 0180의 능력을 평가하였다.

인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 알파 배지 (MEM [최소 필수 배지] 알파 배지, 코닝(Corning))/10% 투석된 태아 소 혈청 (깁코(GIBCO))/100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (깁코)/100 nM 메토트렉세이트 중에서 배양하고, 5% CO₂ 및 95% 습도 하에 37℃에서 유지하였다. HL-60 세포 (E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드를 발현하는 인간 전골수구성 세포주)를 RPMI/글루타민 성장 배지 (깁코)/10% 태아 소 혈청 (깁코)/100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (깁코) 중에서 5% CO₂ 및 95% 습도 하에 37℃에서 유지하였다. 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 96-웰 편평 바닥 흑색 플레이트에 11,500개 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 가습 인큐베이터 내 37℃, 5% CO₂ 및 95% 공기에서 48시간 동안 인큐베이션하여 전면생장 단층을 형성하였다.

정적 부착 중화 검정을 위해, 대수기의 HL-60 세포를 PBS 중에서 3회 세척하고, 500 μL의 PBS 및 동일한 부피의 2μM 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 형광 염료 [(CFSE) (써모피셔(ThemoFisher)] 중에 재현탁시켰다. 세포를 암실 내 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 얼음 상에서 4 mL의 차가운 HL-60 성장 배지를 5분 동안 첨가하여 표지를 중지시켰다. 표지된 HL-60 세포를 행크 평형 염 용액 (HBSS)/1% 소 혈청 알부민 (BSA)/0.1% 아지드화나트륨 중에서 3회 세척하고, 정적 부착 검정에 사용하기 위해 400,000개 세포/mL의 밀도로 재현탁시켰다.

항-E-셀렉틴 키메라 항체 0039, 0164, 0158, 0159, 0154, 0170 및 0180, 음성 대조군 항-P-셀렉틴 항체 및 대조군 인간 IgG를 HBSS/1%BSA/0.1% 아지드화나트륨 중에 연속 희석하였다 (1333 nM 내지 1.83 nM 범위의 농도). 각각의 항체에 대해 항체 부재 대조군을 제조하였다. E-셀렉틴 CHO 세포 단층을 HBSS/1%BSA/0.1% 아지드화나트륨으로 부드럽게 3회 세척하고, 100 μL의 세포 현탁액을 웰에 첨가하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항체를 제거하지 않고 웰당 50 μL (20,000개) CFSE-표지된 HL-60 세포를 첨가하였다. 표지된 HL-60 세포를 CHO 세포 단층과 함께 가습 인큐베이터 내 37℃, 5% CO₂ 및 95% 공기에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 HBSS/1%BSA/0.1% 아지드화나트륨으로 3회 세척하고, 100 μL의 HBSS/1% 트리톤-X100을 첨가하고, 암실에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 결합된 HL-60 세포의 형광을 스펙트라맥스 i3X (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 494/521 나노미터의 여기/방출 파장에서 측정함으로써 부착된 HL-60 세포의 수를 결정하였다. 세포 부재 대조군 웰로부터의 신호를 사용하여 배경 결합을 차감하고, 인간 IgG 대조군을 사용하여 % 부착을 100%로서 결정하였다. 그래프패드 프리즘 스위트에서 추정 EC₅₀ 값을 결정하였다.

정적 부착 조건 하에, 항체 0158 및 0164는 16.5 nM에서 >50% 억제로 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 HL-60 세포 부착을 억제하였다. 항체 0159는 49.4 nM에서 >50% 억제로 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 HL-60 세포 부착을 억제하였다. 항체 0170 및 0180은 444 nM에서 >50% 억제로 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 HL-60 부착을 억제하였다. 항체 0039는 최대 1333 nM의 농도에서 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 HL-60 세포 부착을 억제하지 않았다. 음성 대조군 항체는 HL-60 세포의 부착을 억제하지 않았다 (표 8).

실시예 7: 항-E-셀렉틴 항체의 세포 표면 결합 (FACS).

E-셀렉틴 또는 P-셀렉틴을 발현하도록 조작된 세포에 대한 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 항체 결합을 평가하였다. 시노몰구스 원숭이에 대한 종 교차-반응성을 또한 평가하였다.

인간 E-셀렉틴 또는 P-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 10% 투석된 태아 소 혈청 (깁코), 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (깁코)이 보충된 알파 배지 (MEM [최소 필수 배지] 알파 배지, 코닝) 중에서 배양하였다. 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포의 경우, 성장 배지에 또한 100 nM 메토트렉세이트를 보충하였다. 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (깁코), 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 125 μg/mL 제오신 (깁코)이 보충된 R1 배지 (RI 둘베코 변형 이글 배지/햄 F12 변형) 중에서 배양하였다. 세포를 가습 인큐베이터 내 37℃, 5% CO₂ 및 95% 공기에서 성장 배지 중에서 유지하였다. 실험을 위한 배양 전에 배지로부터 메토트렉세이트 또는 제오신을 제거하였다. CHO-E 셀렉틴 세포 또는 P-셀렉틴 세포를 시트르산 염수 (135 mM KCl, 15 mM 시트르산나트륨)를 사용하여 T-150 플라스크로부터 탈착시키고, 탈착된 세포에 CaCl₂를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 즉시 재석회화하였다. 탈착된 세포에 성장 배지를 즉시 첨가한 다음, 실온에서 300 x g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. 습윤 얼음 상에서 5분 동안, 최종 농도 1%의 소 혈청 알부민 (BSA; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 최종 농도 1 mM의 염화칼슘 및 최종 농도 0.1%의 아지드화나트륨을 함유하는 pH 7.4의 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 이루어진 차가운 CHO 완충제 중 세포를 96-웰 V-바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 4℃에서 300 x g로 2분 동안 원심분리하여 완충제를 제거하였다.

시험 항체 용액을 희석제로서 CHO 완충제를 사용하여 연속 희석물 (1333.3 nM 내지 0.0022 nM 범위)로 제조하고, 100 μL를 첨가하고, 지정된 부피의 연속-희석된 항체 중에서 인큐베이션하고, 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 항체를 제거하고, 세포를 4℃에서 300 x g로 1분 동안 원심분리하여 3회 세척하고, 차가운 CHO 완충제 중에 재현탁시켰다. 세척된 세포를 APC-접합된 아피니퓨어 F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))의 1:1000 희석물 100 μL와 함께 습윤 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 3 또는 4회 세척한 후, 유동 세포측정 분석을 위해 CHO 완충제 중에 재현탁시켰다. 640 나노미터 레이저 라인을 사용하는 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) LSR포르테사 기기를 사용하여 세포 형광 데이터를 획득하였다. 세포의 기하 평균 형광을 플로우조 소프트웨어 패키지 (플로우조, 엘엘씨(FlowJo, LLC))에 의해 분석하고, 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. 프리즘 스위트 (그래프패드, 버전 8)에서 비선형 회귀 분석을 사용하여 추정 EC₅₀ 값을 계산하였다 (표 8).

키메라 항체 0039, 0164, 0158, 0159, 0154, 0170 및 0180은 1.99 nM 내지 4.99 nM 범위의 추정 EC₅₀ 값으로 CHO 세포 상의 세포 표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 결합을 나타냈다 (표 8). 항체 0039, 0164, 0158, 0159, 0170 및 0180은 또한 3.37 내지 13.98 범위의 추정 EC₅₀ 값으로 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 결합하였다. 항체 0164, 0158,0159, 0154, 0170 및 0180은 CHO-발현된 인간 P-셀렉틴에 결합하지 않았으며, 이는 E-셀렉틴에 대한 선택성을 나타낸다. 항체 0039는 추정 EC₅₀ 값 > 354 nM로 CHO-발현된 인간 P-셀렉틴에 대한 최소 결합을 나타냈다.

표 8. 항-E-셀렉틴 항체의 세포 결합 및 중화.

실시예 8: 생리학적 유동 검정을 사용한 항-E-셀렉틴 항체의 생체외 중화

바이오플럭스(BioFlux)™ 플레이트/챔버 (플럭션 바이오사이언시스(Fluxion Biosciences), 48-웰 저전단, 0-20 다인/cm²; 910-0004)를 사용하는 바이오플럭스™ 시스템 (플럭션, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코)을 사용하여 생리학적 유동 조건 하에 생체외 세포 부착을 분석하였다. 재조합의 정제된 가용성 E- 또는 P-셀렉틴 단백질 및 인간 HL-60 세포 (ATCC CCL-240)를 사용하여 부착 검정을 수행하였다. HL-60 세포는 E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드를 발현한다. HL-60 세포를 10% 태아 소 혈청 (깁코); 1X 페니실린/스트렙토마이신 (깁코)을 함유하는 RPMI/글루타민 성장 배지 (깁코) 중에서 5% CO₂ 및 95% 습도 하에 37℃에서 유지하였다. 세포를 관류 전에 37℃에서 유지하고, 바이오플럭스™ 검정을 실온에서 수행하였다. 먼저, 활성화된 내피 세포의 표면을 모방하기 위해, 유동 챔버를 동일한 양의 인간 E- 및 P-셀렉틴 가용성 재조합 단백질 둘 다로 코팅하였다. 바이오플럭스™ 유동 마이크로채널을 PBS 중에서 제조된 가용성 재조합 인간 P-셀렉틴 (알 앤 디 시스템즈(R & D Systems), ADP3) 및 E-셀렉틴 (알 앤 디 시스템즈, ADP1) 각각 10 μg/mL로 코팅하고, 1 다인/cm²로 5분 동안 관류시키고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS에 의해 1 다인/cm²로 3-5분 동안 세척하였다. E-셀렉틴 키메라 항체 0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180을 PBS 중에 희석하고, 플레이트를 시험 물품 (1.6 내지 1000 nM의 농도) 또는 비히클 대조군에 의해 1 다인/cm²로 1시간 동안 처리하였다. HL-60 세포를 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 칼세인 AM (칼세인; 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)™; C3099)으로 30분 동안 염색하고, 포스페이트 완충 염수 (PBS; 깁코)로 2회 세척하고, PBS 중 ~3 x 10⁶개 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 희석된 항체 스톡을 또한 유동 챔버에서의 관류 전 세포 현탁액에 첨가하였다. HL-60 세포의 100 μL의 분취물을 각각의 채널에서 1 다인/cm²의 생리학적 전단 유동으로 10분 동안 관류시켰다. PBS를 1 다인/cm²로 2-3분 동안 관류시켜 비-부착 세포를 제거하였다. 부착 세포를 가시화하고, 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) Ti-S (NIS-엘리먼츠 BR 3.2 64-비트) 도립 위상차 형광 현미경을 사용하여 40X 배율로 카운팅하였다. 세포 카운트를 포스페이트 완충제 비히클 대조군에 대해 정규화하였다. 각각의 실험은 조건당 2개의 웰을 가졌다. 그래프패드 프리즘 (8.0.2)을 사용하여 데이터를 그래프화하고 분석하였다. 추정 반수-최대 억제 농도 (IC₅₀) 값이 분석으로부터 유도되었다.

생체외에서 혈관계를 통한 혈류를 모방하도록 설계된 이들 연구에서, E-셀렉틴 항체 0039, 0164, 0158, 0159, 0170 및 0180은 가용성 재조합 E-셀렉틴 단백질에 대한 HL-60 세포의 부착을 각각 264.7 nM, 1.7 nM, 17.9 nM, 21 nM, 74.2 nM 및 224.7 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 중화시켰다 (표 9).

표 9. 생리학적 유동 하의 가용성 인간 E-셀렉틴 단백질에 대한 HL-60 결합의 중화.

실시예 9: 항-E-셀렉틴 항체의 에피토프 군분류

6종의 중화 키메라 항체 (0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180)를 옥테트 바이오센서를 사용하는 경쟁 검정에 기초하여 에피토프 빈으로 군분류하였다. 항-인간 FC (AHC) 코팅된 팁을 7종의 항체 중 1종을 20μg/mL로 함유하는 웰로 600초 동안 옮겨 제1 항체가 항-인간 FC에 결합하도록 하였다. 팁을 300 nM 인간 E-셀렉틴 세포외 도메인 (서열식별번호: 133 플러스 10개 His 정제 꼬리)을 갖는 제2 웰로 옮기고, 100초 동안 회합되도록 하였다. 마지막으로, 팁을 제2 항체를 함유하는 제3 웰로 100초 동안 옮겼다. 제2 항체가 제1 항체에 의해 생성된 것 초과의 바이오센서 신호의 증가를 나타낸 경우에 항체를 비-경쟁으로 점수화하고, 제2 항체가 신호의 추가의 증가를 생성하지 않은 경우에 항체를 경쟁으로 점수화하였다 (표 10).

이들 경쟁 데이터에 기초하여, 항체 0159, 0164, 0170 및 0180은 하나의 에피토프 군을 규정하고, 0158은 제2 에피토프 군을 규정하고, 0039는 제3 에피토프 군을 규정하였다. 제1 군 및 제2 군은 부분적으로 중첩되고, 제2 및 제3 군은 부분적으로 중첩되고, 제1 및 제3 군은 비-중첩된다. 표 10에서, "+"는 제2 항체 (열 표제로 표시됨)가 제1 항체 (행 표제로 표시됨)의 존재 하에 결합하였다는 것을 나타낸다. "-"는 제2 항체의 첨가 시에 신호의 증가가 관찰되지 않았다는 것을 나타낸다.

표 10. 옥테트 바이오센서에 의한 항-IL-E-셀렉틴 항체의 에피토프 군분류

실시예 10: 결정 구조 및 에피토프

전장 IgG를 파파인으로 절단하고 단백질 A 수지를 사용하여 Fc를 제거함으로써 항-E-셀렉틴 키메라 항체 0164의 Fab 단편을 수득하였다. Fab를 말단절단된 인간 E-셀렉틴 (실시예 1에 기재됨)과 1:1 몰비로 혼합하고, 생성된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 복합체의 결정이 200 mM 아세트산칼슘 pH 7.5, 20% PEG 3350 중에서 형성되었다. 어드밴스드 포톤 소스(Advanced Photon Source)에서 빔라인 17-ID에서 2.68 Å로 데이터를 수집하였다. 구조를 분자 대체에 의해 해석하고, 0.243/0.252의 R/Rfree로 정밀화하였다 (도 1). 결정 구조는 공간군 P3121 내 비대칭 단위에 단일 0164 Fab 단편에 결합된 E-셀렉틴의 단일 카피를 갖는다.

결정 구조에 기초하여, 항체 0164와 상호작용한 E-셀렉틴의 잔기를 i) 3.8 Å 이내의 잔기, ii) 0164 항체 잔기와 E-셀렉틴 잔기의 쌍 사이의 상호작용으로 인해 매립된 표면적 (정규화) (Å²)이 >5Å²임, iii) 염 가교의 형성, iv) 수소 결합의 형성 또는 v) 물-매개 수소 결합의 형성에 기초하여 결정하였다. 잔기의 목록 (이의 넘버링은 성숙 인간 E-셀렉틴 서열 (서열식별번호: 132)에 기초함)은 T7, E8, A9, M10, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E88, E92, Y94, R97, N105, E107, R108, S110, K111, K112 및 K113을 포함한다 (표 11).

x선 결정학에 의한 E-셀렉틴의 그의 천연 리간드 시알릴-루이스 X (sLeX)와의 상호작용이 PDB 구조 (1g1t)에 제시된다 (www.rcsb.org/structure/1g1t 참조). 이러한 구조에서, sLeX의 3.8 Å 이내에 있고 항체 0164와의 상호작용과 유사한 E-셀렉틴 잔기는 Y48, N82, N83, E92, Y94, R97, N105 및 E107 (서열식별번호: 132의 넘버링에 기초함)이다. 또한 sLex의 3.8 옹스트롬 이내에 있는 추가의 잔기는 E80, E98 및 D106 (서열식별번호: 132의 넘버링에 기초함)이다. sLex와 항체 0164의 에피토프의 유의한 중첩을 고려할 때, 이 항체에 의해 입증된 중화 활성은 sLeX 및 다른 유사한 리간드, 예컨대 시알릴-루이스 A (sLeA)와 E-셀렉틴의 상호작용을 직접 차단한 결과일 가능성이 있다.

표 11. E-셀렉틴과 항-E-셀렉틴 항체 0164 또는 sLeX의 상호작용.

실시예 11: 래트 항-E-셀렉틴 항체의 인간화

중화 래트 키메라 항체 0039, 0158, 0159, 0164, 0170 및 0180의 인간화 버전을 상보성 결정 영역 (CDR) 그라프팅 (이하 "CDR-그라프팅"으로 지칭됨)에 의해 생성하였다. 항체 0039, 0158, 0164 및 0180의 경우, 중쇄 CDR을 인간 DP-54 프레임워크 영역 (VH3 하위군) 상에 그라프팅하였다. 인간화 항체 0039는 위치 48에서의 메티오닌, 위치 49에서의 글리신 및 위치 78에서의 발린을 포함한 래트 아미노산 잔기를 함유하였다. 인간화 항체 0158은 위치 24에서의 발린, 위치 48에서의 메티오닌, 위치 49에서의 글리신, 위치 73에서의 트레오닌 및 위치 78에서의 발린을 포함한 래트 아미노산 잔기를 함유하였다. 인간화 항체 0164는 위치 71에서의 알라닌, 위치 78에서의 알라닌 및 위치 94에서의 메티오닌을 포함한 래트 아미노산 잔기를 함유하였다. 인간화 항체 0180은 위치 48에서의 이소류신, 위치 49에서의 글리신, 위치 69에서의 류신, 위치 71에서의 세린, 위치 73에서의 트레오닌, 위치 78에서의 알라닌 및 위치 94에서의 이소류신을 포함한 래트 아미노산 잔기를 함유하였다.

항체 0159의 경우, 중쇄 CDR을 DP-7 프레임워크 영역 (VH1 하위군) 상에 그라프팅하였다. 인간화 항체 0159는 위치 24에서의 발린, 위치 69에서의 류신, 위치 78에서의 알라닌 및 위치 94에서의 메티오닌을 포함한 래트 아미노산 잔기를 함유하였다.

항체 0170의 경우, 중쇄 CDR을 DP-10 프레임워크 영역 (VH1 하위군) 상에 그라프팅하였다. 인간화 항체 0170은 위치 24에서의 발린, 위치 69에서의 이소류신, 위치 73에서의 트레오닌 및 위치 94에서의 발린을 포함한 래트 아미노산 잔기를 함유하였다.

모든 6종의 인간화 항체에 JH4 J-절편 (서열식별번호: 6의 아미노산 서열)을 그라프팅하였다.

항체 0039, 0158, 0164, 0170 및 0180의 경우, 경쇄 CDR을 인간 DPK9 프레임워크 영역 (VKI 하위군) 상에 그라프팅하였다. 인간화 항체 0039는 L87에서의 래트 아미노산 잔기 시스테인을 함유하였다. 인간화 항체 0158은 위치 4에서의 래트 아미노산 잔기 메티오닌을 함유하였다. 인간화 항체 0164 및 180은 위치 87에서의 래트 아미노산 잔기 페닐알라닌을 함유하였다. 인간화 항체 0170은 위치 48에서의 메티오닌 및 위치 87에서의 페닐알라닌을 포함한 래트 아미노산 잔기를 함유하였다.

항체 0159의 경우, 경쇄 CDR을 인간 DPK1 프레임워크 영역 (VKI 하위군) 상에 그라프팅하였다.

인간화 V_H 영역을 이펙터-기능 돌연변이된 인간 IgG1 불변 영역 (서열식별번호: 16의 아미노산 서열)에 연결한 다음, 독점적 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 CDR-그라프팅된 중쇄 서열식별번호: 51 (0039 CDR 그라프트; 항체 0525의 중쇄), 서열식별번호: 62 (0158 CDR 그라프트; 항체 265_254의 중쇄), 서열식별번호: 76 (0159 CDR 그라프트; 항체 0929_0548의 중쇄), 서열식별번호: 22 (0164 CDR 그라프트; 항체 0841의 중쇄), 서열식별번호: 91 (0170 CDR 그라프트; 항체 0955_0300의 중쇄) 및 서열식별번호: 110 (0180 CDR 그라프트; 항체 0564의 중쇄)을 생성하였다.

인간화 V_L 영역을 인간 카파 불변 영역 (서열식별번호: 14의 아미노산 서열)에 융합시킨 다음, 독점적 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 CDR-그라프팅된 경쇄 서열식별번호: 46 (0039 CDR 그라프트; 항체 0525의 경쇄), 서열식별번호: 67 (0158 CDR 그라프트; 항체 0265_0254의 경쇄), 서열식별번호: 81 (0159 CDR 그라프트; 항체 0929_0548의 경쇄), 서열식별번호: 17 (0164 CDR 그라프트; 항체 0841의 경쇄), 서열식별번호: 96 (0170 CDR 그라프트; 항체 0955_0300의 경쇄) 및 서열식별번호: 105 (0180 CDR 그라프트; 항체 0564의 경쇄)를 생성하였다.

표 12. 항-E-셀렉틴 항체.

실시예 12: 표면 플라즈몬 공명을 사용한 인간화 항-E-셀렉틴의 동역학적 평가

인간화 항체 0841 (HC 서열식별번호: 22, LC 서열식별번호: 17)에 대해 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 결합 친화도를 실시예 4에 기재된 방법과 유사한 방법으로 SPR을 사용하여 결정하였다. 먼저 항체를 고정화된 항-인간 IgG에 결합시킴으로써 이를 수행하였다. 항체 포획 후, E-셀렉틴 단백질의 희석물을 유동시키고, 인간 및 시노몰구스 E-셀렉틴에의 결합에 대해 회합률 상수 (ka), 해리율 상수 (kd), t1/2 및 K_D 값을 결정하였다 (표 13). 이러한 SPR 분석에서, 인간 E-셀렉틴 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 인간화 항-E-셀렉틴 항체 0841의 친화도는 각각 92.85 nM 및 138.5 nM이었다.

표 13. 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 항-E-셀렉틴 항체의 친화도.

실시예 13: 인간화 항-E-셀렉틴 항체 (0841)의 세포 표면 결합 (FACS)

E-셀렉틴을 발현하도록 조작된 세포의 유동 세포측정법 (FACS)을 사용하여 항체 결합을 평가하였다. 시노몰구스 원숭이에 대한 종 교차-반응성을 또한 평가하였다.

인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 10% 투석된 태아 소 혈청 (깁코) 및 배양 배지 중 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (깁코)이 보충된 알파 배지 (MEM [최소 필수 배지] 알파 배지, 코닝) 중에서 배양하였다. 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포의 경우, 성장 배지에 또한 100 nM 메토트렉세이트를 보충하였다. 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (깁코), 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 125 μg/mL 제오신 (깁코)이 보충된 R1 배지 (RI 둘베코 변형 이글 배지/햄 F12 변형) 중에서 배양하였다. 세포를 가습 인큐베이터 내 37℃, 5% CO₂ 및 95% 공기에서 성장 배지 중에서 유지하였다. 실험을 위한 배양 전에 배지로부터 메토트렉세이트 또는 제오신을 제거하였다. CHO-E 셀렉틴 세포를 시트르산 염수 (135 mM KCl, 15 mM 시트르산나트륨)를 사용하여 T-150 플라스크로부터 탈착시키고, 탈착된 세포에 CaCl₂를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 즉시 재석회화하였다. 탈착된 세포에 성장 배지를 즉시 첨가한 다음, 실온에서 300 x g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. 습윤 얼음 상에서 5분 동안, 최종 농도 1%의 소 혈청 알부민 (BSA; 시그마-알드리치), 최종 농도 1 mM의 염화칼슘 및 최종 농도 0.1%의 아지드화나트륨을 함유하는 pH 7.4의 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 이루어진 차가운 CHO 완충제 중 세포를 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 4℃에서 300 x g로 2분 동안 원심분리하여 완충제를 제거하였다.

시험 항체 용액을 희석제로서 CHO 완충제를 사용하여 연속 희석물 (1333.3 nM 내지 0.0022 nM 범위)로 제조하고, 100 μL를 지정된 부피의 연속-희석된 항체 중에 첨가하고, 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 항체를 제거하고, 세포를 4℃에서 300 x g로 1분 동안 원심분리하여 3회 세척하고, 차가운 CHO 완충제 중에 재현탁시켰다. 세척된 세포를 재현탁시키고, APC-접합된 아피니퓨어 F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ (잭슨 이뮤노리서치)의 1:1000 희석물 100 μL와 함께 습윤 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 3 또는 4회 세척한 후, 유동 세포측정 분석을 위해 CHO 완충제 중에 재현탁시켰다. 640 나노미터 레이저 라인을 사용하는 벡톤 디킨슨 LSR포르테사 기기를 사용하여 세포 형광 데이터를 획득하였다. 세포의 기하 평균 형광을 플로우조 소프트웨어 패키지 (플로우조, 엘엘씨)에 의해 분석하고, 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. 그래프패드 프리즘 스위트에서 비선형 회귀 분석을 사용하여 추정 EC₅₀ 값을 계산하였다.

CHO 세포의 표면 상에 발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 인간화 항체 0841의 결합은 각각 1.62 및 1.54 nM의 추정 EC₅₀ 값으로 유사하였다 (표 14). 동일한 검정에서 항체 0164에 대한 추정 EC₅₀ 값은 CHO 발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대해 각각 1.39 및 1.73 nM의 추정 EC₅₀ 값으로 유사하였다 (표 14).

실시예 14: 인간 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 리간드 결합의 인간화 항-E-셀렉틴 항체 중화

정적 리간드 세포 부착 검정에서, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 E-셀렉틴 리간드 및 E-셀렉틴 항체는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 상에서 발현된 인간 또는 시노몰구스 E-셀렉틴에의 결합에 대해 경쟁한다. 인간 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하도록 조작된 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에 대한 시알릴 루이스 항원의 중화를 평가하기 위해 경쟁 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하는 정적 중화 검정에서 리간드 결합을 중화시키는 항-E-셀렉틴 항체의 능력을 평가하였다.

인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 배양 배지 (10% 투석된 태아 소 혈청, 100 nM 메토트렉세이트 및 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 MEM (최소 필수 배지) 알파 배지) 중에서 성장시키고, 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (깁코), 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 125 μg/mL 제오신 (깁코)이 보충된 R1 배지 (RI 둘베코 변형 이글 배지/햄 F12 변형) 중에서 배양하였다. E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트에 웰당 12,500개 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 인큐베이션하여 전면생장 단층을 형성하였다. 후속적으로, 플레이트를 200 μL의 칼슘 마그네슘 무함유 PBS로 2회 세척하였다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 IgG1 이소형 대조군을 비오티닐화 시알릴 루이스 A 폴리아크릴아미드 (카르보신트 엘엘씨, OS45446) 또는 시알릴 루이스 X 폴리아크릴아미드 (글리코테크(Glycotech), 01-045)와 스트렙타비딘/양고추냉이 퍼옥시다제 (총 100 μL)의 소형 합성 접합체의 존재 하에 검정에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 200 μL의 칼슘 마그네슘 무함유 PBS로 2회 세척하였다. 인큐베이션 후, 세포를 2 mM의 염화칼슘 (50 mM TRIS [트리스아미노메탄], 150 mM 염화나트륨; 0.05% 폴리소르베이트 20, pH 7.4; 2 mM의 염화칼슘)을 함유하는 200 μL의 세척 완충제로 2회 세척하였다. 100 μL의 1-스텝 울트라 TMB 기질 (써모 사이언티픽, 34028)을 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 신호를 발생시켰다. 반응을 2 M의 황산을 사용하여 정지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다 (스펙트라맥스 M5e). 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버전 8.0.2)를 사용하여 데이터를 분석하고 그래프화하였다. 추정 반수 최대 억제 농도 (IC₅₀) 값이 분석으로부터 유도되었다.

CHO 세포의 표면 상에 발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 인간화 항체 0841에 의한 시알릴 루이스 리간드 결합의 중화는 각각 3.81 및 1.74 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 유사하였다 (표 14). 동일한 검정에서 0164에 대한 추정 IC₅₀ 값은 CHO 발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대해 각각 5.17 및 2.00 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 유사하였다.

실시예 15: 생리학적 유동 하의 세포 부착의 인간화 항-E-셀렉틴 항체 중화

생리학적 유동 시스템을 사용하여 CHO-인간 E-셀렉틴 세포에 대한 HL-60 세포의 부착을 억제하는 항체 0841 및 0164의 효력 및 중화 활성을 평가하기 위해 생체외 세포 롤링/부착 연구를 수행하였다.

CHO-인간 E-셀렉틴 세포를 알파 배지/10% 투석된 태아 소 혈청 (깁코)/페니실린/스트렙토마이신 (1X) 및 100 nM 메토트렉세이트 중에서 5% CO₂ 및 95% 습도 하에 37℃에서 유지하였다. 바이오플럭스™ 플레이트를 PBS 중 50 μg/mL의 피브로넥틴으로 1 다인/cm²의 유량으로 코팅하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인간 E-셀렉틴을 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (인간 CHO-E-셀렉틴 세포)를 1:1 비의 0.05% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 스템프로 아큐타제 (깁코; A1110501)로 37℃에서 5분 동안 처리하여 검정용으로 제조하고, 동일 부피의 성장 배지로 중화시키고, 수집하고, 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 성장 배지 중에 ~30 x 10⁶개 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 플레이트를 CHO-인간 E-셀렉틴 성장 배지로 1 다인/cm²로 실온에서 2-3분 동안 2회 관류시켰다. 모든 배지를 제거하고, 30 μL의 CHO-인간 E-셀렉틴 세포 (~30 x 10⁶개 세포/mL)를 3-4 다인/cm²로 25초 동안 관류시켰다. 플레이트를 기기로부터 제거하고, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 500 μL의 신선한 성장 배지를 첨가하고, 세포를 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, CHO-E 단층을 바이오플럭스 기기 상에서 신선한 성장 배지로 세척하였다 (3-4 다인/cm²). PBS 및 비히클 대조군 중 항체 0841 (연속 희석물), 이소형 대조군 항체 및 IgG1 대조군 항체 (200 nM)를 1 다인/cm²로 1시간 동안 관류시켰다.

HL-60 세포를 10% 태아 소 혈청 (깁코); 및 1X 페니실린/스트렙토마이신 (깁코)을 함유하는 RPMI/글루타민 성장 배지 (깁코) 중에서 5% CO₂ 및 95% 습도 하에 37℃에서 유지하였다. 세포를 관류 전에 37℃에서 유지하였다. HL-60 세포를 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 칼세인 AM (칼세인; 라이프 테크놀로지스™; C3099)으로 30분 동안 염색하고, 포스페이트 완충 염수 (PBS; 깁코)로 2회 세척하고, PBS 중 ~3 x 10⁶개 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 희석된 항체 스톡을 또한 유동 챔버에서의 관류 전 세포 현탁액에 첨가하였다. HL-60 세포의 100 μL의 분취물 플러스 억제제를 각각의 채널에서 1 다인/cm²의 생리학적 전단 유동으로 10분 동안 관류시켰다. PBS를 1 다인/cm²로 2-3분 동안 관류시켜 비-부착 세포를 제거하고, 플레이트를 영상화 및 분석하였다. 검정을 실온에서 수행하였다.

항체 0841 및 0164는 생리학적 유동 조건 하에 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 HL-60 세포의 중화를 각각 4.17 및 3.73 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 억제하였다 (표 14).

표 14. 항체 0841 및 0164에 의한 결합 및 중화.

실시예 16: 인간화 항-E-셀렉틴의 생물물리학적 특징화

열 안정성

시차 주사 열량측정법을 사용하여 인간화 항체 0841 (서열식별번호: 22의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 17의 LC 아미노산 서열을 포함함)의 안정성을 결정하였다. 이 분석을 위해, 0.3 mg/mL의 샘플을 오토샘플러 (말번 인스트루먼츠, 인크.(Malvern Instruments, Inc.))가 구비된 마이크로칼 VP-모세관 DSC의 샘플 트레이 내로 분배하고, 10℃에서 5분 동안 평형화시킨 다음, 시간당 100℃의 속도로 110℃까지 스캐닝하였다. 16초의 필터링 기간을 선택하였다. 미가공 데이터를 기준선 보정하고, 단백질 농도를 정규화하였다. 오리진 소프트웨어 7.0 (오리진랩 코포레이션(OriginLab Corporation), 매사추세츠주 노샘프턴)을 사용하여 데이터를 적절한 수의 변환 하에 MN2-스테이트 모델에 피팅하였다. 하기 표 15는 트리스/Suc 완충제 (20mM 트리스, 8.5% 수크로스, pH 7.5) His/Suc 완충제 (20mM 히스티딘, 8.5% 수크로스, 0.005% EDTA, pH 5.8) 및 Glu/Tre 완충제 (20mM 글루탐산, 8.5% 트레할로스, pH 4.5) 중 분자의 용융 온도 (T_m1 - T_m4 및 FAB)를 제시한다. 이 분자는 CH2 도메인에서의 제1 전이 온도 (T_m1)가 Tris/Suc 및 Glu/Tre 완충제 중에서 65℃ 초과 및 Glu/Tre 완충제 중에서 65℃ 바로 아래로, 우수한 안정성을 나타냈다.

표 15. 인간화 항체 0841의 열 전이.

강제 분해

인간화 항체 0841을 40℃에서의 4주 강제 분해 연구를 위해 3종의 완충제: Tris (20 mM 트리스, pH 7.5), His (20 mM 히스티딘, pH 5.8) 및 Glu (20 mM 글루탐산, pH 4.5) 중으로 광범위하게 투석하였다. 투석 후, 샘플 농도를 5 mg/mL로 조정하였다. T0, T2 및 T4주에, 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (aSEC), 영상화 모세관 전기영동 (iCE) 및 생물검정 시험을 위해 샘플을 취하였다.

가열된 샘플의 응집 상태를 aSEC에 의해 결정하였다. 이동상으로서 pH 7.2의 20 mM 인산나트륨, 400 mM 아르기닌을 갖는 애질런트 1260 HPLC 시스템 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 캘리포니아주 산타 클라라)에 연결된 YMC-팩 디올-200 칼럼 (300 x 8.0 mm, 세공 크기 200 Å) 상에 샘플을 주입하였다. 샘플 용리를 위해 aSEC 칼럼에 등용매 프로그램을 0.75 mL/분의 유량으로 20분 동안 적용하고, 애질런트 오픈랩 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석함으로써 응집체, 관심 단백질 및 저분자량 종의 피크 면적을 적분 및 정량화하였다. 모든 샘플은 % HMMS (고분자량 종) 및 % LMMS (저분자량 종)에서 최소 변화를 나타냈으며, 즉 백분율은 5% 미만이었다 (표 16).

표 16. 인간화 0841의 T4-주 강제 분해 샘플의 aSEC.

iCE를 사용하여 강제 분해 샘플의 전하-기반 불균질성을 검출하였다. iCE는 고전압 하에 단백질 전하 종을 분리하고, 흡광도 280 nm에서 검출한다. 담체 양성전해질은 pH 구배를 생성하고, 단백질은 그의 알짜 전하가 0이 될 때까지 이동한다. 전기영동도를 분석하여 산성, 주요 및 염기성 종에 대한 pI 값 및 피크 면적을 결정하였다. PrinCE 오토샘플러가 구비된 프로테인 심플 iCE3 기기를 사용하여 샘플을 분석하였다. 단백질을 물 중에 2 mg/mL로 희석하였다. 샘플 희석제는 0.01 mg/mL pI 마커 4.65, 0.01 mg/mL pI 마커 9.5, 4.0% 파마라이트 pH 3-10, 0.25% 메틸 셀룰로스 및 2.0 M 우레아를 함유하였다. 샘플은 2 mg/mL의 단백질 15 μL 및 샘플 희석제 85 μL를 함유하였다. 샘플을 1500 볼트에서 1분 동안, 이어서 3000 볼트에서 6분 동안 집속시켰다. 엠파워 소프트웨어를 데이터 분석에 사용하였다.

iCE 분석에서 높은 백분율의 산성/염기성 종을 갖는 샘플의 경우, CDR 영역 상의 서열 문제를 확인하기 위해 추가의 질량 분광 분석이 요구되었다. 히스티딘 및 글루탐산 완충제 중 샘플의 분석은 산성 및 염기성 종의 전형적 증가를 보여주었다. 그러나, 트리스 완충제 중 안정한 항체에 대해 예상된 것보다 염기성 종의 더 큰 증가가 있었으며, 이는 가능한 화학적 변형을 시사한다 (표 17). 모든 3종의 완충제 중 샘플을 질량 분광분석법 3-부분 분석 및 펩티드 맵핑을 사용하여 추가로 분석하였다.

표 17. 인간화 항체 0841 (HC 서열식별번호: 22 및 LC 서열식별번호: 17)의 강제 분해 샘플의 iCE 분석.

질량 분광 분석

3-부분 질량 분광 분석을 위해, FabALACTICA를 사용하여 항체를 소화시켰다. 50 μg의 항체 mAb를 100-150 mM NaPO4 pH 7.0에 25 μL의 부피로 첨가하였다. 1.5 μL의 FabALACTICA 효소 (40 U/μL)를 첨가하고, 부드럽게 진탕시키면서 37℃에서 밤새 (16-18시간) 인큐베이션하였다. 이 후, 50 μL의 8M 구안-HCl, 12.5 μL 1 M DTT 및 12.5 μL 150 mM 인산나트륨 완충제 pH 7.0을 첨가하였다. 이를 부드럽게 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 7-8 μg (약 15 μL)을 3-부분 액체 크로마토그래피 질량 분광측정법 (LC-MS) 분석에 사용하였다.

워터스(Waters) H-클래스 (워터스, 매사추세츠주 밀포드) UPLC에 커플링된 브루커(Bruker) 맥시스 II 질량 분광계 (브루커, 매사추세츠주 빌러리카)를 사용하여 LC-MS 분석을 수행하였다. FabALACTICA 소화되고 환원된 샘플을 65℃에서 유지된 워터스 BEH C4 (1.7Å, 2.1 x 150 mM) 칼럼 상에서 300 μL/분의 유량으로 분리하였다. 이동상 A는 5% 아세토니트릴 및 0.05% TFA를 함유하는 물이고, 이동상 B는 50:50 아세토니트릴:2-프로판올 및 0.05%TFA였다. 질량 분광계를 양성 MS 단독 모드로 실행시키고, 데이터를 oTOF 제어 소프트웨어로 획득하였다. TOF-MS 신호를 콤파스 데이터애널리시스 v 4.2 (브루커)에서 최대 엔트로피를 사용하여 디컨볼루션하였다. 시간 4주 (T4W)에서의 글루탐산, 히스티딘 및 트리스 완충제 중 강제 분해 0841 샘플의 분석은 시간 0 (T0)에서의 샘플과 비교하여 유사한 프로파일을 나타냈다 (도 2). PyroE-Fd (N-말단에 피로글루탐산을 갖는 IgG 중쇄 (PyroE)로부터의 Fd 단편)는 특히 트리스 완충제에서 T4W 샘플의 약간의 증가를 나타냈다 (~3.5%). 추가로, 약 5% Fd D/P 클립 (절단된 아스파르트산/프롤린 (D/P) 부위를 갖는 Fd 단편)이 T0 및 T4W 샘플에서 검출되었다.

LC-MS에 의한 펩티드 맵핑

샘플 안정성을 추가로 조사하기 위해, 펩티드 맵핑 LC-MS를 이용하였다. 펩티드 맵핑을 위해, 항체 0841의 변성 및 환원을 5 M 구안:HCl NaAc, pH 5.0, 10 mM TCEP 중에서 37℃에서 1시간 동안 수행하였다. 반응 혼합물을 100 mM MES, pH 6.0, 0.5 mM TCEP 완충제로 10회 희석하였다. 이어서, LysC/트립신 믹스를 1:10 비로 첨가하고, 이어서 37℃에서 밤새 소화시켰다. 반응물을 0.5% TFA/H₂O (최종 농도)로 켄칭하였다. 이어서, 이 소화 혼합물을 LC-MS 분석을 위해 써모 사이언티픽 오비트랩 퓨전 루모스 상에 주입하였다.

워터스 H-클래스 (워터스, 매사추세츠주 밀포드) UPLC에 커플링된 오비트랩 퓨전 루모스 질량 분광계 (써모 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 LC-MS 펩티드 맵핑 분석을 수행하였다. 소화된 샘플을 60℃에서 유지된 워터스 BEH C18 (300Å, 1.7um 2.1 x 150 mM) 칼럼 상에서 200 μL/분의 유량으로 분리하였다. 이동상 A는 물 중 0.05% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.05% TFA였다. 펩티드를 135분 내에 0.5%에서 35% B의 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용리시켰다. 질량 분광계를 300에서 1600 m/z로 스캐닝하는 양성 MS 단독 모드로 실행시키고, 데이터를 엑스칼리버 소프트웨어로 획득하였다. 데이터 분석 및 데이터베이스 검색을 엑스칼리버 소프트웨어 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 및 피크 AB (바이오인포매틱스 솔루션즈 인크(Bioinformatics Solutions Inc), 캐나다 토론토) 둘 다를 사용하여 수행하였다.

트리스, 히스티딘 및 글루탐산 완충제에 대한 T4W 샘플의 고충실도 펩티드 맵핑 분석은 서열 IDPAN*GNTIYAEK (NG 탈아미드화 부위는 밑줄표시됨; 서열식별번호: 176)를 갖는 HC CDR2 펩티드에서 미량의 탈아미드화 (< 1%)를 확인하였다. NG는 흔한 탈아미드화 부위이지만, 이 경우에 대부분 안정하였다. 잠재적 탈아미드화 (숙신이미드-N의 형태)가 서열 TSQNIN*RYLNWYQQKPGK (NR 탈아미드화 부위는 밑줄표시됨; 서열식별번호: 177)를 갖는 LC CDR1 펩티드에서 검출되었고, 탈아미드화는 트리스 T4W 샘플에서 약 5.1%로 증가하였다 (MS2 스펙트럼은 N(30)R 부위가 가장 가능성 있는 탈아미드화 부위였지만, N28 및 N34도 또한 잠재적으로 미량의 탈아미드화를 가질 수 있음을 나타냈다) (표 18).

표 18. 인간화 항체 0841의 강제 분해 샘플의 LC/MS 펩티드 맵핑.

경쟁 결합 ELISA

강제 분해 샘플의 안정성을 추가적으로 평가하기 위해, 스트레스화 샘플의 활성을 경쟁 결합 ELISA에서 평가하였다. 여기서 T0, T2W 및 T4W 샘플의 안정성을 인간 E-셀렉틴에의 결합에 대해 비오티닐화 키메라 항체 0164 (HC 서열식별번호: 34 및 LC 서열식별번호: 31 포함)와 경쟁하는 그의 능력에 대해 비교하였다. 인간 E-셀렉틴을 Ca/Mg를 함유하는 PBS 중에 500 μg/mL로 저장하고, Ca/Mg를 함유하는 PBS로 1 μg/mL의 농도로 희석하였다. 이를 384 웰 맥시소르프 플레이트에 첨가하고, 밀봉하고, 부드럽게 진탕시키면서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 각각의 웰 내의 시약을 제거하고, 이어서 50 μL의 차단 완충제 (Ca/Mg를 함유하는 PBS 중 1% BSA)를 각각의 웰에 첨가하였다. 웰을 밀봉하고, 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. 0.2 mg/mL의 출발 농도에서, 항체 0841을 Ca/Mg를 함유하는 PBS로 1/3 희석률의 단계로 총 12개의 농도로 연속 희석하였다.

비오티닐화 항체 0164를 Ca/Mg를 함유하는 2% BSA/PBS 중에 0.04 μg/mL로 희석하였다. 동일 부피의 희석된 항체 0841을 비오티닐화 항체 0164와 혼합하였다. 이어서, 세척 플레이트를 각각의 세척에 대해 80 μL를 사용하여 3회 주기 동안 타이터텍(TITERTEK) 상에서 PBST (0.05% 트윈)를 갖는 1% BSA로 차단하였다. 플레이트를 종이 수건 상에서 두드려 배수시켰다. 항체 0841 및 비오틴-표지된 항체 0164의 혼합물 25 μL를 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 이중 웰로 첨가하고, 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 2 - 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 단계를 2회 세척의 3회 주기로 반복하였다. 이어서, 묽은 스트렙타비딘-HRP (차단 완충제 중에 ~ 1/7500 희석됨)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 ~ 40분 내지 1시간 인큐베이션하였다. 세척 단계를 다시 2회 세척의 3회 주기로 반복하고, 두드려 건조시키고, 이어서 25 μL의 TMB 기질 (1종의 성분인 HRP 마이크로웰 기질)을 첨가하였다. 이에 이어서, 25 μL의 0.18 M 황산을 첨가하여 색이 포화에 도달하였을 때 (색 발현을 관찰함으로써 결정됨) 반응을 정지시켰다. 이어서, 플레이트의 OD450 측정치를 엔비전 플레이트 판독기 상에서 판독하고, 데이터를 그래프패드 프리즘7로 분석하였다.

경쟁 결합 결과가 도 3에 제시되고, 3종의 완충제 중 어떠한 것에서도 T0, T2W 및 T4W 샘플 사이에 차이가 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 항체 0841이 고온 조건 (즉, 40℃) 하에서의 저장 후 E-셀렉틴에 결합하는 그의 능력을 유지하였다는 것을 입증한다.

고농도 안정성

인간화 항체 0841을 3종의 완충제, Tris/Suc (20 mM 트리스, 8.5% 수크로스, pH 7.5), His/Suc (20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로스, 0.005% EDTA, pH 5.8) 및 Glu/Tre (20 mM 글루탐산, 8.5% 트레할로스, pH 4.5) 중으로 광범위하게 투석하였다. 투석 후에, 샘플을 스핀 필터 농축기를 사용하여 150 mg/mL로 농축시키고, 4℃ 및 25℃에서 저장하였다. T0, T1, T2, T4 및 T6주에, 실시간 aSEC 분석을 위해 샘플을 취하였다.

고농도 샘플의 응집 상태를 강제 분해 분석에 대해 상기 기재된 바와 같이 aSEC에 의해 결정하였다. 4℃ 및 25℃에서 저장된 샘플은 T6주 (T6W)에 고농도에서 안정하였고, 모든 3종의 완충제 조건 하에 HMMS의 백분율이 거의 증가하지 않았다 (<5%) (표 19).

표 19. T0 및 T6주에서의 인간화 항체 0841 (HC 서열식별번호: 22, LC 서열식별번호: 17)의 고농도 샘플의 aSEC 분석.

T0, T3 (T3W) 및 T6주에, 샘플을 iCE 및 모세관 겔 전기영동 (CGE)에 의해 분석하였다. iCE를 사용하여, 강제 분해 연구에서 사용된 방법과 유사한 방법을 사용하여 고농도 샘플의 전하-기반 불균질성을 검출하였다. % 산성 종 및 % 염기성 종에서의 최소 변화는 His/Suc 및 Glu/Tre 완충제 중 25℃에서 6주의 저장에 걸쳐 관찰되었으며, 보다 큰 변화는 산성 및 염기성 종에서 Tris/Suc 완충제와 연관되었다 (표 20).

표 20. 인간화 항체 0841 (HC 서열식별번호: 22, LC 서열식별번호: 17)의 고농도 샘플의 iCE 분석.

CGE를 수행하여 항체 0841의 고농도 샘플의 단편화를 결정하였다. 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터의 랩칩 터치 HT 단백질 발현 검정을 사용하여 샘플을 분석하였다. 제조업체의 지침에 따라 검정을 설정하고, 변형된 방법을 사용하여 샘플을 제조하였다. 간략하게, 1 mg/mL의 샘플 5 μL를 비-환원 (nrCGE)의 경우 아이오도아세트아미드 또는 환원 CGE의 경우 디티오트레이톨을 함유하는 샘플 완충제 35 μL와 혼합하고, 70℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 가열 후, 70 μL의 탈이온수를 각각의 샘플에 첨가한 후 터치 시스템 상에서 분석하였다. 각각의 샘플에 대한 단편화의 크기 및 수준을 랩칩 GX 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.

% 단편화 및 % HMMS의 정량화는 고농도의 항체 0841이 모든 3종의 완충제에서 안정하다는 것을 입증하였다 (표 21).

표 21. 인간화 항체 0841 (HC 서열식별번호: 22, LC 서열식별번호: 17)의 고농도 샘플의 CGE 분석.

실시예 17: 인간화 항-E-셀렉틴의 인 실리코 면역원성 위험 및 t-세포 에피토프 예측.

인간화 항-E-셀렉틴 항체 0841의 면역원성 위험을 MHCII 펩티드 결합의 예측을 위한 인 실리코 도구를 사용하여 예측하였다. 이들 도구를 (1) 서열 내 각각의 개별 펩티드에 대한 잠재적 MHCII 결합의 에피토프 확인을 위해, (2) 에피토프 분류를 위해, 잠재적 MHCII 펩티드 결합제의 위험을 평가하기 위해 및 (3) 전체 서열 점수화를 위해, MHCII 결합 연관 면역원성 위험을 갖는 전체 서열의 전체 위험을 예측하기 위해 사용하였다. 방법은 하기에 기재된다.

에피토프 확인

2가지 프로토콜 (하기 기재됨)을 사용하여 서열을 분석함으로써 에피토프를 확인하였다. 어느 하나의 프로토콜에 대해 본원에 기재된 규칙에 의해 플래깅된 임의의 서열을 에피토프로 간주하였다. 이들 방법은 주로 아미노산 9-량체 수준의 서열을 조사한다.

프로토콜 1: ISPRI/에피매트릭스

ISPRI 소프트웨어 패키지 (ISPRI v 1.8.0, EpiVax Inc., Providence, RI (2017); Schafer JRA et al. (1998) Vaccine 16(19): 1880-84)에서의 에피매트릭스 분석을 위해 서열을 제출하였다. 미가공 결과는 8종의 상이한 HLA 유형에 대한 각각의 9-량체 아미노산 단편의 결합 가능성의 순위를 제공하였다. 따라서, 각각의 9-량체에 대해 8가지 예측 ("관찰")이 존재하였다. 9-량체는 서열의 각각의 개별 선형 넘버링 위치에서 출발하여 생성되었다 (따라서, 동일한 9-량체가 동일한 서열에서 1회 초과로 발생하는 것이 가능하였다). 임의의 4가지 관찰이 9-량체가 결합제의 상위 5%에 있었다는 것을 나타내는 경우에 (그것이 적어도 4종의 HLA 유형에 대해 결합제의 상위 5%에 있는 것으로 예측되었다는 것을 의미함), 9-량체를 예측된 에피토프 ("에피토프")로 간주하였다. 대안적으로, 8가지 예측 중 임의의 1가지가 9-량체가 결합제의 상위 1%에 있었다는 것을 나타내는 경우에, 9-량체를 또한 예측된 에피토프로 간주하였다.

프로토콜 2: IEDB 컨센서스 방법

IEDB (Vita R. et al., Nucleic Acids Res. 2015; 28 (43): D405-12; IEDB MHC-II Binding Predictions, www.iedb.org)에서의 MHC-II 결합 컨센서스 방법 (Wang P. et al. (2010) BMC Bioinformatics 11: 568; Wang P. et al. (2008) PLoS Comput. Biol. 4(4),e1000048)을 사용하는 분석을 위해 서열을 제출하였다. 소프트웨어의 산출물은 결과를 15-량체로 배열하였다. 컨센서스 점수 및 백분위수 순위를 15-량체 및 HLA 유형의 각각의 조합에 대해 제공하였다. 각각의 15-량체의 컨센서스가 유래된 개별 점수는 15-량체에서 발견된 특정 9-량체의 순위였다: 컨센서스에 사용된 각각의 방법은 15-량체 내의 9-량체에 대한 백분위수 순위를 보고하였다. 전체 15-량체에 대한 값으로서 취해진 컨센서스는 중앙 점수를 갖는 9-량체에 대한 예측이었다. 9-량체는 (a) 그것이 15-량체에 대한 컨센서스 대표로서 선택되고, (b) 고려되는 HLA 유형에 대해 결합체의 상위 10%의 백분위수 순위를 갖는 경우, 및 기준 (a) 및 (b)가 동일한 9-량체에 대해 3종 이상의 별개의 HLA 유형에 대해 발생하는 경우 (즉, 3가지 관찰) 에피토프로서 분류하였다. 고려된 HLA 유형은 표준 ISPRI/에피매트릭스 보고서에서 동일한 HLA 유형인 DRB1*01, 1*03, 1*04, 1*07, 1*08, 1*11, 1*13 및 1*15였다. 따라서, 방법의 1차 산출물이 15-량체의 순위였지만, 본 발명자들은 프로토콜 1과의 비교의 용이성을 위해 데이터를 재해석하여 예측된 9-량체 에피토프의 목록을 수득하였다.

에피토프 분류

각각의 에피토프를 배선 또는 비-배선 에피토프로서 분류하였다. 항체에 대해, 본 발명자들은 각각의 에피토프를 항체 (CDR 또는 비-CDR) 내의 그의 위치에 기초하여 추가로 분류하였다. 본 발명자들은 위유전자 또는 오픈 리딩 프레임 (ORF)으로서 주석달린 배선을 제거하기 위해 IMGT (www.imgt.org)로부터 수득된 인간 V 도메인의 서열을 필터링하였다. 나머지 서열에서 발견된 임의의 예측된 9-량체 에피토프는 배선 에피토프로 간주하였다. J 또는 C 영역 (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 포함) 또는 이들 영역 사이의 연접부에서 발견된 에피토프를 또한 배선 에피토프로서 분류하였다. 그 외는, 에피토프를 비-배선 에피토프로서 분류하였다. 가변 도메인 잔기를 카바트 넘버링 시스템에 기초하여 넘버링하였다 (Kabat EA, et al. (1991) US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 넘버링 후, CDR은 하기 잔기를 포함하는 것으로 정의되었다: CDR-H1 (H26-H35, H35A와 같은 삽입 포함, H36까지이나 이는 포함하지 않음), CDR-H2 (H50-H65 포함), CDR-H3 (H95-H102 포함), CDR-L1 (L24-L34 포함), CDR-L2 (L50-L56 포함), CDR-L3 (L89-L97 포함). 예측된 9-량체 에피토프는 그의 아미노산 중 어느 하나가 CDR 영역의 일부인 경우에 CDR 에피토프였다. CDR-H1에 대해 본 발명자들이 선택한 출발 위치 (H26)는 카바트 주석을 사용하는 일부 다른 공개물과 상이하다는 것을 주목한다.

전체 서열 점수 (T-reg 조정된 점수)

개별 쇄에 대해 또는 항체 VH 및 VL 도메인의 쌍형성에 대해, 하기와 같이 각각의 구성성분 9-량체에 대해 합산함으로써 전체 점수를 계산하였다. 9-량체가 에피토프인지에 관계 없이, 9-량체 및 HLA 유형의 모든 개별 조합 ("관찰")을 조사하였다. 특정한 관찰이 펩티드가 주어진 HLA 유형에 대한 결합제의 상위 5%에 있는 것으로 나타낸 경우에, 이 관찰에 대한 에피매트릭스 Z-점수를 전체 단백질 서열과 연관된 누적 총계에 부가하였다. 조사된 총 관찰 횟수를 또한 기록하였다. 유일한 예외는 ISPRI에 의해 "T-레지토프"로서 확인된 9-량체의 모든 관찰이 0의 에피매트릭스 점수를 갖는 것으로 가정되었다는 것이었다. 누적 총계에서, 0.05 * 2.2248의 기준선 점수를 각각의 관찰 (T-레지토프 포함)로부터 차감하였다. 최종 점수를 하기와 같이 컴퓨터 계산하였다:

T-reg 조정된 점수 = (누적 총계) * 1000 / (관찰 횟수)

보다 낮은 점수는 보다 낮은 예측된 면역원성 잠재력을 나타냈다. 점수는 ISPRI/에피매트릭스로부터의 예측만을 포함하였고, IEDB로부터의 정보는 포함하지 않았다는 것을 주목한다. 따라서, IEDB에 의해 예측되지만 ISPRI에 의해서는 예측되지 않는 임의의 강한 HLA 결합제는 점수에 기여하지 않았다. 이론적으로, 서열은 많은 IEDB-예측된 HLA 결합제를 함유할 수 있고, 에피매트릭스가 또한 그 동일한 서열이 결합제일 가능성이 있는 것으로 예측하지 않는 경우에도 여전히 유리한 T-reg 조정된 점수를 갖는다.

이들 도구를 사용하여 인간화 항체 0841 (서열식별번호: 25의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 21의 VL 아미노산 서열을 포함함)에서 비-배선 T-세포 에피토프의 수 및 전체 서열 점수를 예측하였다. 2가지 프로토콜을 사용하여, 8종의 비-배선 에피토프를 VH 및 VL 서열에서 확인하였다 (H27: YNIRSSYMH (서열식별번호: 178), H63: FKIRFTISA (서열식별번호: 179), H65: IRFTISADN (서열식별번호: 180), L29: INRYLNWYQ (서열식별번호: 181), L46: LLIYNANSL (서열식별번호: 182), L47: LIYNANSLQ (서열식별번호: 183), L48: IYNANSLQT (서열식별번호: 184) 및 L49: YNANSLQTG (서열식별번호: 185) (도 4). 추가적으로, 전체 서열 점수는 -30.34이었다. 에피토프의 수 및 전체 서열 점수의 감소는 서열의 전체 면역원성 위험을 감소시킬 것으로 예측된다.

실시예 18: 인간화 항-E-셀렉틴 항체의 최적화.

항체 0841의 구조-기반 합리적 돌연변이유발

항-E-셀렉틴 항체 0841은 대상체에게 투여되었을 때 면역원성에 대한 위험을 증가시킬 수 있는 여러 예측된 T-세포 에피토프를 함유하였다. 이들은 VH 및 VL 서열에 함유된 8종의 비-배선 에피토프를 포함하였다 (H27: YNIRSSYMH, H63: FKIRFTISA, H65: IRFTISADN, L29: INRYLNWYQ, L46: LLIYNANSL, L47: LIYNANSLQ, L48: IYNANSLQT 및 L49: YNANSLQTG). 추가로, 열 강제 분해 후 항체의 펩티드 맵핑은 L30 위치에서의 NR 탈아미드화 문제를 확인하였다. L30에서의 NR 탈아미드화 문제에 추가로, 중쇄 위치 H54에서의 NG 부위, 위치 L52에서의 NS 부위 및 위치 L92에서의 NS 부위를 포함한 다른 잠재적 문제 부위를 확인하였다. 구조 기반 최적화 방법을 이용하여 예측된 T-세포 에피토프 및 서열 문제 부위를 제거하였다.

처음에는, CDR-L2를 DPK9 CDR-L2 (AASSLQS (서열식별번호: 3))에 배선화하고 CDR-H2의 말단을 (H59-H65 YVDSVKG (서열식별번호: 186))의 DP-54 서열에 배선화하는 추가의 인간화 항체 0978 (서열식별번호: 28의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 26의 LC 아미노산 서열을 포함함)을 생성하였다. 항체 0978은 실시예 16에 기재된 경쟁 결합 검정을 사용하여 항체 0841과 유사한 결합을 유지하는 것으로 나타났다. 이들 2종의 스트레치를 배선화한 것은 5종의 예측된 T-세포 에피토프 (H63: FKIRFTISA (서열식별번호: 179), L46: LLIYNANSL (서열식별번호: 182), L47: LIYNANSLQ (서열식별번호: 183), L48: IYNANSLQT (서열식별번호: 184) 및 L49: YNANSLQTG (서열식별번호: 185))를 제거하였지만, 새로운 예측된 T-세포 에피토프 (H63: VKGRFTISA (서열식별번호: 187))를 도입하였다. 추가적으로, L2의 돌연변이는 위치 L52에서의 잠재적 NS 문제 부위를 제거하였지만, H2의 말단의 돌연변이는 또 다른 잠재적 문제 부위인 위치 H61에서의 DS 부위를 부가하였다. E-셀렉틴의 c-유형 렉틴 도메인 (잔기 22-178)에 결합된 항체 0164의 X선 결정 구조를 사용하여 항체 0978에 대해 구조 기반 최적화를 수행함으로써 나머지 3종의 예측된 T-세포 에피토프 및 서열 문제를 제거하였다.

돌연변이유발에 적합한 위치를 결정하기 위해, 디스커버리 스튜디오 4.5 (다솔트 시스템즈 바이오비아 코포레이션(Dassault Systems Biovia Corp.)) 및 폴드X를 사용하여 친화도의 변화 및 안정성의 변화 둘 다에 대한 돌연변이의 컴퓨터 예측을 수행하였다. 허용 돌연변이는 디스커버리 스튜디오 및 폴드X 방법 둘 다에 대해 ΔΔG >1 kcal/mol을 갖는 것으로 예측되지 않는 것이다. 이들 예측으로부터, 예측된 T-세포 에피토프 및 서열 문제를 제거하면서 결합 및 안정성에 대해 최소의 영향을 가질 것으로 예측될 잔기의 세트를 확인하고, 표 22에 제시하였다.

표 22. 구조 기반 합리적 설계를 통해 확인된 서열 문제 모티프 또는 예측된 T-세포 에피토프를 제거할 것으로 예측된 돌연변이의 목록.

이러한 돌연변이 세트를 사용하여, 표 22에서 확인된 3종의 서열 문제 및 3종의 T-세포 에피토프를 제거한 4종의 최적화된 구축물을 생성하였다. 이들 구축물은 항체 1282 (서열식별번호: 43의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 포함함), 항체 1284 (서열식별번호: 40의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 포함함), 항체 1444 (서열식별번호: 13의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 포함함) 및 항체 1448 (서열식별번호: 37의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 포함함)이다. 항체 0978에 대한 돌연변이가 표 23에 제시된다. 이들 돌연변이체의 결합 친화도는 실시예 16에 기재된 경쟁 결합 검정을 사용하여 항체 0978과 유사한 것으로 확인되었다.

표 23. t-세포 에피토프 및 서열 문제를 제거하기 위해 최적화된 새로운 서열의 목록.

실시예 19: 최적화된 항-E-셀렉틴 항체 (0164, 0841, 1282, 1284, 1444, 1448)의 중화.

세포 표면 E-셀렉틴을 발현하는 CHO에 대한 리간드 결합의 중화

정적 리간드 세포 부착 검정에서, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 E-셀렉틴 리간드 (시알릴 루이스 항원) 및 E-셀렉틴 항체는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 상에서 발현된 인간 또는 시노몰구스 E-셀렉틴에의 결합에 대해 경쟁한다. 인간 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하도록 조작된 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에 대한 시알릴 루이스 항원의 중화를 평가하기 위해 경쟁 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하는 정적 중화 검정에서 리간드 결합을 중화시키는 항-E-셀렉틴 항체의 능력을 평가하였다.

인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 배양 배지 (10% (부피/부피) 투석된 태아 소 혈청, 100 nM 메토트렉세이트 및 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 MEM (최소 필수 배지) 알파 배지) 중에서 성장시켰다. 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (깁코), 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 125 μg/mL 제오신 (깁코)이 보충된 R1 배지 (RI 둘베코 변형 이글 배지/햄 F12 변형) 중에서 배양하였다.

E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트에 웰당 12,500개 세포로 시딩하고, 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 인큐베이션하여 전면생장 단층을 형성하였다. 후속적으로, 플레이트를 200 μL의 칼슘 마그네슘 무함유 PBS로 2회 세척하였다. 항-E-셀렉틴 항체 또는 IgG1 이소형 대조군 (IgG 대조군)을 비오티닐화 시알릴 루이스 A 폴리아크릴아미드 (카르보신트 엘엘씨, OS45446) 또는 시알릴 루이스 X 폴리아크릴아미드 (글리코테크, 01-045)와 스트렙타비딘/양고추냉이 퍼옥시다제 (총 100 μL)의 소형 합성 접합체의 존재 하에 검정에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 200 μL의 칼슘 및 마그네슘 무함유 PBS로 2회 세척하였다. 인큐베이션 후, 세포를 2 mM의 염화칼슘 (50 mM TRIS [트리스아미노메탄], 150 mM 염화나트륨; 0.05% 폴리소르베이트 20, pH 7.4; 2 mM의 염화칼슘)을 함유하는 200 μL의 세척 완충제로 2회 세척하였다. 100 μL의 1-스텝 울트라 TMB 기질 (써모 사이언티픽, 34028)을 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 신호를 발생시켰다. 반응을 2 M의 황산을 사용하여 정지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다 (스펙트라맥스 M5e). 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버전 8.0.2)를 사용하여 데이터를 분석하고 그래프화하였다. 분석으로부터 유도된 추정 반수 최대 억제 농도 (IC₅₀) 값은 인간 E-셀렉틴에 대해 1.38 내지 2.89 nM 범위이고, 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대해 1.85 내지 2.65 nM 범위였다 (도 5 및 도 6) (표 24).

표 24. 세포 표면 E-셀렉틴을 발현하는 CHO에 대한 리간드 결합의 중화

추가 정적 중화 검정에서, 상기 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, 항체 1444는 CHO 세포에 의해 발현된 인간 또는 시노몰구스 E-셀렉틴 단백질 둘 다에 대한 리간드 결합을 각각 1.88 nM - 2.33 nM 및 1.47 nM - 1.49 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 중화시켰다.

가용성 재조합 단백질에 대한 리간드 결합의 중화

재조합 히스티딘-태그부착된 E-셀렉틴; 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴 (시노 바이올로지칼스(Sino Biologicals); 190169-C08H) 및 인간 E-셀렉틴 (시노 바이올로지칼스; 13025-H08H) 원액을 칼슘 및 마그네슘이 없는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에 3 μg/mL의 최종 농도로 제조하였다. 웰당 100 μL의 희석된 재조합 E-셀렉틴 단백질을 Ni-NTA HisSorb 96 웰 플레이트 (퀴아젠, 35061)에 첨가하고, 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 합성 E-셀렉틴 리간드인 시알릴 루이스 A 폴리아크릴아미드 비오틴 (글리코테크 코포레이션 01-044)을 스트렙타비딘 HRP (양고추냉이 퍼옥시다제) (울트라 스트렙타비딘 HRP, 써모 사이언티픽 N504)에 접합시키고, 2 mM 염화칼슘을 함유하는 검정 희석제 (BD OptEIA 완충제; BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 555213) 중에 희석하였다.

또한 2 mM 염화칼슘을 함유하는 검정 희석제 중에서 항체의 2배 농축된 원액 (IgG1 대조군, 0160, 1282, 1284, 1444 및 1448)을 제조하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 2 mM의 염화칼슘 (50 mM TRIS [트리스아미노메탄]; 150 mM 염화나트륨, 0.05% 폴리소르베이트 20, pH 7.4; 2 mM의 염화칼슘)을 함유하는 세척 완충제 200 μL로 5회 세척하였다. 이 후에, 항체 (IgG1 대조군, 0160, 1282, 1284, 1444 및 1448) 및 HRP 접합된 시알릴 루이스 A의 혼합물 100 μL를 이중으로 첨가하고, 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 항체 농도는 200 nM 내지 0.09 nM 범위였고, HRP 접합된 시알릴 루이스 A의 최종 농도는 5 μg/mL였다. 플레이트를 이전에 언급된 바와 같이 세척하고, 웰당 100 μL의 1-스텝 울트라 TMB 기질 (써모 사이언티픽, 34028)을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 100 μl의 2M 황산으로 정지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다 (스펙트라맥스 M5e). 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버전 8.0.2)를 사용하여 데이터를 분석하고 그래프화하였다. 추정 반수-최대 억제 농도 (IC₅₀) 값이 분석으로부터 유도되었다 (표 25).

추정 반수 최대 억제 농도 (IC₅₀) 값이 분석으로부터 유도되었으며, 이는 가용성 재조합 인간 E-셀렉틴에 대한 리간드 결합의 항체 중화에 대해 2.96 nM 내지 3.59 nM 및 가용성 재조합 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 리간드 결합의 항체 중화에 대해 2.74 nM 내지 3.29 nM 범위였다.

표 25. 가용성 재조합 E-셀렉틴에 대한 리간드 결합의 중화

상기 기재된 것과 유사한 방법을 사용하는 추가의 정적 중화 검정에서, 항체 1444는 인간 또는 시노몰구스 E-셀렉틴 단백질 둘 다에 대한 리간드 결합을 각각 2.87 nM - 2.91 nM 및 2.39 nM - 2.45 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 중화시켰다.

실시예 20: 표면 플라즈몬 공명을 사용한 최적화된 항-E-셀렉틴의 동역학적 평가

실시예 4와 유사한 방법으로 SPR을 사용하여 최적화된 항체 1282, 1284, 1444 및 1448에 대해 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 결합 친화도를 결정하였다. 먼저 항체를 고정화된 항-인간 IgG에 결합시킴으로써 이를 수행하였다. 항체 포획 후, E-셀렉틴 단백질의 희석물을 유동시키고, 인간 및 시노몰구스에의 결합에 대해 회합률 상수 (ka), 해리율 상수 (kd), t1/2 및 K_D 값을 결정하였다 (표 26). 이러한 SPR 분석에서, 인간 E-셀렉틴에 대한 1282, 1284, 1444 및 1448의 친화도는 각각 70.3 nM, 65.2 nM, 61.8 nM 및 60.5 nM이었다. 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 1282, 1284, 1444 및 1448의 친화도는 각각 78.3 nM, 76.5 nM, 81.5 nM 및 67.8 nM이었다.

표 26. 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 항-E-셀렉틴 항체의 친화도.

실시예 21: 최적화된 항-E-셀렉틴 항체 (0164, 0841, 1282, 1284, 1444 및 1448)의 세포 표면 결합 (FACS) 및 중화.

FACS에 의한 세포 표면 결합

막-결합된 E-셀렉틴에 대한 항체 0841, 0164, 1282, 1284, 1444 및 1448의 결합을 FACS에 의해 분석하였다. 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 최종 농도 10%의 투석된 태아 소 혈청 (깁코) 및 페니실린/스트렙토마이신 (1X)이 보충되고 메토트렉세이트가 보충된 알파 배지 (MEM [최소 필수 배지] 알파 배지, 50-012-PC, 코닝) 중에서 배양하였다. 간략하게, 해동된 세포를 초기에 100 nM 메토트렉세이트의 존재 하에 성장시켰다. 후속 배양을 위해, 메토트렉세이트를 성장 배지로부터 제거하였다.

내피 세포를 동결된 스톡으로부터 해동시키고, 멸균 0.1% 젤라틴 용액 (시그마, ES-006-B)으로 재코팅된 T-25 플라스크 (코닝, 353108)에 처음 플레이팅하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 내피 세포 성장 배지 (시그마 알드리치, 211-500) 중에서 성장시키고, 한편 시노몰구스 원숭이 폐 미세혈관 내피 세포 (CLMEC)를 완전 원숭이 내피 세포 배지 (셀 바이올로직스(Cell Biologics), MK1168) 중에서 성장시켰다. 세포를 90% 전면생장률에 도달하였을 때 분할하고, 0.1% 젤라틴으로 사전코팅된 3개의 T-175 플라스크에 플레이팅하였다.

인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포주를 효소-무함유 세포 해리 완충제 (깁코, 13151014)를 사용하여 전면생장 플라스크로부터 탈착시켰다. 성장 배지를 탈착된 세포에 즉시 첨가한 다음, 실온에서 300 x g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. 이어서, 세포를 최종 농도 1%의 소 혈청 알부민 (BSA; 시그마-알드리치, A3059), 최종 농도 1 mM의 염화칼슘 및 최종 농도 0.1%의 아지드화나트륨을 함유하는 pH 7.4의 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 이루어진 차가운 CHO 완충제 중에 재현탁시켰다.

1차 세포인 HUVEC 또는 CLMEC의 경우, 성장 배지를 내피 세포 기초 배지 (시그마-알드리치, 210-500)로 대체하여 90% 전면생장률의 배양물을 혈청-고갈시켰다. 세포를 가습 인큐베이터 내 37℃, 5% CO₂ 및 95% 공기에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청 고갈 직후에, 10 ng/mL의 인간 조직 괴사 인자-알파 (TNF-α; 깁코)를 함유하는 내피 세포 기초 배지를 세포에 첨가하여 E-셀렉틴 발현을 유도하였다. TNF-α 자극 4시간 후에, 세포를 시트르산 염수 (135 mM 염화칼륨, 15 mM 시트르산나트륨)를 사용하여 탈착시키고, 염화칼슘을 1 mM 최종 농도로 첨가하여 즉시 재석회화시켰다. 세포를 4℃에서 300 x g로 원심분리하고, 습윤 얼음에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드 (PFA; 일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Microscopy Sciences), 15710)를 함유하는 PBS 중에 재현탁시킴으로써 고정시켰다. PFA를 원심분리에 의해 제거하고, 세포를 CHO 완충제 중에 밤새 재현탁시켰다.

CHO 세포를 사용한 결합 연구는 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 2개의 행을 사용하여 이중으로 수행한 반면, 1차 내피 세포를 사용한 결합 연구는 96-웰 V-바닥 플레이트의 단일 행에서 수행하였다. 플레이트를 4℃에서 300 x g로 2분 동안 원심분리하고, 세포를 재현탁시키고, CHO 완충제 중에서 습윤 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 차단시켰다. 인큐베이션 후에, 세포를 4℃에서 300 x g로 2분 동안 원심분리하여 완충제를 제거하였다. 이어서, 각각의 웰 내의 세포 펠릿을 재현탁시키고, 지정된 부피의 연속-희석된 항체 (인간 IgG1 대조군, 0841, 1282, 1284, 1444 및 1448) 중에서 인큐베이션하고, 습윤 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션되도록 하였다. 시험 항체 용액을 희석제로서 CHO 완충제를 사용하여 3배 연속 희석물 (1333 nM 내지 0.0226 nM)로 제조하였다. 항체와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 4℃에서 300 x g로 1분 동안 원심분리에 의해 3회 세척하고, 차가운 CHO 완충제 중에 재현탁시켰다. 세척된 세포를 재현탁시키고, 습윤 얼음 상에서 45분 (CHO 세포) 또는 30분 (내피 세포) 동안 알렉사플루오르647-접합된 염소 항-인간 F(ab')₂ 단편 (Fcγ 단편 특이적 항체, [잭슨 이뮤노리서치, 109-606-170])의 1:1000 희석물 100 μL와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 3 또는 4회 세척한 후, 유동 세포측정 분석을 위해 CHO 완충제 중에 재현탁시켰다. 640 나노미터 레이저 라인을 사용하는 벡톤 디킨슨 LSR포르테사 기기를 사용하여 세포 형광 데이터를 획득하였다. 세포의 기하 평균 형광을 플로우조 소프트웨어 패키지 (플로우조, 엘엘씨)에 의해 분석하고, 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. 프리즘 스위트 (그래프패드, 버전 8)에서 비선형 회귀 분석을 사용하여 추정 EC₅₀ 값을 계산하였다.

항체 0841, 1282, 1284, 1444 및 1448은 인간 E-셀렉틴을 발현하도록 조작된 CHO 세포에 하위 내지 낮은 nM 범위의 유사한 추정 EC₅₀ 값으로 결합하였다 (표 27). 대조군 인간 IgG는 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 어떠한 결합도 나타내지 않았다.

항체 0164, 1282, 1284, 1444 및 1448은 4시간 동안 TNF-α로 처리된 HUVEC 및 CLMEC 상의 세포 표면 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 결합하여 E-셀렉틴의 발현을 유도하였다. 결합이 검출되지 않은 IgG1 이소형 대조군과 비교하여, TNF-α 활성화된 HUVEC 또는 CLMEC의 세포 표면 상의 내인성으로 발현된 E-셀렉틴에 대한 결합이 관찰되었다. 높은 형광 배경이 관찰되었고, EC₅₀ 값은 계산되지 않았다 (표 27).

표 27. FACS에 의한 세포 표면 항체 결합

실시예 22: 최적화된 항-E-셀렉틴 항체에 의한 세포 부착의 정적 중화

E-셀렉틴은 혈액 세포의 표면 상에 발현된 시알릴화 루이스 변형된 리간드에 결합한다. 이 연구에서, 인간 전골수구성 세포주 (HL-60)를 E-셀렉틴 리간드에 대한 세포 공급원으로서 사용하였다. 세포 표면 E-셀렉틴 (CHO 세포 상)에의 HL-60 세포의 부착에 대한 항체 0164, 1282, 1284, 1444 및 1448의 중화 활성을 정적 중화 부착 검정에서 평가하였다.

인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 100 nM 메토트렉세이트가 보충된 신선한 성장 배지 중에서 성장시켰다. 이러한 세포의 초기 계대배양 후, 후속 배양을 위해 메토트렉세이트를 성장 배지로부터 제거하였다. 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포를 R1 배지 중에서 배양하였다. 이러한 세포의 초기 계대배양 후에, 후속 배양을 위해 제오신을 성장 배지로부터 제거하였다.

대수기의 HL-60 세포를 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 형광 염료 (CFSE) 표지 키트 (써모피셔, 65-0850-84)를 사용하여 표지하였다. 표지된 HL-60 세포를 정적 부착 검정에 사용하기 위해 CHO 완충제 (PBS, pH 7.4/1% 소 혈청 알부민 (BSA)/1 mM 염화칼슘 (CaCl₂)/0.1% 아지드화나트륨 (NaN₃)) 중에 400,000개 세포/mL의 밀도로 재현탁시켰다.

정적 조건 하에 E-셀렉틴 발현 CHO 세포에 대한 HL-60 세포의 세포 부착을 억제하는 항체 0164, 1282, 1284, 1444 및 1448의 능력을 평가하였다. 간략하게, CHO 세포를 96-웰 (기술적 반복물) 편평 바닥 흑색 플레이트의 2개의 행 상에 100,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 가습 인큐베이터 내 37℃, 5% CO₂ 및 95% 공기에서 (전형적으로 24시간 후) 전면생장 단층을 형성하도록 하였다. 세포 단층을 CHO 완충제를 사용하여 부드럽게 세척한 다음, 지정된 웰을 3배 연속 희석물 (200 μg/mL 또는 1333 nM 내지 0.003 μg/mL 또는 0.022 nM 범위)의 항체 용액 (0164, 1282, 1284, 1444 및 1448)과 함께 인큐베이션하였다. 적절한 부피의 CFSE-표지된 HL-60 세포 현탁액 (400,000개 세포/mL)을 최종 항체 농도 (200 μg/mL 또는 1333 nM 내지 0.003 μg/mL 또는 0.022 nM 범위)가 유지되도록 웰에 즉시 첨가하였다. 표지된 HL-60 세포를 가습 인큐베이터 내 37℃, 5% CO₂ 및 95% 공기에서 45분 동안 CHO 세포 단층과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 CHO 완충제로 3회 세척하고, 스펙트라맥스 i3X (몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 494/521 나노미터의 여기/방출 파장에서 결합된 HL-60 세포의 형광을 측정하였다. 형광 단위를 항체 농도의 함수로서 플롯팅하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버전 8.0.2)를 사용하여 비선형 회귀 분석을 사용하여 IC₅₀을 추정하였다.

항체에 대한 추정 IC₅₀ 값은 유사하였고, 3.4 nM 내지 6.2 nM 범위였다 (도 7) (표 28).

표 28. HL-60 세포 부착의 정적 중화.

추가의 정적 중화 검정에서, 상기 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여, 항체 1444는 세포 표면 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴 둘 다에 대한 HL-60 부착을 각각 3.36 nM 및 3.84 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 중화시켰다 (표 38).

실시예 23: 최적화된 항-E-셀렉틴 항체의 내인성 인간 E-셀렉틴 결합.

최적화된 항-E-셀렉틴 항체 1282, 1284, 1444 및 1448에 의한 인간 혈장에서의 E-셀렉틴 결합 억제의 분석을 IP-LC/MS/MS 방법을 사용하여 수행하였다. 이 방법은 인간 혈청 중 유리 가용성 인간 E-셀렉틴 또는 시노몰구스 원숭이 혈청 중 유리 가용성 원숭이 E-셀렉틴을 정량화하였다. 방법은 250 μL의 PBS 중 50 μL의 혈청을 사용하였으며, 이를 1.0 μg의 비오티닐화 항-E-셀렉틴 항체 0164와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다 (저온실에서, 500 rpm으로 진탕함). 인큐베이션 후에, 30 μL의 인비트로젠 T1 스트렙타비딘 자기 비드를 각각의 샘플에 첨가하고, 이어서 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다 (1000rpm으로 진탕함). 이어서, 해밀턴 마이크로랩스타를 사용하여, 자기 비드를 PBS/0.05% 트윈-20으로 2회 세척하고, 이어서 PBS로 1회 세척하였다. 이어서, 가용성 E-셀렉틴을 145 μL의 30 mM 염산 (HCl)으로 비드로부터 용리시키고, 32 μL의 1 M 트리스 HCl, pH 8로 중화시켰다. 후속적으로 50 fmol의 안정한 동위원소 표지된 (SIL) 내부 표준물을 첨가하고, 이어서 디티오트레이톨 (DTT, 10 μL x 50 mM)을 첨가하였다. 60℃에서 35분 인큐베이션한 후에, 샘플을 실온으로 냉각되도록 한 후, 아이오도아세트아미드 (IAA, 10 μL x 100 mM)를 첨가하였다. 이어서, 샘플을 암실에 30분 동안 두고, 여기에 1 μg의 프로메가 LysC/트립신 (10 μL x 100 μg/mL)을 첨가한 다음, 37℃에서 밤새 소화시켰다.

밤새 인큐베이션한 후에, 50 μL의 제조 샘플을 나노 ESILC-MS/MS 상에 주입하였다. 가용성 E-셀렉틴 (CSSLAVLEK (서열식별번호: 193))에 대한 트립신 펩티드를 모니터링함으로써 정량화를 수행하였다. 이 정량화는 항체 1282, 1284, 1444 및 1448이 각각 2.4 nM, 1.1 nM, 1.2 nM 및 1.8 nM의 IC₅₀ 및 각각 4.9 nM, 4.8 nM, 6.5 nM 및 8.6 nM의 IC₉₀으로 인간 E-셀렉틴을 유사하게 억제하였다는 것을 보여주었다.

실시예 24: 인간화 항-E-셀렉틴의 생물물리학적 특징화.

열 안정성

시차 주사 열량측정법을 사용하여 4종의 최적화된 항-E-셀렉틴 항체 1282, 1284, 1444 및 1448의 안정성을 결정하였다. 실시예 16에 기재된 방법과 유사한 DSC 방법을 사용하였다. 하기 표 29는 트리스/수크로스 ("Tris/Suc") 완충제 (20 mM 트리스, 8.5% 수크로스, pH 7.5), 히스티딘/수크로스 ("His/Suc") 완충제 (20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로스, 0.005% EDTA, pH 5.8) 및 글루탐산/트레할로스 ("Glu/Tre") 완충제 (20 mM 글루탐산, 8.5% 트레할로스, pH 4.5) 중에서 이들 분자의 용융 온도 (T_m1 - T_m3 및 FAB)를 보여준다. 모든 4종의 분자는 CH2 도메인에서의 제1 전이 온도 (T_m1)가 Tris/Suc, His/Suc 및 Glu/Tre 완충제 중에서 65℃ 초과로, 우수한 안정성을 나타냈다. 이들 분자는 His/Suc 및 Glu/Tre 완충제 중에서 안정성의 약간의 증가 및 Tris/Suc 완충제 중에서 안정성의 약간의 감소를 나타냈다.

표 29. 시차 주사 열량측정법에 의해 결정된 최적화된 항-E-셀렉틴 항체의 열 안정성.

강제 분해

최적화된 항-E-셀렉틴 항체 1282, 1284, 1444 및 1448을 4주 강제 분해 연구를 위해 40℃에서 3종의 완충제: Tris (20 mM Tris, pH 7.5), His (20 mM 히스티딘, pH 5.8) 및 Glu (20 mM 글루탐산, pH 4.5) 중으로의 광범위한 투석에 의해 제조하였다. 투석 후, 샘플 농도를 5 mg/mL로 조정하였다. T0, T2 및 T4주에, aSEC, iCE 및 생물검정 시험을 위해 샘플을 분취하였다.

강제 분해 샘플의 응집 상태를 실시예 16에 기재된 바와 같이 aSEC에 의해 결정하였다. 모든 샘플은 T4주에 5% 미만의 LMMS 및 1% 미만의 HMMS 종의 최소 변화를 나타냈다 (표 30).

표 30. 최적화된 항-E-셀렉틴 항체의 강제 분해 샘플의 aSEC.

영상화 모세관 등전 포커싱 (iCE)을 사용하여 강제 분해 샘플의 전하-기반 불균질성을 검출하였다. 실시예 16에 사용된 방법과 유사한 방법을 사용하여 이를 수행하였다. iCE 분석에서 높은 % 산성/염기성 종을 갖는 샘플의 경우, CDR 영역에서의 서열 문제를 확인하기 위해 추가의 질량 분광 분석이 요구되었다. Tris, His 및 Glu 완충제 중 샘플의 분석은 산성 및 염기성 종의 전형적 증가를 나타냈다 (표 31). 항체 1444를 인간화 0841과의 비교를 위해 3-부분 질량 분광 분석 및 펩티드 맵핑을 사용하여 추가로 분석하였다.

표 31. 최적화된 항-E-셀렉틴 항체의 강제 분해 샘플의 iCE 분석.

질량 분광 분석

최적화된 항체 1444에 대해 3-부분 질량 분광 분석을 수행하였다. T4W에서 Glu, His 및 Tris 완충제 중 항체 1444의 강제 분해의 분석은 T0과 비교하여 유사한 프로파일을 나타냈다. 스트레스화 샘플에서 낮은 수준의 scFc (단일 쇄 Fc) 산화 및 D/P 클립이 관찰되고, 낮은 수준의 oxi_Fd (산화된 Fd)가 검출되고, 미량의 Fd+ HexNAc (당화된 Fd)가 검출되고, 미량의 Fd D/P 클립 (절단된 D/P 부위를 갖는 Fd 단편)이 검출되고, 낮은 수준의 PyroE Fd (N-말단에 피로글루탐산을 갖는 Fd 단편)가 관찰되었다 (도 8).

실시예 16에 사용된 방법과 유사한 방법을 사용하여 항체 1444에 대해 펩티드 맵핑을 수행하였다. Tris, His 또는 Glu 완충제 중 T0 및 T4주 강제 분해 샘플의 고충실도 펩티드 맵핑 분석은 단지 미량 수준의 이성질체화 및 탈아미드화가 항-E-셀렉틴 항체 1444 HC CDR 2 펩티드 IDPANGNTIYVDSVTGR (서열식별번호: 194)에서 검출되었다는 것을 나타냈다 (표 32). 모든 샘플은 > 96%의 정규 펩티드를 가졌으며, 1% 미만이 탈아미드화 펩티드로서 발견되었고, 2% 미만이 이성질체화 함유 펩티드 (IsoD)로서 발견되었다. 이러한 최적화된 변이체는 경쇄 위치 30에서 Glu로 돌연변이된 화학적으로 불안정한 모티프를 더 이상 함유하지 않는다. LC CDR1 펩티드 TSQNIERYLNWYQQKPGK (서열식별번호: 195)의 경우, 변형은 검출되지 않았다.

표 32. 최적화된 항-E-셀렉틴 항체 1444로부터의 HC CDR2 펩티드의 강제 분해 샘플의 LC/MS 펩티드 맵핑.

강제 분해 샘플의 안정성을 추가적으로 평가하기 위해, 스트레스화 샘플 (항체 1282, 1284, 1444, 1448)의 활성을 경쟁 결합 ELISA에서 평가하였다. 여기서 T0, T2W 및 T4W 샘플을 인간 E-셀렉틴에의 결합에 대해 비오티닐화 키메라 항체 0164와 경쟁하는 그의 능력에 대해 비교하였다. 이 방법은 실시예 16에 기재된 방법과 유사하였다. 경쟁 결합 결과가 도 9a-9d에 제시되고, T0, T2W 및 T4W 샘플 사이에 어떤 차이도 관찰되지 않았으며, 이는 E-셀렉틴에 결합하는 항체의 능력이 고온 인큐베이션 후에 안정하였다는 것을 나타낸다.

고농도 안정성

최적화된 항-E-셀렉틴 항체 1282, 1284, 1444 및 1448을 3종의 완충제인 Tris/Suc (20 mM 트리스, 8.5% 수크로스, pH 7.5), His/Suc (20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로스, 0.005% EDTA, pH 5.8) 및 Glu/Tre (20 mM 글루탐산, 8.5% 트레할로스, pH 4.5) 중으로 광범위하게 투석하였다. 투석 후에, 샘플을 스핀 필터 농축기를 사용하여 150 mg/mL로 농축시키고, 4℃ 및 25℃에서 저장하였다. 시간 0 (T0), 1주 (T1W), 2주 (T2W), 4주 (T4W), 6주 (T6W) 및 7주 (T7W)에 실시간 aSEC 분석을 위해 샘플을 분취하고, 연구 종료 시에 T0, T3 및 T7주에서의 iCE 및 CGE 분석을 수행하였다.

고농도 샘플의 응집 상태를 실시예 16에 기재된 바와 같이 aSEC에 의해 결정하였다. 4℃ 및 25℃에서의 샘플은 모든 3종의 완충제 조건에서 HMMS의 증가가 거의 없이 (총의 <5%) 모든 시점에서 우수한 고농도 안정성을 나타냈다 (도 10a-10d).

iCE를 사용하여, 실시예 16에 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여 고농도 샘플의 전하-기반 불균질성을 검출하였다. 7주 연구에 걸쳐 25℃에서 Tris/Suc, His/Suc 및 Glu/Tre 완충제 중에 저장된 항체에서 % 산성 및 % 염기성 종의 최소 변화가 관찰되었다 (표 33).

표 33. 최적화된 항-E-셀렉틴 항체의 25℃ 고농도 샘플의 iCE 분석.

최적화된 항체 1282, 1284, 1444 및 1448의 고농도 샘플의 단편화를 결정하기 위해 CGE 분석을 수행하였다. 실시예 16에 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여 분석을 수행하였다. % 단편화 및 % HMMS의 정량화는 25℃에서 모든 3종의 완충제 중에서 항체 1282, 1284, 1444 및 1448에 대해 우수한 고농도 안정성을 입증하였다 (표 34).

표 34. 최적화된 항-E-셀렉틴 항체의 25℃ 고농도 샘플의 CGE 분석.

점도

최적화된 항체 1282, 1284, 1444 및 1448의 점도를 하기 DLS (동적 광-산란) 비드-기반 방법을 사용하여 측정하였다. PBS 중 단백질을 막 카세트 장치 10K MWCO (써모 사이언티픽)를 사용하여 20 mM 히스티딘, 85 mg/mL 수크로스, 0.05 mg/mL EDTA, pH 6.0에 대해 광범위하게 투석하였다. 투석으로부터 단백질을 수거하고, 0.2 μM 시린지 필터를 사용하여 여과하였다. 비바스핀 원심분리용 농축기 10K MWCO (지이 헬스케어)를 사용하여 단백질을 농축시켰다. 단백질 부피가 감소하고 단백질 농도가 증가함에 따라 농축기 보유물로부터 샘플 분취물 (12 μL)을 제거하였다. 300 nm 비드 (나노스피어, 써모 사이언티픽)를 단백질 샘플 및 완충제 블랭크에 첨가하였다. 비드를 20 mM 히스티딘, 85 mg/mL 수크로스, 0.05 mg/mL EDTA, pH 6.0 중에 1:10으로 희석하고, 0.75 μL 희석된 비드를 단백질 샘플에 스파이킹하였다. 단백질/비드 및 완충제/비드 샘플을 부드럽게 볼텍싱함으로써 혼합하였다. 8 μL의 샘플을 DLS에 의한 분석을 위해 1536 웰 플레이트 (센소플레이트, 유리 바닥, 그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One)))로 옮겼다. 플레이트를 광학적으로 투명한 테이프로 밀봉하고, 2000 RPM으로 2분 동안 원심분리하여 버블을 제거하였다.

다이나프로 플레이트 판독기 (와이어트 테크놀로지(Wyatt Technology), 캘리포니아주 산타 바바라)를 사용하여 DLS 측정을 수행하였다. 샘플을 25℃에서 인큐베이션하고, 15회 연속 25초 획득으로 측정하였다. 허용되는 붕괴 곡선을 갖는 데이터 획득에 대해 비드의 반경을 평균냈다. 스토크스-아인슈타인 방정식에 기초하여 점도를 계산하였다. 샘플 점도는 측정된 겉보기 반경을 공칭 비드 반경으로 나눈 것 곱하기 25℃에서의 물의 점도인 0.893 센티포아즈 (cP)로서 계산하였다.

고농도 제제는 보다 높고 덜 빈번한 투여를 가능하게 하는 항체에 대한 바람직한 특성이다. 최적화된 항체는 모두, 대략 160 mg/mL까지 점도가 20 cP에 도달하지 않는 우수한 점도 프로파일을 나타냈다. 이러한 측정을 확인하기 위해, 하기 기재된 안톤 파르 방법을 사용하여 각각의 최적화된 항체에 대한 단일 농도에서의 추가의 점도 측정을 수행하였다.

단백질 샘플을 50 kDa 분자량 컷-오프 아미콘 원심분리 필터 유닛 (EMD 밀리포어(EMD Millipore), 매사추세츠주 빌러리카)을 사용하여 170-180 mg/mL의 표적 농도로 농축시켰다. 솔로VPE 가변 경로길이 시스템 (씨 테크놀로지스, 인크.(C Technologies, Inc.), 뉴저지주 브리지워터) 상에서 280 nm 분석에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 25℃에서 150 rpm의 일정한 회전 속도로 MCR-302 레오미터 (안톤 파르 유에스에이 인크.(Anton Paar USA Inc.), 버지니아주 앳슈랜드) 상에서 CP25-1 콘 및 플레이트를 사용하여 점도 측정을 수행하였다. 샘플당 각각 10초의 총 10회 측정을 수집하고, 레오플러스 (안톤 파르 유에스에이 인크.) V 3.62 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 1282의 점도는 179.5 mg/mL에서 36.29 cP인 것으로 측정되었다. 1284의 점도는 171.9 mg/mL에서 27.38 cP인 것으로 측정되었다. 1444의 점도는 185.7 mg/mL에서 33.43 cP인 것으로 측정되었다. 1448의 점도는 186.8 mg/mL에서 33.35 cP인 것으로 측정되었다. 이들 측정 모두는 DLS 점도 측정의 곡선 피트에 잘 피팅되어, 그의 정확도를 강화한다 (도 11).

실시예 25: 최적화된 항-E-셀렉틴의 인 실리코 면역원성 위험 및 T-세포 에피토프 예측.

최적화된 항-E-셀렉틴 항체 1282, 1284, 1444 및 1448의 면역원성 위험을 MHCII 펩티드 결합의 예측을 위한 인 실리코 도구를 사용하여 예측하였다. 사용된 방법은 실시예 17에 기재된 방법과 유사하였다. 최적화된 항체는 인간화 항체 0841에 대한 -30.34에서 항체 1282에 대한 -46.26, 항체 1284에 대한 -46.16, 항체 1444에 대한 -45.11 및 항체 1448에 대한 -45.32의 점수로 감소하는 개선된 전체 서열 점수를 보여주었다. 추가적으로, 8종의 예측된 비-배선 T-세포 에피토프를 최적화된 항체에서 제거하였다 (표 35).

표 35. 최적화된 항-E-셀렉틴 항체의 인 실리코 면역원성 분석.

실시예 26: 최적화된 항-E-셀렉틴 항체의 자기-상호작용 및 다반응성.

최적화된 항체 1444 (서열식별번호: 13의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 포함함), 1282 (서열식별번호: 43의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 포함함), 1284 (서열식별번호: 40의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 포함함) 및 1448 (서열식별번호: 37의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 포함함)을 DNA 및 인슐린에의 결합에 대해 시험하고, 추가로 AC-SINS 검정 (친화도-포획 자기-상호작용 나노입자 분광분석법; 문헌 [Liu et al. (2014) mAbs 6:483-92])에서 자기-상호작용에 대해 시험하였다. AC-SINS 검정에서, 금 나노스피어 상에 포획된 mAb는 이들이 서로 결합하여 비드가 클러스터링되도록 하는 경우에 최대 흡광도의 이동을 유도한다. 본 검정에서의 높은 점수는 낮은 또는 불량한 용해도 및 비특이적 막 상호작용과 상관관계가 있는 것으로 시사되었다 (Liu et al., mAbs 2014; 6:483-92). 항체 1282, 1284, 1444 및 1448은 음성 대조군의 것과 대등한 매우 낮은 AC-SINS 점수 및 DNA/인슐린 점수를 가졌다 (표 36). 이들 데이터는 이들 항체가 음성 대조군의 것과 유사한 낮은 다반응성 위험이 있다는 것을 나타낸다.

표 36. E-셀렉틴 항체의 비-특이적 결합 및 자기-상호작용.

실시예 27: 표면 플라즈몬 공명을 사용한 최적화된 항-E-셀렉틴의 교차-반응성 평가.

실시예 20에 기재된 바와 같이 SPR을 사용하여 최적화된 항체 1444 (서열식별번호: 13의 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 포함함)에 대해 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 결합 친화도를 결정하였다. 405 nM의 높은 분석물 농도를 사용한 유사한 방법을 사용하여, 본 발명자들은 또한 실시예 5에 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여 래트 E-셀렉틴, 마우스 E-셀렉틴, 토끼 E-셀렉틴, 인간 L-셀렉틴 및 인간 P-셀렉틴의 상동체에 대한 상기 항체의 결합 친화도를 평가하였다. 25℃에서, 래트 E-셀렉틴, 마우스 E-셀렉틴, 토끼 E-셀렉틴, 인간 L-셀렉틴 및 인간 P-셀렉틴에 대한 항체 1444의 결합은 405 nM까지 관찰되지 않았다 (도 12). 항체 1444는 인간 E-셀렉틴에 68.35 +/- 3.18 nM의 K_D로 결합하였고, 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 64.9 +/- 1.13 nM의 K_D로 결합하였다.

실시예 28: 항체 1282, 1284, 1444 및 1448의 플레이트 기반 직접 결합 ELISA 분석.

직접 결합 ELISA를 사용하여 다양한 고정화된 가용성 재조합 셀렉틴에 대한 항체 0841, 1282, 1284, 1444 및 1448의 결합을 특징화하였다. 재조합 히스티딘 태그부착된 인간 P-, E- 또는 L-셀렉틴 (시노 바이올로지칼스), 마우스 E-셀렉틴 (시노 바이올로지칼스), 래트 E-셀렉틴 (시노 바이올로지칼스) 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴 (시노 바이올로지칼스) 원액을 칼슘 및 마그네슘이 없는 포스페이트 완충 염수 중에 1 μg/mL의 최종 농도로 제조하였다. 대조군은 L-셀렉틴 지시된 항체 (바이오레전드(BioLegend); 304811) 또는 P-셀렉틴 지시된 항체 또는 음성 대조군 IgG를 포함하였다. 웰당 100 μL의 희석된 재조합 셀렉틴 단백질을 Ni-NTA HisSorb 96 웰 플레이트 (퀴아젠; 35061)에 첨가하였다. 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 200 μL의 세척 완충제 (50 mM TRIS [트리스아미노메탄]; 150 mM 염화나트륨; 0.05% 폴리소르베이트 20, pH 7.4)로 3회 세척하였다. 비특이적 결합을 감소시키기 위해, 플레이트를 200 μL의 차단 완충제 (BD OptEIA 완충제; 555213; BD 바이오사이언시스)로 처리하고, 오비탈 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 항체 (IgG1 대조군 항체, 항-E-셀렉틴 항체, 항-P-셀렉틴 항체 또는 항-L-셀렉틴 항체)를 4배 연속 희석물 (133.33 nM 내지 0.004 nM 범위, BD OptEIA 완충제 중에서 제조)로 이중으로 웰당 100 μL로 반응물에 첨가하고, 오비탈 진탕기에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 100 μL 특이적 검출 항체 (하기 기재됨)를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다:

● IgG1 대조군, 0841, 1282, 1284, 1444, 1448, 항-마우스-E-셀렉틴 및 항-P-셀렉틴 항체를 퍼옥시다제-접합된 염소 항-인간 IgG Fc 감마 (잭슨 이뮤노리서치 랩; 109-035-008)의 1 대 25000 또는 1 대 50000 희석을 사용하여 검출함;

● 항-L-셀렉틴 및 항-래트-E-셀렉틴 항체를 퍼옥시다제-접합된 아피니퓨어 염소 항-마우스 IgG (H+L) (잭슨 이뮤노리서치 랩)의 1 대 25000 희석을 사용하여 검출함.

플레이트를 세척하고, 웰당 100 μL의 1-스텝 울트라 TMB 기질 (써모 사이언티픽)을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 100 μL의 2 M 황산으로 정지시키고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다 (스펙트라맥스 M5e). 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (8.0.2)를 사용하여 데이터를 분석하고 그래프화하였다. 추정 반수-최대 농도 (EC₅₀) 값이 분석으로부터 유도되었다.

고정화된 인간 L-셀렉틴 또는 인간 P-셀렉틴에 대한 용량-의존성 결합이 L- 또는 P-셀렉틴 지시된 항체에서 각각 0.362 nM 및 0.081 nM의 추정 EC₅₀ 값으로 관찰되었다. 대조적으로, 가용성 인간 L- 또는 P-셀렉틴 단백질에 대한 0841, 1282, 1284, 1444 또는 1448의 교차 반응성은 관찰되지 않았다 (도 13). 이들 연구는 항체 (예를 들어, 1444)가 인간 L- 또는 P-셀렉틴에 대한 결합이 관찰되지 않으면서 E-셀렉틴에 선택적으로 결합한다는 것을 입증한다.

마우스 E-셀렉틴 및 래트 E-셀렉틴에 대한 용량-의존성 결합이 대조군 래트 또는 마우스 항-E-셀렉틴 항체에서 낮은 내지 하위-나노몰 결합 (각각 0.153 nM 및 0.0139 nM)으로 관찰되었다. 대조적으로, 마우스 및 래트 E-셀렉틴에 대한 0841, 1282, 1284, 1444 또는 1448의 약한 결합이 관찰되었고, 결합 곡선은 양성 대조군 항체와 비교하여 우측으로 이동하였다. 결합 곡선은 대조군 래트 또는 마우스 E-셀렉틴 지시된 항체와 비교하여 더 약한 포화불가능한 또는 가변적 결합을 나타냈다 (표 37).

표 37. 가용성 재조합 E-셀렉틴 단백질에 대한 항체 교차 반응성.

추가의 직접 결합 ELISA에서, 상기 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, 항체 1444는 고정화된 가용성 재조합 인간 E-셀렉틴에 0.085의 EC50으로 및 고정화된 가용성 재조합 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 0.071 내지 0.075 nM의 EC50으로 결합하였다 (표 38).

실시예 29: 정맥내 또는 피하 투여 후 원숭이에서의 최적화된 항체 1444의 약동학.

시노몰구스 원숭이에서 정맥내 및 피하 투여를 사용하여 최적화된 항체 1444의 약동학 연구를 수행하였다. 혈청 항체 1444 (서열식별번호: 7의 HC 아미노산 서열 (말단 리신을 포함함) 및 서열식별번호: 1의 LC 아미노산 서열을 포함함)의 정량화 농도를 메소-스케일 디스커버리(Meso-Scale Discovery)® (MSD) 검정 플랫폼 상에서 면역검정을 사용하여 결정하였다. 검정에서, 항-E-셀렉틴 항체 1444를 정량화하기 위해, 비오티닐화 염소 항-인간 이뮤노글로불린 G (IgG)를 차단된 스트렙타비딘-코팅된 작은 스팟 플레이트 상에 결합시켰다. 항-E-셀렉틴 항체 1444는 리간드인 재조합 인간 가용성 E-셀렉틴에 의해 포획되었다. 결합된 항-E-셀렉틴 항체 1444를 루테닐화 염소 항-인간 IgG로 검출하였다. 플레이트를 MSD 섹터 이미저 6000 상에서 판독하고, 결합된 항-E-셀렉틴 항체 1444의 양을 나타내는 MSD 기기 내의 전기화학발광 신호를 생성하는 트리프로필아민 (TPA) 및 루테늄 표지된 염소 항-인간 IgG 항체를 사용하여 최종 검출을 수행하였다. 5-파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 피팅된 표준 곡선으로부터의 내삽에 의해 샘플 농도를 결정하였다 (표준 곡선에 대한 가중 식은 1/y^2임). 100% 혈청에서의 정량화 범위는 40.0 ng/mL 내지 2560 ng/mL였다.

각각 2마리의 동물에게 0.3, 0.6, 1, 3 또는 10 mg/kg의 정맥내 (IV) 투여 후에, 항체 1444는 시간 0에서 마지막 측정가능한 농도로부터 계산된 평균 전신 클리어런스 (CL_0-tlast)가 각각 0.39, 0.31, 0.15, 0.18 및 0.18 mL/h/kg인 것으로 및 정상 상태에서의 겉보기 분포 부피 (V_ss(0-tlast))가 각각 25, 22, 27, 35 및 36 mL/kg인 것으로 나타났다. 항체 1444는 용량 의존성 약동학을 나타냈고, 클리어런스는 용량이 증가함에 따라 감소하였으며, 이는 표적-매개 약물 배치를 나타낸다. 0.3, 0.6, 1, 3 또는 10 mg/kg로의 IV 투여에 대한 평균 반감기 (t_1/2)는 각각 102, 264, 188, 287 및 345시간이었다.

각각 2마리의 동물에게 1 또는 3 mg/kg의 피하 (SC) 투여 후에, 항체 1444는 1 mg/kg의 항체의 IV 투여와 비교하였을 때 1 mg/kg의 SC 투여 후에 50%의 평균 생체이용률 (%F)을 가졌다. 3 mg/kg의 항체 1444의 SC 투여 후, 항체 1444는 3 mg/kg의 항체 1444의 IV 투여와 비교하였을 때 65%의 평균 %F를 가졌다. 1 및 3 mg/kg의 항체 1444의 SC 투여에 대한 평균 반감기 (t_1/2)는 각각 243 및 518시간이었다.

메소 스케일 디스커버리 플랫폼 상에서 시노몰구스 원숭이 혈청 중 항-약물 항체 (ADA)의 존재를 검출하기 위해 리간드 결합 검정을 검증하였다. 이 방법에서, 시노몰구스 원숭이 혈청 중에 스파이킹된 마우스 모노클로날 항-항체 1444 항체로 이루어진 2가지 상이한 농도의 양성 대조군 및 풀링된 정상 시노몰구스 원숭이 혈청으로 이루어진 음성 대조군을 각각의 플레이트 상에 포함시켜 검정 성능을 모니터링하였다. 항체 1444에 대한 ADA 유도의 전체 발생률은 모든 용량 군에 걸쳐 0% (0/18마리 동물)였다.

실시예 30: 생리학적 유동 검정에서 최적화된 항체 1444에 의한 세포 부착의 생체외 중화

E-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포의 부착을 억제하는 항체 1444의 효력 및 중화 활성을 평가하기 위해, 재조합 단백질 또는 세포 단층으로 코팅된 마이크로유체 채널 내부에서 생체외 세포 부착 실험을 수행하였다. 바이오플럭스™ (S/N-008-0180-08) 시스템 (플럭션, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코)을 사용하여 생리학적 유동 조건 하에 세포 부착을 분석하였다. 세포 표면 상에 E-셀렉틴 (인간 또는 시노몰구스 원숭이)을 발현하도록 조작된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 재조합의 정제된 가용성 E- 또는 P-셀렉틴 단백질을 사용하여 부착 검정을 수행하였다. E-셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 X 리간드를 발현하는 인간 HL-60 세포, E-셀렉틴 리간드를 발현하는 정제된 인간 호중구, 또는 겸상 적혈구 질환을 갖는 환자로부터 수득된 전혈을 사용하여 재조합 E- 및 P-셀렉틴 단백질 및 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 부착을 시험하였다.

바이오플럭스™ 플레이트/챔버 (플럭션 바이오사이언시스, 48-웰 저전단, 0-20 다인/cm²; 910-0004)를 이들 연구에 사용하였다. 인간 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포 (인간 CHO-E, 화이자) 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포 (시노몰구스 원숭이 CHO-E, 화이자) 및 HL-60 세포를 그의 각각의 성장 배지 중에서 37℃에서 5% CO₂ 및 95% 습도 하에 유지하였다. HL-60 세포 또는 정제된 인간 호중구를 사용한 연구에서, 세포를 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 칼세인 AM (칼세인; 라이프 테크놀로지스™; C3099)으로 30분 동안 염색하고, 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBS) (깁코; 카탈로그 번호 14040-133)로 2회 세척하고, 유동 챔버에서의 관류 전에 PBS 중 3 x 10⁶개 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 세포를 관류 전에 37℃에서 유지하고, 바이오플럭스™ 검정을 실온에서 수행하였다. 부착 세포를 가시화하고, 니콘 이클립스 Ti-S (NIS-엘리먼츠 BR 3.2 64-비트) 도립 위상차 형광 현미경을 사용하여 40X 배율로 카운팅하였다. 세포 카운트를 포스페이트 완충제 비히클 대조군에 대해 정규화하였다. 각각의 실험은 조건당 2개의 웰을 가졌다. 그래프패드 프리즘 (8.0.2)을 사용하여 데이터를 그래프화하고 분석하였다. 분석으로부터 유도된 추정 반수-최대 억제 농도 (IC₅₀) 값을 소수점으로부터 2자리 유효 숫자로 반올림하였다. 데이터를 비히클 대조군 (=100%, 억제 없음)에 대해 정규화함으로써 추정 IC₅₀ 값을 계산하였다.

재조합 E-셀렉틴에 대한 세포 부착의 중화

먼저, 활성화된 내피 세포의 표면을 모방하기 위해, 유동 챔버를 동일한 양의 인간 E- 및 P-셀렉틴 가용성 재조합 단백질 둘 다로 코팅하였다. 바이오플럭스™ 유동 마이크로채널을 PBS 중에서 제조된 가용성 재조합 인간 P-셀렉틴 및 E-셀렉틴 (시노 바이올로지칼스) 각각 20 μg/mL로 코팅하고, 1 다인/cm²로 5분 동안 관류시키고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)/PBS에 의해 1 다인/cm²로 3-5분 동안 세척하였다. 플레이트를 PBS 중 항체1444 (0.78 내지 200 nM의 농도), 이소형 음성 대조군 항체 (200 nM), 양성 대조군 항-E 셀렉틴 항체 (200 nM) 및 비히클 대조군을 포함한 시험 물품에 의해 1 다인/cm²로 1시간 동안 처리하였다. HL-60 세포의 100 μL의 분취물을 각각의 채널에서 1 다인/cm²의 생리학적 전단 유동으로 10분 동안 관류시켰다. PBS를 1 다인/cm²로 2-3분 동안 관류시켜 비-부착 세포를 제거하고, 기재된 바와 같이 분석하였다.

항체 1444 (0.78 내지 200 nM), 이소형 음성 대조군 항체 또는 비히클을 챔버에서 관류시켜 E-셀렉틴 결합을 억제하였다. 이들 연구에서, E-셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 X 리간드를 발현하는 HL-60 세포를 1 다인/cm로 유동시켰다. 항체 1444는 정제된 가용성 인간 E-셀렉틴 단백질에 대한 HL-60 세포 부착을 15.26 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 감소시켰다. 이소형 음성 대조군은 검정에서 효과가 없었다. 양성 대조군 항-E 셀렉틴 항체는 HL-60 부착을 약 43%만큼 감소시켰다.

추가의 유동 부착 중화 검정에서, 상기 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, 항체 1444는 재조합 인간 E-셀렉틴 단백질에 대한 HL-60 부착을 13.28 nM - 15.94 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 중화시켰다 (표 38).

E-셀렉틴을 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포에 대한 세포 부착의 중화

바이오플럭스™ 플레이트를 PBS 중 100 μg/mL의 피브로넥틴 (어드밴스드 바이오매트릭스(Advanced BioMatrix), 카탈로그 번호 5050-1MG)으로 1 다인/cm²의 유량으로 코팅하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. E-셀렉틴을 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (인간 또는 시노몰구스 원숭이 CHO-E) 세포를 1:1 비의 0.05% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) (깁코, 25300054) 및 스템프로 아큐타제 (깁코; A1110501)로 37℃에서 5분 동안 처리하여 검정용으로 제조하고, 동일 부피의 성장 배지로 중화시키고, 수집하고, 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 그의 각각의 성장 배지 중에 60 x 10⁶개 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 플레이트를 250 μL의 CHO 성장 배지로 1 다인/cm²로 실온에서 2-3분 동안 2회 관류시키고, 모든 배지를 제거하고, 10-20 μL의 CHO-E 세포 (60 x 10⁶개 세포/mL)를 2-3 다인/cm²로 15초 동안 관류시켰다. 플레이트를 기기로부터 제거하고, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 500 μL의 신선한 성장 배지를 첨가하고, 세포를 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, CHO-E 단층을 바이오플럭스 기기 상에서 신선한 성장 배지로 세척하였다 (3-4 다인/cm²). 플레이트를 PBS 중 항체 1444 (0.78 내지 200 nM의 농도), 이소형 음성 대조군 항체 (200 nM), 양성 대조군 상업적 항-E 셀렉틴 항체 (200 nM) 및 비히클 대조군을 포함한 시험 물품에 의해 1 다인/cm²로 1시간 동안 관류시켜 처리하였다. HL-60 세포의 100 μL의 분취물을 각각의 채널에서 1 다인/cm²의 생리학적 전단 유동으로 10분 동안 관류시켰다. PBS를 1 다인/cm²로 2-3분 동안 관류시켜 비-부착 세포를 제거하고, 플레이트를 기재된 바와 같이 영상화 및 분석하였다.

E-셀렉틴은 내피 세포 표면 상에서 발현된다. E-셀렉틴 (인간 또는 시노몰구스 원숭이)을 발현하는 CHO 세포를 유동 챔버의 표면에 부착시켜 세포 단층을 형성하였다. 항체 1444를 챔버에서 관류시키고 (0.78 내지 200 nM), HL-60 세포를 1 다인/cm²로 생리학적 유동 하에 관류시켰다. 음성 대조군은 이소형 음성 대조군 항체 및 비히클을 포함하였다. 항-E-셀렉틴 항체1444는 인간 CHO-E-셀렉틴 세포에 대한 HL-60 세포의 세포 부착을 4.41 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 중화시켰다. 추가로, 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 세포에 대한 HL-60의 중화에 대한 추정 IC₅₀ 값은 4.34 nM이었다. 이소형 음성 대조군 항체는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포에 대한 HL-60 결합을 중화시키지 않았다. 200 nM에서 시험한 양성 대조군 항체는 인간 E-셀렉틴을 발현하는 세포에 대한 HL-60 부착을 약 44%만큼 감소시켰다.

추가의 유동 부착 중화 검정에서, 상기 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, 항체 1444는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴 발현 CHO 세포에 대한 HL-60 부착을 각각 4.25 nM - 4.56 nM 및 4.32 nM - 4.35 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 중화시켰다 (표 38).

E-셀렉틴을 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포에 대한 정제된 호중구 부착의 중화

인간 및 시노몰구스 원숭이 CHO 세포 단층을 기재된 바와 같이 바이오플럭스 플레이트 상에서 제조하였다. 4명의 건강한 지원자 공여자로부터 전혈을 수득하고 (화이자), 각각 3 mL를 풀링하고, 밀테니 키트 (MACSxpress 전혈 호중구 단리 키트, 인간, 130-104-434)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 호중구를 정제하였다.

PBS 중 항체 1444 (0.78 내지 200 nM의 농도), 이소형 음성 대조군 항체 (200 nM), 양성 대조군 항-E 셀렉틴 항체 (200 nM) 및 비히클 대조군을 포함한 시험 물품을 1 다인/cm²로 1시간 동안 관류시켰다. 정제된 호중구를 칼세인으로 염색하고, 검정 전에 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) (바이오탕 인크(Biotang Inc), 50-751-5681)로 37℃에서 10분 동안 처리하였다. 호중구를 실온에서 300 x g로 10분 동안 수집하고, PBS (칼슘 및 마그네슘 함유) 중에 재현탁시켰다. 호중구를 1 다인/cm²로 10분 동안 관류시켰다. PBS를 1 다인/cm²로 2-3분 동안 관류시켜 비-부착 세포를 제거하고, 플레이트를 영상화 및 분석하였다.

호중구는 E-셀렉틴 리간드를 발현하고, E-셀렉틴은 내피에 대한 호중구 부착을 매개한다. 생체외 생리학적 유동 하에 E-셀렉틴 (인간 또는 시노몰구스 원숭이)을 발현하는 CHO 단층에 대한 인간 호중구의 항-E-셀렉틴 항체 중화를 평가하였다. 항체 1444, 이소형 음성 대조군 항체 또는 비히클을 챔버 내로 관류시켰다. 인간 호중구를 4명의 건강한 공여자로부터 정제하고, 풀링하고, TNF-α 활성화된 (10 ng/mL) 호중구를 검정에서 평가하였다. 항체 1444는 인간 CHO-E-셀렉틴 세포에 대한 활성화된 인간 호중구의 부착을 2.87 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 중화시켰다. 시노몰구스 원숭이 CHO-E-셀렉틴 세포에 대한 활성화된 인간 호중구 부착의 중화에 대한 추정 IC₅₀은 16.33 nM이었다.

추가의 유동 부착 중화 검정에서, 상기 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, 항체 1444는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴 발현 CHO 세포에 대한 활성화된 인간 호중구의 부착을 각각 4.65 nM 및 9.45 nM의 추정 IC₅₀ 값으로 중화시켰다 (표 38).

SCD 혈액 세포 부착의 중화

SCD에서의 염증유발 반응은 겸상 적혈구 및 활성화된 내피 세포에서의 변경에 의해 촉진된다 (Manwani D and Frenette PS Blood 2013; 122(24):3892-98). 적혈구의 겸상적혈구화, 용혈 및 내피 세포 기능장애는 염증 및 세포 활성화를 유도하고, SCD 발병기전에 기여한다. SCD를 갖는 2명의 공여자로부터의 전혈을 칼세인 및 훽스트로 표지하여 롤링 및 부착을 가시화하였다. 간략하게, 도착 24시간 후에 혈액을 검정하고, 1 mM 염화칼슘, 1 mM 염화마그네슘, 10 mM N-2-히드록시에틸피페라진-N-2-에탄 술폰산, 0.25% BSA, 0.1% 글루코스를 함유하는 pH 7.4의 HBSS (행크 평형 염 용액) 완충제를 사용하여 15%의 적혈구용적률로 희석하였다. 혈액 세포를 검정 전에 칼세인 및 훽스트 (써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 33342) 염료 (1:1000)로 37℃에서 30분 동안 염색하였다. 유동 챔버를 PBS 중에서 제조된 가용성 재조합 인간 E- 및 P-셀렉틴 단백질 (시노 바이올로지칼스) 각각 20 μg/mL로 1 다인/cm²로 5분 동안 코팅하고, 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션하고, 0.1% BSA/PBS에 의해 1 다인/cm²로 3-5분 동안 세척하였다.

두 공여자로부터의 혈액을 재조합 인간 E- 및 P-셀렉틴 단백질에 대한 부착에 대해 평가하였다. PBS 중 항체 1444, 항-P-셀렉틴 항체 대조군 (0.78-200 nM), 이소형 음성 대조군 항체 (200 nM), 대조군 항-E-셀렉틴 항체 (200 nM) 또는 비히클을 포함한 시험 물품을 1 다인/cm²로 1시간 동안 유동시켰다. 희석된 SCD 혈액을 0.6 다인/cm²로 10분 동안 유동시켰다. PBS를 1 다인/cm²로 2-3분 동안 관류시켜 비-부착 세포를 제거하고, 플레이트를 영상화 및 분석하였다. 추정 IC₅₀ 값을 상기 기재된 바와 같이 계산하였다. 추정 IC₂₀, IC₈₀ 및 IC₉₀을 하기 식에 기초하여 계산하였다: (IC₅₀*효과)/(100-효과). 계산은 E_max T모델 [E= (E_max+C)/(C+EC₅₀)]에 기초한다.

이소형 음성 대조군 항체는 결합을 중화시키지 않았다. 200 mM로 시험된 양성 대조군 항체는 세포 결합 부착을 10-35% 감소시켰다. 항체 1444는 재조합 E-셀렉틴에 대한 인간 SCD 세포의 결합을 6.17 nM 및 18.66 nM의 추정 IC₅₀ 값 (평균 12.4 nM)으로 중화시켰다 (도 14). IC₂₀, IC₈₀ 및 IC₉₀ 값은 각각 3.1 nM, 49.6 nM 및 111.6 nM인 것으로 추정되었다. 가용성 E- 및 P-셀렉틴 단백질 코팅된 챔버를 사용한 유사한 생리학적 유동 조건 하의 P-셀렉틴 억제와 비교하여 E-셀렉틴 억제에서 더 큰 세포 부착 중화가 관찰되었다.

표 38. 항체 1444의 주요 약리학적 특성의 요약.

실시예 31: 최적화된 항-E-셀렉틴 항체 1444의 세포 표면 결합 (FACS) 및 중화.

E-셀렉틴은 내피 세포 표면 상에서 및 내피 세포 기능장애, 예컨대 염증 반응의 조건 하에서 발현되며, 순환 혈액 세포는 리간드-부착 분자 상호작용을 통해 혈관 내피에 부착된다. 세포 표면 발현된 E-셀렉틴에 결합하는 항체 1444의 능력을 평가하였다. 이들 연구에서, 막-결합된 인간 또는 시노몰구스 E-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포주를 사용하여 세포 표면 발현된 E-셀렉틴에 대한 항체 1444의 결합을 특징화하였다.

세포 표면 상에 E-셀렉틴 (인간 또는 시노몰구스 원숭이) 또는 인간 P-셀렉틴을 발현하는 CHO 세포 및 대조군 비-형질감염 CHO 세포 (CHO-DUKX)를 항체 1444, 이소형 대조군 IgG1 및 2개의 대조군 P-셀렉틴 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 평가하였다. 항체 1444는 인간 E-셀렉틴에 0.66 내지 2.33 nM의 추정 EC₅₀ (6회 실험에 기초함)으로 결합하였다. 항체 1444는 시노몰구스 E-셀렉틴에 0.75 내지 1.37 nM의 추정 EC₅₀ (6회 실험에 기초함)으로 결합하였다. 항체 1444는 대조군 CHO-DUKX에 결합하지 않았으며, 이는 검출가능한 세포 표면 결합의 부재를 나타낸다. 추가로, 항체 1444는 세포-표면 P-셀렉틴에 결합하지 않았다. CHO-P-셀렉틴 세포에 대한 대조군 항-P-셀렉틴 항체의 용량 의존성 결합이 관찰되었으며, 이는 P-셀렉틴의 발현을 나타낸다. 이소형 대조군 IgG1에서는 결합이 관찰되지 않았다 (표 38).

실시예 32: 시노몰구스 원숭이에서의 내약성 및 독성동태학 연구

시노몰구스 원숭이는 E-셀렉틴 결합 및/또는 생물학적 활성을 억제하는 항체 1444의 능력을 평가하기 위해 설계된 시험관내 약리학 연구에 기초한 유일한 약리학상 관련된 비임상 종이었다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 결합 친화도는, 마우스, 토끼 또는 래트로부터의 E-셀렉틴에 대한 강력한 결합의 부재와는 대조적으로, 평가된 검정에 걸쳐 유사하였다. 시험관내 기능적 검정에서, 항체 1444는 가용성 재조합 인간 E-셀렉틴 단백질 및 세포 발현된 재조합 인간 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 대한 인간 전골수구성 세포의 세포 부착을 용량-의존성으로 중화시켰다. 추가로, 항체1444는 인간 및 시노몰구스 원숭이 세포 E-셀렉틴 둘 다에 대한 정제된 호중구의 부착을 낮은 nM 범위의 추정 50% 억제 농도 (IC₅0) 값으로 중화시켰다. 30 mg/kg의 SC 용량은 353 μg/mL의 전체 최대 관찰 농도 (C_max) 및 92,500 μg·h/mL의 시간 0에서 336시간까지의 농도-시간 곡선하 면적 (AUC₃₃₆)과 연관된 반면; 100 mg/kg의 IV 용량은 693 μg/mL의 전체 C_max 및 108,000 μg·h/mL의 AUC₃₃₆과 연관되었다. 항체 1444를 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이에게 200 mg/kg/주 이하의 용량으로 1개월 동안 매주 1회 IV 투여하였으며, 이는 또한 내약성이 있었다. 시험관내 인간 보체 성분 1q (C1q) 및 결정화가능 단편 감마 Fc 수용체 (FcγR) 결합 검정 및 조직 교차 반응성 평가는 안전성 우려를 나타내지 않았다.

실시예 33: 동물에서의 약동학 및 생성물 대사

항체 1444의 IV 및/또는 SC 투여 후 시노몰구스 원숭이에서 단일-용량 PK 및 반복-용량 TK를 평가하였다. 시노몰구스 원숭이에서 단일 IV 투여 후에, 용량 의존성 클리어런스 (CL)가 관찰되었으며, 이는 포화가능한 표적 매개 약물 배치 (TMDD)와 일치하였다. 0.3 내지 10 mg/kg의 용량 범위의 단일 IV 투여 후에, 항체 1444는 각각 대략 0.39 내지 0.15 mL/h/kg 및 22 내지 36 mL/kg의 평균 CL 및 평균 V_SS를 나타냈다. 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 항체 1444의 단일 SC 용량 후에, T_max는 각각 72 및 96시간에 관찰되었고, SC 생체이용률은 >50%였다. 3 mg/kg IV의 항체 1444의 추정 T_1/2는 대략 12일이었다.

1-개월 GLP 반복-용량 독성 연구에서, 반복 SC 및 IV 투여 후 전신 노출에서 겉보기 성별-관련 차이는 없었다 (최대 관찰 농도[C_max] 및 농도-시간 곡선하 면적 [AUC]에 의해 평가 시). 전신 노출은 용량 (SC)이 증가함에 따라 증가하였고, 반복 SC 및 IV 투여 후에 더 높았다. 항체 1444를 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이에게 15 또는 50 mg/kg/주 SC 또는 200 mg/kg/주의 용량으로 1개월 동안 매주 1회 IV 투여하였다 (총 5회 용량). 15 및 50 mg/kg/주로 매주 1회 반복 투여한 후에, 평균 T_max는 제1일 및 제22일에 투여 후 72 내지 112시간이었다. 전신 노출은 15 (SC), 50 (SC) 및 200 (IV) mg/kg/주에 대해 각각 5.5, 3.2 및 1.9의 평균 축적 비 (AUC₁₆₈, 제22일/제1일)로, 반복 투여 후에 더 높았다.

인간에서 예측된 효과적인 용량은 항체 1444의 단일 SC 투여 150 mg이다. 150 mg SC 투여에서 예측된 최소 유효 농도 및 노출은 각각 평균 농도 (C_av [1 내지 168시간])에 대해 14 μg/mL 및 AUC₁₆₈에 대해 2400 μg·h/mL이다.

실시예 34: 동물에서의 E-셀렉틴 수준, 응집체 및 ICAM-1 발현

액체 크로마토그래피-질량-분광측정법 (LC-MS)에 의해 0.3 내지 10 mg/kg 범위의 항체 1444의 용량 후 시노몰구스 원숭이로부터의 혈청에서 가용성 E-셀렉틴을 특징화하였다. 항체 1444는 농도-의존성 방식으로 E-셀렉틴의 효과적인 결합을 나타냈고, 가용성 E-셀렉틴에 대한 >90% 억제 효과가 모든 용량 군에서 관찰되었으며, 이는 항체 1444의 생체내 E-셀렉틴 결합 활성을 나타낸다.

항체 1444를 투여한 후, 시노몰구스 원숭이로부터 혈액을 수집하고, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 이를 분석함으로써 세포 응집체 및 부착 마커를 검출하였다. 단핵구-혈소판 응집체 및 호중구-혈소판 응집체를 조사하였다. 이러한 FACS 분석에서, CD14를 사용하여 크기 스캔을 사용하여 단핵구 및 호중구를 분화시키고, CD41을 사용하여 단핵구-혈소판 응집체 및 호중구-혈소판 응집체를 검출하였다. 항체 1444는 처리 후 시노몰구스 원숭이에서 단핵구-혈소판 및 호중구-혈소판 응집체의 감소에 대한 효과를 나타냈다.

FACS 분석을 사용하여 항체 1444 투여 후 시노몰구스 원숭이로부터의 백혈구에서 백혈구 세포간 부착 분자 1 (ICAM-1) 발현을 조사하였다. 투여 후 ICAM-1의 감소가 관찰되었다.

ATCC

PTA-126529

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Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 166 gatatacaaa tgacacagag tccgagttcc ctatcagcga gcgtgggaga cagggttacc 60 ataacgtgta aagcatcgca gaatattgac aaatatctcg actggtatca acagaagccg 120 ggcaaagcac caaaactcct tatgtataac accaactctt tacatactgg cgtcccaagt 180 cgtttttcgg ggtctggcag cggcacagat tttacgctca ccattagttc gctgcagcca 240 gaagactttg ctacctactt ctgtctgcaa cataatagcg gctacacctt cggtcagggg 300 actaaagttg aaataaaa 318 <210> 167 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 167 gaagtccagc tgcagcagtc cggggctgag cttgggaaac ctgggacctc agtcaagttg 60 tcttgcaagg tttctggcta tagtattagg agtacctaca tgcactgggt gaatcagagg 120 cctggaaagg gcctggaatg ggtaggaagg attgatcctg caaatggaaa tacaatatat 180 gctgagaggt tcaaaaacaa ggccacactg actgcagata catcgtccaa cacagcctac 240 atgcaactca gccaactgaa atctgacgac acagcaatct atttttgtgc tgtggagatc 300 cttgggatct ttgattactg gggccaagga gtcatggtca cagtctcctc a 351 <210> 168 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Arg Asp Tyr Thr His Leu Val 35 40 45 Ala Ile Gln Asn Lys Glu Glu Ile Asn Tyr Leu Asn Ser Asn Leu Lys 50 55 60 His Ser Pro Ser Tyr Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Val Asn Asn Val 65 70 75 80 Trp Ile Trp Val Gly Thr Gly Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Gln Asn 85 90 95 Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Lys Gln Arg Asn Glu Asp Cys Val 100 105 110 Glu Ile Tyr Ile Gln Arg Thr Lys Asp Ser Gly Met Trp Asn Asp Glu 115 120 125 Arg Cys Asn Lys Lys Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ser Cys Thr 130 135 140 Asn Ala Ser Cys Ser Gly His Gly Glu Cys Ile Glu Thr Ile Asn Ser 145 150 155 160 Tyr Thr Cys Lys Cys His Pro Gly Phe Leu Gly Pro Asn Cys Glu Gln 165 170 175 Ala Val Thr Cys Lys Pro Gln Glu His Pro Asp Tyr Gly Ser Leu Asn 180 185 190 Cys Ser His Pro Phe Gly Pro Phe Ser Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Phe 195 200 205 Gly Cys Lys Arg Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Met Glu Thr Thr Val Arg 210 215 220 Cys Thr Ser Ser Gly Glu Trp Ser Ala Pro Ala Pro Ala Cys His Val 225 230 235 240 Val Glu Cys Glu Ala Leu Thr His Pro Ala His Gly Ile Arg Lys Cys 245 250 255 Ser Ser Asn Pro Gly Ser Tyr Pro Trp Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp 260 265 270 Cys Val Glu Gly Tyr Arg Arg Val Gly Ala Gln Asn Leu Gln Cys Thr 275 280 285 Ser Ser Gly Ile Trp Asp Asn Glu Thr Pro Ser Cys Lys Ala Val Thr 290 295 300 Cys Asp Ala Ile Pro Gln Pro Gln Asn Gly Phe Val Ser Cys Ser His 305 310 315 320 Ser Thr Ala Gly Glu Leu Ala Phe Lys Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys 325 330 335 Glu Gln Ser Phe Thr Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Glu Cys Ser Ala 340 345 350 Gln Gly Gln Trp Thr Pro Gln Ile Pro Val Cys Lys Ala Val Gln Cys 355 360 365 Glu Ala Leu Ser Ala Pro Gln Gln Gly Asn Met Lys Cys Leu Pro Ser 370 375 380 Ala Ser Gly Pro Phe Gln Asn Gly Ser Ser Cys Glu Phe Ser Cys Glu 385 390 395 400 Glu Gly Phe Glu Leu Lys Gly Ser Arg Arg Leu Gln Cys Gly Pro Arg 405 410 415 Gly Glu Trp Asp Ser Lys Lys Pro Thr Cys Ser Ala Val Lys Cys Asp 420 425 430 Asp Val Pro Arg Pro Gln Asn Gly Val Met Glu Cys Ala His Ala Thr 435 440 445 Thr Gly Glu Phe Thr Tyr Lys Ser Ser Cys Ala Phe Gln Cys Asn Glu 450 455 460 Gly Phe Ser Leu His Gly Ser Ala Gln Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly 465 470 475 480 Lys Trp Thr Gln Glu Val Pro Ser Cys Gln Val Val Gln Cys Pro Ser 485 490 495 Leu Asp Val Pro Gly Lys Met Asn Met Ser Cys Ser Gly Thr Ala Val 500 505 510 Phe Gly Thr Val Cys Glu Phe Thr Cys Pro Asp Asp Trp Thr Leu Asn 515 520 525 Gly Ser Ala Val Leu Thr Cys Gly Ala Thr Gly Arg Trp Ser Gly Met 530 535 540 Pro Pro Thr Cys Glu Ala Pro Val Ser Pro Thr Arg Pro Leu Val Val 545 550 555 560 Ala Leu Ser Ala Ala Gly Thr Ser Leu Leu Thr Ser Ser Ser Leu Leu 565 570 575 Tyr Leu Leu Met Arg Tyr Phe Arg Lys Lys Ala Lys Lys Phe Val Pro 580 585 590 Ala Ser Ser Cys Gln Ser Leu Gln Ser Phe Glu Asn Tyr His Val Pro 595 600 605 Ser Tyr Asn Val 610 <210> 199 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 199 Trp Tyr Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Leu Met Thr Tyr Asp Glu Ala Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Cys Gln Arg Asp Tyr Thr His Leu Val Ala Ile Gln Asn Lys 20 25 30 Glu Glu Ile Asn Tyr Leu Asn Ser Asn Leu Lys His Ser Pro Ser Tyr 35 40 45 Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Val Asn Asn Val Trp Ile Trp Val Gly 50 55 60 Thr Gly Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Gln Asn Trp Ala Pro Gly Glu 65 70 75 80 Pro Asn Asn Lys Gln Arg Asn Glu Asp Cys Val Glu Ile Tyr Ile Gln 85 90 95 Arg Thr Lys Asp Ser Gly Met Trp Asn Asp Glu Arg Cys Asn Lys Lys 100 105 110 Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ser Cys Thr Asn Ala Ser Cys Ser 115 120 125 Gly His Gly Glu Cys Ile Glu Thr Ile Asn Ser Tyr Thr Cys Lys Cys 130 135 140 His Pro Gly Phe Leu Gly Pro Asn Cys Glu Gln Ala Val 145 150 155 <210> 200 <211> 610 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 200 Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Lys Glu Ser Gly Ala Trp Ser Tyr Asn Thr Ser Thr Glu Ala Met Thr 20 25 30 Tyr Asp Glu Ala Ser Ala Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu Val 35 40 45 Ala Ile Gln Asn Lys Glu Glu Ile Glu Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Ser 50 55 60 Tyr Ser Pro Ser Tyr Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Val Asn Asn Val 65 70 75 80 Trp Val Trp Val Gly Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn 85 90 95 Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Arg Gln Lys Asp Glu Asp Cys Val 100 105 110 Glu Ile Tyr Ile Lys Arg Asp Lys Asp Val Gly Met Trp Asn Asp Glu 115 120 125 Arg Cys Ser Lys Lys Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ala Cys Thr 130 135 140 Asn Thr Ser Cys Ser Gly His Gly Glu Cys Val Glu Thr Ile Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Thr Cys Lys Cys Asp Pro Gly Phe Ser Gly Leu Glu Cys Glu Gln 165 170 175 Ile Val Asn Cys Thr Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Gly Ser Leu Val 180 185 190 Cys Ser His Pro Leu Gly Asn Phe Ser Tyr Ser Ser Ser Cys Ser Val 195 200 205 Ser Cys Asp Arg Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Val Glu Thr Thr Gln Cys 210 215 220 Met Ser Ser Gly Glu Trp Ser Val Pro Ile Pro Ala Cys Lys Val Val 225 230 235 240 Glu Cys Asp Ala Val Thr Asn Pro Ala Asn Gly Phe Val Glu Cys Phe 245 250 255 Gln Asn Pro Gly Ser Phe Pro Trp Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp Cys 260 265 270 Glu Glu Gly Phe Glu Leu Met Gly Ala Gln Ser Leu Gln Cys Thr Ser 275 280 285 Ser Gly Asn Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr Cys Lys Ala Val Thr Cys 290 295 300 Arg Ala Ile Arg Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Arg Cys Ser His Ser 305 310 315 320 Pro Ala Gly Glu Phe Thr Phe Lys Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys Glu 325 330 335 Glu Gly Phe Met Leu Gln Gly Ala Ala Gln Val Glu Cys Thr Thr Gln 340 345 350 Gly Gln Trp Thr Gln Gln Val Pro Val Cys Glu Ala Phe Gln Cys Thr 355 360 365 Ala Leu Ser Asn Pro Glu Arg Gly Tyr Met Asn Cys Leu Pro Ser Ala 370 375 380 Ser Gly Ser Phe Arg Asn Gly Ser Ser Cys Glu Phe Ser Cys Glu Gln 385 390 395 400 Gly Phe Val Leu Lys Gly Ser Lys Arg Leu Gln Cys Gly Pro Thr Gly 405 410 415 Glu Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr Cys Glu Ala Val Arg Cys Asp Ala 420 425 430 Val His Gln Pro Gln Arg Gly Leu Val Arg Cys Ala His Ser Pro Ile 435 440 445 Gly Glu Phe Thr Tyr Lys Ser Ser Cys Ala Phe Ser Cys Glu Glu Gly 450 455 460 Phe Glu Leu His Gly Ser Thr Gln Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly Gln 465 470 475 480 Trp Thr Glu Glu Val Pro Ser Cys Gln Val Val Lys Cys Ser Ser Leu 485 490 495 Ala Val Leu Glu Lys Ile Asn Met Ser Cys Ser Gly Glu Pro Val Phe 500 505 510 Gly Thr Val Cys Asn Phe Ala Cys Pro Glu Gly Trp Arg Leu Asn Gly 515 520 525 Ser Ala Ala Met Thr Cys Gly Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Met Leu 530 535 540 Pro Thr Cys Glu Ala Pro Thr Glu Ser Asn Thr Pro Leu Val Ala Gly 545 550 555 560 Leu Ser Ala Ala Gly Leu Ser Leu Leu Thr Leu Ala Pro Phe Leu Leu 565 570 575 Trp Leu Arg Lys Cys Phe Arg Lys Ala Lys Lys Phe Val Pro Ala Ser 580 585 590 Ser Cys Gln Ser Leu Glu Ser Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Pro Ser Tyr 595 600 605 Ile Leu 610 <210> 201 <211> 589 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 201 Trp Ser Tyr Asn Thr Ser Thr Glu Ala Met Thr Tyr Asp Glu Ala Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu Val Ala Ile Gln Asn Lys 20 25 30 Glu Glu Ile Glu Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Ser Tyr Ser Pro Ser Tyr 35 40 45 Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Val Asn Asn Val Trp Val Trp Val Gly 50 55 60 Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn Trp Ala Pro Gly Glu 65 70 75 80 Pro Asn Asn Arg Gln Lys Asp Glu Asp Cys Val Glu Ile Tyr Ile Lys 85 90 95 Arg Asp Lys Asp Val Gly Met Trp Asn Asp Glu Arg Cys Ser Lys Lys 100 105 110 Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ala Cys Thr Asn Thr Ser Cys Ser 115 120 125 Gly His Gly Glu Cys Val Glu Thr Ile Asn Asn Tyr Thr Cys Lys Cys 130 135 140 Asp Pro Gly Phe Ser Gly Leu Glu Cys Glu Gln Ile Val Asn Cys Thr 145 150 155 160 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Gly Ser Leu Val Cys Ser His Pro Leu 165 170 175 Gly Asn Phe Ser Tyr Ser Ser Ser Cys Ser Val Ser Cys Asp Arg Gly 180 185 190 Tyr Leu Pro Ser Ser Val Glu Thr Thr Gln Cys Met Ser Ser Gly Glu 195 200 205 Trp Ser Val Pro Ile Pro Ala Cys Lys Val Val Glu Cys Asp Ala Val 210 215 220 Thr Asn Pro Ala Asn Gly Phe Val Glu Cys Phe Gln Asn Pro Gly Ser 225 230 235 240 Phe Pro Trp Asn Thr Thr Cys Thr Phe Asp Cys Glu Glu Gly Phe Glu 245 250 255 Leu Met Gly Ala Gln Ser Leu Gln Cys Thr Ser Ser Gly Asn Trp Asp 260 265 270 Asn Glu Lys Pro Thr Cys Lys Ala Val Thr Cys Arg Ala Ile Arg Gln 275 280 285 Pro Gln Asn Gly Ser Val Arg Cys Ser His Ser Pro Ala Gly Glu Phe 290 295 300 Thr Phe Lys Ser Ser Cys Asn Phe Thr Cys Glu Glu Gly Phe Met Leu 305 310 315 320 Gln Gly Ala Ala Gln Val Glu Cys Thr Thr Gln Gly Gln Trp Thr Gln 325 330 335 Gln Val Pro Val Cys Glu Ala Phe Gln Cys Thr Ala Leu Ser Asn Pro 340 345 350 Glu Arg Gly Tyr Met Asn Cys Leu Pro Ser Ala Ser Gly Ser Phe Arg 355 360 365 Asn Gly Ser Ser Cys Glu Phe Ser Cys Glu Gln Gly Phe Val Leu Lys 370 375 380 Gly Ser Lys Arg Leu Gln Cys Gly Pro Thr Gly Glu Trp Asp Asn Glu 385 390 395 400 Lys Pro Thr Cys Glu Ala Val Arg Cys Asp Ala Val His Gln Pro Gln 405 410 415 Arg Gly Leu Val Arg Cys Ala His Ser Pro Ile Gly Glu Phe Thr Tyr 420 425 430 Lys Ser Ser Cys Ala Phe Ser Cys Glu Glu Gly Phe Glu Leu His Gly 435 440 445 Ser Thr Gln Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly Gln Trp Thr Glu Glu Val 450 455 460 Pro Ser Cys Gln Val Val Lys Cys Ser Ser Leu Ala Val Leu Glu Lys 465 470 475 480 Ile Asn Met Ser Cys Ser Gly Glu Pro Val Phe Gly Thr Val Cys Asn 485 490 495 Phe Ala Cys Pro Glu Gly Trp Arg Leu Asn Gly Ser Ala Ala Met Thr 500 505 510 Cys Gly Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Met Leu Pro Thr Cys Glu Ala 515 520 525 Pro Thr Glu Ser Asn Thr Pro Leu Val Ala Gly Leu Ser Ala Ala Gly 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Thr Leu Ala Pro Phe Leu Leu Trp Leu Arg Lys Cys 545 550 555 560 Phe Arg Lys Ala Lys Lys Phe Val Pro Ala Ser Ser Cys Gln Ser Leu 565 570 575 Glu Ser Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Pro Ser Tyr Ile Leu 580 585 <210> 202 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 202 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 203 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 203 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 204 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 204 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 205 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 205 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 206 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 206 gaagtgcagc ttgtggaatc cgggggcggc ttggtccaac cgggtggcag cctccgtctg 60 tcgtgcgcgg cttcgggcta tgccatccgt tctgcctaca tgcactgggt tcgccaggcg 120 cctgggaagg gcctggaatg ggtggccagg attgatcctg caaacggaaa tactatatat 180 gtggactccg tgaccggccg ctttacaatc agcgccgaca acgctaagaa ttccgcctac 240 ctgcaaatga atagcctgcg ggcagaggat accgcggtgt actattgtgc catggattta 300 tattccacgt ctgaatattg gggccaagga accctggtaa cggtgtcgtc ggcgtcgacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgctggggc accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ccccggga 1338

Claims

(a) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR-1), 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-2, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR-3, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR-1), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-2 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR-3;
(b) 서열식별번호: 2, 18, 47, 68, 82, 97 및 106의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR-1 아미노산 서열;
(c) 서열식별번호: 3, 19, 48, 69, 83, 98, 107 및 120의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR-2 아미노산 서열;
(d) 서열식별번호: 4, 20, 49, 70, 84, 99, 108 및 121의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR-3 아미노산 서열;
(e) 서열식별번호: 8, 23, 52, 63, 77, 92, 111 및 125의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR-1) 아미노산 서열;
(f) 서열식별번호: 9, 24, 29, 38, 41, 44, 53, 64, 78, 93, 112 및 126의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR-2 아미노산 서열;
(g) 서열식별번호: 10, 54, 65, 79, 94, 113 및 127의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR-3 아미노산 서열;
(h) 서열식별번호: 11의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 아미노산 서열 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 아미노산 서열;
(i) ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3 아미노산 서열 및 ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3 아미노산 서열;
(j) 서열식별번호: 11, 25, 30, 35, 39, 42, 45, 55, 60, 66, 75, 80, 90, 95, 104, 114, 118 및 128의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 5, 21, 27, 32, 50, 57, 71, 73, 85, 87, 100, 102, 109, 116 및 122의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL);
(k) 서열식별번호: 11의 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 5의 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL);
(l) 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(m) ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(n) 서열식별번호: 7, 13, 22, 28, 34, 37, 40, 43, 51, 59, 62, 74, 76, 89, 91, 103, 110, 117 및 124의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 1, 17, 26, 31, 46, 56, 67, 72, 81, 86, 96, 101, 105, 115 및 119의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (LC);
(o) 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13의 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 1의 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LC;
(p) 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 LC; 및
(q) ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 ATCC에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 LC
중 적어도 1개를 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
서열식별번호: 5의 아미노산 서열에 의해 명시된 바와 같은 LCDR-1, LCDR-2 및 LCDR-3을 포함하는 아미노산 서열; 및
서열식별번호: 11의 아미노산 서열에 의해 명시된 바와 같은 HCDR-1, HCDR-2 및 HCDR-3을 포함하는 아미노산 서열
을 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
제2항에 있어서, 서열식별번호: 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 불변 영역 (CH) 및 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 단리된 항체.
서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 LC 및 서열식별번호: 7 또는 13의 아미노산 서열로 이루어진 HC를 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
a) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 VL 영역;
서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 항체 VH 영역;
서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 항체 CL 영역; 및
서열식별번호: 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 (CH) 불변 영역;
b) 서열식별번호: 5에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 영역; 및 서열식별번호: 11에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역; 및
c) 서열식별번호: 1에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC 영역 및 서열식별번호: 7 또는 13에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC
중 적어도 1개를 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC 및 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 삽입물에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC를 포함하는, 인간 E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, IgA₁, IgA₂, IgD, IgE, IgM, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄의 Fc 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Fc 도메인; 및/또는 카파 또는 람다로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 중쇄 이소형이 IgG1이고/거나 경쇄 불변 영역이 카파 경쇄인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간화 항체, 인간 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 낙타류 항체인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 약 200 nM, 175 nM, 150 nM, 125 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900pM, 800pM, 700pM, 600pM 및 500pM로 이루어진 군으로부터 선택된 값 또는 그 미만의 K_D로 결합하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
인간 또는 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 약 200 nM 내지 약 2 nM의 K_D로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며,
(i) 임의로 SPR에 의해 측정 시, 인간 E-셀렉틴에 200 nM 이하의 K_D로 결합함;
(ii) 임의로 SPR에 의해 측정 시, 시노몰구스 원숭이 E-셀렉틴에 200 nM 이하의 K_D로 결합함;
(iii) 임의로 FAC에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 E-셀렉틴에 50 nM 이하의 EC₅₀으로 결합함;
(iv) 임의로 FACS에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 P-셀렉틴에 350 nM 이상의 EC₅₀으로 결합함;
(v) 임의로 SPR에 의해 측정 시, 405 nM까지 가용성 래트, 마우스 또는 토끼 E-셀렉틴 또는 가용성 인간 L- 또는 P-셀렉틴에 검출가능하게 결합하지 않음;
(vi) 임의로 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 2 nM 이하의 EC₅₀으로 결합함;
(vii) 임의로 알파리사(AlphaLisa) 경쟁 검정에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 2 nM 이하의 EC₅₀으로 중화시킴;
(viii) 인간 혈청 중 유리 가용성 인간 E-셀렉틴에 약 1 nM 내지 약 3 nM의 IC₅₀으로 결합함;
(ix) 임의로 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 100 nM 이하의 IC₅₀으로 중화시킴;
(x) 임의로 정적 조건 하의 경쟁 ELISA에 의해 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 시알릴-루이스 A 리간드의 결합을 50 nM 이하의 IC₅₀으로 중화시킴;
(xi) 임의로 정적 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 100 nM 이하의 IC₅₀으로 억제함;
(xii) 임의로 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 세포-표면 발현된 인간 E-셀렉틴에 대한 E-셀렉틴 리간드 (예를 들어, E 셀렉틴 리간드, PSGL-1 및 다른 시알릴 루이스 리간드)를 발현하는 세포의 부착을 100 nM 이하의 IC₅₀으로 억제함;
(xiii) 임의로 생리학적 유동 조건 하에 측정 시, 가용성 인간 E-셀렉틴에 대한 SCD 환자로부터의 혈액 세포의 부착을 약 6.17 nM 내지 약 18.66 nM의 IC₅₀으로 억제함;
(xiv) 인간 E-셀렉틴의 T7, E8, A9, M10, T11, P46, S47, Y48, N82, N83, Q85, E88, E92, Y94, R97, N105, E107, R108, S110, K111, K112 및 K113으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 잔기에 결합함;
(xv) 10 mg/kg의 용량으로의 IV 투여 후 약 14.4일 (345시간)의 평균 반감기를 가짐;
(xvi) 약 3 mg/kg의 용량으로의 SC 투여 후 약 21.5일 (518시간)의 평균 반감기를 가짐;
(xvii) 임의로 안톤 파르(Anton Parr) 방법에 의해 25℃에서 측정 시, 185.7 mg/mL에서 33.4 cP의 점도를 가짐;
(xviii) 고도의 열 안정성 및 고농도에서의 최소 응집을 포함한, 상업적으로 적합한 제제화 특성을 나타냄; 및
(xix) 대규모 제조 조건 하에 재현가능한 발현 및 순도를 나타냄
으로부터 선택된 적어도 1종의 검출가능한 특징을 나타내는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
인간 E-셀렉틴에의 결합에 대해 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 적어도 1종의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
a) 서열식별번호: 136의 핵산 서열, 서열식별번호: 137의 핵산 서열 또는 둘 다;
b) 서열식별번호: 136, 144, 146, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171 및 173의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열 또는 서열식별번호: 137, 145, 147, 149, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172 및 174의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열 또는 둘 다;
c) 서열식별번호: 206 또는 138의 핵산 서열, 서열식별번호: 139의 핵산 서열 또는 둘 다; 및
d) ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126529를 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열, ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-126530을 갖는 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열 또는 둘 다
중 적어도 1개를 포함하는 단리된 핵산 분자.
제14항 또는 제15항의 핵산을 포함하는 벡터.
제16항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제17항에 있어서, CHO 세포, COS 세포, HEK-293 세포, NS0 세포, PER.C6® 세포 또는 Sp2.0 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포인 숙주 세포.
제17항 또는 제18항의 숙주 세포를 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
제20항에 있어서, i) 서열식별번호: 7의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 항체 중쇄 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 항체 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, ii) 서열식별번호: 13의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 항체 중쇄 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 항체 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 iii) 둘 다를 포함하는 제약 조성물.
E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, E-셀렉틴의 발현 및/또는 리간드에 대한 E-셀렉틴의 결합에 의해 매개되거나 그와 연관된 의학적 상태, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이러한 의학적 상태, 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
제22항에 있어서, 의학적 상태, 질환 또는 장애가 SCD, 피부 질환 (예를 들어, 건선), 염증성 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염) 및/또는 당뇨병의 합병증인 방법.
E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하고, 심흉계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 만성 제한성 폐 질환, 좌심실 확장기 질환, 폐고혈압, 급성 흉부 증후군, 부정맥, 돌연사, 혈관-폐쇄성 발증 (VOC)), 신경계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 출혈성 졸중, 정맥동 혈전증, 뇌의 침묵 뇌경색, 만성 통증, 뇌의 급성 허혈성 졸중, 증식성 망막병증, 안와 경색, 인지 장애), 세망내피계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 비장 격리, 기능적 비장기능저하증, 빈혈, 용혈), 근골격계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 무혈관성 괴사, 피부 궤양화), 비뇨생식기계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 유두상 괴사, 단백뇨, 신부전, 혈뇨, 야간 야뇨증, 지속발기증) 및 위장계에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 담석증, 담관병증, 간병증, 장간막 혈관-폐쇄)으로 이루어진 군으로부터 선택된 SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료, 예방 및/또는 호전시키는 것을 포함하는, SCD의 치료를 필요로 하는 대상체에서 SCD를 치료하는 방법.
제24항에 있어서, VOC의 치료가 i) VOC의 지속기간 및/또는 강도를 감소시키는 것에 의한 급성 VOC의 치료, ii) VOC의 예방 또는 발생의 감소 또는 iii) 둘 다를 포함하는 것인 SCD를 치료하는 방법.
E-셀렉틴에 특이적으로 결합하는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, E-셀렉틴 생물학적 활성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 E-셀렉틴 생물학적 활성을 감소시키는 방법.
제26항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 적어도 1종의 검출가능한 E-셀렉틴 생물학적 활성을 감소시키며, 여기서 감소된 활성은 (a) 내피 세포에 대한 백혈구 테더링; (b) 내피 세포에 대한 안정한 부착의 활성화; (c) 정지하기 위한 백혈구의 느린 롤링; (d) 백혈구의 효율적인 경내피 이동; (e) CD18 인테그린에 대한 E-셀렉틴의 친화도 및 결합력; (f) 급성 염증 부위로의 백혈구의 트래픽킹; (g) 시토졸 칼슘; (h) p38 MAP 키나제 및 Syk 키나제를 활성화시키는 티로신 인산화; (i) 혈액으로부터 혈관 내피로의 혈소판 및 백혈구의 동원; 및 (j) 염증유발 환경의 생성으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 적어도 1종의 추가의 치료 활성 화합물 또는 치료 양식의 치료 유효량의 투여를 포함하는 방법.
제28항에 있어서, 적어도 1종의 추가의 치료 활성 화합물이 페니실린 예방제, 히드록시우레아 (드록시아(DROXIA), 히드레아(HYDREA)), L-글루타민 (엔다리(ENDARI)), 크리잔리주맙 (아다크베오(ADAKVEO)), 복셀로터 (옥스브리타(OXBRYTA)), 아픽사반 (엘리퀴스(ELIQUIS)), 리바록사반 (자렐토(XARELTO)), 비-스테로이드성 항염증 약물, 진통제 (예를 들어, 오피오이드 진통제), IW-1701, 리오시구아트 (아뎀파스(ADEMPAS)), 티카그렐로르 (브릴린타(BRILINT)A), 메만틴 (나멘다(NAMENDA)) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제28항에 있어서, 적어도 1종의 추가의 치료 활성 화합물이 항-P-셀렉틴 항체, HbS를 그의 R 상태 (즉, 산소화)로 유지하도록 조정하는 화합물, HbS의 산소 친화도를 조정하는 화합물, 2,3-디스포스포글리세르산의 생성을 조정함으로써 HbS 중합을 표적화하는 화합물, 태아성 헤모글로빈 (HbF)의 발현을 유도함으로써 HbS 중합을 표적화하는 화합물, 기능장애성 세포 부착, 혈관 기능장애 및/또는 염증을 표적화하는 화합물, 혈액 중 산화질소 (NO)의 수준을 화합물의 투여 전 NO의 수준과 비교하여 증가시키는 화합물, 정맥내 IG, 응고항진을 표적화하는 화합물, NMDA 수용체 결합을 차단하는 화합물 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제30항에 있어서, HbS를 그의 R 상태 (즉, 산소화)로 유지하도록 조정하는 화합물이 6-{(1S)-1-[(2-아미노-6-플루오로퀴놀린-3-일)옥시]에틸}-5-(1H-피라졸-1-일)피리딘-2-올, (S)-6-(1-((2-아미노-6-플루오로퀴놀린-3-일)옥시)에틸)-5-(1H-피라졸-1-일)피리딘-2(1H)-온 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제28항에 있어서, 적어도 1종의 추가의 치료 활성 치료 양식이 보충 산소, 임의로 철 킬레이트화를 동반한 수혈, 골수 이식, 유전자 요법, CRISPR에 의한 유전자 편집 요법 또는 아연 핑거 기술 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 적어도 1종의 추가의 치료 활성 화합물 또는 치료 양식의 투여가 치료 유효량의 항-E-셀렉틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여와 동시, 순차 또는 별개인 방법.
치료 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항-E-셀렉틴 항체를 포함하는, SCD의 치료를 위한 키트.
제34항에 있어서, SCD의 적어도 1종의 징후 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 적어도 1종의 추가의 치료 활성 화합물 또는 치료 양식의 상승작용적 치료 유효량을 추가로 포함하는 키트.
제1항 내지 제13항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, E-셀렉틴 발현 및/또는 리간드에 대한 E-셀렉틴 결합과 연관되거나 그에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태를 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.
제36항에 있어서, 질환, 장애 또는 상태가 SCD인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.
E-셀렉틴 발현 및/또는 리간드에 대한 E-셀렉틴 결합과 연관되거나 그에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도.
제38항에 있어서, 질환, 장애 또는 상태가 SCD인 용도.
제1항 내지 제13항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, SCD의 치료를 위해, E-셀렉틴 활성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 E-셀렉틴 활성을 감소시키는 데 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.