KR20220108747A - 신규한 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 뛰어난 신규한 결합 분자 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 결합 분자 및 이의 용도{Novel binding molecule and use thereof}
본 발명은 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 뛰어난 신규한 결합 분자 및 이의 용도에 관한 것이다.
뇌졸중, 치매, 알츠하이머병 등의 퇴행성 뇌신경질환에서 기억력, 주의력, 인지능력, 감정조절 등의 저하가 관찰되며 이는 신경세포의 사멸 및 신경 분지의 위축에 의한 결과이다. 신경세포의 신경분지의 신장은 신경가소성을 증대함으로써 신경회로의 기억, 학습 기능에 중요한 역할을 하고 있다. 이에 신경세포의 신경분지 신장과 신경 재생을 촉진하는 유효성분은 퇴행성 뇌신경 질환의 새로운 치료제로 개발 가능성이 있다고 예측된다.
노령화 인구가 급증함에 따라 퇴행성 뇌신경계 질환의 발병 추세도 증가추세에 있으며 의학의 혁신적인 발전에도 불구하고 아직 퇴행성 뇌신경계 질환에 대한 예방법과 치료법이 분명치 않고 결정적인 효과를 가진 약제를 발견하지 못하고 있는 실정이다. 현재 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제와 치료법이 개발되고 있지만 장기 복용에 따른 부작용 및 독성을 나타내는 경우가 많고, 치료보다는 증상을 경감시키는 효과만 있기 때문에 부작용 및 독성을 감소하고 치료할 수 있는 소재의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 조절 T 세포(Regulatory T cell; Treg)의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질에 대한 결합능이 뛰어나며, 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 뛰어난 결합 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체-약물 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 결합 분자를 포함하는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체-약물 결합체를 유효 성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체(CAR)를 유효 성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 결합 분자를 포함하는 뇌신경계 질환의 진단용 조성물과 진단용 키트, 그리고 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 조절 T 세포(regulatory T cells, Treg cells)에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 "결합 분자"는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로블린, 예를 들면 인플루엔자 A 바이러스의 단량체 HA 또는 삼량체 HA와의 결합을 위해 온전한(intact) 이뮤노글로블린과 경쟁하는 이뮤노글로블린 단편을 포함하는 가변성 도메인을 뜻한다. 구조와는 상관없이 항원-결합 단편은 온전한(intact) 이뮤노글로블린에 의해 인식된 동일한 항원과 결합된다. 항원-결합 단편은 결합 분자의 아미노산 서열의 2개 이상의 연속기, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기, 30개 이상의 연속 아미노산 잔기, 35개 이상의 연속 아미노산 잔기, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기, 175개 이상 연속 아미노산 잔기, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. "항원-결합 단편"은 특히 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가(bivalent) 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디, 테트라바디, 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로브린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함한다. 상기 단편은 합성으로 또는 완전한 이뮤노글로블린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 생성될 수 있다. 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서, 상기 "Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질" 은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 1091개의 아미노산으로 이루어진 막관통 단백질로서, 세포 외 혹은 루멘 쪽의 루신 반복 서열(leucine-rich repeat(LRR))과 세개의 면역체 유사 도메인(immunoglobulin-like domains), 세포막 관통 서열 및 세포질 꼬리부분으로 구성되어 있다. LRIG 유전자 패밀리는 LRIG1, LRIG2와 LRIG3이 존재하며, 이들 간의 아미노산들은 매우 보전적으로 구성되어 있다. 상기 LRIG1 유전자는 정상 피부에서 높게 발현하고 있으며, 기저와 모낭 세포에 발현하여 상피 줄기세포의 증식을 조절할 수 있다. 따라서, 표피의 항상성 유지에 중요한 역할을 하며, 부존재시 건선이나 피부암으로 발전할 수 있다. LRIG1이 위치한 염색체 3p14.3 부분이 잘리는 경우에는 암세포로 발전할 가능성이 있는 것으로 보고된 바 있으며, 실제로 신장암(renal cell carcinoma)과 편평상피암(cutaneous squamous cell carcinoma)에서는 LRIG1의 발현이 매우 감소되어 있는 것으로 확인되었다. 그런데 최근에는 상기 Lrig-1을 발현하는 암은 20~30% 정도에 불과하다고 밝혀지기도 하였다. 한편, 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질은 인간 또는 쥐에 존재하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 Lrig-1 단백질은 인간 유래인 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드이거나, 마우스 유래인 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시되는 Lrig-1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 3으로 표시되는 Lrig-1 단백질은 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 결합 분자는,
서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서, 상기 결합 분자는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는,
서열번호 13으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 CDR1; 서열번호 14로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 CDR2; 서열번호 15로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 16으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 CDR1; 서열번호 17로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 CDR2; 서열번호 18로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서, 상기 결합 분자는 서열번호 19로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 20으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는 Fc 영역(Fragment crystallization region) 또는 불변 영역(constant region)을 더 포함할 수 있다. 이때 상기 Fc 영역은 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역이거나, 그로부터 유래된 것일 수 있고, 혹은 하이브리드 Fc(hybrid Fc) 영역일 수 있다.
본 발명에서 상기 Fc 영역은 포유동물 유래 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역일 수 있고, 바람직하게는 인간 유래 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 21로 표시되는 마우스 유래 IgG2a 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 22로 표시되는 마우스 유래 면역글로불린 카파(kappa) 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 23 또는 24로 표시되는 인간 유래 IgG1 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 25 또는 26으로 표시되는 인간 유래 면역글로불린 카파(kappa) 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 27로 표시되는 인간 유래 IgG2 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 28로 표시되는 인간 유래 IgG3 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 29로 표시되는 인간 유래 IgG4 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 30으로 표시되는 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 31로 표시되는 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Fc 영역은 인간 유래 면역글로불린 람다(lambda) 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "하이브리드 Fc"는 인간 IgG 서브클래스의 조합 또는 인간 IgD 및 IgG의 조합으로부터 유도될 수 있다. 상기 하이브리드 Fc는 생물학적 활성 분자, 폴리펩티드 등에 결합하는 경우, 생물학적 활성 분자의 혈청 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 Fc-폴리펩타이드 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드가 발현될 때 폴리펩타이드의 발현 수준을 높이는 효과가 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 하이브리드 Fc 영역은 서열번호 32로 표시되는 하이브리드 Fc 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 결합 분자에서 상기 Fc 또는 불변 영역은 상기 가변 영역에 링커(linker)로 연결될 수 있다. 이때 상기 Fc 또는 불변 영역의 C-말단에 링커가 연결되며, 상기 링커에 본 발명의 결합 분자의 N-말단이 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "링커(linker)"는 목적하는 질환의 조직 또는 세포 내에서 과발현되는 효소에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기와 같이 과발현되는 효소에 의해 절단될 수 있는 경우에는 Fc 또는 불변 영역으로 인하여 폴리펩티드의 활성이 저하되는 것을 효과적으로 방지할 수 있다. 본 발명에서는 링커의 바람직한 예로, 혈액 내에 가장 많이 존재하는 인간 알부민의 282번 내지 314번째 부분에 위치한 33개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커, 보다 바람직하게는 292번 내지 304번째 부분에 위치한 13개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커일 수 있으며, 이러한 부분은 3차원적인 구조상 대부분 외부에 노출된 부분으로서 체내에서 면역반응을 유도할 가능성이 최소화된 부분이다. 단, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 결합 분자는, 서열번호 21, 23, 24, 27, 28, 29, 30 및 32로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는, 서열번호 22, 25, 26 및 31로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 23, 24, 27, 28, 29 및 30으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변 영역; 및
서열번호 25, 26 및 31로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 33 또는 35로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 중쇄 불변 영역; 및
서열번호 34 또는 36으로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 서열번호 37 또는 38로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열번호 39 또는 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 서열번호 41 또는 43으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 서열번호 42 또는 44로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 서열번호 41로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 서열번호 42로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 서열번호 43으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 서열번호 44로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 항체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항체는 단일클론항체(monoclonal antibody), 전장 항체 (full-length antibody) 또는 항체의 일부분으로서 Lrig-1 단백질에 결합할 능력을 가지며 본 발명의 결합 분자와 경쟁적으로 Lrig-1 항원 결정 부위에 결합할 수 있는 항체 단편 모두를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로블린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항원은 조절 T 세포(regulatory T cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질일 수 있다. 바람직하게는 상기 Lrig-1 단백질의 류신 리치 구역(Leucine Rich Region) 또는 면역글로블린 유사 도메인을 특이적으로 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 "면역글로불린"은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(Framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(Epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
또한, 본 발명에서 상기 "단일클론항체"는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 일컫는 말로, 특정 항원 결정기(Epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명에서 상기 "전장 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(Disulfide) 결합으로 연결되어 있으며, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG를 포함한다. 상기 IgG는 그 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
또한, 본 발명에서 상기 "항체의 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. 또한, Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(Variable fragment)는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 다이설파이드 결합으로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 상기 항체 단편은 단백질 가수분해 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신을 이용하는 경우 Fab 또는 F(ab')2의 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 유니바디(unibody) 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 또는 이의 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 "키메라 항체"는, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
또한, 본 발명에서 상기 "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고, 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있고, 그 외의 다른 단백질에도 결합할 수 있는 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편으로도 제공될 수 있다.
본 발명에서 상기 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따르는 결합 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 일 예시로, 상기 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 본 발명에 따르는 결합 분자를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 결합 분자인 항원 결합 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함한다. 여기서, 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 Lrig-1 단백질 이외의 다른 단백질로, 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, PD-1 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 임의의 적합한 포맷으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편은 이중특이적 항체 접합체(예: IgG2, F(ab')2 또는 CovX-바디), 이중특이적 IgG 또는 IgG-형 분자(예: IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, 또는 2 인(in) 1-IgG, mAb2, 또는 Tandemab common LC), 비대칭성 이중특이적 IgG 또는 IgG-형 분자(예: kih IgG, kih IgG common LC, CrossMab, kih IgG-scFab, mAb-Fv, 전하쌍 또는 SEED-바디), 소형 이중특이적 항체 분자(예: 디아바디(Db), dsDb, DART, scDb, tandAbs, 탠덤 scFv (taFv), 탠덤 dAb/VHH, 트리플 바디, 트리플 헤드, Fab-scFv, 또는 F(ab')2-scFv2), 이중특이적 Fc 및 CH3 융합 단백질(예: taFv-Fc, 디-디아바디, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc, 또는 scFv-kih-CH3), 또는 이중특이적 융합 단백질(예: scFv2-알부민, scDb-알부민, taFv-독소, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-사이토카인2)일 수 있다. 당업자는 본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편을 설계하고 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 이중특이적 항체를 생산하는 방법은 환원성 디설파이드 또는 비환원성 티오에테르 결합과 항체 또는 항체 단편의 화학적 가교결합을 포함한다. 예를 들면, N-석신이미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)는 디설파이드 연결된 이중특이적 F(ab)2 헤테로다이머를 생성하기 위해, 예를 들면, 힌지 영역 SH- 그룹을 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교결합시키는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 이중특이적 항체를 생산하기 위한 다른 방법은 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 쿼드로마 세포를 생성하기 위해 항체-생산 하이브리도마를, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 융합시킴을 포함한다.
본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 또한, 예를 들면, 항원 결합 분자를 위한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 작제물로부터 발현에 의해 재조합으로 생산될 수 있다.
예를 들면, 2개의 항원 결합 도메인(즉, PD-1 등에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하고, 항원 결합 도메인 사이의 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물은 분자 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 이중특이적 항체는 이후 적합한 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포) 중에서 작제물의 발현(예: 시험관내)에 의해 생산될 수 있고, 이어서 발현된 재조합 이중특이적 항체는 임의로 정제될 수 있다.
항체는, 비변형된 부모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된 변형된 항체가 생성되는 친화도 성숙 공정에 의해 생성될 수 있다. 친화도 성숙 항체는 당해 기술 분야에 공지된 절차로 생산될 수 있다.
아울러, 본 발명에서 제공하는 결합 분자는, Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글라이신 및 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 수행할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Gln/Glu 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 결합 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명에서 용어 "실질적인 동일성"이란, 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 병렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 병렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 이 링크에서 접속 가능하다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 온라인(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html)을 통해 확인할 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자, 바람직하게 상기 항체는, 항체를 생산하는 통상의 방법에 의해 생성될 수 있지만, 친화도 성숙(Affinity maturation)에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서 상기 "친화도 성숙(Affinity maturation)"은, 활성화된 B 세포가 면역 반응 과정에서 항원에 대한 친화도가 증가된 항체를 생산하는 과정을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 친화도 성숙은 자연에서 일어나는 과정과 동일하게, 돌연변이와 선택의 원리에 기초하여 친화도 성숙으로 인해 생성된 항체 또는 항체 단편을 생성할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 결합 분자, 바람직하게 항체는 뇌신경계 질환으로 특히, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 결합 분자의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
본 발명의 핵산 분자는 서열번호 41 또는 43으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 서열번호 42 또는 44로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 서열번호 41로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 서열번호 42로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 서열번호 43으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 서열번호 44로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 단리된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자를 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 발현 벡터가 형질 전환된 숙주 세포주를 제공한다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩티드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩티드(들)로 체내에서 형질주입된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포주로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 항체 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 제공한다.
본 발명에서 상기 "항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)"란, 항체와 약물의 생물학적 활성을 저하시키지 않으면서 약물과 항체를 화학적으로 연결한 형태를 지칭한다. 본 발명에서 상기 항체-약물 결합체는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단의 아미노산 잔기에 약물이 결합된 형태, 구체적으로는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단, α-아민기에 약물이 결합된 형태를 말한다.
본 발명에서 상기 "약물"은 세포에 특정 생물학적 활성을 가지는 임의의 물질을 의미할 수 있으며, 이는 DNA, RNA 또는 펩타이드(Peptide)를 포함하는 개념이다. 상기 약물은 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 형태일 수 있으며, α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 링커가 연결되어 있는 형태 역시 포함한다.
본 발명에서 상기 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기의 예로는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있다면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 아민기와 반응하는 종류를 모두 포함한다. 그 예로 아이소티오시아네이트(Isothiocyanate), 아이소시아네이트(Isocyanates), 아실 아자이드(Acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(Sulfonyl chloride), 알데하이드(Aldehyde), 글리옥살(Glyoxal), 에폭사이드(Epoxide), 옥시레인(Oxirane), 칼보네이트(Carbonate), 아릴 할라이드(Aryl halide), 이미도에스터(Imidoester), 카보이미드(Carbodiimide), 안하이드라이드(Anhydride) 및 플루오로페닐 에스터(Fluorophenyl ester) 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 약물은 뇌신경계 질환으로, 특히 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 치료할 수 있는 약물이라면 그 종류에 관계없이 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 항원 특이적 결합 도메인, 연결 도메인 및 CD3 제타(ζ) 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor: CAR)를 유효 성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"이란 세포외 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 조작된 수용체를 의미한다. CAR의 가장 흔한 유형이 CD3 제타(ζ) 사슬과 같은 T 세포 동시수용체의 막통과 및 세포내 도메인에 융합된 단일 클론 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하지만, 본 명세서에 기재된 본 발명은 이들 도메인으로 제한되지 않는다. 오히려, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 임의의 세포 내 신호전달 분자를 발현하도록 조작된 임의의 수용체 및 이들에 융합되거나 연결된 세포외 항원 결합 도메인을 의미한다. 본 발명에서 상기 결합 도메인은 Lrig-1 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 단쇄 가변 단편(scFv)를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 "단쇄 가변 단편" 또는 "scFv"란, VL과 VH 사이의 펩타이드 링커에 의한, 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 융합 단백질을 의미한다.
또한, 본 발명에서 상기 VH 도메인과 VL 도메인은 가요성 링커를 통해 연결될 수 있다. 본 발명에서 상기 가요성 링커는 약 10개 내지 30개의 아미노산(예를 들어, 30개, 25개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 또는 5개의 아미노산)의 글라이신/세린 링커일 수 있고, 바람직하게는 15개의 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명에서 상기 링커 길이는 키메라 항원 수용체의 중요한 결정부위로 작용할 수 있어, 상기 범위보다 더 짧은 링커는 친화도를 증대시킬 수 있지만, 또한 세포내 다합체 형성을 발생시켜 CAR의 발현을 손상시킬 수 있는 반면, 상기 범위보다 더 긴 링커는 VL 및 VH CDR을 공간상 더 멀리 이동시킴으로써 항원 친화도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 힌지 영역 (또는 스페이서) 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 힌지 영역은 항원 결합 도메인과 막통과 도메인을 연결하는 부분으로 '스페이서'라고도 불리우는데, T 세포막 또는 NK 세포막으로부터 항원 결합 도메인을 확장하기 위한 목적을 갖는다. 본 발명에서 상기 힌지 영역은 예를 들어 인간 또는 그의 일부를 포함하는 임의의 속으로부터의 임의의 적합한 서열로부터 얻어질 수 있으며, 혹은 본 기술분야에서 통상적으로 사용하는 CD8, CD28, 4-1BB, OX40, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함한 인간 단백질의 힌지 영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기 힌지 영역은 면역글로불린에 제한하지 않으면서 면역글로불린 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD)으로부터 선택되는 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 T 세포 내부에서 발견되거나 발견되도록 조작된 키메라 항원 수용체의 부분을 의미한다. 본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 T 세포의 혈장 막에서 키메라 항원 수용체를 고정하는 역할을 하는 막통과 도메인을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에서 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인은 동일한 단백질(예를 들어, CD3 제타(ζ) 분자)로부터 유래할 수 있고, 혹은 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인은 상이한 단백질(예를 들어, CD28의 막관통 도메인 및 CD3 제타(ζ) 분자의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 그 반대)로부터 유래할 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인으로는, 예를 들면 T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 상기 보조자극 도메인은 4-1BB (CD137); OX40; CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; 자연살해 그룹 2 멤버 C (NKG2C); 자연살해 그룹 2 멤버 (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; LFA-1 (CD11a/CD18) 또는 ICOS에 결합하는 리간드; 이들의 활성 단편; 이들의 기능 유도체; 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드로부터 유래한 기능 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 전부 또는 일부, 공통 FcR 감마 (FcER1G), Fc감마RIIIa, FcR베타 (Fc 엡실론 립), CD3감마, CD3델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DNAX- 활성화 단백질 10 (DAP10), DNAX- 활성화 단백질 12 (DAP12), 이의 활성 단편, 이의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드로부터 유래한 기능 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이러한 신호전달 도메인은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 항원 특이적 결합 도메인, 연결 도메인 및 CD3 제타(ζ) 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에서, 상기 특이적인 결합도메인은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역인 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 조성물이 예방, 개선 또는 치료하기 위한 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있다.
본 발명에서 상기 "신경 퇴행성 질환"은 신경 세포들의 기능 감소 또는 소실에 의해 발생되는 질환을 의미할 수 있고, 상기 "신경 염증성 질환"으로는 신경계의 과도한 염증 반응에 의하여 발생되는 질환을 의미할 수 있다. 본 발명에서 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 구체적인 예시로는 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "예방"은 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환에 의해 기인된 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시킬 수 있는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환에 의해 기인된 증상이 호전될 수 있도록 하거나, 이롭게 될 수 있도록 하는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 투여가 필요한 개체에게, 본 발명에서 제공하는 결합 분자; 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터; 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주; 또는 본 발명에서 제공하는 항체-약물 결합체(ADC)를 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 "개체"는 뇌신경계 질환의 발병이 의심되는 개체로서, 상기 질환 발병의 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명에서 제공하는 유효 물질로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 방법을 통해 치료되는 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있고, 그 구체적인 예시로는 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 방법은 본 발명에서 제공하는 결합 분자; 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터; 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주; 또는 본 발명에서 제공하는 항체-약물 결합체(ADC)를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 상기 유효성분을 포함하는 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 상기 유효성분을 포함하는 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
본 발명에서 상기 결합 분자; 또는 항체-약물 결합체의 투여 용량은 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 μg 내지 500 mg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 결합 분자를 이용하여 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 면역 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 T 세포는 조절 T 세포일 수 있다.
본 발명의 상기 진단용 조성물은 조절 T 세포는 예를 들면, 활성화된 조절 T 세포 즉, 이펙터 T 세포의 억제능이 활성화된 조절 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 진단용 조성물은 T 세포의 표면에 존재하는 CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다. 이와 같이, T 세포의 표면에 존재하는 다양한 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 더 측정하는 경우에는 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자를 단독으로 측정한 경우와 비교하여 목적하는 질환을 진단하는데 현저한 시너지 효과가 발휘되도록 할 수 있다.
본 발명의 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인의 발현 수준과, CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 Lrig-1 단백질을 코딩하는 유전자(즉, LAIR1) 또는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인을 코딩하는 유전자와, CCD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, LNA 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명의 상기 "프로브"는, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 결합분자를 포함하는 뇌신경계 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 예를 들면, 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머 쌍은 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 예를 들면 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 또는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일 클론 항체, 다 클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 결합 분자를 이용하여 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 면역 관련 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 T 세포는 조절 T 세포일 수 있다.
본 발명의 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 T 세포의 표면에 존재하는 CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 더 측정하는 것일 수 있다. 이와 같이, T 세포의 표면에 존재하는 다양한 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 더 측정하는 경우에는 상기 Lrig-1 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자를 단독으로 측정한 경우와 비교하여 목적하는 질환을 진단하는데 현저한 시너지 효과가 발휘되도록 할 수 있다.
본 발명의 상기 "목적하는 개체"는, 해당 질환의 발병 여부가 불확실한 개체로, 질환의 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명의 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 Lrig-1 단백질; 또는 이의 세포 외 도메인은 T 세포에서도 특히 조절 T 세포, 예를 들면, 활성화된 조절 T 세포 즉, 이펙터 T 세포의 억제능이 활성화된 조절 T 세포의 세포 표면에서 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인과, CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질의 발현 수준의 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(Liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(Liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 또는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인을 코딩하는 유전자와, CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하기 위하여, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 분석 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 감소된 경우, 면역 관련 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 T 세포의 표면에 존재하는 CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 발현이 변화(증가 또는 감소)된 경우, 면역 관련 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체 예에서, 상기 Lrig-1 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 감소된 경우, 면역 관련 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명에서 상기와 같이 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 면역 관련 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측 또는 진단하는 경우, 상기 목적하는 개체에 대하여 그 질환에 대한 약제 투여를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는, 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 CDR1; 서열번호 14로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 CDR2; 서열번호 15로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 CDR1; 서열번호 17로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 CDR2; 서열번호 18로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것인, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;을 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는 서열번호 19로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역;을 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는 Fc 영역(Fragment crystallization region) 또는 불변 영역(constant region)을 더 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Fc 영역은 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역, 또는 하이브리드 Fc(hybrid Fc) 영역인, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는 서열번호 21, 23, 24, 27, 28, 29, 30 및 32로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는 서열번호 22, 25, 26 및 31로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는, 서열번호 33 또는 35로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 중쇄 불변 영역; 및 서열번호 34 또는 36으로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 경쇄 불변 영역;을 더 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는, 서열번호 37 또는 38로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄; 및 서열번호 39 또는 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는, 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄; 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는, 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄; 및 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는, 서열번호 41 또는 43으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄; 및 서열번호 42 또는 44로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는, 서열번호 41로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄; 및 서열번호 42로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는, 서열번호 43으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄; 및 서열번호 44로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자는 항체 또는 그 단편인, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 유니바디(unibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편인, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면,서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자를 유효 성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환인, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면,항원 특이적 결합 도메인, 연결 도메인 및 CD3 제타(ζ) 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에서, 상기 특이적인 결합도메인은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역인 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자를 포함하는 뇌신경계 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 뇌신경계 질환의 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결합 분자로 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 결합 분자는 다양한 신경 퇴행성 또는 신경 염증성 질환 등의 뇌신경계 질환을 특이적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포와 비 조절 T 세포 내 Lrig-1 단백질의 발현량 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포의 표면에 Lrig-1 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체의 알츠하이머 치료 효과를 확인하기 위한 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 10는 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체를 포함한 각 처리 후 수득한 마우스의 뇌 피질 및 해마 조직을 티오플라빈 S (ThS)으로 염색시켜 그 결과를 형광 현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 11은 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체를 포함한 각 처리 후 수득한 마우스의 뇌 피질 및 해마 조직을 티오플라빈 S (ThS)으로 염색시킨 뒤 정상 마우스 대비 ThS+ 면적 비율(%)을 계산한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체를 포함한 각 처리 후 Y자 미로 실험 결과 자발적 교대(spontaneous alteration)(%) 값의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13는 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체를 포함한 각 처리 후 신규 물체 인식 실험 결과 선호도 수치의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 14은 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체를 포함한 각 처리 후 수중 미로 실험 결과 플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15은 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체를 포함한 각 처리 후 수중 미로 실험 결과 표적을 지나간 횟수의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체를 포함한 각 처리 후 수중 미로 실험 동안 플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간의 변화를 측정하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체의 알츠하이머 치료 효과를 확인하기 위한 알츠하이머 유도 마우스인 5xFAD 마우스와 6xTg 마우스의 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 18은 알츠하이머 유도 마우스인 5xFAD 마우스와 6xTg 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체를 포함한 각 처리 후 Y자 미로 실험 결과 자발적 교대(spontaneous alteration)(%) 값의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 알츠하이머 유도 마우스인 6xTg 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체를 포함한 각 처리 후 신규 물체 인식 실험 결과 선호도 수치의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 20는 알츠하이머 유도 마우스인 5xFAD 마우스와 6xTg 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체를 포함한 각 처리 후 수동 회피 실험 결과 머무름 시간 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] T 세포 아형 세포 배양
조절 T 세포(Treg)에서만 Lrig-1 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, T 세포의 아형(subset)인 Th0, Th1, Th2, Th17 및 iTreg을 준비하였다. 상기 iTreg은 자연적으로 분리한 nTreg과는 달리 하기 조성을 포함하는 배지에서 분화를 인공적으로 유도한 세포를 의미한다.
T 세포의 아형은 우선, 쥐의 비장으로부터 얻은 나이브(naive) T 세포를 분리한 뒤, 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT) 10%를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 영양배지에 하기 표 1의 성분을 각각 더 포함하도록 하여, 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 배양을 통해 각각의 세포로 분화 유도하였다.
분화 세포 조성
Th0 anti-CD3, anti-CD28
Th1 IL-12, anti-IL-4 항체
Th2 IL-4, anti-IFNβ
Th17 IL-6, TGFβanti-IFNβ
iTreg IL-2, TGFβ
[실시예 1] Lrig-1 구조 분석
조절 T 세포의 표면 단백질인 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인의 3차원 입체 구조를 예측하였다.
우선, 항원 결정기(Epitope) 염기서열 예측을 위해 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인(Extracellular domain; ECD)의 구조를 확인하기 위하여 Uniprot(http://www.uniprot.org)과 RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) 툴을 이용하여 3차원 입체 구조를 예측한 뒤, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-LRR 도메인(아미노산 서열 41 ~ 494번) 내에는 LRR1 내지 LRR15의 총 15개의 류신 리치 부위(Leucine rich region)가 존재하였다. 상기 LRR 도메인 각각은 23 내지 27개의 아미노산으로 구성되고, 류신은 3 내지 5개가 존재하였다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-1 단백질의 아미노산 서열 494 내지 781번에는 면역글로블린 유사 도메인(Immunoglobulin-like domain)이 3개 존재하였다.
[실시예 2] Lrig-1 항원 결정기(epitope) 아미노산 서열 예측
상기 염기서열의 예측은 Lrig-1 단백질의 구조를 기반으로 하는 항원 결정기 예측 소프트웨어(epitope prediction software)인 Ellipro 서버(http://tools.iedb.org/ellipro/)를 이용하였다. 상기 Ellipro 검색 엔진은 현존하는 항원 결정기를 예측하는 알고리즘 중에서 가장 신뢰도가 높다고 알려진 검색엔진에 해당하여 이를 이용하였다.
항원 결정기 예측 소프트웨어에 상기 실시예 1에서 분석된 세포외 도메인을 입력한 뒤, 예측된 항원 결정기의 예측된 연속 또는 불연속 아미노산 서열은 총 22개가 예측되었고, 불연속된 항원 결정기 아미노산 서열은 총 8개가 예측되었다.
[제조예 1 및 2] Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체의 제작
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하였다. 본 항체는 특정 항원 결정기를 정하여 생산하지 않고, Lrig-1 단백질에 어느 부위든지 결합할 수 있는 항체를 생산하였다.
상기 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질이 발현되는 세포를 제작하였다. 보다 상세하게는, 서열번호 2에 해당하는 DNA 단편 및 pcDNA(hygro)를 절단 효소로 절단한 뒤, 37℃에서 배양하여 라이게이션(Lrigation) 하여, Lrig-1 단백질의 DNA 서열이 삽입(insert) 되어 있는 pcDNA를 제작하였다. 상기 제작된 서열번호 2가 삽입된 pcDNA는 L세포에 형질주입(transfection)을 통해 도입되어 L 세포의 표면에 Lrig-1 단백질이 발현될 수 있도록 하였다.
상기 세포 표면에 발현되는 Lrig-1에 결합할 수 있는 경쇄(Lright chain) 및 중쇄(heavy chain) 아미노산의 서열을 Human scFv library에서 선별하였다.
상기 선별된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 각각 서열번호 24 또는 30의 중쇄 불변 영역과 서열번호 26 또는 31의 경쇄 불변 영역과 융합하여 단일클론항체(monoclonal antibody)를 제작하였다. 상기 단일 클론 항체의 서열은 하기 표 2와 같다.
구분 클론 위치 아미노산 서열 서열정보
제조예 1 GTC310-01 마우스 항체 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS NYAMS WVRQAPGKGLEWVS VISHGGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR VISNCHLGVCYYSNGMDV WGQGTLVTVSS

AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVK
GYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASS
TKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVS
EDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKD
LPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKT
ELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK		 서열번호 37
경쇄 QLVLTQPPSVSAAPGQRVSISC SGSSSNIGDNYVS WYQQVPGSAPKLLIY DNNKRPS GIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCAT WDGSLSAGRV FGGGTKLTVL

RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDG
SERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC		 서열번호 39
제조예 2 GTC310-01 인간화 항체 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS NYAMS WVRQAPGKGLEWVS VISHGGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR VISNCHLGVCYYSNGMDV WGQGTLVTVSS

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS
NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK		 서열번호 38
경쇄 QLVLTQPPSVSAAPGQRVSISC SGSSSNIGDNYVS WYQQVPGSAPKLLIY DNNKRPS GIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCAT WDGSLSAGRV FGGGTKLTVL

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC		 서열번호 40
[실시예 3] Lrig-1 mRNA의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에 특이적인 바이오마커(biomarker)로 작용할 수 있는지 검증하였다.
상기 검증을 위하여, 쥐의 비장으로부터 CD4 비드를 통해 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, CD25 항체를 이용하여 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 이용해 조절 T (CD4+CD25+ T)세포 및 비 조절 T (CD4+CD25- T)세포를 분리하였다. 각각의 세포 및 상기 준비예 1에서 분화된 세포는 트리졸(Trizol)을 이용하여 mRNA를 추출한 뒤, 게노믹 RNA는 gDNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 gDNA를 제거하였다. gDNA가 제거된 mRNA는 BDsprint cDNA 합성 키트 (Clonetech)를 통해 cDNA로 합성하였다.
상기 cDNA에서 Lrig-1 mRNA의 발현량을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 SYBR Green (Molecular Probes)을 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 95℃에서 3분, 61℃에서 15초, 72℃에서 30초씩 40 사이클의 조건으로, 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 수행하였고, 상대적인 유전자 발현량은 ΔCT 방법을 이용하여 계산하였으며, HPRT를 이용하여 일반화(normalization) 하여, 그 결과를 도 5 내지 8에 나타내었다.
프라이머 서열 서열정보
쥐 Lrig-1 Forward 5' - GAC GGA ATT CAG TGA GGA GAA CCT - 3' 서열번호 45
Reverse 5' - CAA CTG GTA GTG GCA GCT TGT AGG - 3' 서열번호 46
쥐 Lrig-2 forward 5' - TCA CAA GGA ACA TTG TCT GAA CCA- 3' 서열번호 47
reverse 5' - GCC TGA TCT AAC ACA TCC TCC TCA- 3' 서열번호 48
쥐 Lrig-3 forward 5' - CAG CAC CTT GAG CTG AAC AGA AAC - 3' 서열번호 49
reverse 5' - CCA GCC TTT GGT AAT CTC GGT TAG - 3' 서열번호 50
쥐 FOXP3 forward 5' - CTT TCA CCT ATC CCA CCC TTA TCC - 3' 서열번호 51
reverse 5' - ATT CAT CTA CGG TCC ACA CTG CTC - 3' 서열번호 52
ACTG1 forward 5' - GGC GTC ATG GTG GGC ATG GG - 3' 서열번호 53
reverse 5' - ATG GCG TGG GGA AGG GCG TA - 3' 서열번호 54
도 5에서 보는 바와 같이, 비 조절 T (CD4+CD25- T)세포에 비하여 조절 T((CD4+CD25+ T) 세포에서 Lrig-1의 발현이 18.1배 높은 것을 알 수 있다. 이는, 기존에 알려져 있는 조절 T 세포의 마커인 Lag3 및 Ikzf4와 비교하였을 때 약 10배 정도 발현양이 높은 수준이었다. 또한, 도 6 및 7에서 보는 바와 같이, 다른 종류의 면역세포에 비하여 조절 T 세포, 특히 유도된 조절 T 세포(iTreg)에 비해 자연적으로 분리한 조절 T 세포(nTreg)에서 Lrig-1 mRNA의 발현이 현저하게 높았다.또한, 도 8에서 보는 바와 같이, Lrig 패밀리에 해당하는 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 중에서 Lrig-1의 발현이 가장 높았다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포, 특히 자연적으로 존재하는 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 4] Lrig-1 단백질의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 mRNA로부터 발현된 Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에서만 특이적으로 발현되는지 확인하였다.
조절 T 세포 특이적인 전사 인자인 FOXP3 프로모터에 RFP(Red fluorescence protein)이 결합된 FOXP3-RFP 주입(Knock-in) 쥐를 이용하여, 상기 쥐의 비장으로부터 CD4 비드로 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, RFP 단백질을 이용하여, 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 통해 조절 T (CD4+RFP+ T)세포 및 비 조절 T(CD4+RFP- T)를 분리하여 얻었다. 각각의 상기 세포는 구입한 Lrig-1 항체 및 음성 대조군은 아이소타입(isotype)을 통해 염색하여 형광 활성 세포 분류기로 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 점선으로 표시되는 비-조절 T 세포의 경우 음성 대조군과 거의 동일한 Lrig-1의 발현 수준을 보였지만, 조절 T 세포의 경우 Lrig-1의 발현 수준이 높은 세포가 다수 존재하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 5] 조절 T 세포 표면에서의 Lrig-1 단백질 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 세포 치료의 타겟이 되기 위해서는 조절 T 세포의 표면에 발현되어야 더욱 효과적으로 타겟 치료를 할 수 있으므로, Lrig-1 단백질이 표면에서의 발현 여부를 확인하였다.
상기 준비예 1의 각각의 분화된 T 세포 아형을 항-CD4-APC 및 항 Lrig-1-PE 항체로 염색하고, 형광 이용 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 각각의 세포 표면에서 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 활성화된 T 세포(activated T cell), Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포 및 나이브(Naive) T 세포에서는 Lrig-1의 발현이 0.77 내지 15.3의 양으로 발현되는 반면, 분화가 유도된 T 세포(iTreg)에서는 83.9로 높게 발현되었다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포(Treg) 세포에서 특이적으로 발현될 뿐만 아니라, 특히 Treg 세포의 표면에서 더욱 높게 발현되는 것을 알 수 있다.
[실시예 6] 본 발명에 따른 항체의 알츠하이머 치료능 평가 - 5xFAD 마우스
본 발명에 따른 항체의 알츠하이머 치료능을 평가하기 위하여, 도 11과 같이 군을 설계하였다. 구체적으로, 5 내지 6 개월된 수컷의 알츠하이머 유도 5xFAD 마우스에 상기 제조예 1의 GTC310-01 마우스 항체를 10 mpk의 양으로 3주간 정맥에 주사하였다. 다만, 비교를 위하여 양성 대조군으로 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate, GA, Copaxone®)을 100 ug의 양으로 3 주 동안 피하 주사하거나, 하기 표 4로 표시되는 H6 항체를 10 mpk 양으로 4주간 정맥에 주사하였다.
클론 위치 아미노산 서열
H6
항체		 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISHGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVISNCHLGVCYYSNGMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNDVYWYQQLPGTAPKLLIYSDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
1. 아밀로이드-β 플라크 감소 효과
면역조직학적 분석을 위해, 상기 각 처리된 마우스를 안락사시킨 뒤 뇌의 피질(cortex)과 해마(hippocampus) 조직을 수득한 뒤 4% 파라포름알데히드(pH 7.4)에서 16 시간 동안 고정시켰다. 고정된 피질 및 해마의 뇌 조직을 동결보호(Cryoprotection)를 위해 30% 수크로스에 담그고 Cryostat(Microm HM 525, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 35μm 두께로 슬라이스 하였다. Aβ 플라크를 시각화하기 위해, 슬라이싱된 뇌 절편을 티오플라빈 S (thioflavin S, ThS)로 7분 동안 염색하였다. 티오플라빈 S는 Sigma-Aldrich (카탈로그 번호 T-1892)에서 구입하였다. 500 μM의 티오플라빈 S (ThS)를 50% 에탄올에 용해시켰다. 100%, 95% 및 70% 에탄올로 연속 세정한 후, 절편을 PBS로 옮겼다. 면역형광을 위해, 상대적으로 두꺼운 자유 부동 뇌 절편을 염소 항-GFAP 항체와 함께 4℃에서 7일간 인큐베이션 하였다. 이어서 절편을 Alexa Fluor 594- 접합 당나귀 항-염소 IgG (1:200, Abcam, ab150132)와 함께 밤새 4 ℃에서 인큐베이션 하였다. 4'6'-디아미노-2-페닐인돌이염산염수화물 (DAPI, 1 mg/mL, 1:2000, Sigma)을 사용하여 핵 대조 염색을 수행하였다. 이미지는 Leica DM2500 형광 현미경으로 촬영하여 그 결과를 도 12에 나타내었다. 또한, ImageJ 소프트웨어 프로그램을 사용하여 정상 마우스 대비 ThS+ 면적 비율(%)을 계산하여 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 12 및 13에서 보는 바와 같이, 알츠하이머 유도 마우스에서 ThS+ 면적이 현저히 증가하였지만, 본 발명에 따른 GTC310-01 항체를 투여한 경우 특히 피질에서 ThS+ 면적이 현저히 감소하였고, 즉 아밀로이드-β 플라크(plaques) 감소 효과가 매우 뛰어난 것을 알 수 있었다.
2. Y자 미로 실험(Y-maze test)
Y자 미로 실험은 40 cm의 길이(벽의 높이 15cm)의 동일한 3개의 암(arm)을 120도의 각도로 배치하여 만든 미로틀을 이용하였다. 이 실험은 설치류의 본능적인 탐색 습성을 이용한 행동 실험이며, 새로운 영역을 탐색할 가능성이 높은 것에 착안한 방법이었다. 바로 전에 탐색한 암(arm)을 기억하여 동일한 암(arm)에 들어가지 않을 수록 높은 기억력의 수치를 나타내었다. 개체당 8분의 탐색 시간을 제공하며, 최종 결과는 도 14에 자발적 교대(spontaneous alteration)(%) 값으로 표현하였다. 자발적 교대(spontaneous alteration)(%) 값은 다음과 같은 식 1로 계산하였다. 여기서 행동 패턴의 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다.
[식 1]
Spontaneous alternation (%) = The number of triplet / (total arm entry-2)
도 14에서 보는 바와 같이, 실험 동물이 주변의 단서를 파악하여 순차적으로 미로를 들어가는 상대적 빈도를 측정한 본 실험에 있어서, 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명에 따른 GTC310-01 항체를 투여한 경우, 정상 대조군과 유사한 수준으로 자발적 교대 값을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
3. 신규 물체 인식 실험(Novel Object Recognition)
신규 물체 인식 실험은 40 cm x 40 cm의 아크릴 케이지에 상이한 2개의 물체를 이용하여 기억력을 평가하였다. 아크릴 케이지 내를 익숙하게 한 후, 2개의 물체를 일정한 위치에 위치하여 자유롭게 인지하게 한 후, 각 물체를 탐색한 시간을 측정하였다. 24 시간의 지연 시간을 개체별로 주고 다시 동일한 위치에 한 가지 물체만 다른 물체로 변경하였다. 이 때 변경한 물체를 신규 물체로 인식하여 탐색 시간이 길수록 기억력이 좋은 것으로 판단할 수 있다. 24 시간 전의 물체를 기억하지 못한다면 신규 물체와 기존 물체를 구분하지 못하고 양쪽 물체 모두 균일하게 탐색할 가능성이 있다. 총 10분간 자유롭게 탐색하도록 하며, 결과는 선호도 수치(preference index = Novel object exploring time/total exploring time)로 도 15에 나타내었다. 이때 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다.
도 15에서 보는 바와 같이, 새로운 물체에 대한 선호도 수치(Preference Index)에서 정상 대조군에 비하여 알츠하이머 유도 군에서 선호도 수치가 낮게 관찰되었다. 그런데 본 발명에 따른 GTC310-01 항체를 투여한 경우 정상 대조군 이상으로 선호도 수치가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
4. 수중 미로 시험(Water maze test)
수중 미로 시험은 Morris에 의해 고안된 방법을 기초로 하여 실시하였다. 스테인레스 풀 (직경 90cm, 높이 50 cm)에 물(22 ± 1 ℃)을 채워 수면 높이를 30 cm가 되도록 하였다. 숨겨진 플랫폼(platform) (직경 5cm)은 수면 아래 1cm 지점에 위치하도록 하였다. 평가 첫 날 3번~4번의 훈련을 실시하였다. 한 개체 당 전체 수영시간은 60초로 설정하였으며, 60초 이내에 플랫폼(platform)을 찾은 개체는 10초간 플랫폼(platform) 위에서 머무르도록 하여 기억을 유도하였다. 60초가 지나도 플랫폼(platform)을 찾지 못하는 개체는 인위적으로 플랫폼(platform)으로 안내하여 플랫폼(platform) 위에서 10초간 머무르도록 하며 이때의 탈출 시간(escape time)은 60초로 하였다. 수영 연습을 시킨 후 6일차에 프로브 실험(probe test)을 실시하여 공간지각능력(플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간(Latency to target, sec) 및 표적을 지나간 횟수(target crossing numbers, 수))를 측정하여 그 결과를 도 16 및 17에 나타내었고, 습득 실험(acquisition test)을 실시하여 실험 동안 플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간(time to platform, sec)을 측정하여 그 결과를 도 18에 나타내었다. 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다. 결과 해석에서 제외시키는 기준은 수영을 통한 탐색을 하지 않고 특정부위만 선회하는 개체로 설정하였다.
도 16 내지 18에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 GTC310-01 항체를 투여한 경우 표적을 지나간 횟수는 현저히 증가하였고, 플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간은 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 실험들을 통하여 본 발명에 따른 항체는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
[실시예 7] 본 발명에 따른 항체의 알츠하이머 치료능 평가 - 6xTg 마우스
본 발명에 따른 항체의 알츠하이머 치료능을 평가하기 위하여, 도 19와 같이 군을 설계하고 실험을 진행하였다. 구체적으로, 4.5개월 동안 적응 기간을 거친 암컷의 알츠하이머 유도 5xFAD 마우스와 암컷의 6xTg 마우스에 상기 제조예 1의 GTC310-01 항체를 10 mpk의 양으로 2달간 격주로 정맥에 주사하였다. 다만, 비교를 위하여 양성 대조군으로 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate, GA, Copaxone®)을 100 ug의 양으로 2달간 격주로 정맥에 주사하였다. 2달 후 Y자 미로 실험, 신규 물체 인식 실험, 수동회피실험을 진행하였다.
1. 6xTg 마우스의 특징
5xFAD 마우스는 알츠하이머 유도 모델로서 많이 사용되고 있으나 하기 실험에 사용된 6xTg 마우스는 아밀로이드-β(Aβ42) 뿐만 아니라, tau 단백질(MAPT)가 돌연변이되어 축적된 마우스 모델로서 5xFAD 마우스보다 인간 질병 모델에 더욱 가까운 모델이므로 알츠하이머를 포함한 뇌신경계 질환 모델로서 이상적인 동물 모델에 해당한다.
2. Y자 미로 실험(Y-maze test)
Y자 미로 실험은 40 cm의 길이(벽의 높이 15cm)의 동일한 3개의 암(arm)을 120도의 각도로 배치하여 만든 미로틀을 이용하였다. 이 실험은 설치류의 본능적인 탐색 습성을 이용한 행동 실험이며, 새로운 영역을 탐색할 가능성이 높은 것에 착안한 방법이었다. 바로 전에 탐색한 암(arm)을 기억하여 동일한 암(arm)에 들어가지 않을 수록 높은 기억력의 수치를 나타내었다. 개체당 8분의 탐색 시간을 제공하며, 최종 결과는 도 20에 자발적 교대(spontaneous alteration)(%) 값으로 표현하였다. 자발적 교대(spontaneous alteration)(%) 값은 다음과 같은 식 1로 계산하였다. 여기서 행동 패턴의 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다.
[식 1]
Spontaneous alternation (%) = The number of triplet / (total arm entry-2)
도 20에서 보는 바와 같이, 실험 동물이 주변의 단서를 파악하여 순차적으로 미로를 들어가는 상대적 빈도를 측정한 본 실험에 있어서, 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명에 따른 GTC310-01 항체를 투여한 경우, 정상 대조군과 유사한 수준으로 자발적 교대 값을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 더 나아가 좀 더 인간 질병 모델과 더욱 가까운 6xTg 모델 마우스에서 5xFAD 마우스보다 좀 더 정상 대조군과 유사한 수준으로 자발적 교대 값을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
3. 신규 물체 인식 실험(Novel Object Recognition)
신규 물체 인식 실험은 40 cm x 40 cm의 아크릴 케이지에 상이한 2개의 물체를 이용하여 기억력을 평가하였다. 아크릴 케이지 내를 익숙하게 한 후, 2개의 물체를 일정한 위치에 위치하여 자유롭게 인지하게 한 후, 각 물체를 탐색한 시간을 측정하였다. 24 시간의 지연 시간을 개체별로 주고 다시 동일한 위치에 한 가지 물체만 다른 물체로 변경하였다. 이 때 변경한 물체를 신규 물체로 인식하여 탐색 시간이 길수록 기억력이 좋은 것으로 판단할 수 있다. 24 시간 전의 물체를 기억하지 못한다면 신규 물체와 기존 물체를 구분하지 못하고 양쪽 물체 모두 균일하게 탐색할 가능성이 있다. 총 10분간 자유롭게 탐색하도록 하며, 결과는 선호도 수치(preference index = Novel object exploring time/total exploring time)로 도 21에 나타내었다. 이때 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다.
도 21에서 보는 바와 같이, 새로운 물체에 대한 선호도 수치(Preference Index)에서 정상 대조군에 비하여 알츠하이머 유도 군에서 선호도 수치가 낮게 관찰되었다. 그런데 본 발명에 따른 GTC310-01 항체를 투여한 경우 인간 질병 모델과 더욱 가까운 6xTg 모델에서 정상 대조군 이상으로 선호도 수치가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
4. 수동회피실험(Passive Avoidance Test)
Passive avoidance test 실험기구는 조명이 있는 밝은 챔버와 어두운 챔버, 2개의 구역으로 구분되어 있으며, 바닥은 철망으로 이루어져 있다. 먼저 첫째 날에는 마우스를 자유롭게 이동시켜서 적응시켰다. 다음 날 각각의 5xFAD 마우스와 6xTg 마우스는 조명이 있는 챔버에서 조명을 켜지 않은 채 1분 동안 적응시킨 후 조명을 켜고, 2분 동안 적응시킨 후 마우스가 어두운 챔버로 이동하자마자 전기충격을 0.5 mA, 1초 동안 가하여 학습 시험을 실시하였다. 이와 같이 학습 시험을 시킨 다음날 각 마우스들을 대상으로 기억 시험(teat trial)을 실시하였다 조명을 켠 챔버에 5xFAD 마우스와 6xTg 마우스를 놓고 5xFAD 마우스와 6xTg 마우스의 네 발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency time: 머무름 시간)을 300초 이내로 지정하고 실행하였다. 그 결과 도 22에서 보는 것과 같이 5xFAD 마우스뿐 만 아니라 6xTg 마우스에서도 GTC310-01 항체를 투여한 경우 정상 대조군에 근접할 정도로 회복되는 것을 알 수 있었다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
<110> Good T Cells, Inc. <120> Novel binding molecule and use thereof <130> PDPB212109k01 <160> 54 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 759 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Pro Arg Ala Pro Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys Ala Gly Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asp Cys Gly Gly Arg Gly Leu Ala Ala Leu Pro Gly Asp Leu Pro 20 25 30 Ser Trp Thr Arg Ser Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Lys Leu Ser Glu Ile 35 40 45 Asp Pro Ala Gly Phe Glu Asp Leu Pro Asn Leu Gln Glu Val Tyr Leu 50 55 60 Asn Asn Asn Glu Leu Thr Ala Val Pro Ser Leu Gly Ala Ala Ser Ser 65 70 75 80 His Val Val Ser Leu Phe Leu Gln His Asn Lys Ile Arg Ser Val Glu 85 90 95 Gly Ser Gln Leu Lys Ala Tyr Leu Ser Leu Glu Val Leu Asp Leu Ser 100 105 110 Leu Asn Asn Ile Thr Glu Val Arg Asn Thr Cys Phe Pro His Gly Pro 115 120 125 Pro Ile Lys Glu Leu Asn Leu Ala Gly Asn Arg Ile Gly Thr Leu Glu 130 135 140 Leu Gly Ala Phe Asp Gly Leu Ser Arg Ser Leu Leu Thr Leu Arg Leu 145 150 155 160 Ser Lys Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Val Arg Ala Phe Lys Leu Pro 165 170 175 Arg Leu Thr Gln Leu Asp Leu Asn Arg Asn Arg Ile Arg Leu Ile Glu 180 185 190 Gly Leu Thr Phe Gln Gly Leu Asn Ser Leu Glu Val Leu Lys Leu Gln 195 200 205 Arg Asn Asn Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ala Phe Trp Gly Leu Ser 210 215 220 Lys Met His Val Leu His Leu Glu Tyr Asn Ser Leu Val Glu Val Asn 225 230 235 240 Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Leu Thr Ala Leu His Gln Leu His Leu Ser 245 250 255 Asn Asn Ser Ile Ala Arg Ile His Arg Lys Gly Trp Ser Phe Cys Gln 260 265 270 Lys Leu His Glu Leu Val Leu Ser Phe Asn Asn Leu Thr Arg Leu Asp 275 280 285 Glu Glu Ser Leu Ala Glu Leu Ser Ser Leu Ser Val Leu Arg Leu Ser 290 295 300 His Asn Ser Ile Ser His Ile Ala Glu Gly Ala Phe Lys Gly Leu Arg 305 310 315 320 Ser Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp His Asn Glu Ile Ser Gly Thr Ile 325 330 335 Glu Asp Thr Ser Gly Ala Phe Ser Gly Leu Asp Ser Leu Ser Lys Leu 340 345 350 Thr Leu Phe Gly Asn Lys Ile Lys Ser Val Ala Lys Arg Ala Phe Ser 355 360 365 Gly Leu Glu Gly Leu Glu His Leu Asn Leu Gly Gly Asn Ala Ile Arg 370 375 380 Ser 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 38 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser His Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ile Ser Asn Cys His Leu Gly Val Cys Tyr Tyr Ser Asn 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 39 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 39 Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Gly Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg 100 105 110 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 115 120 125 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 145 150 155 160 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 180 185 190 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 195 200 205 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 40 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 40 Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Gly Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 41 <211> 1380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 41 gaagttcagc tgcttgagtc tggcggagga ctggttcaac ctggcggaag cctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc aactacgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggaaaag gccttgaatg ggtgtccgtg atctctcacg gcggaggcag cacctactac 180 gccgattctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgcgc cagagtgatc 300 agcaactgcc acctgggcgt gtgctactac agcaacggca tggatgtgtg gggccagggc 360 acactggtta ccgttagttc tgctagcgcc aaaacaacag ccccctccgt atacccccta 420 gcccccgtat gcggcgacac caccggctcc tccgtaaccc taggctgcct agtaaaaggc 480 tacttccccg aacccgtaac cctaacctgg aactccggct ccctatcctc cggcgtacac 540 accttccccg ccgtactaca atccgaccta tacaccctat cctcctccgt aaccgtaacc 600 tcctccacct ggccctccca atccatcacc tgcaacgtag cccaccccgc ctcctccacc 660 aaagtagaca aaaaaatcga gccaaggggc cccaccatca agccttgccc tccctgcaag 720 tgccctgccc ccaacctgct gggcggcccc tccgtgttca tcttccctcc aaagatcaag 780 gacgtgctga tgatctccct gagccccatc gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtccgag 840 gacgaccctg acgtgcagat cagctggttc gtgaacaacg tggaggtgca caccgcccag 900 acccagaccc acagagagga ctacaactcc accctgaggg tggtgagcgc cctgccaatc 960 cagcaccagg actggatgtc cggcaaggag ttcaagtgca aggtgaacaa caaggacctg 1020 ccagccccaa tcgagaggac catcagcaag cctaagggct ccgtgagggc cccccaggtg 1080 tacgtgctgc cccctcctga ggaggagatg accaagaagc aggtgaccct gacctgcatg 1140 gtgaccgact tcatgcctga ggacatctac gtggagtgga ccaacaacgg caagaccgag 1200 ctgaactaca agaacaccga gcctgtgctg gacagcgacg gcagctactt catgtacagc 1260 aagctgaggg tggagaagaa gaactgggtg gagagaaact cctactcctg ctccgtggtg 1320 cacgagggcc tgcacaacca ccacaccacc aagagcttct ccagaacccc cgggaagtga 1380 1380 <210> 42 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 42 gaagttcagc tgcttgagtc tggcggagga ctggttcaac ctggcggaag cctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc aactacgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggaaaag gccttgaatg ggtgtccgtg atctctcacg gcggaggcag cacctactac 180 gccgattctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgcgc cagagtgatc 300 agcaactgcc acctgggcgt gtgctactac agcaacggca tggatgtgtg gggccagggc 360 acactggtta ccgttagttc tgctagcacc aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc 420 tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 480 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggggccctga ccagcggcgt gcacaccttc 540 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 600 agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 660 gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 720 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 840 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 960 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1020 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1080 ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1140 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1200 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1260 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1320 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 1371 <210> 43 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 43 caactggttc tgacacagcc tccaagcgtg tcagctgccc ctggacagag agtgtccatc 60 agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc gacaactacg tgtcctggta tcagcaggtc 120 ccaggctctg cccctaagct gctgatctac gacaacaaca agcggcccag cggcatcccc 180 gatagatttt ctgccagcaa gagcggcacc agcgccacac tgggaattac aggactgcag 240 acaggcgacg aggccgacta ctattgtgcc acatgggatg gctccctgag cgccggaaga 300 gtttttggcg gaggcaccaa gctgaccgtg cttcgtacgg atgctgcacc aactgtatcc 360 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 420 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 480 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 540 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 600 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgt 654 <210> 44 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 44 caactggttc tgacacagcc tccaagcgtg tcagctgccc ctggacagag agtgtccatc 60 agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc gacaactacg tgtcctggta tcagcaggtc 120 ccaggctctg cccctaagct gctgatctac gacaacaaca agcggcccag cggcatcccc 180 gatagatttt ctgccagcaa gagcggcacc agcgccacac tgggaattac aggactgcag 240 acaggcgacg aggccgacta ctattgtgcc acatgggatg gctccctgag cgccggaaga 300 gtttttggcg gaggcaccaa gctgaccgtg cttagatctg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Lrig-1 forward primer <400> 45 gacggaattc agtgaggaga acct 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Lrig-1 reverse primer <400> 46 caactggtag tggcagcttg tagg 24 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Lrig-2 forward primer <400> 47 tcacaaggaa cattgtctga acca 24 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Lrig-2 reverse primer <400> 48 gcctgatcta acacatcctc ctca 24 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Lrig-3 forward primer <400> 49 cagcaccttg agctgaacag aaac 24 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Lrig-3 reverse primer <400> 50 ccagcctttg gtaatctcgg ttag 24 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse FOXP3 forward primer <400> 51 ctttcaccta tcccaccctt atcc 24 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse FOXP3 reverse primer <400> 52 attcatctac ggtccacact gctc 24 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTG1 forward primer <400> 53 ggcgtcatgg tgggcatggg 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTG1 reverse primer <400> 54 atggcgtggg gaagggcgta 20

Claims (29)

  1. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 CDR1; 서열번호 14로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 CDR2; 서열번호 15로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 16으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 CDR1; 서열번호 17로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 CDR2; 서열번호 18로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것인, 결합 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;을 포함하는, 결합 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 19로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 20으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역;을 포함하는, 결합 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는 Fc 영역(Fragment crystallization region) 또는 불변 영역(constant region)을 더 포함하는, 결합 분자.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역, 또는 하이브리드 Fc(hybrid Fc) 영역인, 결합 분자.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 21, 23, 24, 27, 28, 29, 30 및 32로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 결합 분자.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 결합 분자는 서열번호 22, 25, 26 및 31로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 결합 분자.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 33 또는 35로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 중쇄 불변 영역; 및
    서열번호 34 또는 36으로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 경쇄 불변 영역;을 더 포함하는, 결합 분자.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 37 또는 38로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄; 및
    서열번호 39 또는 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄; 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄; 및 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 41 또는 43으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄; 및
    서열번호 42 또는 44로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 41로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄; 및 서열번호 42로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 43으로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 중쇄; 및 서열번호 44로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 경쇄;를 포함하는, 결합 분자.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는 항체 또는 그 단편인, 결합 분자.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 유니바디(unibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편인, 결합 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자.
  19. 제18항의 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
  20. 제19항의 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주.
  21. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC).
  22. 제1항 내지 제17항 또는 제21항 중 어느 한 항의 결합 분자를 유효 성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환인, 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  25. 항원 특이적 결합 도메인, 연결 도메인 및 CD3 제타(ζ) 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에서,
    상기 특이적인 결합도메인은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역인 키메라 항원 수용체.
  26. 제25항의 키메라 항원 수용체를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  27. 제1항의 결합 분자를 포함하는 뇌신경계 질환의 진단용 조성물.
  28. 제27항의 조성물을 포함하는 뇌신경계 질환의 진단용 키트.
  29. 제1항의 결합분자로 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
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