KR20190082235A - Gitr 및 ctla-4에 이중 특이적인 폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 결합 도메인 및 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는, 다중 특이적 폴리펩타이드, 예컨대 이중특이적 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 이중특이적 폴리펩타이드의 조성물, 뿐만 아니라 이의 방법 및 용도를 추가로 제공한다.
Description
본 발명은 GITR 및 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩티드, 및 이의 암의 치료 및 예방에서의 용도에 관한 것이다.
암은 선진국에서 조기 사망의 주요 원인이다. 암의 면역요법은 종양 세포에 대한 효과적인 면역 반응을 일으키는 것을 목표로 한다. 이는 예를 들어, 종양 항원에 대한 파괴 내성, 항-종양 면역 반응의 증가, 및 종양 부위에서의 국소적인 사이토카인 반응의 자극에 의해 달성될 수 있다. 오래 지속되는 항-종양 면역 반응의 핵심 효과기(effector) 세포는 활성화 종양 특이적 효과기 T 세포 (Teff)이다. 활성화 효과기 T 세포의 강력한 확장은 면역 반응을 종양쪽으로 전향시킬 수 있다. 이러한 맥락에서, 조절 T 세포 (Treg)는 항-종양 면역을 억제하는 역할을 한다. 따라서 Treg를 고갈시키거나, 억제/복귀시키거나 또는 불활성화시키는 것은 종양 미세 환경에서 항-종양 효과를 제공하고 면역억제를 복귀시킬 수 있다. 또한, 예를 들어 수지상 세포에 의한 효과기 T 세포의 불완전한 활성화는 비효율적인 항-종양 반응을 초래하는 T 세포 아네르기를 유발할 수 있는 반면, 수지상 세포에 의한 적절한 유도는 활성화 효과기 T 세포의 강력한 확장을 생성하여, 면역 반응을 종양쪽으로 전향시킬 수 있다. 또한 자연 사멸 (NK) 세포는 하향 조절된 인간 백혈구 항원 (HLA) 발현을 갖는 종양 세포를 공격하고 항체 의존성 세포독성 (ADCC)을 유도하여, 종양 면역학에서 중요한 역할을 한다. 따라서 NK 세포의 자극은 또한 종양 성장을 감소시킬 수 있다.
글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질 (GITR, CD357 또는 TNFRSF18)은 미경험(naive) CD4+ 및 CD8+ T 세포의 T 세포 프라이밍 동안 T 세포 수용체 (TCR) 신호전달, T 세포 효과기 (Teff) 분화 및 기억 T 세포 반응을 강화시킬 수 있는 T 세포에 대한 중요한 동시-자극 수용체이다. 인간의 경우, GITR 발현은 미경험 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 일반적으로 낮으며, 활성화 T 세포 및 조절 T 세포 (Treg)로 제한된다. GITR의 상향 조절은 TCR 활성화시 6 시간 후에 발생하고, 24 시간 내에 피크를 갖는다 (Kanamuru, 2004). GITR 활성화는 주로 항원 제시 세포 (APC) 및 내피 세포에서 발현되는 그의 리간드 GITRL에 의해 유발된다. 다른 TNFR 패밀리 구성원과 유사하게, TCR 신호와 함께 GITR 동시-자극은 NFκB 경로의 활성화를 유도하고, IL-2, IFNγ, IL-4 또한 IL-10와 같은 사이토카인 방출을 향상시키고 (Kanamuru, 2004), CD3-유도된 아폽토시스를 억제하고 (Nocentini, 1997), T 세포 생존, 증식 및 확장을 촉진한다. 이에 따라 GITR 자극은 CD4 효과기 T 세포 확장, 메모리 표현형으로의 성숙 및 분화, 및 CD8 T 세포 활성화에 유리하게 만든다. 중요하게는, GITR은 말초 및 흉선 Treg에서, 특히 이것이 그의 조절 기능에서 중요하나 또한 상반된 역할을 하는 활성화 Treg에서 높게 발현된다 (Ronchetti, 2015):
1) 마우스 모델에서, GITR은 Treg 분화 및 확장에 있어 중요하다.
2) 반대로, GITR 자극은, 예를 들어 FOXP3의 분해를 통해 Treg의 면역억제 기능을 폐지할 수 있다 (Shimizu, 2002) (McHugh, 2002) (Cohen, 2010). 이는 부분적으로는 비-생리적 조건에서의 GITR의 과자극으로 인한 일시적인 약리학적 효과에 의해 설명될 수 있다.
3) GITR 유도된 신호전달은 또한 T 세포가 Treg에 의해 유도된 면역억제에 대해 더욱 내성을 갖도록 촉진할 수 있다; 약한 면역원성 종양 관련 항원에 대한 T 세포 반응성을 향상시켜, 종양 지향 면역 및 종양 거부를 유도한다.
4) Treg에 대한 GITR 항체의 또 다른 억제 효과는, GITR 항체 Fc-부분과 활성화 Fcγ 수용체 (FcγR)의 결합, 및 미경험 T 세포 또는 Teff 상에서보다 Treg 상에서의 GITR의 더욱 높은 발현에 기인하는, 특정적으로 Treg의 고갈에 의존한다. 이 효과는 FcγR-발현 자연 사멸 세포 (NK 세포)의 높은 침투 및 종양을 침투하는 골수 세포로 인해 종양 영역에 제한된다고 제안되었다 (Bulliard, 2013).
GITR 항체의 치료 효과에 대한 이러한 메커니즘의 상대적 중요성은 상황에 따라 다를 수 있다.
현재 임상 I기에 8개의 GITR mAb가 존재한다. 이들은 전통적인 2가 단일클론 항체를 포함하며, 또한, 최적의 T 세포 활성화 및/또는 Treg 고갈을 위해 GITR 다중화를 최대화하기 위해, Fc 도메인에 결합된 GITR 다중화를 극대화하기 위해 Fc 도메인에 결합된 다가 (육량체) GITRL 융합 단백질인 MEDI-1873 (MedImmune/AstraZeneca)을 포함한다. 인간화된 글리코실화되지 않은 IgG1 GITR 항체인 TRX-518 (Leap Therapeutics)은, 흑색종에 대해 2010년에 임상에 처음 진입한 비-고갈(non-depleting) 항체이다. 첫번째 단일 용량 증가 연구는 낮은 효능 또는 독성을 나타냈다. TRX-518을 반복 투여한 새로운 용량 증가 연구는 2015년에 시작되었다. INCAGN01876 (Agenus/Incyte) 및 GWN323 (Novartis)은 모두 FcγR에 결합하여 이를 활성화시키고, Treg와 같은 표적 세포의 ADCC를 유도할 수 있는 IgG1 항체이다. 적어도 4 종 이상의 GITR 항체가 BMS, Amgen 및 Merck 사로부터 임상 개발되고 있다. 항체의 이소타입 및 ADCC를 유도하는 그의 능력은 상이한 GITR 표적 화합물에 대한 작용 방식으로서 Treg 고갈 및 T 세포 효과기 기능의 균형에 영향을 미칠 것이다.
T 세포 수용체 CTLA-4는 T 세포 활성화의 음성 조절자 역할을 하며, 초기 활성화 후 T 세포 표면에서 상향 조절된다. 항원 제시 세포에 의해 발현되는 CTLA-4 수용체의 리간드는 B7 단백질, CD80 및 CD86이다. T 세포 활성화의 상향 조절을 담당하는 상응하는 리간드 수용체 쌍은 CD28 - B7이다. CD28을 통한 신호전달은 동시-자극 경로를 구성하고, MHC 복합체에 의해 제시된 항원 펩타이드를 인식하는 T 세포 수용체를 통해 T 세포의 활성화를 따른다. CD80/CD86에 대한 CTLA-4 상호작용을 차단함으로써, 면역 반응의 정상적인 체크포인트 중 하나가 제거될 수 있다. 최종 결과는 항-종양 면역에 기여할 수 있는 효과기 T 세포의 강화된 활성이다. 이는 효과기 T 세포의 직접적인 활성화로 인한 것일 수 있지만, 예를 들어 ADCC 또는 ADCP를 통한 Treg 세포의 활성 및/또는 수 감소로 인한 것일 수도 있다.
CTLA-4의 체크포인트 차단은 T 세포 활성화 및 항-종양 효과를 개선시키지만, 항-CTLA-4 항체의 투여는 독성 부작용과 관련되어 있다. CTLA-4는 흑색종 폐암, 신장암 및 두경부암과 같은 많은 고형 종양에서의 조절 T 세포 상에서 과발현된다 (Kwiecien, 2017) (Montler, 2016) (Ross, Clin Science, 2017).
흑색종의 CTLA-4 항체 처리 (이필리무맙)의 임상 연구는, 생존 이점을 입증하였다 (Hodi 등, 2010). IgG1 항체인 이필리무맙의 효과 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았다. 현재 데이터는 주변 Teff를 활성화시키고 종양내 Treg를 고갈시키는, CTLA-4 항체의 이중 활성을 뒷받침한다 (Bulliard, 2013) (Furness, 2014).
CTLA-4-CD80/CD86 상호작용을 차단함으로써, 면역 반응의 정상적인 체크포인트 중 하나가 제거된다. 이는 원하지 않는 면역 활성화를 초래할 가능성이 있으며, 심지어 항-종양 효과를 유발할지라도 독성 부작용과 관련된다. 다른 것들은, (종양 세포에 의한) 항-CTLA-4 항체의 국소 생성이 전신 투여와 관련된 자가면역 반응없이 항-종양 효과를 유발함을 입증하였다 (Fransen, 2013).
IgG1 형태의 항-CTLA-4 mAb인 이필리무맙 (BMS)은 흑색종의 치료를 위해 승인되었으며, 현재 예를 들어 비-소세포 폐암 (NSCLC), 소세포 폐암 (SCLC), 방광 및 전립선암에 대한 임상 III기에 있다. 또한, BMS는 임상 I기에서 이필리무맙의 비-푸코실화된 버전을 갖는다. 트레멜리무맙 (MedImmune/Astra Zeneca)은 예를 들어 중피종, NSCLC 및 방광암에 대하여 임상 III기인 항-CTLA-4 IgG2 mAb이다. AGEN-1884 (Agenus Inc.)는 진행성 고형 종양에 대하여 임상 I기인 최근에 등록된 항-CTLA-4 항체이다.
GITR 또는 CTLA-4를 표적화하는 단일특이적 항체는 일반적으로, 예를 들어 다른 세포 상의 Fcγ 수용체를 통한 가교 결합에 의존하여, 각각의 수용체를 발현하는 세포에 대하여 강한 신호전달을 유도한다. 따라서, 이러한 가교 결합이 제공되지 않으면 이들은 효율적으로 신호전달하지 않는다.
단 하나의 T 세포 표적만을 표적화하는 기존의 단일특이적 약물, 예컨대 GITR 또는 CTLA-4에 대한 대안이 필요하다.
발명의 개요
본 발명의 제 1 양태는, CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 결합 도메인(B1로 지정) 및 GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 결합 도메인(B2로 지정)을 포함하는 다중특이적 폴리펩타이드를 제공한다.
"다중특이적" 폴리펩타이드는 전형적으로 상이한 항원들 상의 하나 초과의 표적 에피토프에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드의 예로는 이중특이적 항체 및 삼중특이적 항체, 및 이들의 폴리펩타이드 유도체 (하기 참조)가 포함된다.
따라서, 이중특이적 항체는 동일하거나 상이한 항원 상의 2 개의 상이한 에피토프에 결합하는 능력을 갖는 분자이다. 이중특이적 항체는, 2 개의 세포 표면 수용체들의 동시-억제, 또는 2 개의 리간드의 차단, 2개의 수용체들의 가교 결합 또는 종양 세포 근방으로의 T 세포의 소집(recruitment)를 가능하게 하기 위해 개발되었다 (Fournier, 2013).
CTLA-4 및 GITR과 같은 2 종 이상의 상이한 T 세포 표적을 표적화하는 다중특이적 항체는, 모든 표적이 과발현되는 위치에서 특이적으로 면역계를 활성화시킬 가능성을 갖는다. 예를 들어, CTLA-4는 종양 미세 환경에서 조절 T 세포 (Treg) 상에서 과발현되지만, 효과 T 세포 상에서의 발현은 낮다. 따라서, 본 발명의 다중특이적 항체는 종양 미세 환경에서 조절 T 세포를 선택적으로 표적화할 가능성을 갖는다.
GITR 발현은 종양 미세 환경을 침투하는 것으로 알려진 활성화 Treg 상에서의 CTLA-4 발현과 연관되고, 그의 억제 활성은 GITR 및 CTLA-4 발현과 관련된다 (Ronchetti, 2015) (Furness, 2014) (Bulliard, 2013) (Leving, 2002). 따라서 이중특이적 항체는 종양의 억제 Treg를 선택적으로 표적화할 수 있으며, Treg를 특이적으로 고갈시키거나 Treg의 면역억제를 역전시킬 가능성을 갖는다. 이 효과는 이중특이적 항체의 Fc 부분을 통한 ADCC 또는 ADCP 유도에 의해 (Furness, 2014), 또는 GITR 자극을 통해 유도되는 신호전달에 의해, 및/또는 CTLA-4 신호전달 경로 차단에 의해(Walker, 2011) 매개될 수 있다. Teff에서, 이중특이적 항체는 GITR 자극, 및 CTLA-4 체크포인트 차단 모두를 통해 활성화를 유도하고 효과기 기능을 증가시킬 가능성을 갖는다. 암 환자에서 GITR 자극 및 생체외 단리된 Treg의 CTLA-4 차단의 병용 연구는, 면역억제가 폐지되고, T 세포의 항-종양 면역을 복원할 수 있음을 보여준다 (Gonzales, 2015). 또한, 마우스 모델에서의 연구는, GITR 자극 및 CTLA-4 차단의 조합시 유익한 항-종양 효과를 제안한다 (Pruitt, 2011).
요약하면, 이론에 얽매이기를 바라지 않으며, 본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체 폴리펩타이드의 주된 작용 방식은, 이필리무맙과 같은 CTLA-4 항체와 비교하여 더욱 내성인 안전성 프로파일을 가지면서, 종양 침투 Treg를 고갈시키고 억제하여, 단일특이적 GITR 항체와 비교하여 향상된 효과를 제공하는 것이라고 믿어진다.
다중특이적 항체로서, 본 발명의 GITR-CTLA-4 항체는 단일특이적 항체의 조합과 비교하여, 잠재적으로 증가된 치료 효능을 제공하고, 약물 개발, 생성, 임상 시험 및 규제 승인 비용을 감소시키는 기회를 제공한다. 그 자체의 형식 또한 2 개의 세포 또는 2 개의 상이한 세포 수용체를 물리적으로 연결함으로써 상승 효과를 줄 수 있다 (May, 2012). 이러한 특징들은 다중특이적 항체를 암 치료에 있어 치료제로서 매우 매력적으로 만든다.
특히, GITR 및 CTLA-4를 표적화하는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체는 종양에서 면역계를 국소적으로 활성화시킬 가능성을 갖는다. 상기에 언급된 바와 같이, GITR 및 CTLA-4 발현은 종양에 침투하는 것으로 알려진 활성화 Treg와 관련된다. 따라서 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체는 종양에서 (ADCC를 통해) Treg를 선택적으로 표적화하고 특이적으로 억제하거나 고갈시킬 가능성을 갖는다. 결과적으로, 단일특이적 GITR 또는 CTLA-4 항체의 2가 결합과 비교하여 GITR 및 CTLA-4에 대한 이중 결합에 의해 치료 효능이 향상되어, 단일특이적 경쟁자와 비교하여 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체의 유익한 항-종양 효과를 제공한다. 또한, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체의 전신 투여량은 단일 특이적 항체보다 낮을 수 있어, 독성을 줄이고 환자에 대한 안전성을 증가시키면서 비용을 절감할 수 있다.
GITR 및 CTLA-4의 세포 표면 발현 패턴은 부분적으로 중복되어 있다. 따라서, GITR 및 CTLA-4를 표적화하는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체는 시스 및 트랜스 모두에서 표적 둘 다에 결합할 가능성을 갖는다. 이러한 이중특이적 항체는 잠재적으로, 동일한 세포에서 시스로의 수용체 클러스터링 수준을 증가시키거나, 또는 2 개의 세포 사이에 인공 면역 시냅스를 생성시킴으로써, FcγR- 가교 결합 독립적 방식으로 GITR 및 CTLA-4를 통해 자극하는 능력을 가질 것이고, 또한 이는 2 개 세포 모두에서 향상된 수용체 클러스터링 및 증가된 신호전달을 유도할 수 있다. 이러한 세포-세포 상호작용은 증가된 면역 활성화를 유도하며, 이는 개별적인 단일특이적 항체들의 조합에 의해서는 달성되지 않는다.
따라서, 예시적인 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 GITR 및 CTLA-4에 특이적으로 결합하여 하기의 것을 유도할 수 있다:
1. 단일 특이적 항체에 비해 더 높은 정도의 면역 활성화. 면역 활성화는 CTLA-4 및 GITR 단일특이적 항체의 조합보다 상당히 높다.
2. Fc 감마 수용체를 발현하는 다른 세포와 같은 가교 결합 시약, 웰 표면과 같은 표면에 항체를 부착시키는 것에 의한 물리적 가교, 또는 단일특이적 항체의 Fc 부분에 결합하는 가교 항체의 존재 하에서만 활성화되는 단일특이적 항체와는 대조적으로, GITR 및 CTLA-4 결합 독립체(entity)에 의해 제공된 가교 결합을 제외하고는 어느 가교 결합도 없는 상태에서 활성화된다.
3. 보다 지향된/국소화된 면역 활성화. 면역 활성화는 높은 GITR 발현 및 CTLA-4 발현을 모두 포함하는 환경에서만 발생한다. 종양 미세 환경은 이러한 환경이다. 이는 효과를 증가시키고 또한 독성 부작용을 최소화할 가능성을 갖는다. 따라서, 치료 윈도우가 증가될 수 있다.
"폴리펩타이드"는 본원에서 가장 넓은 의미로 2 개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 다른 펩타이드 모방체의 화합물을 지칭하기 위해 사용된다. 따라서, 용어 "폴리펩타이드"는 짧은 펩타이드 서열 및 보다 긴 폴리펩타이드 및 단백질도 또한 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은, D 및 L 광학적인 이소타입을 포함한 천연 및/또는 비-천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩타이드 모방체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "다중특이적"은, 폴리펩타이드가 적어도 2 개의 상이한 표적 독립체, 이 경우에는 GITR 및 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 유리하게는, 본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 GITR의 세포외 도메인 및 CTLA-4의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 이러한 결합 특이성은 생체내에서, 즉 환자에게 이중특이적 폴리펩타이드의 투여 후에 명백해야 한다.
한 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 결합 도메인은 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체" 또는 "항체들"은, 항원 결합 부위를 함유하는 분자, 예를 들어 면역글로불린 분자, 및 항원 결합 부위를 함유하는 면역글로불린 분자의 면역 활성 단편을 지칭한다. 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 유형의 것일 수 있다. 항체는 합성 항체, 모노클로날 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 항체, 재조합 생성 항체, 다중특이적 항체 (이중특이적 항체 포함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인트라바디, scFvs (예를 들어, 단일특이적 및 이중 특이적인 것 등 포함), Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화-결합 Fv (sdFv), 항-이디오타입(항-Id) 항체, 및 상기 어느 것의 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "~로 지향되는" 또는 "~에 대하여 지향되는"은, 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 특정 표적/마커/에피토프/항원에서 그의 결합 특이성(들)을 지향시키도록 구성된 항체, 즉 표적/마커/에피토프/항원에 면역특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 또한, "~로 지향되는" 또는 "~에 대하여 지향되는" 것과 동일한 정의를 갖는 특정 대상/마커/에피토프"에 대해 선택적"인 항체라는 표현이 사용된다. 적어도 2 개의 상이한 표적/마커/에피토프/항원으로 지향되는 (그에 대해 선택적인) 다중특이적 (예를 들어 이중특이적) 항체는 표적/마커/에피토프/항원 모두에 면역특이적으로 결합한다. 항체가 GITR과 같은 특정 표적 항원으로 지향되는 경우, 상기 항체는 상기 표적 항원 구조 상에 존재하는 임의의 적합한 에피토프에 대해 지향될 수 있는 것으로 가정된다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 단편"은, F(ab').sub.2, F(ab).sub.2, Fab', Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 일부분이다. 구조와는 상관없이, 항체 단편은 온전한 항체가 인식하는 동일한 항원과 결합한다. 예를 들어, 항-GITR 항체 단편은 GITR에 결합한다. 용어 "항체 단편"은 또한, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 단리된 절편, 예컨대 경쇄 및 중쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 및 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커 ("scFv 단백질")에 의해 연결된 재조합 단쇄 폴리펩타이드 분자를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체 단편"은, 항원 결합 활성이 없는 항체의 부분, 예컨대 Fc 단편 또는 단일 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
ScFv 도메인은 본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체에 포함시키기에 특히 바람직하다.
따라서, 한 구현예에서, 폴리펩타이드는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체이다.
당업자는 본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 여러 상이한 구조적 형태의 것일 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어, Chan & Carter, 2016, Nature Reviews Immunology 10, 301-316 참조, 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨).
예시적인 구현예에서, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체는 하기의 것으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i) 2가 이중특이적 항체, 예컨대 IgG-scFv 이중특이적 항체 (예를 들어, 여기서 B1은 온전한 IgG이고, B2는 IgG의 경쇄의 N-말단 및/또는 경쇄의 C-말단에서, 그리고/또는 중쇄의 N-말단 및/또는 중쇄의 C-말단에서 B1에 부착되거나, 또는 그 반대임);
ii) 1가 이중특이적 항체, 예컨대 DuoBody ® (Genmab AS, 덴마크 코펜하겐) 또는 '놉-인-홀(knob-in-hole)' 이중특이적 항체 (예를 들어, scFv-KIH, scFv-KIHr, BiTE-KIH 또는 BiTE- KIHr (Xu 등, 2015, mAbs 7(1):231-242 참조);
iii) scFv2-Fc 이중특이적 항체 (예컨대 Emergent Biosolutions Inc로부터의 ADAPTIR™ 이중특이적 항체);
iv) BiTE/scFv2 이중특이적 항체;
v) DVD-Ig 이중특이적 항체;
vi) DART-기반 이중특이적 항체 (예를 들어, DART2-Fc, DART2-Fc 또는 DART);
vii) DNL-Fab3 이중특이적 항체; 및
viii) scFv-HSA-scFv 이중특이적 항체.
따라서, 본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체의 바람직한 구현예에서:
(a) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2는 온전한 IgG 항체이거나 (또는 이들이 함께 온전한 IgG 항체를 형성하고);
(b) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2는 Fv 단편 (예를 들어, scFv)이고/거나;
(c) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2는 Fab 단편이고; 및/또는
(d) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2는 단일 도메인 항체 (예를 들어, 도메인 항체 및 나노바디)이다.
예를 들어, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체는 IgG-scFv 항체일 수 있다. IgG-scFv 항체는 VH-VL 또는 VL-VH 배향일 수 있다. 한 구현예에서, scFv는 VH와 VL 사이의 S-S 브릿지에 의해 안정화될 수 있다.
대안적 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 항체 가변 도메인 또는 그의 일부를 포함하거나 이들로 이루어진 제 1 결합 도메인, 및 항체 가변 도메인 또는 그의 일부가 아닌 제 2 결합 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 제 1 및/또는 제 2 결합 도메인은 비-항체 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, B1은 IgG1 항체를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있고, B2는 비-면역글로불린 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있고, 또는 그 반대이다.
한 구현예에서, B2는 CTLA-4에 결합할 수 있는 CD86 도메인 또는 그의 변이체를 포함하거나 이들로 이루어진다.
당업자는 결합 도메인 B1 및 결합 도메인 B2가 서로 직접 융합됨을 이해할 것이다.
대안적 구현예에서, 결합 도메인 B1 및 결합 도메인 B2는 폴리펩타이드 링커를 통해 결합된다. 예를 들어, 폴리펩타이드 링커는 약 10 내지 약 25 개 아미노산 사이의 짧은 링커 펩타이드일 수 있다. 링커는 일반적으로 가요성을 위해서는 글리신이 풍부하고, 용해도를 위해서는 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결할 수 있거나, 그 반대이다. 예시 링커는 서열 번호 47 내지 51 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열의 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 당업계에서 사용되는 임의의 공지된 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab 및 Mab2 (F-star), Fc-조작된 IgG1 (Xencor) 또는 DuoBody (Fab 아암(arm) 교환에 기초함, Genmab)를 포함한다. 이중특이적 항체를 제조하는데 유용한 다른 플랫폼의 예는 WO 2008/119353 (Genmab), WO 2011/131746 (Genmab)에 기재되며, 또한 van der Neut-Kolfschoten 등에 의해 보고 (2007, Science 317 (5844): 1554-7)된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하이브리드 하이브리도마 및 화학적 컨쥬게이션 방법 (Marvin and Zhu (2005) Acta Ph아암acol Sin 26: 649)과 같은 전통적인 방법을 사용할 수도 있다. 상이한 중쇄 및 경쇄로 이루어진 2 개의 항체의 숙주 세포에서 동시-발현은, 원하는 이중특이적 항체 이외에도 가능한 항체 생성물의 혼합물을 유도하고, 이는 이후 예를 들어 친화성 크로마토그래피 또는 유사한 방법에 의해 단리될 수 있다.
당업자는, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체가 바람직하게는 인간 Fc 영역, 또는 상기 영역의 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 영역은 IgG1, IgG2 IgG3 또는 IgG4 영역, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 영역임을 이해할 것이다.
항체의 불변 (Fc) 영역은, 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 전형적 보체 시스템의 제 1 성분 (C1q)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. Fc 영역은 바람직하게는 인간 Fc 영역, 또는 상기 영역의 변이체이다. Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 영역, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 영역일 수 있다. Fc 영역의 변이체는 전형적으로, 폴리펩타이드의 개선된 기능 및/또는 반감기를 제공하는 변경된 친화성으로 FcγR 및/또는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)와 같은 Fc 수용체와 결합한다. 생물학적 기능 및/또는 반감기는 천연 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 반감기에 비해 증가되거나 감소될 수 있다. 변이체 Fc 영역의 존재에 의해 조절될 수 있는 생물학적 기능의 예는, 항체 의존성 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포 식균 작용 (ADCP), 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및/또는 아폽토시스를 포함한다.
따라서, Fc 영역은 자연 발생될 수 있고 (예를 들어, 내인성으로 생성된 인간 항체의 일부), 또는 인공적일 수 있다 (예를 들어, 자연 발생 인간 Fc 영역 대비, 하나 이상의 점 돌연변이를 포함).
당업계에 널리 공지된 바와 같이, 항체의 Fc 영역은 CDC, ADCC 및 ADCP와 같은 그의 혈청 반감기 및 효과기 기능을 매개한다.
치료용 모노클로날 항체 또는 Fc 융합 단백질의 Fc 영역의 조작은, 이들에 대해 요구되는 약리학적 활성에 보다 적합한 분자를 생성할 수 있다 (Strohl, 2009, Curr Opin Biotechnol 20 (6): 685-91, 이는 본원에 참고로 포함됨).
(a)
증가된 반감기를 위한 조작된 Fc 영역
치료용 항체의 효능을 개선시키기 위한 하나의 접근법은, 그의 혈청 지속성을 증가시킴으로써, 보다 높은 순환 수준, 덜 빈번한 투여 및 감소된 투여량을 허용하는 것이다.
IgG의 반감기는 신생아 수용체 FcRn에 대한 pH 의존성 결합에 의존한다. 내피 세포의 표면 상에서 발현되는 FcRn은 pH 의존적으로 IgG에 결합하여 이를 분해로부터 보호한다.
pH 6.0에서 FcRn에 선택적으로 결합하지만 pH 7.4에서는 결합하지 않는 일부 항체는, 다양한 동물 모델에서 보다 높은 반감기를 나타낸다.
CH2와 CH3 도메인 사이의 경계면에 위치하는 여러 돌연변이, 예컨대 T250Q/M428L (Hinton 등, 2004, J Biol Chem. 279(8):6213-6, 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨) 및 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F (Vaccaro 등, 2005 Nat, Biotechnol 23(10): 1283-8, 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)는 생체내에서 FcRn에 대한 결합 친화성 및 IgG1의 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다.
(b)
변경된 효과기 기능을 위한 조작된 Fc 영역
치료 항체 또는 Fc 융합 단백질 적용에 따라, 효과기 기능 (예컨대 ADCC)을 감소시키거나 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
세포-표면 분자를 표적화하는 항체, 특히 면역 세포 상의 항체들의 경우, 특정 임상 증상에 대해 요구될 수 있는 효과기 기능의 폐지가 필요할 수 있다.
반대로, 종양학 용도 (예컨대 백혈병 및 고형 종양의 치료에서; 하기 참조)로 의도된 항체에서, 효과기 기능 증가는 치료 활성을 개선시킬 수 있다.
4 개의 인간 IgG 이소타입은 상이한 친화성으로 활성화 Fcγ 수용체 (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 억제 FcγRIIb 수용체, 및 보체의 제 1 성분(C1q)에 결합하여, 매우 상이한 효과기 기능을 생성한다 (Bruhns 등, 2009, Blood. 113(16):3716-25, 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨).
FcγR 또는 C1q에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치한 잔기에 의존한다. CH2 도메인의 두 영역은 FcγR 및 C1q 결합에 중요하며, IgG2 및 IgG4에서는 독특한 서열을 갖는다. 인간 IgG1를 위치 233-236의 IgG2 잔기 및 위치 327, 330 및 331의 IgG4 잔기로 치환시키는 경우, ADCC 및 CDC를 크게 감소시키는 것으로 나타났다 (아암or 등, 1999, Eur J Immunol. 29(8): 2613-24; Shields 등, 2001, J Biol Chem. 276(9): 6591-604, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). 또한, Idusogie 등은, K322를 포함한 상이한 위치에서의 알라닌 치환이 보체 활성화를 유의하게 감소시킨다는 것을 입증하였다 (Idusogie 등, 2000, J Immunol. 164(8): 4178-84, 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). 유사하게, 뮤린 IgG2A의 CH2 도메인의 돌연변이는 FcγRI 및 C1q에 대한 결합을 감소시키는 것으로 나타났다 (Steurer 등, 1995 J Immunol. 155(3): 1165-74, 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨).
다수의 돌연변이가 인간 IgG1의 CH2 도메인에서 만들어졌고, ADCC 및 CDC에 대한 이들의 효과가 시험관내에서 시험되었다 (상기에서 인용된 참고 문헌 참조). 특히, 위치 333에서의 알라닌 치환은 ADCC 및 CDC 모두를 증가시키는 것으로 보고되었다 (Shields 등, 2001, 상기 문헌; Steurer 등, 1995, 상기 문헌). Lazar 등은, FcγRIIIa에 대한 높은 친화성 및 FcγRIIb에 대한 낮은 친화성을 가져서, 향상된 ADCC를 생성하는 삼중 돌연변이 (S239D/I332E/A330L)를 기재하였다 (Lazar 등, 2006, PNAS (103)(11):4005-4010, 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). 동일한 돌연변이를 증가된 ADCC를 갖는 항체를 생성하는 데 사용하였다 (Ryan 등, 2007, Mol. Cancer Ther. 6:3009-3018, 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). Richards 등은, 대식세포에 의한 표적 세포의 증식된 식균작용을 매개하는, 개선된 FcγRIIIa 친화성 및 FcγRIIa/FcγRIIb 비율을 갖는 약간 상이한 삼중 돌연변이체 (S239D/I332E/G236A)를 연구했다 (Richards 등, 2008. Mol Cancer Ther. 7(8): 2517-27, 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨).
효과기 기능이 없기 때문에, IgG4 항체는 세포 고갈없이 수용체 조절을 위한 바람직한 IgG 하위 유형을 나타낸다. IgG4 분자는 Fab-아암 교환으로 불리는 동적 과정에서 반-분자들을 교환할 수 있다. 이 현상은 또한 치료용 항체와 내인성 IgG4 사이에서 생체내에서 발생할 수도 있다.
S228P 돌연변이는 예측불가능한 정도가 낮은 치료용 IgG4 항체의 설계를 가능하게 하는 이 재조합 과정을 방지하는 것으로 나타났다 (Labrijn 등, 2009, Nat Biotechnol. 27(8):767-71, 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨).
조작된 Fc 영역의 예를 하기 표 Ⅰ에 나타내었다.
표 Ⅰ
*Fc 아미노산 돌연변이의 위치는 Eu 번호 지정 전략을 사용하여 정의되며, 이는 상기 서열 번호 18 및 19의 번호 지정과는 다르다: Edelman 등, 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63:78-85)을 참고하라.
표 Ⅰ에 대한 참고
추가의 구현예에서, Fc 영역의 효과기 기능은, 예를 들어 생성 동안 푸코스, 갈락토스, 이등분 N-아세틸글루코사민 및/또는 시알산의 상대 수준을 변형시킴으로써, 이의 CH2 도메인 내의 탄수화물 잔기의 변형을 통해 변경될 수 있다 (Jefferis, 2009, Nat Rev Drug Discov. 8(3):226-34 and Raju, 2008, Curr Opin Immunol., 20(4):471-8 참조; 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨).
따라서, Fc 영역에서 푸코스 잔기가 부족하거나 낮은 치료용 항체는 인간에서 향상된 ADCC 활성을 나타낼 수 있음이 공지되어 있다 (예를 들어, Peipp 등, 2008, Blood 112(6): 2390-9, Yamane-Ohnuki & Satoh, 2009, MAbs 1(3): 230-26, Iida 등, 2009, BMC Cancer 9;58 참조, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). 낮은 푸코스 항체 폴리펩타이드는 킨푸넨신과 같은 만노시다제 억제제를 함유하는 배지에서 배양된 세포에서의 발현에 의해 생성될 수 있다. 낮은 푸코스 항체 폴리펩타이드는 FcγRIIIA와 같은 FcγR을 포함한 Fc 수용체에 증가된 결합을 나타낸다.
항체의 낮은 푸코스 형태로의 글리코실화를 변형시키는 다른 방법은, GDP-푸코스 대신에 GDP-만노스 (GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스)의 GDP-람노스로의 전환을 위한, 세포에서의 박테리아 효소 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로스 리덕타제의 사용을 포함한다 (예를 들어 PrBioGen AG (독일 베를린)의 GlymaxX® 기술 사용).
낮은 푸코스 항체를 생성하는 또 다른 방법은, 항체-생성 세포에서 알파-(1,6)-푸코실트랜스퍼라제의 억제 또는 고갈에 의한 것이다 (예를 들어, Lohza Ltd (스위스 바젤) 및 BioWa (미국 뉴저지주 프린스톤)의 Potelligent® CHOK1SV 기술 사용).
따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 천연 인간 항체와 비교하여 감소된 푸코스를 갖는 Fc 영역을 갖는다.
한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 무푸코실화 (또는 탈푸코실화)된 Fc 영역을 갖는다.
"무푸코실화", "탈푸코실화" 또는 "비-푸코실화" 항체는, 항체의 Fc 영역이 임의의 부착된 푸코스 당 단위를 갖지 않거나, 푸코스 당 단위의 감소된 함량을 갖는 것을 의미한다. 감소된 함량은 푸코실화 "야생형" 항체와 비교한 변형된 항체 상의 푸코스의 상대적 양, 예를 들어 만노시다제 억제제의 부재 하 및/또는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로스 리덕타제의 존재 하에 발현되는 등가 항체와 비교하여 면역글로불린 1분자당 더 적은 푸코스 당 단위로 정의될 수 있다.
(완전한 중쇄를 형성하기 위해) 본원에 개시된 임의의 VH 영역 서열과 조합예시적인 중쇄 불변 영역 아미노산 서열은, 여기에 재현된 IgG1 중쇄 불변 영역 서열이다:
(서열 번호 97)
다른 중쇄 불변 영역 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 또한 본원에 개시된 임의의 VH 영역과 조합될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 불변 영역은 여기에 재현된 것과 같은 변형된 IgG4 불변 영역이다:
(서열 번호 99)
이 변형된 IgG4 서열은 감소된 FcRn 결합을 나타내며, 따라서 야생형 IgG4와 비교하여 감소된 혈청 반감기를 초래한다. 또한, IgG4의 코어 힌지의 안정화를 나타내어 IgG4를 보다 안정하게 만들고, Fab 아암 교환을 방지한다.
또 다른 바람직한 불변 영역은 여기에 재현된 것과 같은 변형된 IgG4 불변 영역이다:
(서열 번호 101)
이 변형된 IgG4 서열은 IgG4의 코어 힌지의 안정화를 제공하여 IgG4를 보다 안정하게 만들고, Fab 아암 교환을 방지한다.
또한 여기에 재현된 것과 같은 야생형 IgG4 불변 영역이 바람직하다:
(서열 번호 100)
(완전한 경쇄를 형성하기 위해) 본원에 개시된 임의의 VL 영역 서열과 조합예시적인 경쇄 불변 영역 아미노산 서열은, 여기에 재현된 카파 사슬 불변 영역 서열이다:
(서열 번호 98)
다른 경쇄 불변 영역 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 또한 본원에 개시된 임의의 VL 영역과 조합될 수 있다.
항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 특정 바람직한 결합 특징 및 기능적 효과를 가지며, 이는 하기에서 보다 상세히 설명된다. 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 바람직하게는 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드의 일부로서 혼입될 때 이들 결합 특징 및 기능적 효과를 보유한다.
한 구현예에서, 항원 결합 단편은, Fv 단편 (예컨대 단쇄 Fv 단편, 또는 이황화-결합된 Fv 단편), Fab-유사 단편 (예컨대 Fab 단편; Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편) 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
한 구현예에서, 이중특이적 폴리펩타이드는, 카파 사슬의 C-말단 부분으로 융합된 비-면역글로불린 폴리펩타이드를 갖는 IgG1 항체 (예컨대 CTLA-4 결합 도메인, 예를 들어 CD86 또는 그의 돌연변이 형태, 예컨대 서열 번호 17; 하기 참조)일 수 있다.
한 구현예에서, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는, 중쇄 감마 1 사슬의 C-말단에 융합된 scFv 단편을 갖는 IgG1 항체일 수 있다.
한 구현예에서, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 2 개의 상이한 표적 (이 경우, GITR 및 CTLA-4)에 결합하는 2-4 scFv를 함유할 수 있다.
표적으로는, 활성 상태 또는 불활성 상태의 CD3+ T 세포의 세포막에 위치한 폴리펩타이드 수용체가 포함된다. 이러한 막-결합 수용체는 투여 후 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드가 접근하기 위해 세포외로 노출될 수 있다.
당업자는 표적 (GITR 및 CTLA-4)이 세포 표면 상에 국소화될 수 있음을 이해할 것이다. "세포 표면 상에 국소화됨"은, 표적의 하나 이상의 영역이 세포 표면의 외면에 존재하도록 표적이, 세포와 관련되어 있음을 의미한다. 예를 들어, 표적은 세포외질 표면 상에 제시된 하나 이상의 영역을 갖는 세포 원형질막 내로 삽입될 수 있다 (즉, 막관통 단백질로서 배향됨). 이는 세포에 의한 표적 발현 과정에서 일어날 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, "세포 표면 상에 국소화됨"은 "세포 표면 상에서 발현됨"을 의미할 수 있다. 대안적으로, 표적은 세포의 외부에 있을 수 있는데, 공유 및/또는 이온 상호작용으로 인해 이들이 세포 표면의 특정 영역 또는 영역들에 국소화시킬 수 있다.
당업자는, 본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체는 ADCC, ADCP, CDC 및/또는 아폽토시스를 유도할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 한 구현예에서, 폴리펩타이드는 GITR 발현 종양 세포를 표적화하고 면역계를 활성화시킬 수 있다.
예를 들어, 폴리펩타이드는, 선택적으로 ADCC를 통해, GITR 발현 종양 세포를 사멸시킬 수 있다.
당업자는, 면역계의 활성화가 효과기 T 세포의 활성화를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
추가의 구현예에서, 폴리펩타이드는 종양 면역을 유도할 수 있다. 이는, 예를 들어 IL-2 및 IFNγ 생성을 측정함으로써, T 세포 활성화 검정에서 시험관내에서 시험될 수 있다. 효과기 T 세포의 활성화는 종양 특이적 T 세포 반응이 생체내에서 달성될 수 있음을 암시한다. 또한, 마우스 모델과 같은 생체내 모델에서 항-종양 반응은 종양에 대한 성공적인 면역 반응이 달성되었음을 암시한다.
다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체는 T 세포 표적을 발현하는 세포의 활성을 조절할 수 있으며, 상기 조절은 상기 세포의 활성의 증가 또는 감소이다. 세포는 일반적으로 T 세포이다. 항체는 CD4+ 또는 CD8+ 효과기 세포의 활성을 증가 시킬 수 있거나, 또는 조절 T 세포 (Treg)의 활성을 감소시킬 수 있다. 두 경우 중 어느 하나에서, 항체의 순(net) 효과는 효과기 T 세포의 활성 증가일 것이다. 효과기 T 세포의 활성 변화를 측정하는 방법은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 대조군의 존재 하에 T 세포 IFNγ 또는 IL-2 생성 및/또는 T 세포 증식의 수준 대비, 항체의 존재 하에 T 세포 IFNγ 또는 IL-2 생성 수준의 증가 또는 T 세포 증식의 증가를 측정하는 것을 포함한다. 세포 증식 및/또는 IFNγ 또는 IL-2 생성에 대한 분석은 널리 공지되어 있고, 실시예에 예시되어 있다.
표적을 향한 리간드의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 분석은 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블랏, RIA 및 유동 세포계측법 분석을 포함하여 당업계에 널리 공지되어 있다. 폴리펩타이드의 결합 동역학 (예를 들어, 결합 친화성)은 또한 표면 플라스몬 공명 분석 (SPR) 또는 생물층 간섭계 (BLI)와 같은 당업계에 공지된 표준 검정에 의해 평가될 수 있다.
용어 "결합 활성" 및 "결합 친화성"은, 폴리펩타이드 분자가 표적에 결합하거나 결합하지 않는 경향을 지칭하도록 의도된다. 결합 친화성은 폴리펩타이드 및 그의 표적에 대한 해리 상수 (Kd)를 측정함으로써 정량화될 수 있다. Kd는 낮을 수록 표적에 대한 친화성이 더 높은 것을 나타낸다. 유사하게, 폴리펩타이드의 그의 표적에 대한 결합 특이성은 폴리펩타이드 및 또 다른 비-표적 분자에 대한 해리 상수 대비, 그의 표적에 대한 폴리펩타이드의 비교 해리 상수 (Kd)로 정의될 수 있다.
이 해리 상수의 값은 널리 공지된 방법에 의해 직접 측정될 수 있고, 예를 들어 [Caceci 등, Byte 9: 340-362, 1984 (이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)]에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 복합 혼합물에 대해서도 계산될 수 있다. 예를 들어, Kd는 [Wong & Lohman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993]에 개시된 것과 같은 이중-필터 니트로셀룰로스 필터 결합 분석을 사용하여 확립될 수 있다. ELISA, 웨스턴 블랏, RIA 및 유동 세포계측법 분석을 포함하여, 표적에 대한 항체와 같은 리간드의 결합 능력을 평가하는 다른 표준 분석법이 당업계에 공지되어 있다. 항체의 결합 동역학 (예를 들어, 결합 친화성)은 또한 Biacore™ 또는 Octet™ 시스템 분석과 같은 당업계에 공지된 표준 검정에 의해 평가될 수 있다.
항체의 표적에 대한 결합을, 또 다른 항체와 같은 그 표적의 또 다른 공지된 리간드에 의한 표적에 대한 결합과 비교하는 경쟁 결합 분석을 수행할 수 있다. 50% 억제가 일어나는 농도는 Ki로 공지되어 있다. 이상적인 조건에서, Ki는 Kd와 같다. Ki 값은 Kd보다 작지 않을 것이고, 따라서 Ki의 측정은 Kd의 상한을 제공하도록 편리하게 대체될 수 있다.
결합 친화성의 대안적 측정은 EC50 또는 IC50을 포함한다. 이러한 맥락에서 EC50은 폴리펩타이드가 고정된 양의 표적에 최대 결합의 50%를 달성하는 농도를 나타낸다. IC50은 폴리펩타이드가 고정된 양의 표적에 고정된 양의 경쟁자의 최대 결합의 50%를 억제하는 농도를 나타낸다. 두 경우 모두, 낮은 수준의 EC50 또는 IC50은 표적에 대한 보다 높은 친화성을 나타낸다. 그의 표적에 대한 리간드의 EC50 및 IC50 값은 둘 다 널리 공지된 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 측정될 수 있다. EC50 및 IC50을 평가하기 위한 적합한 검정은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 바람직하게는, 또 다른 비-표적 분자에 대한 그의 결합 친화성에 비해 적어도 2 배, 10 배, 50 배, 100 배 또는 그 이상인 친화성을 갖고 그의 표적 각각에 결합할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 임의의 적합한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 전부 또는 일부는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 의해 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
대안적으로, 부분 B1 및 B2는 별도로 제조된 다음, 후속적으로 함께 조합될 수 있다. 결합은 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 상기한 화학적 컨쥬게이션 방법 및 링커를 사용하여 달성될 수 있다. 부분 B1 및 B2의 별도의 생성은 임의의 적절한 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 하기에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 선택적으로 별도의 세포에서 별도의 뉴클레오타이드로부터의 발현에 의해 달성될 수 있다.
당업자는, 본 발명의 다중특이적 항체가 GITR 및 CTLA-4 이외에도 표적 항원에 결합할 수 있음을 이해할 것이다; 달리 말하면, 본 발명은 3개 이상의 표적에 결합하는 다중특이적 항체를 포함한다.
예를 들어, 다중특이적 폴리펩타이드는 GITR, CTLA-4 및 추가 표적 항원에 결합할 수 있는 삼중특이적 항체일 수 있다. 따라서, 추가의 표적 항원은 추가의 T 세포 표적일 수 있다.
한 구현예에서, 추가의 T 세포 표적은 동시-자극 또는 동시-억제 분자와 같은 체크포인트 분자이다. "동시-자극"에는 T 세포 활성화를 촉진할 수 있는 동시-신호전달 분자가 포함된다. "동시 억제"에는 T 세포 활성화를 억제할 수 있는 동시-신호전달 분자가 포함된다.
따라서, 추가의 T 세포 표적은 자극 체크포인트 분자 (예컨대 CD27, CD137, CD28, ICOS 및 OX40)일 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 다중특이적 폴리펩타이드는 자극 체크포인트 분자에서 작용제이다.
대안적으로 또는 부가적으로, 추가의 T 세포 표적은 억제 체크포인트 분자 (예컨대 PD-1, Tim3, Lag3, Tigit 또는 VISTA)일 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 다중특이적 폴리펩타이드는 억제 체크포인트 분자에서 길항제이다.
한 구현예에서, 추가의 T 세포 표적은 TNFR (종양 괴사 인자 수용체) 슈퍼패밀리 구성원이다. TNFR 슈퍼패밀리에는, 세포외 시스테인 풍부 도메인을 통해 종양 괴사 인자 (TNF)에 결합하는 능력을 특징으로 하는 사이토카인 수용체가 포함된다. TNFR의 예는 OX40 및 CD137을 포함한다.
추가의 구현예에서, 추가의 T 세포 표적은 OX40, CTLA-4, CD137, CD40 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 제 1 및/또는 제 2 T 세포 표적은 OX40, CTLA-4 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 폴리펩타이드는 GITR, CTLA-4 및 OX40에 결합할 수 있는 삼중특이적 항체일 수 있다.
변이체
본원에 기재된 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드 또는 그의 구성요소 결합 도메인 (예컨대 GITR 및 CTLA-4 결합 도메인)은 본원에서 언급된 임의의 특정 아미노산 서열의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있으며, 단 폴리펩타이드 또는 결합 도메인은 그의 표적에 대한 결합을 보유한다. 한 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 본원에서 언급된 서열의 CDR 서열을 보유할 수 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체는 표 C에 언급된 임의의 특정 아미노산 서열의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있으며, 단 항체는 그의 표적에 대한 결합을 보유한다. 이러한 변이체 또는 단편은 전형적으로 표 C의 상기 서열의 CDR 서열을 보유할 수 있다. CTLA-4 결합 도메인은 표 A의 임의의 서열의 변이체를 포함할 수 있으며, 단 그 결합 도메인은 그의 표적에 대한 결합을 보유한다.
본원에서 언급된 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 중 임의의 하나의 단편은, 상기 아미노산 서열로부터 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100 개의 연속적인 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에서 언급된 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 중 임의의 하나의 변이체는 상기 서열의 치환, 결실 또는 부가 변이체일 수 있다. 변이체는 상기 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 최대 10, 최대 20, 최대 30 개 또는 그 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다. "결실" 변이체는 개개의 아미노산의 결실, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산과 같은 아미노산의 소그룹의 결실, 또는 특정 아미노산 또는 다른 특징부의 결실과 같은 보다 큰 아미노산 영역의 결실을 포함할 수 있다. "치환" 변이체는 바람직하게는 동일한 수의 아미노산으로 하나 이상의 아미노산을 치환하고 보존적 아미노산을 치환하는 것을 포함한다. 예를 들어, 아미노산은, 유사한 특성을 갖는 대안적 아미노산, 예를 들어, 또 다른 염기성 아미노산, 또 다른 산성 아미노산, 다른 중성 아미노산, 또 다른 하전된 아미노산, 또 다른 친수성 아미노산, 또 다른 소수성 아미노산, 또 다른 극성 아미노산, 또 다른 방향족 아미노산 또는 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적합한 치환기를 선택하기 위해 사용될 수 있는 20 개의 주요 아미노산의 일부 특성은 하기와 같다:
본원에서 아미노산은 전체 명칭, 3 문자 코드 또는 1 문자 코드로 지칭될 수 있다.
바람직한 "유도체" 또는 "변이체"는 자연 발생 아미노산 대신에 서열에 나타나는 아미노산이 그의 구조적 유사체인 아미노산을 포함한다. 서열에 사용된 아미노산은 또한, 항체의 기능에 유의하게 악영향을 미치지 않는다면, 유도체화 또는 변형, 예를 들어 표지화될 수 있다.
상기에 기재된 바와 같은 유도체 및 변이체는, 항체의 합성 동안 또는 생성 후 변형에 의해, 또는 항체가 재조합 형태인 경우, 부위-지향된 돌연변이 유발, 무작위 돌연변이 유발 또는 핵산의 효소적 절단 및/또는 결찰의 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
바람직하게는, 변이체는 본원에 개시된 서열에 나타낸 서열과 60% 초과 또는 70% 초과, 예를 들어 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예를 들어 90 또는 95% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 아미노산 동일성의 수준은 관련 서열 번호 서열의 전체 길이에 걸쳐, 또는 전장 폴리펩타이드의 크기에 따라 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 개 또는 그 이상의 아미노산과 같은 서열의 일부에 걸쳐 나타날 수 있다.
아미노산 서열과 관련하여, "서열 동일성"은, 하기 파라미터로 ClustalW (Thompson 등, 1994, Nucleic Acids Res. 22(22): 4673-80; 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)를 사용하여 평가할 때 명시된 값을 갖는 서열을 지칭한다:
쌍방향 정렬 파라미터 - 방법: accurate, 매트릭스: PAM, 갭 오픈 페널티: 10.00, 갭 확장 페널티: 0.10;
다중 정렬 파라미터 - 매트릭스: PAM, 갭 오픈 페널티: 10.00, 지연에 대한% 동일성: 30, 말단 갭 페널라이즈: on, 갭 분리 거리: 0, 음성 매트릭스: no, 갭 확장 페널티: 0.20, 잔기-특이적 갭 페널티: on, 친수성 갭 페널티: on, 친수성 잔기: GPSNDQEKR. 특정 잔기에서의 서열 동일성은 단순히 유도체화된 동일한 잔기를 포함하도록 의도된다.
폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 세포
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 폴리펩타이드, 또는 B1의 전부 또는 일부 또는 B2의 전부 또는 일부를 암호화할 수 있다. 용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 그의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적 예로는, 유전자, 유전자 단편, 메신저 RNA (mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머가 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 단리된 또는 실질적으로 단리된 형태로 제공될 수 있다. 실질적으로 단리됨은, 임의의 주위의 배지로부터 폴리펩타이드의 실질적인, 그러나 전체는 아닌 단리가 존재할 수 있음을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 그의 의도된 용도를 방해하지 않는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있고, 이는 여전히 실질적으로 단리된 것으로 간주된다.
선택된 폴리펩타이드를 "암호화"하는 핵산 서열은, 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓여질 때 생체내에서 폴리펩타이드로 전사 (DNA의 경우) 및 번역 (mRNA의 경우)되는 핵산 분자이다. 암호화 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3' (카르복시) 말단의 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 핵산 서열은, 바이러스, 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 바이러스 또는 원핵 DNA 또는 RNA로부터의 게놈 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 종결 서열은 암호화 서열에 대해 3'에 위치할 수 있다.
항체의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 예를 암호화하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 본원에 개시된 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 표 C에 개시된 서열 중 임의의 하나를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 표 C에 나타낸 폴리펩타이드를 암호화하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 또한 표 C에 나타낸 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다 (인트론 서열은 소문자로 표시됨). CTLA-4 결합 도메인의 예를 암호화하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 표 B에 나타낸 바와 같이 서열 번호 25 내지 43 중 임의의 하나를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
적합한 폴리뉴클레오타이드 서열은 대안적으로 이들 특정 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 변이체는 임의의 상기 핵산 서열의 치환, 결실 또는 부가 변이체일 수 있다. 변이체 폴리뉴클레오타이드는 서열 목록에 주어진 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 최대 10, 최대 20, 최대 30, 최대 40, 최대 50, 최대 75 개 또는 그 이상의 핵산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
적합한 변이체는 본원에 개시된 핵산 서열 중 임의의 하나의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 70%, 바람직하게는 그와 적어도 80 또는 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 바람직하게는 이들 수준의 상동성 및 동일성은 적어도 폴리뉴클레오타이드의 암호화 영역에 대하여 존재한다. 상동성을 측정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 당업자는 본원에서 상동성이 핵산 동등성에 기초하여 계산된다는 것을 이해할 것이다. 이러한 상동성은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 30, 예를 들어, 적어도 40, 60, 100, 200 개 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 존재할 수 있다. 이러한 상동성은 변형되지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 상동성 또는 동일성을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 상동성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다 (예를 들어 그의 디폴트 설정에서 사용됨) (Devereux 등, 1984, Nucleic Acids Research 12: 387-395; 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨).
PILEUP 및 BLAST 알고리즘이 또한, 예를 들어 [Altschul, 1993, J Mol Evol 36: 290-300; Altschul 등, 1990, J Mol Biol 215: 403-10 (이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)]에 기재된 바와 같이, (전형적으로 그의 디폴트 설정에서) 상동성 또는 라인 업 서열을 계산하기 위해 사용될 수 있다.
BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공개적으로 입수가능하다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양수 값 임계 스코어 T와 일치하거나 만족하는 쿼리 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 식별하여 높은 스코어링 서열 쌍 (HSP)을 먼저 식별하는 것을 포함한다. T는 인접 단어 스코어 임계 값으로 불린다 (Altschul 등, 상기 문헌). 이러한 초기 인접 단어 히트는 이를 포함하는 HSP를 찾기 위해 검색을 시작하기 위한 시드로서 사용된다. 단어 히트는 누적 정렬 스코어를 증가시킬 수 있는 한 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 각 방향의 단어 히트에 대한 확장은, 누적 정렬 점수가 하나 이상의 음수-스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하가 되는 경우; 또는 두 서열 중 하나의 끝에 도달하는 경우 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 11의 단어 길이 (W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 참조; 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨) 정렬 (B), 10의 기대치 (E), M = 5, N = 4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 두 서열 간의 유사성에 대한 통계 분석을 수행한다 (예를 들어, Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 참조; 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 측정은, 2 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공하는, 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 제 1 서열과 제 2 서열을 비교할 때 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 서열은 또 다른 서열과 유사하다고 간주된다.
상동체는 3, 5, 10, 15, 20 개 또는 그 이상의 돌연변이 (각각은 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음)에 의해 관련 폴리뉴클레오타이드의 서열과 상이할 수 있다. 이러한 돌연변이는 상동체의 적어도 30, 예를 들어 적어도 40, 60 또는 100 개 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다.
한 구현예에서, 변이체 서열은 유전 코드의 중복으로 인해 서열 목록에 주어진 특정 서열과 다를 수 있다. DNA 코드는 4개의 1 차 핵산 잔기 (A, T, C 및 G)를 갖고, 이를 사용하여 유기체의 유전자에서 암호화된 단백질의 아미노산을 나타내는 3 문자 코돈을 "스펠링(spell)"한다. DNA 분자를 따르는 코돈의 선형 서열은 이들 유전자에 의해 암호화되는 단백질(들) 내의 아미노산의 선형 서열로 번역된다. 코드는 20 개의 천연 아미노산을 암호화하는 61개의 코돈 및 "정지" 신호를 나타내는 3개의 코돈으로 고도로 퇴화되어 있다. 따라서, 대부분의 아미노산은 하나 초과의 코돈에 의해 암호화된다 - 실제로 몇몇은 4개 이상의 상이한 코돈으로 암호화된다. 따라서, 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 또 다른 폴리뉴클레오타이드와 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화할 수 있지만, 동일한 아미노산을 암호화하기 위해 상이한 코돈의 사용으로 인해 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 그것을 암호화하고 발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 형태로 생성되거나 전달될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 [Green & Sambrook, 2012, Molecular Cloning - 실험실 매뉴얼, 4 판; Cold Spring Harbor Press (이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)]에 기재된 바와 같이, 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 삽입된 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 발현 카세트의 형태로 제공될 수 있고, 그에 따라 생체내에서 본 발명의 폴리펩타이드의 발현이 가능하다. 또한, 이러한 발현 카세트는 일반적으로 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터) 내에 제공된다. 이러한 발현 카세트는 숙주 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 숙주 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 유전 벡터를 사용하여 제조 및/또는 투여된다. 적합한 벡터는 충분한 양의 유전 정보를 운반할 수 있고 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 허용할 수 있는 임의의 벡터일 수 있다.
따라서, 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 이러한 발현 벡터는 분자 생물학 분야에서 통상적으로 구축되며, 예를 들어, 플라스미드 DNA 및 적절한 개시제, 프로모터, 인핸서, 및 예를 들어 폴리아데닐화 신호와 같은 다른 요소의 사용을 포함하고, 이는 필수적일 수 있고, 정확한 배향으로 배치되며, 이에 따라 본 발명의 펩타이드의 발현을 가능하게 된다. 다른 적합한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다 (Green & Sambrook, 상기 문헌 참조).
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하도록 변형된 세포를 포함한다. 이러한 세포는 포유류 세포 또는 곤충 세포와 같은 일시적 또는 바람직하게는 안정한 고등 진핵 세포주, 효모와 같은 하등 진핵 세포 또는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 또는 발현 카세트의 삽입에 의해 변형될 수 있는 세포의 특정 예로는, 포유류 HEK293T, CHO, HeLa, NS0 및 COS 세포가 포함된다. 바람직하게는, 선택된 세포주는 안정할뿐만 아니라 성숙 글리코실화 및 폴리펩타이드의 세포 표면 발현을 가능하게 하는 것이다.
본 발명의 이러한 세포주는 통상적인 방법을 사용하여 배양되어 본 발명의 폴리펩타이드를 생성할 수 있거나, 또는 치료적으로 또는 예방적으로 사용되어 본 발명의 항체를 대상체에게 전달할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트 또는 벡터를 대상체 유래의 세포에 생체외 투여하고, 이어서 세포를 대상체의 신체로 되돌릴 수 있다.
제약 제제, 치료 용도 및 환자 그룹
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 세포와 같은 본 발명의 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항체 및/또는 이중특이적 폴리펩타이드와 같은 본 발명의 하나 이상의 분자 및 적어도 하나의 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에서 사용되는 "제약학적으로 허용가능한 담체"는, 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 것)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 폴리펩타이드는 산의 작용 및 폴리펩타이드를 불활성화 또는 변성시킬 수 있는 다른 자연 조건으로부터 폴리펩타이드를 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
바람직한 제약학적으로 허용가능한 담체는 수성 담체 또는 희석제를 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 담체의 예는 물, 완충수 및 식염수를 포함한다. 다른 담체의 예로는 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 올레산 에틸과 같은 주사가능한 유기 에스테르가 포함된다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 조성물은 또한 제약학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 상기 살균 절차에 의해, 또한 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 조성물에 당, 염화나트륨 등의 등장제를 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사용 제약 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제의 포함에 의해 제공될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균성이고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀전, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙 구조로서 제형화될 수 있다.
멸균 주사용 용액은, 필요에 따라 적절한 용매 중의 필요한 양의 활성제 (예를 들어, 폴리펩타이드)를 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합물과 함께 혼입한 후 멸균 미세여과시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성제를 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은, 활성제의 분말 + 이전에 멸균 여과된 그의 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결 건조)이다.
특히 바람직한 조성물은 전신 투여 또는 국소 투여를 위해 제형화된다. 국소 투여는 종양 부위에서 또는 종양 드레이닝(draining) 림프절 내로의 투여일 수 있다. 조성물은 바람직하게는 일정 기간에 걸쳐 서방형으로 제형화될 수 있다. 따라서, 조성물은 서방을 촉진시키는 매트릭스 내에 또는 매트릭스의 일부로서 제공될 수 있다. 바람직한 서방형 매트릭스는 몬타니드 또는 γ-폴리글루탐산 (PGA) 나노입자를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 국소화된 방출은, 선택적으로 지속 기간에 걸쳐, CTLA-4 길항제의 투여와 관련된 잠재적 자가면역 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 폴리펩타이드뿐만 아니라 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이들은 또한 추가의 치료제 또는 예방제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 기타 조성물을 포함하는 키트 및 사용 지시서도 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 추가로 하나 이상의 추가 시약, 예를 들어 상기 논의된 바와 같은 추가의 치료제 또는 예방제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 치료학적 적용에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은, 질환 또는 하나 이상의 그의 증상을 치유, 완화 또는 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로, 장애 또는 병태를 이미 앓고있는 대상체에게 투여된다. 이러한 치료적 처치는 질환 증상의 중증도를 감소시키거나 증상이 없는 기간의 빈도 또는 기간을 증가시킬 수 있다. 이것을 달성하기에 충분한 양은 "치료 유효량"으로 정의된다. 예방적 적용에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 증상의 발병을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양으로 장애 또는 병태의 증상을 아직 나타내지 않는 대상체에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 대상체는 임의의 적합한 방법에 의해 질환 또는 병태를 발병할 위험이있는 것으로 확인되었을 수 있다.
특히, 본 발명의 항체 및 이중특이적 폴리펩타이드는 암의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이적 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 개체에게 본 발명의 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 암의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이적 폴리펩타이드를 제공한다.
암은 전립선암, 유방암, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 폐암, 자궁경부암, 횡문근육종, 신경모세포종, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 흑색종, 방광암, 위암, 두경부암, 간암, 피부암, 림프종 또는 아교모세포종일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이중특이적 폴리펩타이드, 또는 상기 항체 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 당업계에 공지된 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 전신 투여 또는 국소 투여가 바람직하다. 국소 투여는 종양 부위에서 또는 종양 드레이닝 림프절 내로의 투여일 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 조성물의 바람직한 투여 방식은 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 방식 (예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것)을 포함한다. 본원에서 사용되는 "비경 구 투여"라는 문구는, 통상적으로 주사에 의한, 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미한다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 조성물은 비경구 방식, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드의 적합한 투여량은 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준은, 환자에게 독성이 아니면서, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 변화될 수 있다. 선택된 투여 수준은, 사용된 특정 폴리펩타이드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 폴리펩타이드의 배설 속도, 치료 기간, 다른 약물, 사용된 특정 조성물과 조합되어 사용되는 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강 및 이전의 병력, 및 의학 분야에서 널리 공지된 유사 인자를 포함한 다양한 약동학 인자에 좌우될 것이다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드의 적절한 투여량은, 예를 들어, 치료될 환자의 체중 1 kg 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 적합한 투여량은 1일 당 약 1 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg 체중, 또는 1일 당 약 10 g/kg 내지 약 5 mg/kg 체중일 수 있다.
투여량 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스(bolus)가 투여될 수 있고, 여러번 분할된 용량이 시간에 따라 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여량 단위 형태는 치료하고자 하는 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 제약학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.
항체 또는 폴리펩타이드는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 다중 용량은 동일하거나 상이한 경로를 통해 동일하거나 상이한 위치로 투여될 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 폴리펩타이드는 상기에 기재된 서방형 제제로서 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자의 폴리펩타이드의 반감기 및 원하는 치료 기간에 따라 달라질 수 있다. 투여의 투여량 및 빈도는 또한 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서는, 상대적으로 적은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여될 수 있다. 치료학적 적용에서는, 예를 들어 환자가 질환의 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지 비교적 높은 투여량이 투여될 수 있다.
2 개 이상의 작용제의 병용 투여는 다수의 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 한 구현예에서, 항체 또는 폴리펩타이드 및 다른 작용제는 단일 조성물로 함께 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 폴리펩타이드 및 다른 작용제는 병용 요법의 일부로서 별도의 조성물로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조절자는 다른 작용제 투여 전, 투여 후 또는 그와 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 조성물은 또한 GITR 및 CTLA-4를 발현하는 세포 집단의 활성화를 증가시키는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 상기 세포 집단에 본 발명의 폴리펩타이드 또는 조성물을 상기 세포와 본 발명의 폴리펩타이드 사이의 상호작용을 허용하기에 적합한 조건 하에 투여하는 것을 포함한다. 세포 집단은 전형적으로 GITR을 발현하는 적어도 일부 세포, 전형적으로 T 세포, 및 CTLA-4를 발현하는 적어도 일부 세포를 포함한다. 상기 방법은 전형적으로 생체외에서 수행된다.
GITR에 대한 결합 도메인
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질 (GITR; 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 18 [TNFRSF18] 및 활성-유도성 TNFR 패밀리 수용체 [AITR]로도 공지됨)에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 특정 바람직한 결합 특징 및 기능적 효과를 가지며, 이는 하기에서 보다 상세히 기재된다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 바람직하게는 본 발명의 이중특이적 항체의 일부로서 혼입될 때 이들 결합 특징 및 기능적 효과를 보유한다. 본 발명은 또한, 상기 항체를 단리된 형태의 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 즉 본 발명의 이중특이적 항체와 독립적으로 제공한다.
항-GITR 도메인 (B1)은 바람직하게는 GITR에 특이적으로 결합하고, 즉, 이는 GITR에 결합하지만 다른 분자에는 결합하지 않거나 더 낮은 친화성으로 결합한다. 본원에서 사용되는 용어 "GITR"은 전형적으로 인간 GITR을 지칭한다. 인간 GITR의 아미노산 서열은 서열 번호 111 (GenBank: AAI52382.1에 상응함)에 기재되어 있다. B1 도메인은 다른 포유류로부터의 GITR, 예컨대 비-인간 영장류, 예를 들어 마카카 페시쿨라리스(Macaca fascicularis) (시노몰구스 원숭이)로부터의 GITR에 대해 약간의 결합 친화성을 가질 수 있다. B1 도메인은 바람직하게는 뮤린 GITR에 결합하지 않고/거나 다른 인간 TNFR 슈퍼패밀리 구성원, 예를 들어 인간 CD137, OX40 또는 CD40에 결합하지 않는다.
B1 도메인은 천연 상태의 GITR 및 특히 세포 표면 상에 국소화된 GITR에 결합하는 능력을 갖는다. "세포 표면 상에 국소화됨"은 이전에 정의된 바와 같다. 바람직하게는, B1 도메인은 GITR에 특이적으로 결합할 것이다. 즉, B1 도메인은 바람직하게는 또 다른 분자에 결합하는 것보다 더 큰 결합 친화성으로 GITR에 결합할 것이다.
바람직하게는, B1 도메인의 상기 결합 특징은 본 발명의 이중특이적 항체에서 실질적으로 유지된다.
따라서, 이중특이적 항체는 GITR을 발현하는 세포의 활성을 조절할 수 있으며, 상기 조절은 상기 세포의 활성의 증가 또는 감소이다. 세포는 일반적으로 T 세포이다. 항체는 CD4+ 또는 CD8+ 효과기 T 세포의 활성을 증가시킬 수 있거나 Treg 세포의 활성을 감소시키거나 이를 고갈시킬 수 있다. 두 경우 모두, 항체의 네트 효과는 Teff 세포, 특히 CD4+, CD8+ 또는 NK 효과기 T 세포의 활성 증가일 것이다. 효과기 T 세포의 활성 변화를 측정하는 방법은 널리 공지되어 있으며 상기에 기재된 바와 같다.
항체는 바람직하게는 시험관내에서 CD8+ T 세포의 활성을 증가시키며, 선택적으로 상기 활성의 증가는 T 세포에 의한 증식, IFN-γ 생성 및/또는 IL-2 생성의 증가이다. 증가는 바람직하게는 동일한 검정에서 측정된 이소타입 대조군 항체에 의해 야기된 활성 변화보다 적어도 2 배, 보다 바람직하게는 적어도 10 배, 또한 보다 바람직하게는 적어도 25 배 높다.
항체는 바람직하게는 10x10-9 M 미만 또는 7x10-9 M 미만, 보다 바람직하게는 4, 또는 2x10-9 M 미만, 가장 바람직하게는 1x10-9 M 미만인 Kd 값으로 인간 GITR에 결합한다.
예를 들어, 항체는 바람직하게는 뮤린 GITR 또는 임의의 다른 TNFR 슈퍼패밀리 구성원, 예컨대 OX40 또는 CD40에 결합하지 않는다. 따라서, 전형적으로, 인간 GITR에 대한 항체의 Kd는, 다른 비-표적 분자, 예컨대 뮤린 GITR, 다른 TNFR 슈퍼패밀리 구성원, 또는 임의의 다른 관련이 없는 물질 또는 환경에 수반되는 물질에 대한 Kd보다 2 배, 바람직하게는 5 배, 보다 바람직하게는 10 배 낮을 것이다. 보다 바람직하게는, Kd는 50 배 미만, 더욱 더 바람직하게는 100 배 미만, 또한 더욱 더 바람직하게는 200 배 미만이다.
이 해리 상수의 값은 상기에 기재된 바와 같이 널리 공지된 방법으로 직접 결정할 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이 경쟁 결합 검정을 수행할 수도 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 또 다른 비-표적 분자에 대한 그의 결합 친화성보다 적어도 2 배, 10 배, 50 배, 100 배 또는 그 이상 더 큰 친화성으로 그의 표적에 결합할 수 있다.
요약하면, 항-GITR 항체는 바람직하게는 하기 기능적 특징 중 적어도 하나를 나타낸다:
I. 10x10-9 M 미만, 보다 바람직하게는 1.2x10-9 M 미만인 KD 값으로 인간 GITR에 결합함; 및
II. 시험관내에서 CD8+ T 세포의 활성을 증가시키며, 선택적으로 상기 활성의 증가는 T 세포에 의한 증식, IFN-γ 생성 및/또는 IL-2 생성의 증가임. 증가는 바람직하게는 동일한 검정에서 측정된 이소타입 대조군 항체에 의해 야기된 활성 변화보다 적어도 2 배, 보다 바람직하게는 적어도 10 배, 또한 보다 바람직하게는 적어도 25 배 높다.
항체는 GITR, 전형적으로 인간 GITR에 특이적이고, 표 D(1) 및 D(2)의 임의의 상응하는 열의 쌍의 예시적 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두를 포함할 수 있다.
예를 들어, 항체는 표 D(1) 및 D(2)의 제 1 행의 예시적 CDR 서열 (서열 번호 76, 77, 78, 88, 89, 90) 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두를 포함할 수 있다.
대안적으로 항체는 표 D(1) 및 D(2)의 제 2, 3 또는 4 행의 예시적 CDR 서열 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두를 포함할 수 있다.
바람직한 항-GITR 항체는 표 D(1)의 임의의 개별 행에 정의된 바와 같은 중쇄 CDR3 및/또는 표 D(2)의 임의의 개별 행에 정의된 바와 같은 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 항체는 표 D(1)의 개별 행에 나타낸 모든 3개의 중쇄 CDR 서열 (즉, 소정의 "VH 번호"의 모든 3개의 중쇄 CDR) 및/또는 표 D(2)의 개별 행에 나타낸 모든 3개의 경쇄 CDR 서열 (즉, 소정의 "VL 번호"의 모든 3개의 경쇄 CDR)을 포함할 수 있다.
항-GITR 항체의 완전한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 예는 표 C에 나타내었다. 각각의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열도 또한 나타내었다. 서열 번호 52 내지 67은 항-GITR 항체의 관련 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 표 C의 상기 VH 및 VL 영역의 넘버링은 표 D(1) 및 (2)에서와 같이 사용된 넘버링 체계에 상응한다. 따라서, 예를 들어, "2349, 경쇄 VL"의 아미노산 서열은 표 D(2)에 나타낸 VL 번호 2349의 모든 3개의 CDR을 포함하는 완전한 VL 영역 서열의 예이고, "2348, 중쇄 VH "의 아미노산 서열은 표 D(1)에 나타낸 VH 번호 2348의 모든 3개의 CDR을 포함하는 완전한 VH 영역 서열의 예이다.
본 발명의 바람직한 항-GITR 항체는 특정 VH 번호의 모든 3개의 CDR을 포함하는 VH 영역 및 특정 VL 번호의 모든 3개의 CDR을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 예를 들어, 항체는 VH 번호 2348의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 2349의 모든 3개의 CDR 모두를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는 표 C에 나타낸 바와 같이 2348 및 2349의 상응하는 완전한 VH 및 VL 서열 (mAb - CTLA-4 결합 도메인없이) (서열 번호 52 및 61)을 포함할 수 있다.
항체는 대안적으로 VH 번호 2372의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 2373의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는 표 C에 나타낸 바와 같이 2372 및 2373의 상응하는 완전한 VH 및 VL 서열 (mAb - CTLA-4 결합 도메인없이) (서열 번호 54 및 63)을 포함할 수 있다.
항체는 대안적으로 VH 번호 2396의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 2397의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는 표 C에 나타낸 바와 같이 2396 및 2397의 상응하는 완전한 VH 및 VL 서열 (mAb - CTLA-4 결합 도메인없이) (서열 번호 56 및 65)을 포함할 수 있다.
항체는 대안적으로 VH 번호 2404의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 2405의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는 표 C에 나타낸 바와 같이 2404 및 2405의 상응하는 완전한 VH 및 VL 서열 (mAb - CTLA-4 결합 도메인없이) (서열 번호 58 및 67)을 포함할 수 있다.
항-GITR 항체는 본원에 기재된 특정 항-GITR 항체 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
대안적 구현예에서, 결합 도메인 (B1)은, 예를 들어 서열 번호 61, 63, 65 및 67로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호 52, 54, 56 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 단편 또는 변이체인, 본원에 기재된 예시적 GITR 결합 도메인 중 하나 이상의 인간 GITR에 대한 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있다.
경쟁 항체는 전형적으로, 시험 항체가 기준 항체에 결합하는 항원 상의 에피토프 (이 경우, 1630/1631)에, 또는 적어도 그에 근접하여 결합하기 때문에 발생한다. 그러나, 당업자는, 경쟁 결합이 또한 입체적 간섭으로 인해 발생할 수 있고; 따라서, 시험 항체는 기준 항체가 결합하는 것과 상이한 에피토프에서 결합할 수 있지만, 항원에 대한 기준 항체의 결합을 방해하기에 여전히 충분한 크기 또는 형태를 가질 수 있음을 이해할 것이다.
표적에 대한 기준 폴리펩타이드의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있는 폴리펩타이드를 확인하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 ELISA, BLI 또는 SPR이다.
CTLA-4에 대한 결합 도메인
본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 또한 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4 (CTLA-4; CD152로도 공지됨)에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
인간 CTLA-4의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 제시되어 있다.
CD86 및 CD80은 본원에서 B7 단백질 (각각 B7-2 및 B7-1)로 지칭될 수 있다. 이들 단백질은 항원 제시 세포 표면 상에서 발현되며 T 세포 수용체 CD28 및 CTLA-4와 상호작용한다. B7 분자가 CD28에 결합하면 T 세포의 활성화가 촉진되는 반면 B7 분자가 CTLA-4와 결합하면 T 세포의 활성화가 차단된다. B7 단백질과 CD28 및/또는 CTLA-4와의 상호작용은 면역 활성화 및 조절에서 중요한 역할을 하는 동시-자극 신호전달 경로를 구성한다. 따라서 B7 분자는 면역 억제를 분리하여 환자의 면역을 향상시키기 위해 조작이 가능한 경로의 일부이다.
CD86 단백질은 단량체이며 2 개의 세포외 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인으로 구성된다. CD86의 수용체 결합 도메인은 전형적인 IgV-세트 구조를 갖지만, 막 근위 도메인은 C1-세트 유사 구조를 갖는다. CD80 및 CD86의 구조는 자체적으로 또는 CTLA-4와의 복합체로 측정되었다. CD80 및 CD86 분자 상의 접촉 잔기는 가용성 세포외 도메인에 있으며, 대부분 베타-시트에 위치하며 (CDR-유사) 루프에는 위치하지 않는다.
서열 번호 3은 인간 야생형 CD86의 단량체 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열이다. 이 야생형 서열은 N-말단, 즉 위치 24 및 25에서 알라닌 및 프롤린이 선택적으로 결핍될 수 있다. 이들 아미노산은 각각 본원에서 A24 및 P25로 지칭될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 결합 도메인으로서 CTLA-4에 특이적인 도메인, "CTLA-4 결합 도메인"을 포함할 수 있다. 이러한 결합 도메인의 적합한 예가 WO 2014/207063에 개시되어 있으며, 이것의 내용은 참고로 포함된다. CTLA-4에 특이적인 결합 도메인은 또한 CD28에 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 CTLA-4는 전형적으로 인간 CTLA-4를 지칭하고, 본원에서 사용되는 용어 CD28은 일반적으로 인간 CD28을 지칭한다. 인간 CTLA-4 및 인간 CD28의 서열은 각각 서열 번호 1 및 2에 기재되어 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 다른 포유류, 예를 들어 영장류로부터의 CTLA-4 또는 CD28, 또는 뮤린 CTLA-4 또는 CD28에 대해 일부 결합 친화성을 가질 수 있다.
CTLA-4 결합 도메인은 천연 상태의 CTLA-4 및 특히 세포 표면 상에 국소화된 CTLA-4에 결합하는 능력을 갖는다. "세포 표면 상에 국소화됨"은 상기에 정의된 바와 같다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인 부분은 하기의 것을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다:
(i) 서열 번호 3의 아미노산 서열; 또는
(ii) 서열 번호 3의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산이 변화된 아미노산 서열. 단, 상기 결합 도메인은 야생형 인간 CD86보다 높은 친화성으로 인간 CTLA-4에 결합한다.
달리 말하면, CTLA-4 결합 도메인은 (i) 인간 야생형 CD86의 단량체 가용성 세포외 도메인, 또는 (ii) 상기 가용성 세포외 도메인의 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 또는 이들로 이루어진 인간 CTLA-4에 특이적인 폴리펩타이드 결합 도메인이며, 단 상기 폴리펩타이드 변이체는 야생형 인간 CD86보다 높은 친화성으로 인간 CTLA-4에 결합한다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 인간 야생형 CD86과 동일한 표적 결합 특징을 가질 수 있거나 또는 인간 야생형 CD86의 표적 결합 특징과 비교하여 상이한 표적 결합 특징을 가질 수 있다. 이러한 특성을 비교하기 위한 목적으로, "인간 야생형 CD86"은 전형적으로 이전 섹션에서 기재된 바와 같이 인간 야생형 CD86의 단량체 가용성 세포외 도메인을 지칭한다.
인간 야생형 CD86은 2 개의 표적, CTLA-4 및 CD28에 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 결합 특성은 이들 표적 각각에 결합하는 폴리펩타이드의 능력에 대한 개별 척도로서 나타낼 수 있다. 예를 들어, 인간 야생형 CD86의 단량체 세포외 도메인의 폴리펩타이드 변이체는 바람직하게는 CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 경우보다 높은 결합 친화성으로 CTLA-4에 결합한다. 이러한 폴리펩타이드는 선택적으로 CD28에 대한 야생형 인간 CD86의 경우보다 낮은 결합 친화성으로 CD28에 결합할 수도 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 CTLA-4에 특이적인 폴리펩타이드 결합 도메인이다. 이는, 이것이 바람직하게는 또 다른 분자에 결합하는 것보다 큰 결합 친화성으로 CTLA-4에 결합한다는 것을 의미한다. CTLA-4 결합 도메인은 바람직하게는 CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 경우와 동일하거나 더 높은 친화성으로 CTLA-4에 결합한다.
바람직하게는, 인간 CTLA-4에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 Kd는, 인간 CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 Kd보다 적어도 2 배, 적어도 2.5 배, 적어도 3 배, 적어도 3.5 배, 적어도 4 배, 적어도 4.5 배, 적어도 5 배, 적어도 5.5 배, 적어도 8 배 또는 적어도 10 배 더 낮을 것이다. 가장 바람직하게는, 인간 CTLA-4에 대한 CTLA-4 결합 도메인의 Kd는, 인간 CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 Kd보다 적어도 5 배 또는 적어도 10 배 더 낮을 것이다. CTLA-4에 대한 폴리펩타이드의 Kd를 결정하기 위한 바람직한 방법은 예를 들어 Biacore™ 시스템을 이용한 SPR 분석이다. 폴리펩타이드의 SPR 분석에 적합한 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다.
바람직하게는, 인간 CTLA-4에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 EC50은, 동일한 조건 하에서의 인간 CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 EC50보다 적어도 1.5 배, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 5 배, 적어도 10 배, 적어도 12 배, 적어도 14 배, 적어도 15 배, 적어도 17 배, 적어도 20 배, 적어도 25 배 또는 적어도 50 배 더 낮을 것이다. 가장 바람직하게는, 인간 CTLA-4에 대한 CTLA-4 결합 도메인의 EC50은, 동일한 조건 하에서의 인간 CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 EC50보다 적어도 10 배 또는 적어도 25 배 더 낮을 것이다. CTLA-4에 대한 폴리펩타이드의 EC50을 결정하기 위한 바람직한 방법은 ELISA를 통한 방법이다. 폴리펩타이드의 EC50의 평가에 사용하기에 적합한 ELISA 검정은 당업계에 공지되어 있다.
바람직하게는, 인간 CTLA-4에 결합하기 위해 야생형 인간 CD86과 경쟁할 때, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 IC50은, 동일한 조건 하에서의 야생형 인간 CD86의 IC50보다 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 10 배, 적어도 13 배, 적어도 15 배, 적어도 50 배, 적어도 100 배, 또는 적어도 300 배 더 낮을 것이다. 가장 바람직하게는, CTLA-4 결합 도메인의 IC50은 동일한 조건 하에서의 야생형 인간 CD86의 IC50보다 적어도 10 배 또는 적어도 300 배 더 낮을 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 IC50을 측정하기 위한 바람직한 방법은 ELISA를 통한 방법이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 IC50의 평가에 사용하기에 적합한 ELISA 검정은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 또한 CD28에 특이적으로 결합할 수 있다. 즉, CTLA-4 결합 도메인은, 이것이 CTLA-4를 제외한 또 다른 분자에 결합하는 것보다 더 큰 결합 친화성으로 CD28에 결합할 수 있다. CTLA-4 결합 도메인은 인간 CD28에 대한 야생형 인간 CD86의 경우보다 낮은 친화성으로 인간 CD28에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 인간 CD28에 대한 CTLA-4 결합 도메인의 Kd는, 인간 CD28에 대한 야생형 인간 CD86의 Kd보다 적어도 2 배, 바람직하게는 적어도 5 배, 보다 바람직하게는 적어도 10 배 더 높을 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 결합 특성은 또한, 폴리펩타이드가 2 개의 표적, CTLA-4 및 CD28 2 개의 표적에 결합하는 능력의 상대적 척도로서 나타낼 수 있다. 즉, CTLA-4 결합 도메인의 결합 특성은 폴리펩타이드가 CTLA-4에 결합하는 능력 대 이것이 CD28에 결합하는 능력의 상대적 척도로서 나타낼 수 있다. 바람직하게는, CTLA-4 결합 도메인은, CTLA-4 대 CD28에 결합하는 인간 야생형 CD86의 상응하는 상대적 능력과 비교할 때, 증가된 CTLA-4 대 CD28에 결합하는 상대적 능력을 갖는다.
CTLA-4 및 CD28 모두에 대한 폴리펩타이드의 결합 친화성이 동일한 파라미터 (예를 들어, Kd, EC50)를 사용하여 평가되는 경우, 각 표적에 대한 폴리펩타이드의 상대적 결합 능력은 각 표적에 대한 파라미터의 값의 단순 비로서 나타낼 수 있다. 이 비율은 폴리펩타이드의 결합 비 또는 결합 강도 비로 지칭될 수 있다. 결합 친화성을 평가하는 데 사용되는 많은 파라미터 (예를 들어, Kd, EC50)에서, 더 낮은 값은 더 높은 친화성을 나타낸다. 이 경우, CTLA-4 대 CD28에 대한 결합 친화성의 비는 바람직하게는 하기 식에 따라 계산된 단일 수치로 표현된다:
결합 비 = [CD28에 대한 결합 친화성] / [CTLA-4에 대한 결합 친화성]
대안적으로, 더 높은 값이 더 높은 친화성을 나타내는 파라미터를 사용하여 결합 친화성을 평가하는 경우, 상기 식의 역수가 바람직하다. 어느 경우든, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 바람직하게는 인간 야생형 CD86보다 더 높은 결합 비를 갖는다. 주어진 폴리펩타이드에 대한 결합 비와 또 다른 폴리펩타이드에 대한 결합 비의 직접적인 비교는 통상적으로, 결합 친화성을 평가하고 두 폴리펩타이드에 대한 결합 비를 계산하기 위해 동일한 파라미터가 사용될 것을 요구함을 이해할 것이다.
바람직하게는, 폴리펩타이드에 대한 결합 비는 각각의 표적에 대한 폴리펩타이드의 Kd를 결정한 다음, 식 [CD28에 대한 Kd] / [CTLA-4에 대한 Kd]에 따라 비율을 계산함으로써 계산된다. 이 비율은 폴리펩타이드의 Kd 결합 비로 지칭될 수 있다. 표적에 대한 폴리펩타이드의 Kd를 결정하기 위한 바람직한 방법은 예를 들어 Biacore™ 시스템을 이용한 SPR 분석이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 SPR 분석에 적합한 프로토콜이 실시예에 기재되어 있다. 이 방법에 따라 계산된 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 결합 비는 바람직하게는 동일한 방법에 따라 계산된 야생형 인간 CD86의 결합 비보다 적어도 2 배 또는 적어도 4 배 더 높다.
대안적으로, 폴리펩타이드의 결합 비는 각 표적에 대한 폴리펩타이드의 EC50을 결정한 다음, 식 [CD28에 대한 EC50] / [CTLA-4에 대한 EC50]에 따라 비율을 계산하여 계산할 수 있다. 이 비율은 폴리펩타이드의 EC50 결합 비로 지칭될 수 있다. 표적에 대한 폴리펩타이드의 EC50을 결정하기 위한 바람직한 방법은 ELISA를 통한 방법이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 EC50 평가에 사용하기에 적합한 ELISA 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 이 방법에 따라 계산된 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 결합 비는 동일한 방법에 따라 계산된 야생형 인간 CD86의 결합 비보다 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 6 배, 적어도 7 배, 적어도 8 배, 적어도 9 배 또는 적어도 10 배 더 높다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하기 위해 또 다른 폴리펩타이드와 교차-경쟁하는 능력을 가질 수 있다. 예를 들어, CTLA-4 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하기 위해 서열 번호 6 내지 24 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 교차-경쟁할 수 있다. 이러한 교차-경쟁 폴리펩타이드는 표준 결합 분석에서 확인될 수 있다. 예를 들어, 교차-경쟁을 입증하기 위해 SPR 분석 (예를 들어, Biacore™ 시스템 사용), ELISA 검정 또는 유동 세포계측법을 사용할 수 있다.
상기 기능적 특징 이외에도, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 특정 바람직한 구조적 특징을 갖는다. CTLA-4 결합 도메인은 (i) 인간 야생형 CD86의 단량체 가용성 세포외 도메인, 또는 (ii) 상기 가용성 세포외 도메인의 폴리펩타이드 변이체를 포함하거나 이들로 이루어지며, 단 상기 폴리펩타이드 변이체는 야생형 인간 CD86보다 높은 친화성으로 인간 CTLA-4에 결합한다.
인간 야생형 CD86의 단량체 가용성 세포외 도메인의 폴리펩타이드 변이체는 인간 야생형 CD86의 것으로부터 유래된 아미노산 서열, 구체적으로 인간 야생형 CD86의 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호 3) (선택적으로 A24 및 P25가 결핍된 것)을 포함하거나 이들로 이루어진다. 특히, 변이체는 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 적어도 하나의 아미노산이 변화된 아미노산 서열을 포함한다. "변화된"은 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 적어도 하나의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환됨을 의미한다. "결실된"은 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)에 존재하는 적어도 하나의 아미노산이 제거되어, 아미노산 서열이 하나의 아미노산만큼 짧아짐을 의미한다. "삽입된"은 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열) 내로 적어도 하나의 추가 아미노산이 도입되어, 아미노산 서열이 하나의 아미노산만큼 길어짐을 의미한다을 의미한다. "치환된"은 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)의 적어도 하나의 아미노산이 대안적 아미노산으로 대체됨을 의미한다.
전형적으로, 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교할 때, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개의 아미노산이 변화된된다. 전형적으로, 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교할 때, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 2 또는 1 개 이하의 아미노산이 변화된다. 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 허용되는 변화 수에 대한 범위를 정의하기 위해 이들 하한 중 임의의 것이 이들 상한 중 임의의 것과 조합될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는, 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 허용되는 아미노산 변화 수가 2 내지 3개, 2 내지 4개, 2 내지 5개, 2 내지 6개, 2 내지 7개, 2 내지 8개, 2 내지 9개, 2 내지 10개, 3 내지 4개, 3 내지 5개, 3 내지 6개 등의 범위인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교할 때 적어도 2 개의 아미노산이 변화되는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 허용되는 아미노산 변화 수는 2 내지 9개, 2 내지 8개 또는 2 내지 7개의 범위이다.
상기에 기재된 수 및 범위는 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 결실, 삽입 또는 치환의 임의의 조합으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 단지 결실, 단지 삽입, 또는 단지 치환, 또는 결실, 삽입 또는 치환의 임의의 혼합물이 존재할 수 있다. 바람직하게는, 변이체는 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 모든 변화가 치환인 아미노산 서열을 포함한다. 즉, 서열 번호 3의 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 어떠한 아미노산도 결실 또는 삽입되지 않은 서열이다. 바람직한 변이체의 아미노산 서열에서는, 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 아미노산이 치환되고 서열 번호 3의 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 어떠한 아미노산도 결실 또는 삽입되지 않는다.
바람직하게는 서열 번호 3의 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교한 변화가 FG 루프 영역 (위치 114 내지 121) 및/또는 서열 번호 3의 베타 시트 영역에 있다. 베타 시트 영역의 가닥은 서열 번호 3에서 하기 위치를 갖는다: A: 27-31, B: 36-37, C: 54-58, C': 64-69, C": 72-74, D: 86-88, E: 95-97, F: 107-113, G: 122-133.
가장 바람직하게는, 서열 번호 3의 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교한 변화는 32, 48, 49, 54, 74, 77, 79, 103, 107, 111, 118, 120, 121, 122, 125, 127 또는 134로부터 선택된 위치 중 하나 이상에 있다. 본원의 아미노산 위치의 모든 넘버링은 N-말단부터 시작하여 서열 번호 4의 아미노산을 계수하는 것에 기초한다. 따라서, 서열 번호 3의 N-말단의 첫번째 위치는 24로 넘버링된다 (도 23의 개략도 참조).
특히 바람직한 삽입은 위치 116과 117 사이에 삽입된 단일의 추가 아미노산 및/또는 위치 118과 119 사이에 삽입된 단일의 추가 아미노산을 포함한다. 삽입된 아미노산은 바람직하게는 티로신 (Y), 세린 (S), 글리신 (G), 류신 (L) 또는 아스파르트산 (D)이다.
특히 바람직한 치환은 아르기닌 (R)인 위치 122에서 일어난다. 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 적어도 위치 122가 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 위치 122에서의 가장 바람직한 치환은 아르기닌 (R)을 라이신 (L) 또는 아스파라긴 (N) (바람직한 순서로 랭킹된 것)으로 대체하는 것이다. 이 치환은 R122K/N으로 지칭될 수 있다.
다른 바람직한 치환은, 각각 류신 (L), 이소류신 (I) 및 글루탐산 (Q)인 위치 107, 121 및 125에서의 치환이다. 위치 122에서의 치환에 추가하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는, 서열 번호 3의 아미노산 서열 (또는 A24 및 P25가 결핍된 상기 서열)과 비교하여 위치 107, 121 및 125의 아미노산 중 적어도 하나가 또한 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 또한 위치 32, 48, 49, 54, 64, 74, 77, 79, 103, 111, 118, 120, 127 및 134 중 하나 이상에서 치환될 수 있다.
위치 107에서의 가장 바람직한 치환은 류신 (L)을 이소류신 (I), 페닐알라닌 (F) 또는 아르기닌 (R) (바람직한 순서로 랭킹된 것)으로 대체하는 것이다. 이 치환은 L107I/F/R로 지칭될 수 있다. 유사한 명명법이 본원에 기재된 다른 치환에 대해 사용된다. 위치 121에서의 가장 바람직한 치환은 이소류신 (I)을 발린 (V)으로 대체하는 것이다. 이 치환은 I121V로 지칭될 수 있다.
위치 125에서의 가장 바람직한 치환은 글루타민 (Q)을 글루탐산 (E)으로 대체하는 것이다. 이 치환은 Q125E로 지칭될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 바람직할 수 있는 다른 치환은 하기의 것을 포함한다: F32I, Q48L, S49T, V54I, V64I, K74I/R, S77A, H79D/S/A, K103E, I111V, T118S, M120L, N127S/D 및 A134T.
인간 야생형 CD86의 상기 가용성 세포외 도메인의 특히 바람직한 변이체는 표 A에 나타낸 바와 같은 서열 번호 6 내지 24의 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하거나 이들로 이루어진다.
서열 번호 6 내지 14에 나타낸 아미노산 서열은 N-말단에 추가의 잔기 AP를 선택적으로 포함할 수 있다. 서열 번호 15 내지 24에 나타낸 아미노산 서열은 N-말단에서 잔기 AP가 선택적으로 결핍될 수 있다. 어느 경우든, 이들 잔기는 서열 번호 3의 A24 및 P25에 상응한다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 인간 야생형 CD86의 상기 가용성 세포외 도메인의 임의의 상기 변이체 중 임의의 것을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 표 A에 나타낸 바와 같은 서열 번호 6 내지 24 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
결합 도메인은, 예를 들어 T 세포와 같은 CTLA-4를 발현하는 세포에 투여될 때, CTLA-4로부터의 신호전달을 조절할 수 있다. 바람직하게는 결합 도메인은 상기 신호전달을 감소, 즉 억제 또는 차단하여 상기 세포의 활성화를 증가시킨다. 시험 작용제 (예컨대 결합 도메인)의 투여 결과로서의 CTLA-4 신호전달 및 세포 활성화의 변화는 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 적합한 방법은, 시험 작용제의 존재 하에 또는 적합한 대조군의 존재 하에 있을 때, T 세포의 표면 상에 발현된 CTLA-4를 통해 결합 및 신호전달하는 막-결합 CD86 (예를 들어, 라지 (Raji) 세포)의 능력을 검정하는 것을 포함한다. 대조군의 존재 하에서의 T 세포 IL-2 생성 및/또는 T 세포 증식의 수준에 비해, 시험 작용제의 존재 하에서의 T 세포 IL-2 생성 수준의 증가 또는 T 세포 증식의 증가는, CTLA-4를 통한 신호전달의 감소 및 세포 활성화의 증가에 대한 지표이다. 이러한 유형의 전형적인 검정은 US20080233122의 실시예 9에 개시되어 있다.
다른 T 세포 표적에 대한 결합 영역
본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 또한 GITR 및 CTLA-4 (상기 참조) 이외의 T 세포 표적에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
(a) OX40-결합 도메인
한 구현예에서, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 OX40에 특이적인 결합 도메인을 추가로 포함한다.
OX40-결합 도메인의 예시적인 VH 및 VL 영역은 WO 2016/185016에 개시되어 있고, 이것의 개시내용은 참고로 포함된다.
(b) CD40-결합 도메인
한 구현예에서, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드는 CD40에 특이적인 결합 도메인을 추가로 포함한다.
CD40-결합 도메인의 예시적인 VH 및 VL 영역은 WO 2015/091853 및 WO 2013/034904에 나타나 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드
본 발명의 제 1 양태의 구현예에서, 이중특이적 폴리펩타이드는 GITR 및 CTLA-4에 특이적인 결합 도메인을 가지며, 예를 들어 B1은 GITR에 특이적이고 B2는 CTLA-4에 특이적이다.
이들 결합 도메인은 상기에 정의된 바와 같다.
구현예 부분 B1의 이중특이적 폴리펩타이드 - GITR에 특이적인 결합 도메인
GITR에 특이적인 결합 도메인은 상기에 정의된 바와 같다.
구현예 부분 B2의 이중특이적 폴리펩타이드 - CTLA-4에 특이적인 결합 도메인
CTLA-4에 특이적인 결합 도메인은 상기에 정의된 바와 같다.
구현예의 이중특이적 폴리펩타이드
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 인간 GITR 및 인간 CTLA-4 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있다. "GITR 및 CTLA-4 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있음"은, 상기 각 부분에 대해 제공된 정의에 따라, 항-CTLA-4 부분이 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, 항-GITR 부분이 GITR에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 이중특이적 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 CTLA-4 결합 도메인에 연결된 본원에 기재된 바와 같은 임의의 GITR 결합 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는 이들의 각각의 표적에 대한 상이한 부분의 결합 특징은, 이들이 별도의 실체로서 존재할 때 개별 부분에 대한 상기 특징과 비교할 때, 본 발명의 이중특이적 항체의 일부로서 존재할 때 변화되지 않거나 실질적으로 변화되지 않는다.
전형적으로, 이는 이중특이적 분자가, 단독으로 존재시 CTLA-4 결합 도메인의 CTLA-4에 대한 Kd 값과 바람직하게는 실질적으로 동일한 CTLA-4에 대한 Kd를 가질 것임을 의미한다. 대안적으로, 이중특이적 분자가, 단독으로 존재시 CTLA-4 결합 도메인의 CTLA-4에 대한 Kd에 비해 증가된 CTLA-4에 대한 Kd를 갖는 경우, 그 증가는 10 배 이하, 바람직하게는 9 배, 8 배, 7 배, 6 배, 5 배, 4 배, 3 배 또는 2 배 이하만큼이다. 또한, 이중특이적 분자는, 단독으로 존재시 바람직하게는 GITR 결합 도메인의 GITR에 대한 Kd 값과 실질적으로 동일한 GITR에 대한 Kd를 독립적으로 가질 것이다. 대안적으로, 이중특이적 분자가, 단독으로 존재시 항-GITR 항체의 GITR에 대한 Kd에 비해 증가되는 GITR에 대한 Kd를 갖는 경우, 그 증가는 10 배 이하, 바람직하게는 9 배, 8 배, 7 배, 6 배, 5 배, 4 배, 3 배 또는 2 배 이하만큼이다. 개별 결합 도메인에 대한 바람직한 Kd 값은 상기에 기재된 바와 같다.
CTLA-4 결합에서의 배수 변화 중 임의의 것은 주어진 이중특이적 분자의 결합 특징을 기재하기 위해 GITR 결합에서 언급된 배수 변화 중 임의의 것과 독립적으로 조합될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 임의의 이중특이적 폴리펩타이드의 GITR 또는 CTLA-4에 대한 결합 특징은 임의의 적합한 검정에 의해 평가될 수 있다. 특히, 각각의 별도의 부분에 대해 상기에 기재된 검정은 두 표적에 대한 동시 결합을 평가하기 위한 이중특이적 항체 또는 조합 검정에 적용될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드의 결합 특징을 평가하기 위한 적합한 검정은 또한 실시예에 기재되어 있으며 당업계에 공지되어 있다.
구현예의 이중특이적 폴리펩타이드는 면역계 세포의 활성을 GITR 또는 CTLA-4의 개별 작용제 단독 또는 이러한 개별 작용제의 조합보다 더 큰 정도로 조절할 수 있다. 특히, 이중특이적 폴리펩타이드의 투여는 보다 높은 수준의 T 세포 활성, 특히 효과기 T 세포 활성, 예를 들어 CD4+ 효과기 T 세포 활성을 생성한다. 효과기 T 세포 활성의 증가는 또한, 이중특이적 폴리펩타이드가 CTLA-4 및 GITR 둘 다 높게 발현되는 미세 환경에서만 가장 큰 효과를 나타내기 때문에, 개별 GITR 또는 CTLA-4 작용제 단독 (또는 이들의 조합)의 투여로 인한 것보다 더 국소화된다. 종양은 이러한 미세 환경이다. GITR은 CD8 T 세포에서 상승된 수준으로 발현되므로 특히 이들을 활성화시킬 수 있다. CD8 T 세포는 효과적인 종양 반응의 주 효과기 성분 중 하나이다.
효과기 T 세포 활성의 증가는 GITR 경로의 활성화 또는 CTLA-4 억제 경로의 차단을 통한 효과기 T 세포의 자극으로부터 직접적으로 발생할 수 있거나, 또는 Treg의 고갈 또는 하향 조절로부터 간접적으로 발생할 수 있으며, 이로써 면역억제 효과가 감소한다. Treg의 고갈/하향 조절은 ADCP 또는 ADCC 메커니즘에 의해 매개될 수 있다. 전반적으로, 그 결과는 종양사멸 활성의 즉각적인 생성을 위한 매우 강력하고 국소화된 면역 활성화일 것이다.
CTLA-4 및 GITR의 세포 표면 발현 패턴은 부분적으로 중복되어 있으며, 따라서 본 발명의 이중특이적 항체는 시스 및 트랜스 모두에서 두 표적에 모두 결합할 수 있다. 이는 동일한 세포에서 시스의 수용체 클러스터링 수준을 증가시키거나 또는 트랜스에서 2 개의 세포 사이에 인공적인 면역 시냅스를 생성함으로써, FcγR- 가교 결합 독립적 방식으로 GITR 및 CTLA-4를 통한 자극을 생성할 수 있고, 이는 또한 수용체 클러스터링을 강화시키고 2 개의 세포 모두에서 신호전달을 증가시킬 수 있다. 전반적으로, 그 결과는 종양사멸 활성의 생성을 위한 매우 강력한 종양 지향 면역 활성화일 것이다.
면역계의 세포에 대한 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드의 효과의 측정은 임의의 적합한 검정으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 폴리펩타이드의 개별 성분 B1 및 B2에 대하여 상기에 기재된 바와 같은 검정에 의해 효과기 T 세포의 증가된 활성을 측정할 수 있고, 이는 대조군과 비교하여 이중특이적 폴리펩타이드의 존재 하에 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포에 의한 증식 또는 IFNγ 또는 IL-2 생성의 측정을 포함한다. 대조군과 비교하여 증식 또는 IFNγ 또는 IL-2 생성의 증가는 증가된 세포 활성화의 지표이다. 이러한 유형의 전형적인 검정은 US20080233122의 실시예 9에 개시되어 있다. 세포 증식 및/또는 IFNγ 또는 IL-2 생성에 대한 검정은 널리 공지되어 있으며, 또한 실시예에서 예시된다. 동일한 검정에서 평가할 때, 이중특이적 분자는 전형적으로, 동일한 표적에 결합하는 단일특이적 작용제의 조합에 의해 유도된 효과기 T 세포의 활성 증가보다 적어도 1.5 배 더 높은 또는 적어도 2 배 더 높은, 보다 바람직하게는 3 배 더 높은, 가장 바람직하게는 5 배 더 높은 효과기 T 세포의 활성의 증가를 유도할 것이다.
이중특이적 분자는 GITR 및 CTLA-4가 모두 높게 발현되는 미세 환경에서 면역계를 강력하게 활성화시킨다. 전형적으로, 이중특이적 분자는 CD4+ 또는 CD8+ 효과기 세포의 활성을 증가시키거나 Treg 세포의 활성을 감소시킬 수 있다. 두 경우 모두, 항체의 네트 효과는 효과기 T 세포의 활성 증가일 것이다. 동일한 검정에서 평가할 때, 이중특이적 분자는 전형적으로, 동일한 표적에 결합하는 단일특이적 작용제의 조합에 의해 유도된 효과기 T 세포의 활성 증가보다 적어도 1.5 배 더 높은 또는 1.7 배 더 높은, 보다 바람직하게는 4.5 배 더 높은, 가장 바람직하게는 7 배 더 높은 효과기 T 세포의 활성의 증가를 유도할 것이다.
효과기 T 세포의 활성 변화를 측정하는 방법은 널리 공지되어 있으며, 상기에 기재된 바와 같다. 세포 증식 및/또는 IFNγ 또는 IL-2 생성에 대한 검정은 널리 공지되어 있으며, 실시예에서 예시된다.
예를 들어, 폴리펩타이드는 CTLA-4 및 GITR 모두에 특이적으로 결합할 수 있고, B1은 GITR에 특이적인 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있고; B2는 CTLA-4에 특이적인 폴리펩타이드 결합 도메인일 수 있으며, 이는 하기의 것들을 포함하거나 이들로 이루어진다:
i) 서열 번호 3의 아미노산 서열; 또는
ii) 서열 번호 3의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산이 변화된 아미노산 서열. 단, 상기 결합 도메인은 야생형 인간 CD86보다 높은 친화성으로 인간 CTLA-4에 결합한다.
폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 CTLA-4는 영장류 또는 뮤린, 바람직하게는 인간 CTLA-4일 수 있고/거나 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 GITR은 영장류, 바람직하게는 인간 GITR일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 부분 B1은, 전형적으로 적어도 하나의 중쇄 (H) 및/또는 적어도 하나의 경쇄 (L)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 B2는 B1의 임의의 부분에 부착될 수 있지만, 전형적으로는, 바람직하게는 N 또는 C 말단에서, 상기 적어도 하나의 중쇄 (H) 또는 적어도 하나의 경쇄 (L)에 부착될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 B2 부분은 임의의 적합한 연결 분자 (링커)를 통해 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다.
부분 B1은 바람직하게는 적어도 하나의 중쇄 (H) 및 적어도 하나의 경쇄 (L)를 포함하고, 부분 B2는 바람직하게는 상기 중쇄 (H) 또는 상기 경쇄 (L)의 N 또는 C 말단에 부착된다. B1의 예시적인 항체는 2 개의 동일한 중쇄 (H) 및 2 개의 동일한 경쇄 (L)로 이루어진다. 이러한 항체는 전형적으로 2 개의 아암(아암)으로서 배열되고, 이들 각각은 이종이량체로서 결합된 하나의 H 및 하나의 L을 갖고, 2 개의 아암은 H 사슬 사이의 이황화물 결합에 의해 결합된다. 따라서, 항체는 효과적으로 2 개의 H-L 이종이량체로 형성된 동종이량체이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 B2 부분은 이러한 항체의 H 사슬 또는 L 사슬 모두에 또는 단지 하나의 H 사슬 또는 단지 하나의 L 사슬에 부착될 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 대안적으로, CTLA-4에 특이적인 적어도 하나의 폴리펩타이드 결합 도메인이 부착된 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서 기재될 수 있으며, 이는 인간 야생형 CD86의 단량체 가용성 세포외 도메인 또는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다. B1 및 B2의 결합 도메인은 본 발명의 폴리펩타이드의 유일한 결합 도메인일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는, 하기 식 (N-C 방향으로 기재됨) 중 임의의 하나에 따라 배열된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다:
(A) L-(X)n-B2;
(B) B2-(X)n-L;
(C) B2-(X)n-H;
(D) H-(X)n-B2;
H는 항체 (즉, B1)의 중쇄이고, L은 항체 (즉, B1)의 경쇄이고, X는 링커이고, n은 0 또는 1이다. 링커 (X)가 펩타이드인 경우, 이는 일반적으로 아미노산 서열 SGGGGSGGGGS (서열 번호 47), SGGGGSGGGGSAP (서열 번호 48), NFSQP (서열 번호 49), KRTVA (서열 번호 50), GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호 51) 또는 (SG)m (m = 1 내지 7)을 갖는다. 식 (A) 내지 (D)의 개략도가 도 24에 나타나 있다.
본 발명은 또한 화학식 (A) 내지 (D) 중 임의의 것에 따라 배열된 폴리펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 단량체로서 제공될 수 있거나 또는 항체와 같은 다량체 단백질의 성분으로서 존재할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 단리될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 예가 표 C에 나타나 있다. 각 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열이 또한 나타나 있다. 예시적인 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 68 내지 75에 언급되어 있다.
부분 B2는 임의의 적합한 수단에 의해 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 부분에 또는 링커에 부착될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 다양한 부분은 펩타이드 결합과 같은 화학적 컨쥬게이션에 의해 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 선택적으로 펩타이드 링커에 의해 결합된 B1 (또는 그의 성분 부분) 및 B2를 포함하는 융합 단백질을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 이러한 융합 단백질에서, B1의 GITR-결합 도메인 또는 도메인들 또는 B2의 CTLA-4-결합 도메인 또는 도메인들은 유일한 결합 도메인일 수 있다.
분자를 폴리펩타이드에 컨쥬게이션시키는 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 카르보디이미드 컨쥬게이션 (Bauminger & Wilchek, 1980, Methods Enzymol. 70: 151-159 참조; 이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)이 독소루비신을 포함한 다양한 작용제를 항체 또는 펩타이드에 컨쥬게이션시키는 데 사용될 수 있다. 수용성 카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)가 관능성 잔기를 결합 잔기에 컨쥬게이션시키는 데 특히 유용하다. 추가의 예로서, 컨쥬게이션은 과요오드산나트륨 산화 후 적절한 반응물의 환원성 알킬화에 의해 또는 글루타르알데하이드 가교 결합에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 어느 방법이 선택되든, 바람직하게는 부분 B1 및 B2가 본 발명의 폴리펩타이드의 일부로서 존재할 때 그의 표적 결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유함이 결정되어야 함을 인식한다.
동일한 기술이 본 발명의 폴리펩타이드 (직접 또는 간접적으로) 또 다른 분자와 연결시키는 데 사용될 수 있다. 다른 분자는 치료제 또는 검출가능한 표지일 수 있다. 적합한 치료제는 세포독성 잔기 또는 약물을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 단리된 또는 실질적으로 단리된 형태로 제공될 수 있다. 실질적으로 단리됨은, 임의의 주위의 배지로부터 폴리펩타이드의 실질적인, 그러나 전체는 아닌 단리가 존재할 수 있음을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 그의 의도된 용도를 방해하지 않는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있고, 이는 여전히 실질적으로 단리된 것으로 간주된다.
본 발명의 예시적인 폴리펩타이드는 표 C에 나타낸 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
항체의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 예를 암호화하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 53, 55, 57, 59, 60, 62, 64, 또는 66으로 표 C에 기재된 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 표 C에 나타낸 폴리펩타이드를 암호화하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 또한 표 C에 나타낸 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다 (인트론 서열은 소문자로 표시됨) (예를 들어, 서열 번호 68, 70, 72 및 74). 부분 B2의 예를 암호화하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 표 B에 나타낸 바와 같이 서열 번호 25 내지 43 중 임의의 하나를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
본 발명의 추가의 양태
본 발명의 제 2 양태는, 상기에 기재된 바와 같은, 개체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 제 1 양태에 따른 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 제 3 양태는, 상기에 기재된 바와 같은, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법이다.
본 발명의 한 구현예는, 질환 또는 병태가 암이고, 선택적으로 개체가 인간인, 본 발명의 제 2 양태에 따른 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드 또는 본 발명의 제 3 양태에 따른 방법이다.
추가의 구현예에서, 방법은, 상기에 기재된 바와 같은, 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체를 전신적으로 또는 국소적으로, 예컨대 종양 부위에 또는 종양 드레이닝 림프절 내로 투여하는 것을 포함한다.
암은 전립선암, 유방암, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 폐암, 자궁경부암, 횡문근육종, 신경모세포종, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 흑색종, 방광암, 위암, 두경부암, 간암, 피부암, 림프종 또는 아교모세포종일 수 있다.
본 발명의 제 4 양태는, 상기에 기재된 바와 같은, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드의 적어도 하나의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 제 5 양태는, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 제약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물이다.
본 발명의 한 구현예에서, 구현예의 제 1 또는 제 2 양태 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드는 추가의 치료학적 잔기에 컨쥬게이션된다.
또한, 당업자는, 본 발명의 제약 조성물이 단독으로, 또는 암 치료에 사용되는 다른 치료제, 예컨대 대사길항제, 알킬화제, 안트라사이클린 및 다른 세포독성 항생제, 빈카 알킬로이드, 에토포시드, 백금 화합물, 탁산, 토포이소머라제 I 억제제, 항증식성 면역억제제, 코르티코스테로이드, 성 호르몬 및 호르몬 길항제, 및 기타 면역요법 항체 (예컨대 트라스투주맙)와 조합되어 투여될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 병용 요법은 GITR 및/또는 CTLA-4 이외의 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하는 암의 치료에 효과적인 추가의 면역요법제를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 면역요법제의 치료 이득은 억제 면역 체크포인트 분자의 기능을 약화시킴으로써 및/또는 자극 면역 체크포인트 분자의 기능을 활성화시킴으로써 매개될 수 있음을 이해할 것이다.
또 다른 구현예에서, 추가의 치료학적 잔기는 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역요법제이다:
(a) PD-1에 결합하는 면역요법제;
(b) OX40에 결합하는 면역요법제; 및
(c) CD137에 결합하는 면역요법제.
따라서, 추가의 면역요법제는 PD1 기능을 억제할 수 있는 항-PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 같은 PD1 억제제 (예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 람브롤리주맙, 피딜주맙 및 AMP-224)일 수 있다. 대안적으로, PD1 억제제는 PD1 기능을 억제할 수 있는 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, MEDI-4736 및 MPDL3280A)을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 제 6 양태는, 상기에 정의된 바와 같은 GITR에 특이적인 항체이다.
이제, 본 발명의 특정 양태를 구현하는 바람직한 비-제한적 예를, 하기 도면을 참조하여 기술할 것이다:
도 1은 다양한 상이한 이중특이적 항체에 의한 이중 항원 결합을 나타낸다. 인간 GITR을 ELISA 플레이트에 코팅하고, 이중특이적 항체를 상이한 농도로 첨가하였다. 2 차 항원으로 비오틴화 CTLA-4를 첨가하였고, 스트렙타빈-HRP를 검출 시약으로 사용하였다.
도 2는 야생형 및 무푸코실화 형태에서의 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373에 의한 이중 항원 결합을 나타낸다. 인간 GITR을 ELISA 플레이트에 코팅하고, 항체를 상이한 농도로 첨가하였다. 2 차 항원으로 비오틴화 CTLA-4를 첨가하였고, 스트렙타빈-HRP를 검출 시약으로 사용하였다.
도 3은 인간 GITR과 상호작용하는 이중특이적 항체의 동역학 프로파일을 나타낸다. 이중특이적 항체를 1.25 내지 80 nM 범위의 농도에서 센서 팁 표면 상에 고정화된 GITR에 대해 검정하였다 (300 초 결합 및 900 초 해리).
도 4는 인간 CTLA-4와 상호작용하는 이중특이적 항체 2372/2373의 동역학 프로파일을 나타낸다. 이중특이적 항체를 센서 팁에 고정시키고 10 내지 80 nM 범위의 농도에서 hCTLA-4에 대해 검정하였다 (180 초 결합 및 600 초 해리).
도 5는 GITR - GITR 리간드 상호작용을 차단하는 이중특이적 항체의 능력을 나타낸다. 상단 4 개의 부분도는 각각의 이중특이적 항체에 사용된 2 개의 센서 팁 (검정 센서 및 기준 센서)으로부터의 센소그램을 나타내며, 하단 부분도는 이중 특이적 항체가 존재하지 않는 GITR에 대한 GITR 리간드의 결합을 나타낸다. 도에 포함된 다른 단계는, a) 고정화된 GITR에 대한 이중특이적 항체의 결합, b) 고정화된 GITR에 대한 GITR 리간드의 결합 (검정 센서) 또는 동역학 완충액에서의 결합된 이중특이적 항체의 해리 (기준 센서) 및 c) 형성된 GITR-GITR 리간드 복합체의 해리이다.
도 6은 2 차 항체 (이중특이적 또는 단일특이적)와 GITR의 상호작용을 차단하는 이중특이적 항체 2372/2373의 능력을 나타낸다. 상단 4 개의 부분도는 각각의 2 차 이중특이적 항체에 사용된 2 개의 센서 팁 (검정 센서 및 기준 센서)으로부터의 센소그램을 나타내며, 하단 부분도는 임의의 2 차 항체가 없는 2372/2373의 결합 및 해리 프로파일을 나타낸다. 도에 포함된 다른 단계는, a) 고정화된 GITR에 대한 이중특이적 항체 2372/2373의 결합, b) 2372/2373으로의 이전 차단이 있는 (검정 센서, 상단 센소그램) 또는 이것이 없는 (기준 센서, 하단 센소그램) 고정화된 GITR에 대한 2 차 항체의 결합이다.
도 7은, 유동 세포계측법에 의해 측정된, 표적-발현 세포에 대한 야생형 및 무푸코실화 형태의 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373의 결합을 나타낸다. GITR고-CTLA-4고 세포를 일련의 희석된 항체, 그 후 2 차 PE-컨쥬게이션된 항-hFc 항체로 염색하였다.
도 8은, 유동 세포계측법에 의해 측정된, FcγRIIIa-발현 세포에 대한 야생형 및 무푸코실화된 형태의 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373의 결합을 나타낸다. CHO-FcγRIIIa 세포를 일련의 희석된 항체, 그 후 2 차 PE-컨쥬게이션된 항-hFc 항체로 염색하였다.
도 9는, ELISA를 사용하여 평가된, 야생형 및 무푸코실화된 2372/2373 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 C1q에 대한 결합을 나타낸다. 인간 C1q를 플레이트 상에 코팅하고, 항체를 상이한 농도로 첨가하였다. 양(sheep) 항-인간 C1q-HRP를 검출 항체로서 사용하고, 그 후 퍼옥시다제 기질을 사용하였다. 리툭시맵은 양성 대조군으로서 포함되었으며, IgG1 및 IgG4 이소타입 대조군은 음성 대조군으로서 포함되었다.
도 10은, 가용성 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 또는 가용성 단일특이적 대조군의 조합 (Miltenyi로부터의 GITR mAb 및 CTLA-4 결합 부분을 갖는 이소타입 대조군, iso/CTLA-4)으로 자극된 인간 CD3+ T 세포의 시험관내 자극에 따른 IFNγ 생성을 나타낸다. 실험은 CTLA-4 유무에 관계없이 CD3으로 코팅된 플레이트에서 수행되었다. a) GITR/CTLA-4 이중특이적 항체: 2372/2373의 전체 용량-반응 곡선. b) 이중특이적 항체: 2348/2349, 2372/2373, 2396/2397 및 2404/2405 또는 단일특이적 대조군의 단일 항체 농도 (16 nM). 이 검정은 총 4 명의 공여자에서 2 회 수행되었다. 하나의 대표적인 실험 (2 명의 공여자의 평균)을 나타내었다.
도 11은 야생형 및 무푸코실화 2372/2373 변이체의 작용제 효과를 나타낸다. CD3+ T 세포를 αCD3 및 CTLA-4로 코팅된 플레이트에서 72 시간 동안 야생형 및 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체로 자극하였다. (a) IFN-γ, 및 (b) IL-2의 분비를 ELISA에 의해 상등액에서 측정하였다. 하나의 대표 실험 (4 명의 공여자의 평균)을 나타내었다.
도 12는, a) FcγRIIIa 발현 세포의 부재 하에, 또한 b) FcγRIIIa 발현 CHO 세포 (100,000 세포/웰)의 존재 하에 야생형 및 무푸코실화된 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373 및 이소타입 대조군에 반응하는 GITR 활성화를 나타낸다. 주르카트(Jurkat) 세포를 발현하는 GITR을 리포터 세포로서 사용하였다. 데이터는 배지 대조군에 대한 배수 유도로서 제시되었다.
도 13은 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373, 단일특이적 대응물 (iso/CTLA-4＋αGITR mAb) 및 이소타입 대조군의 조합에 반응하는 FcγRIIIa (V158) 효과기 세포의 활성화를 나타낸다. GITR고-CTLA4저 CHO 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 데이터는 배지 대조군에 대한 배수 유도로서 제시되었다. 두 가지 실험 중 하나를 나타내었다.
도 14는 야생형 및 무푸코실화 2372/2373 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 및 이소타입 대조군에 반응하는 FcγRIIIa (V158) 효과기 세포의 활성화를 나타낸다. 표적 세포로서, a) CHO-GITR고-CTLA4저 세포, 및 b) CHO-GITR고-CTLA4고 세포를 사용하였다. 데이터는 배지 대조군에 대한 배수 유도로서 제시되었다. 두 가지 실험 중 하나를 나타내었다.
도 15는 야생형 및 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373 및 이소타입 대조군에 반응하는 ADCC를 나타낸다. 표적 세포로서 PBMC 효과기 세포 및 CHO-GITR고-CTLA4고 세포를 4 시간 동안 50:1 비율로 시험 화합물과 공동-배양한 후 상등액에서 LDH를 측정하였다. 4 명의 공여자의 평균을 나타내었다.
도 16은 야생형 및 무푸코실화 2372/2373 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체에 반응하는 FcγRIIIa (V158) 효과기 세포의 활성화를 나타낸다. 표적 세포로서, (a) 새로 단리된 Treg (CD4+CD25+CD127저), 및 (b) αCD3/αCD28 비드로 48 시간 활성화된 Treg를 사용하였다. 데이터는 배지 대조군에 대한 배수 유도로서 제시되었다. (c) GITR 및 CTLA-4의 발현을 활성화 전후에 PBMC 및 Treg에 대한 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. 2 명의 공여자의 평균을 나타내었다.
도 17은 비장세포 검정에서 대용 이중특이적 항체의 작용제 효과를 나타낸다. CD3+ T 세포를 αCD3 및 CTLA-4로 코팅된 플레이트에서 48 시간 동안 야생형 또는 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체로 자극하였고, T 세포의 활성화를 ELISA에 의해 IFN-γ 분비의 형태로 측정하였다.
도 18은 대용 야생형 또는 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체에 의한 ADCC 반응의 지표로서 mFcγRIV 리포터 세포의 활성화를 나타낸다. 데이터는 배지 대조군에 대한 배수 유도로서 제시되었다.
도 19는 CT26 결장암 모델에서의 이중특이적 대용 GITR/CTLA-4 항체의 항-종양 효과를 나타낸다. 7, 10, 13 일에 복강내 치료를 수행하였다. (a) 비히클 및 DTA-1에 비해 2776/2777에 의한 종양 체적 억제. (b) 비히클에 비해 2776/2777 AF의 생존율 증가. 그래프는 예시적 그래프, 평균 종양 부피 +/- SEM 또는 카플란-마이어(Kaplan-Meyer) 생존율, n = 10/실험을 나타낸다.
도 20은 MC38 결장암 모델에서의 이중특이적 대용 GITR/CTLA-4 항체의 항-종양 효과를 나타낸다. 치료는 확립된 피하 종양을 갖는 마우스에서 7, 10, 13 일에 복강내로 수행하였다. (a) 2776/2777에 의한 종양 체적 억제, (b) 비히클에 비해 2776/2777 AF 치료 마우스의 생존율 증가. 그래프는 예시적 그래프, 평균 종양 부피 +/- SEM, 또는 카플란-마이어 생존율, n = 10/실험을 나타낸다.
도 21은 Treg에 대한 이중특이적 대용 항체의 항-종양 효과를 나타낸다. 피하 MC38 결장암을 갖는 마우스를 10, 13 및 16 일에 2776/2777 또는 2776/2777 AF (200 ㎍)로 복강내 주사로 치료하였다. 마지막 주사 후 24 시간에, 종양 및 비장을 수확하여 Treg 및 효과기 세포를 염색하였다. (a) 종양의 퍼센트 Treg (b) 종양내 CD8/Treg 비율, 및 (c) 비장에서의 CD8/Treg 비율. 그래프는 평균 + SD를 나타낸다.
도 22는 이중특이적 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 항-종양 효능을 나타낸다. RPMI-8226 형질세포종 (10×106)을 0 일에 우측 뒷다리 옆구리/등에 피하에 접종하였다. 인간 PBMC 세포 (5×106)를 5 일에 복강내 투여하였다. 치료는 5, 11 및 18 일에 복강내 주사 (대략 500 nmol/용량)에 의해 수행하였다. (a) hPBMC의 존재 하에 종양 체적 억제, n = 5/공여자, n(공여자)=2 (b) hPBMC의 부재 하에 종양 체적 억제, n = 10/그룹. 그래프는 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 23은 본원에 개시된 인간 야생형 CD86 아미노산 서열의 개략도를 제공한다. (A)는 N-말단 신호 서열을 갖지 않는 인간 CD86의 단량체 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호 3)이고; (B)는 N-말단 신호 서열을 포함하는 인간 야생형 CD86의 단량체 세포외 및 막관통 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호 4)이고; (C)는 인간 CD86의 전장 아미노산 서열 (Genbank ABK41931.1, 서열 번호 44)이다. A의 서열은 N-말단, 즉, 굵게 표시된 위치 24 및 25에서 알라닌 및 프롤린이 선택적으로 결핍될 수 있다. B 및 C의 신호 서열에는 밑줄이 그어져 있다. 아미노산 위치의 넘버링은 N-말단부터 시작하여 서열 번호 4 및 44에 기초한다.
도 24는 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 대한 예시적인 배열의 구조의 개략도를 나타낸다. 항-GITR 항체 가변 도메인은 흑색으로; 불변 도메인은 백색으로 채워져 있다. CTLA-A 결합 도메인은 대각선으로 음영 처리되어 있다.
도 2는 야생형 및 무푸코실화 형태에서의 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373에 의한 이중 항원 결합을 나타낸다. 인간 GITR을 ELISA 플레이트에 코팅하고, 항체를 상이한 농도로 첨가하였다. 2 차 항원으로 비오틴화 CTLA-4를 첨가하였고, 스트렙타빈-HRP를 검출 시약으로 사용하였다.
도 3은 인간 GITR과 상호작용하는 이중특이적 항체의 동역학 프로파일을 나타낸다. 이중특이적 항체를 1.25 내지 80 nM 범위의 농도에서 센서 팁 표면 상에 고정화된 GITR에 대해 검정하였다 (300 초 결합 및 900 초 해리).
도 4는 인간 CTLA-4와 상호작용하는 이중특이적 항체 2372/2373의 동역학 프로파일을 나타낸다. 이중특이적 항체를 센서 팁에 고정시키고 10 내지 80 nM 범위의 농도에서 hCTLA-4에 대해 검정하였다 (180 초 결합 및 600 초 해리).
도 5는 GITR - GITR 리간드 상호작용을 차단하는 이중특이적 항체의 능력을 나타낸다. 상단 4 개의 부분도는 각각의 이중특이적 항체에 사용된 2 개의 센서 팁 (검정 센서 및 기준 센서)으로부터의 센소그램을 나타내며, 하단 부분도는 이중 특이적 항체가 존재하지 않는 GITR에 대한 GITR 리간드의 결합을 나타낸다. 도에 포함된 다른 단계는, a) 고정화된 GITR에 대한 이중특이적 항체의 결합, b) 고정화된 GITR에 대한 GITR 리간드의 결합 (검정 센서) 또는 동역학 완충액에서의 결합된 이중특이적 항체의 해리 (기준 센서) 및 c) 형성된 GITR-GITR 리간드 복합체의 해리이다.
도 6은 2 차 항체 (이중특이적 또는 단일특이적)와 GITR의 상호작용을 차단하는 이중특이적 항체 2372/2373의 능력을 나타낸다. 상단 4 개의 부분도는 각각의 2 차 이중특이적 항체에 사용된 2 개의 센서 팁 (검정 센서 및 기준 센서)으로부터의 센소그램을 나타내며, 하단 부분도는 임의의 2 차 항체가 없는 2372/2373의 결합 및 해리 프로파일을 나타낸다. 도에 포함된 다른 단계는, a) 고정화된 GITR에 대한 이중특이적 항체 2372/2373의 결합, b) 2372/2373으로의 이전 차단이 있는 (검정 센서, 상단 센소그램) 또는 이것이 없는 (기준 센서, 하단 센소그램) 고정화된 GITR에 대한 2 차 항체의 결합이다.
도 7은, 유동 세포계측법에 의해 측정된, 표적-발현 세포에 대한 야생형 및 무푸코실화 형태의 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373의 결합을 나타낸다. GITR고-CTLA-4고 세포를 일련의 희석된 항체, 그 후 2 차 PE-컨쥬게이션된 항-hFc 항체로 염색하였다.
도 8은, 유동 세포계측법에 의해 측정된, FcγRIIIa-발현 세포에 대한 야생형 및 무푸코실화된 형태의 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373의 결합을 나타낸다. CHO-FcγRIIIa 세포를 일련의 희석된 항체, 그 후 2 차 PE-컨쥬게이션된 항-hFc 항체로 염색하였다.
도 9는, ELISA를 사용하여 평가된, 야생형 및 무푸코실화된 2372/2373 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 C1q에 대한 결합을 나타낸다. 인간 C1q를 플레이트 상에 코팅하고, 항체를 상이한 농도로 첨가하였다. 양(sheep) 항-인간 C1q-HRP를 검출 항체로서 사용하고, 그 후 퍼옥시다제 기질을 사용하였다. 리툭시맵은 양성 대조군으로서 포함되었으며, IgG1 및 IgG4 이소타입 대조군은 음성 대조군으로서 포함되었다.
도 10은, 가용성 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 또는 가용성 단일특이적 대조군의 조합 (Miltenyi로부터의 GITR mAb 및 CTLA-4 결합 부분을 갖는 이소타입 대조군, iso/CTLA-4)으로 자극된 인간 CD3+ T 세포의 시험관내 자극에 따른 IFNγ 생성을 나타낸다. 실험은 CTLA-4 유무에 관계없이 CD3으로 코팅된 플레이트에서 수행되었다. a) GITR/CTLA-4 이중특이적 항체: 2372/2373의 전체 용량-반응 곡선. b) 이중특이적 항체: 2348/2349, 2372/2373, 2396/2397 및 2404/2405 또는 단일특이적 대조군의 단일 항체 농도 (16 nM). 이 검정은 총 4 명의 공여자에서 2 회 수행되었다. 하나의 대표적인 실험 (2 명의 공여자의 평균)을 나타내었다.
도 11은 야생형 및 무푸코실화 2372/2373 변이체의 작용제 효과를 나타낸다. CD3+ T 세포를 αCD3 및 CTLA-4로 코팅된 플레이트에서 72 시간 동안 야생형 및 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체로 자극하였다. (a) IFN-γ, 및 (b) IL-2의 분비를 ELISA에 의해 상등액에서 측정하였다. 하나의 대표 실험 (4 명의 공여자의 평균)을 나타내었다.
도 12는, a) FcγRIIIa 발현 세포의 부재 하에, 또한 b) FcγRIIIa 발현 CHO 세포 (100,000 세포/웰)의 존재 하에 야생형 및 무푸코실화된 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373 및 이소타입 대조군에 반응하는 GITR 활성화를 나타낸다. 주르카트(Jurkat) 세포를 발현하는 GITR을 리포터 세포로서 사용하였다. 데이터는 배지 대조군에 대한 배수 유도로서 제시되었다.
도 13은 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373, 단일특이적 대응물 (iso/CTLA-4＋αGITR mAb) 및 이소타입 대조군의 조합에 반응하는 FcγRIIIa (V158) 효과기 세포의 활성화를 나타낸다. GITR고-CTLA4저 CHO 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 데이터는 배지 대조군에 대한 배수 유도로서 제시되었다. 두 가지 실험 중 하나를 나타내었다.
도 14는 야생형 및 무푸코실화 2372/2373 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 및 이소타입 대조군에 반응하는 FcγRIIIa (V158) 효과기 세포의 활성화를 나타낸다. 표적 세포로서, a) CHO-GITR고-CTLA4저 세포, 및 b) CHO-GITR고-CTLA4고 세포를 사용하였다. 데이터는 배지 대조군에 대한 배수 유도로서 제시되었다. 두 가지 실험 중 하나를 나타내었다.
도 15는 야생형 및 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 2372/2373 및 이소타입 대조군에 반응하는 ADCC를 나타낸다. 표적 세포로서 PBMC 효과기 세포 및 CHO-GITR고-CTLA4고 세포를 4 시간 동안 50:1 비율로 시험 화합물과 공동-배양한 후 상등액에서 LDH를 측정하였다. 4 명의 공여자의 평균을 나타내었다.
도 16은 야생형 및 무푸코실화 2372/2373 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체에 반응하는 FcγRIIIa (V158) 효과기 세포의 활성화를 나타낸다. 표적 세포로서, (a) 새로 단리된 Treg (CD4+CD25+CD127저), 및 (b) αCD3/αCD28 비드로 48 시간 활성화된 Treg를 사용하였다. 데이터는 배지 대조군에 대한 배수 유도로서 제시되었다. (c) GITR 및 CTLA-4의 발현을 활성화 전후에 PBMC 및 Treg에 대한 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. 2 명의 공여자의 평균을 나타내었다.
도 17은 비장세포 검정에서 대용 이중특이적 항체의 작용제 효과를 나타낸다. CD3+ T 세포를 αCD3 및 CTLA-4로 코팅된 플레이트에서 48 시간 동안 야생형 또는 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체로 자극하였고, T 세포의 활성화를 ELISA에 의해 IFN-γ 분비의 형태로 측정하였다.
도 18은 대용 야생형 또는 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체에 의한 ADCC 반응의 지표로서 mFcγRIV 리포터 세포의 활성화를 나타낸다. 데이터는 배지 대조군에 대한 배수 유도로서 제시되었다.
도 19는 CT26 결장암 모델에서의 이중특이적 대용 GITR/CTLA-4 항체의 항-종양 효과를 나타낸다. 7, 10, 13 일에 복강내 치료를 수행하였다. (a) 비히클 및 DTA-1에 비해 2776/2777에 의한 종양 체적 억제. (b) 비히클에 비해 2776/2777 AF의 생존율 증가. 그래프는 예시적 그래프, 평균 종양 부피 +/- SEM 또는 카플란-마이어(Kaplan-Meyer) 생존율, n = 10/실험을 나타낸다.
도 20은 MC38 결장암 모델에서의 이중특이적 대용 GITR/CTLA-4 항체의 항-종양 효과를 나타낸다. 치료는 확립된 피하 종양을 갖는 마우스에서 7, 10, 13 일에 복강내로 수행하였다. (a) 2776/2777에 의한 종양 체적 억제, (b) 비히클에 비해 2776/2777 AF 치료 마우스의 생존율 증가. 그래프는 예시적 그래프, 평균 종양 부피 +/- SEM, 또는 카플란-마이어 생존율, n = 10/실험을 나타낸다.
도 21은 Treg에 대한 이중특이적 대용 항체의 항-종양 효과를 나타낸다. 피하 MC38 결장암을 갖는 마우스를 10, 13 및 16 일에 2776/2777 또는 2776/2777 AF (200 ㎍)로 복강내 주사로 치료하였다. 마지막 주사 후 24 시간에, 종양 및 비장을 수확하여 Treg 및 효과기 세포를 염색하였다. (a) 종양의 퍼센트 Treg (b) 종양내 CD8/Treg 비율, 및 (c) 비장에서의 CD8/Treg 비율. 그래프는 평균 + SD를 나타낸다.
도 22는 이중특이적 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 항-종양 효능을 나타낸다. RPMI-8226 형질세포종 (10×106)을 0 일에 우측 뒷다리 옆구리/등에 피하에 접종하였다. 인간 PBMC 세포 (5×106)를 5 일에 복강내 투여하였다. 치료는 5, 11 및 18 일에 복강내 주사 (대략 500 nmol/용량)에 의해 수행하였다. (a) hPBMC의 존재 하에 종양 체적 억제, n = 5/공여자, n(공여자)=2 (b) hPBMC의 부재 하에 종양 체적 억제, n = 10/그룹. 그래프는 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 23은 본원에 개시된 인간 야생형 CD86 아미노산 서열의 개략도를 제공한다. (A)는 N-말단 신호 서열을 갖지 않는 인간 CD86의 단량체 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호 3)이고; (B)는 N-말단 신호 서열을 포함하는 인간 야생형 CD86의 단량체 세포외 및 막관통 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호 4)이고; (C)는 인간 CD86의 전장 아미노산 서열 (Genbank ABK41931.1, 서열 번호 44)이다. A의 서열은 N-말단, 즉, 굵게 표시된 위치 24 및 25에서 알라닌 및 프롤린이 선택적으로 결핍될 수 있다. B 및 C의 신호 서열에는 밑줄이 그어져 있다. 아미노산 위치의 넘버링은 N-말단부터 시작하여 서열 번호 4 및 44에 기초한다.
도 24는 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 대한 예시적인 배열의 구조의 개략도를 나타낸다. 항-GITR 항체 가변 도메인은 흑색으로; 불변 도메인은 백색으로 채워져 있다. CTLA-A 결합 도메인은 대각선으로 음영 처리되어 있다.
서열의 기재
서열 번호 1은 인간 CTLA-4의 아미노산 서열 (GenBank: AAD00698.1에 상응함)이다.
서열 번호 2는 인간 CD28의 아미노산 서열 (GenBank: AAA51944.1에 상응함)이다.
서열 번호 3은 N-말단으로부터 23개-아미노산 신호 서열을 제외한, 인간 야생형 CD86의 단량체 세포외 도메인의 아미노산 서열이다.
서열 번호 4는 N-말단 신호 서열을 포함하는, 인간 야생형 CD86의 단량체 세포외 및 막관통 도메인의 아미노산 서열이다 (도 23 참조). 본원의 아미노산 위치의 모든 넘버링은 N-말단부터 시작하여 서열 번호 4의 위치에 기초한다. 따라서, 서열 번호 3의 N-말단의 알라닌은 24로 넘버링된다.
서열 번호 5는 [Peach 등, Journal of Biological Chemistry 1995, vol 270(36), 21181-21187]에 개시된 인간 CD86의 세포외 도메인의 돌연변이 형태의 아미노산 서열이다. 야생형 서열의 위치 79에서의 H는 서열 번호 5의 서열에 대한 상응하는 위치에서 A로 치환된다. 이 변화는 본원에서 H79A로 지칭된다. 동등한 명명법이 본원에서 언급된 다른 아미노산 치환에 대해 전체적으로 사용된다. 위치의 넘버링은 상기에 기재된 바와 같은 서열 번호 4에 기초한다.
서열 번호 6 내지 24는 본 발명의 특정 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 25 내지 43은 각각 서열 번호 6 내지 24 각각의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다,
서열 번호 44는 인간 CD86의 전장 아미노산 서열 (GenBank: ABK41931.1에 상응함)이다.
서열 번호 45는 뮤린 CTLA-4의 아미노산 서열 (UniProtKB/Swiss-Prot: P09793.1에 상응함)이다.
서열 번호 46은 뮤린 CD28의 아미노산 서열 (GenBank: AAA37395.1에 상응함)이다.
서열 번호 47 내지 51은 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 사용될 수 있는 다양한 링커이다.
서열 번호 52 내지 75는 본 발명의 예시적인 서열이다.
서열 번호 76 내지 96은 본 발명의 예시적인 CDR 서열이다.
서열 번호 97은 예시적인 중쇄 불변 영역 아미노산 서열이다.
서열 번호 98은 예시적인 경쇄 불변 영역 아미노산 서열이다.
서열 번호 99는 힌지 영역 (위치 108)에서 Ser에서 Pro로의 돌연변이, 또한 CH3 영역 (위치 315)에서 His에서 Arg로의 돌연변이를 갖는 예시적인 변형된 인간 중쇄 IgG4 불변 영역 서열이다. 돌연변이는 혈청 반감기를 감소시키고 IgG4의 코어 힌지를 안정화시켜 IgG4를 보다 안정하게 만들고 Fab 아암(아암) 교환을 방지한다.
서열 번호 100은 예시적인 야생형 인간 중쇄 IgG4 불변 영역 서열이다. 이는 서열 번호 99의 돌연변이가 없는 서열이다.
서열 번호 101은 힌지 영역 (위치 108)에서 Ser에서 Pro로의 단일 돌연변이를 갖는 예시적인 변형된 인간 중쇄 IgG4 불변 영역 서열이다. 돌연변이는 IgG4의 코어 힌지를 안정화시켜 IgG4를 보다 안정하게 만들고 Fab 아암 교환을 방지한다.
서열 번호 102는 서열 번호 99의 IgG4 불변 영역을 암호화하는 예시적인 cDNA 서열 (즉, 인트론 결핍)이다.
서열 번호 103은 서열 번호 99의 IgG4 불변 영역을 암호화하는 예시적인 게놈 DNA 서열 (즉, 인트론 포함)이다
서열 번호 104는 서열 번호 100의 IgG4 불변 영역을 암호화하는 예시적인 cDNA 서열 (즉, 인트론 결핍)이다.
서열 번호 105는 서열 번호 100의 IgG4 불변 영역을 암호화하는 예시적인 게놈 DNA 서열 (즉, 인트론 포함)이다.
서열 번호 106 및 107은 각각 서열 번호 97의 IgG1 불변 영역을 암호화하는 예시적인 cDNA 및 게놈 DNA 서열이다.
서열 번호 108은 서열 번호 98의 경쇄 카파 영역을 암호화하는 예시적인 DNA 서열이다.
서열 번호 109는 서열 번호 101의 IgG4 영역을 암호화하는 예시적인 cDNA 서열 (즉, 인트론 결핍)이다.
서열 번호 110은 서열 번호 101의 IgG4 영역을 암호화하는 예시적인 게놈 DNA 서열 (즉, 인트론 포함)이다.
서열 번호 111은 인간 GITR의 아미노산 서열 (GenBank: AAD00698.1에 상응함)이다.
서열 번호 112 내지 143은 OX40-결합 도메인의 VL 및 VH 영역의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열이다.
표 (서열)
기타 서열
실시예
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 설명하며, 이는 추가의 제한으로서 해석되어선 안된다. 본원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 명백히 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1 - 이중특이적 항체 GITR/CTLA-4의 이중 ELISA
재료 및 방법
ELISA 플레이트를 GITR-hFc (0.5㎍/㎖) 50㎕/웰 (R & D Systems, #689-GR)로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBST (PBS + 0.05% 폴리소르베이트 20)로 3 회 세척하고, PBST 및 1% BSA로 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다. PBST로 3 회 세척한 후, 이중특이적 항체를 상이한 농도 (최고 농도 66.7 nM)로 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온 처리하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하고 0.1㎍/㎖의 비오틴화 CTLA-4-mFc (Ancell, #501-030)을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온 처리하였다. PBST로 3 회 세척한 후, HRP-표지된 스트렙타비딘을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온 처리하였다. 플레이트를 PBST로 6 회 세척하고, SuperSignal Pico Luminescent 기질 (Thermo Scientific, #37069)을 제조자의 프로토콜에 따라 첨가하고 발광을, Fluorostar Optima (BMG labtech)에서 측정하였다.
결과 및 결론
이중특이적 항체는 용량-의존적 방식으로 두 표적에 동시에 (도 1) 결합할 수 있으며, 이는 제안된 작용 양식에 있어 중요하다. 무푸코실화 이중특이적 항체 형태에서 표적 결합의 차이는 나타나지 않는다 (도 2). EC50 값은 야생형 및 무푸코실화 항체에 대해 각각 0.64 및 0.54 nM이다.
실시예 2 - GITR과의 이중특이적 항체 상호작용의 동역학
재료 및 방법
동역학 측정은 AR2G (Amine Reactive 2nd Gen) 센서 팁 (ForteBio)이 장착된 Octet RED96 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 20 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC), 10 mM N-히드록시숙신이미드 (NHS) 및 1 M 에탄올아민-HCl (pH 8.5)와의 표준 아민 커플링을 사용하여, 인간 GITR (Acro Biosystems, #GIR-H5228)을 10 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.0) 중에서 바이오센서 표면에 커플링시켰다. 이중특이적 항체를 1×동역학 완충액 (ForteBio) 중에서 80 nM, 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM 및 1.25 nM으로 희석하였다. 결합 동역학은, 결합이 300 초 동안, 그 후 해리가 900 초 동안 허용된 1×동역학 완충액 중에서 연구하였다. 센서 팁은 10 mM 글리신 (pH 1.7)을 사용하여 재생시켰다. 생성된 데이터는 평행 완충액 블랭크를 뺌으로써 기준화하였고, 기준선을 y-축과 정렬시키고, 해리에 대한 정렬에 의한 단계간 상관을 수행하고, 데이터 분석 소프트웨어 (v.9.0.0.14)에서 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 필터로 데이터를 평활화시켰다. 처리된 데이터를 핏팅 정확성의 측정으로서 X2를 사용하여, 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 핏팅하였다.
결과 및 결론
하기 표 1 및 도 3에 요약된 바와 같이, 이중특이적 항체는 상기에 기재된 검정 셋업 사용시 낮은 nM 내지 nM 미만 범위의 KD로 GITR에 결합한다. X2 값은 곡선 핏팅이 양호함을 확인시켜준다.
실시예 3 - CTLA-4와의 이중특이적 항체의 상호작용의 동역학
재료 및 방법
동역학 측정은 항-hIgG Fc 캡쳐 (AHC) 센서 팁 (ForteBio)이 장착된 Octet RED96 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 이중특이적 항체를 1×동역학 완충액 (ForteBio)에서 2 ㎍/㎖로 희석하고, 300초 동안 센서 팁에 로딩하였다. 이어서, 고정화된 이중특이적 항체를 인간 CTLA-4 (ACRO Biosystems, #CT4-H5229)의 4 2 배 희석에 대하여 검정하였다. 결합 동역학은, 결합이 180 초 동안, 그 후 해리가 600 초 동안 허용된 1×동역학 완충액에서 연구하였다. 센서 팁은 10 mM 글리신 (pH 1.7)을 사용하여 재생시켰다. 생성된 데이터는 평행 완충액 블랭크를 뺌으로써 기준화하였고, 기준선을 y-축과 정렬시키고, 해리에 대한 정렬에 의한 단계간 상관을 수행하고, 데이터 분석 소프트웨어 (v.9.0.0.14)에서 사비츠키-골레이 필터로 데이터를 평활화시켰다. 처리된 데이터를 핏팅 정확성의 측정으로서 X2를 사용하여, 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 핏팅하였다.
결과 및 결론
하기 표 2 및 도 4에 요약된 바와 같이, CTLA-4 결합제 2372/2373은 상기에 기재된 검정 셋업을 사용하여 nM 범위의 KD로 CTLA-4와 상호작용한다. X2 값은 곡선 핏팅이 양호함을 확인시켜준다.
실시예 4 - GITR과 GITR 리간드간의 상호작용을 차단하는 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 능력.
재료 및 방법
리간드 차단 실험은 AR2G (Amine Reactive 2nd Gen) 센서 팁 (ForteBio)이 장착된 Octet RED96 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 20 mM 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC), 10 mM N-히드록시숙신이미드 (NHS) 및 1 M 에탄올아민-HCl (pH 8.5)와의 표준 아민 커플링을 사용하여, 인간 GITR (Acro Biosystems, #GIR-H5228)을 10 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.0) 중에서 바이오센서 표면에 커플링시켰다. 이중특이적 항체를 80 nM로 희석하고, GITR 리간드 (Acro Biosystems, # GIL-H526a)를 1×동역학 완충액 (ForteBio) 중에서 5 ㎍/㎖로 희석하였다. 각각의 이중특이적 항체를 600초 동안 2 개의 평행한 바이오센서 팁에 결합시킨 후, 300 초 동안 GITR 리간드 용액 중에 1 개의 센서 (검정 센서)를 침지시키고, 1×동역학 완충액 중에 1 개의 센서 (기준 센서)를 침지시켰다. 한 쌍의 바이오센서를 임의의 이중특이적 항체가 없는 1×동역학 완충액에서 작동시켜 억제가 없는 GITR 리간드 결합을 입증하였다. 마지막으로, 10 mM 글리신 (pH 1.7)을 사용하는 센서 팁 재생 전에, 형성된 GITR-GITR 리간드 복합체의 1×동역학 완충액 중에서의 해리가 이어졌다.
결과 및 결론
도 5에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 항체는, GITR이 GITR 리간드와 상호작용하는 능력을 완전히 또는 부분적으로 차단하는 방식으로 GITR에 결합한다. 2372/2373 및 2404/2405는 GITR 리간드를 거의 완전히 차단한다.
실시예 5 - GITR과의 서로의 상호작용을 차단하는 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 능력.
재료 및 방법
차단 실험은 AR2G (Amine Reactive 2nd Gen) 센서 팁 (ForteBio)이 장착된 Octet RED96 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 20 mM 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC), 10 mM N-히드록시숙신이미드 (NHS) 및 1 M 에탄올아민-HCl (pH 8.5)와의 표준 아민 커플링을 사용하여, 인간 GITR (Acro Biosystems, #GIR-H5228)을 10 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.0) 중에서 바이오센서 표면에 커플링시켰다. 이중특이적 항체를 1×동역학 완충액 (ForteBio) 중에서 80 nM (1 차 이중특이적 항체) 또는 20 nM (2 차 이중특이적 항체 및 대조군 mAb)로 희석하였다. 대조군으로서 시판되는 GITR 특이적 단일특이적 mAb (DT5D3, Miltenyi Biotec)를 사용하였다. 2 개의 바이오센서 팁을 각 검정에 사용하였다. 1 차 이중특이적 항체를 600초 동안 이들 센서 중 하나에 결합시켰으며 (검정 센서), 다른 센서는 1×동역학 완충액에서 항온 처리하였다 (참조 센서). 다음으로, 2 개의 센서를 2차 항체를 함유하는 웰에서 항온 처리하고, 결합을 180 초 동안 연구한 후, 10 mM 글리신 (pH 1.7)을 사용하여 센서를 재생시켰다.
결과 및 결론
도 6에 예시된 바와 같이, 이중특이적 항체는 분석된 모든 2차 항체 (이중특이적 및 대조군 mAb)의 GITR에 대한 결합을 적어도 부분적으로 억제하는 능력을 갖는다. 이 검정은 4가지의 이중특이적 항체 모두를 1차 항체로서 사용하여 반복하였고, 모든 셋업에서 유사한 결과가 나타났다 (데이터는 나타내지 않음). 이는, 이 검정에 포함된 모든 항체가, GITR에 대한 서로의 결합을 차단하거나 입체 장애에 의해 또는 GITR의 형태 변화를 유도하여 수용체에 결합하는 것을 방해하도록 적어도 가까이 인접하는 또는 중복되는 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 6 - GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 표적-발현 세포에 대한 결합
GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 표적-발현 세포에 대한 결합을 유동 세포계측법으로 평가하였다. 무푸코실화 형태를 야생형 IgG1과 비교하였다. 표적-결합 능력의 차이는 예상되지 않았다.
재료 및 방법
높은 수준의 GITR 및 CTLA-4를 안정적으로 발현하는 트랜스펙션된 CHO 세포 (CHO-GITR고-CTLA-4고 세포)를 사용하였다. 250,000 세포/웰을 4℃에서 1 시간 동안 FACS 완충액 (0.5% BSA 함유 PBS) 중에서 연속 희석된 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체로 염색하였다. 세포를 FACS 완충액 중에서 세척한 후, FACS 완충액 중에서 1:100 희석된 2차 PE-컨쥬게이션된 항-hFc 항체 (Jackson, #109-115-098)를 첨가하였다. 4℃에서 30분 항온 처리 후, 세포를 2회 세척하고, FACS 완충액 중에 재현탁하고, FACS Verse에서 분석하였다.
결과 및 결론
도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 표적 결합의 차이는 보이지 않는다. 야생형 및 무푸코실화 항체의 EC50 값은 각각 11.7 및 9.9 nM이다.
실시예 7 - 무푸코실화 Fc 도메인을 갖는 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 Fc 수용체 결합
항원 결합 이외에도, 항체는 불변 도메인과의 상호작용을 통해 Fc-감마 수용체 (FcγR)와 맞물릴 수 있다. 이러한 상호작용은 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포 식균 작용 (ADCP) 및 보체-의존적 세포독성 (CDC)과 같은 효과기 기능을 매개한다. 효과기 기능 활성은 IgG1 이소타입에서는 높지만, IgG2 및 IgG4에서는 낮다. 때때로 IgG1 항체, 특히 ADCC의 효과기 기능을 향상시키는 것이 바람직하다. 이는 예를 들어 돌연변이의 도입이나 무푸코실화를 통해 달성될 수 있다. 여기서, 본 발명자들은 인간 및 마우스 FcγR에 대한 결합에 대하여 야생형 및 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체를 비교하였다. 인간 FcγRIIIa에 대한 향상된 결합은 무푸코실화 형태에서 예상된다.
재료 및 방법
FcγR 친화성은 항-인간 Fab-CH1 (FAB2G) 센서 팁 (ForteBio)이 장착된 Octet RED96 플랫폼을 사용하여 결정되었다. 이중특이적 항체를 1×동역학 완충액 (ForteBio) 중에서 200 nM로 희석하고 ＞1.5nm의 고정화 반응에 도달하기 위해 300 초 동안 8 개의 평행 센서 세트에 로딩하였다. 이어서, 고정화된 이중특이적 항체를, 인간 FcγRI에 대해서는 100 nM에서, 또한 다른 모든 검정된 FcγR에 대해서는 1 μM에서 시작하여, FcγR의 7 2 배 희석에 대하여 검정하였다. 하나의 고정화된 센서를 기준화를 위해 1×동역학 완충액에 대해 분석하고 이중 기준화를 허용하기 위해 이중특이적 항체를 고정화하지 않고 전체 검정을 반복하였다. 포함된 FcγR은 R&D Systems (인간 FcγRI, #1257-FC-050; 인간 FcγRIIa, #1330-CD-050; 인간 FcγRIIb, #1460-CD-050; 인간 FcγRIIIa (V158), #4325-FC-050; 인간 FcγRIIIa (F158), #8894-FC-050; 마우스 FcγRI, #2074-FC-050; 마우스 FcγRIIb, #1875-CD-050; 마우스 FcγRIII, #1960-FC-050) 및 Sino Biologicals (마우스 FcγRIV, # 50036-M27H-50)로부터 입수하였다. FcγR에 대한 결합을 60 초 동안 수행한 후, 1×동역학 완충액 중에서 60 초 동안 해리시키고, 10 mM 글리신 (pH 1.7)을 사용하여 센서 팁을 재생시켰다. 생성된 데이터를 표준 이중 기준화에 의해 기준화하였고, 기준선을 y-축과 정렬시키고, 해리에 대한 정렬에 의한 단계간 상관을 수행하고, 데이터 분석 소프트웨어 (v.9.0.0.14)에서 사비츠키-골레이 필터링으로 데이터를 평활화시켰다. 처리된 데이터를 핏팅 정확성의 측정으로서 X2를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 핏팅하였다. 매우 빠른 해리 속도를 갖는 FcγR에 대해 생성된 해리 곡선의 곡선 핏팅 품질을 향상시키기 위해, 해리 곡선의 초기 10 초만이 곡선 핏팅에 포함되었다.
결과 및 결론
FcγR 세트에 대해 평가된 이중특이적 항체의 얻어진 친화성 상수 (KD)를 표 3 및 표 4에 요약하였다. 예상되는 바와 같이, 2372/2373의 무푸코실화는 인간 FcγRIIIa (V158 및 F158 변이체 모두)에 대해 증가된 친화성을 유도하였다. 이것 외에도, 2372/2373의 무푸코실화 버전 및 이중특이적 대용 항체는, 이들 이중특이적 항체의 야생형 및 비교하여 2.1-2.5 배 증가된 친화성으로 마우스 FcγRIV에 결합하였다.
표 3 - 인간 Fcγ 수용체에 대한 야생형 및 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 친화성 상수 (K D, nM)의 요약
1형성된 복합체의 매우 느린 해리 속도는 측정된 해리 속도 상수 및 결과적으로 또한 친화성 상수의 정확성을 감소시킴
2이들 상호작용의 낮은 친화성으로 인한 낮은 반응은 곡선 핏팅 품질을 유의하게 감소시킴
3배수 = K D 2372/2373 WT/K D 2372/2373 AF
표 4 - 마우스 Fcγ 수용체에 대한 야생형 및 무푸코실화 2372/2373 및 대용 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 친화성 상수 (K D, nM)의 요약
1이들 상호작용의 낮은 친화성으로 인한 낮은 반응은 곡선 핏팅 품질을 유의하게 감소시킴
2배수 = K D 2372/2373 WT/K D 2372/2373 AF
실시예 8 - 무푸코실화 Fc 도메인을 갖는 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 FcγRIIIa-발현 세포에 대한 결합
무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 FcγRIIIa에 대한 향상된 결합을 확인하기 위해, FcγRIIIa-발현 세포에 대한 결합을 유동 세포계측법으로 평가하였다.
재료 및 방법
높은 수준의 FcγRIIIa (V158)를 안정적으로 발현하는 트랜스펙션된 CHO 세포 (CHO-FcγRIIIa 세포)를 사용하였다. 250,000 세포/웰을 4℃에서 1 시간 동안 FACS 완충액 (0.5% BSA 함유 PBS) 중에서 연속 희석된 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체로 염색하였다. 세포를 FACS 완충액 중에서 세척한 후, FACS 완충액 중에서 1:100 희석된 2차 PE-컨쥬게이션된 항-hFc 항체 (Jackson, #109-115-098)를 첨가하였다. 4℃에서 30분 항온 처리 후, 세포를 2 회 세척하고, FACS 완충액 중에 재현탁하고, FACS Verse에서 분석하였다.
결과 및 결론
예상되는 바와 같이, 야생형 IgG1 변이체와 비교하여 FcγRIIIa-발현 세포에 대한 향상된 결합이 무푸코실화 이중특이적 항체에서 나타났다 (도 8).
실시예 9 - 인간 보체의 C1q 성분에 대한 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 결합
이 실시예에서는, 야생형 및 무푸코실화 IgG1 형태를 갖는 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체를 사용하여 인간 보체 시스템의 C1q 성분에 대한 결합을 평가하였다.
재료 및 방법
ELISA 플레이트를 인간 C1q 단백질 (2㎍/㎖), 50㎕/웰 (Calbiochem, #204876)으로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBST (PBS + 0.05% 폴리소르베이트 20)로 3 회 세척하고, PBST 및 1% BSA로 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다. PBST로 3 회 세척한 후, 모노클로날 항체 또는 이중특이적 항체를 상이한 농도로 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 항온 처리하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하고, 50 ㎕ 양 항-인간 C1q-HRP (BioRad, #2221-5004P)를 1:400으로 희석하여 첨가하였다. 실온에서 1 시간 항온 처리한 후, 플레이트를 PBST 중에서 6 회 세척한 후, 50㎕ 퍼옥시다제 (Pierce, #37069)를 첨가하였다. 발광을 Fluorostar Optima (BMG Labtech)에서 측정하였다.
결과 및 결론
도 9에 나타낸 바와 같이, C1q에 대한 유사한 용량-의존적 결합이 야생형 및 무푸코실화 2372/2373에서 나타났고, 수준은 IgG1 이소타입 대조군과 동등하였다. 예상되는 바와 같이, IgG4 이소타입 대조군에서는 어떠한 결합도 나타나지 않았다. 한편, C1q에 결합하고 보체-매개된 용해를 매개하는 능력으로 인해 양성 대조군으로서 포함된 리툭시맵 (Mabthera®)은 강력한 신호를 나타냈다.
실시예 10 - 이중특이적 GITR/CTLA-4 항체의 작용제 기능
CTLA-4의 존재 하에 GITR을 발현하는 T 세포를 활성화시키는 이중특이적 GITR/CTLA-4 항체의 능력을 측정하였다. IFNγ 생성 증가와 T 세포 활성화가 CTLA-4 코팅된 웰에 결합하는 이중특이적 항체를 통해 GITR 가교의 존재 하에 예상되었다. 목적은 CTLA-4 존재시 이중특이적 항체의 보다 높은 효능 및 효력, 뿐만 아니라 GITR 단일특이적 항체 (GITR mAb) 및 CTLA-4 결합 부분에 커플링된 이소타입 대조군 (iso/CTLA-4)의 조합보다 더 높은 효능을 달성하는 것이었다. 또한, 야생형 및 무푸코실화 형태의 이중특이적 항체 2372/2373을 비교하였다. 무푸코실화 이중특이적 항체 형태에서는 작용제 기능의 변화가 예상되지 않는다.
재료 및 방법
음성 선택 (팬(Pan) T 세포 단리 키트, 인간, Miltenyi, 130-096-535)을 사용하여 피콜(Ficoll) 분리 PBMC (룬드(Lund) 대학 병원의 혈액 은행에서 백혈구 필터로부터 얻음)로부터 인간 CD3 양성 T 세포를 정제하였다. PBS 중에 희석된 CTLA-4 (Orencia, 5 ㎖/g)를 갖거나 갖지 않는 50 ㎕의 α-CD3 (클론: OKT3, BD, 농도: 3 g/㎖)을 4℃에서 밤새 비-조직 배양 처리된, U자형 96-웰 플레이트 (Nunc, VWR #738-0147)의 표면에 코팅하였다. 세척 후, T 세포를 첨가하였다 (100,000 세포/웰). 이중특이적 GITR/CTLA-4 항체를 연속 희석하여 웰에 첨가하고, 동일한 몰 농도에서 2 개의 단일특이적 대조군: 1) GITR mAb, 시판되는 단일특이적 GITR 항체 (DT5D3, Miltenyi Biotec) 및 2) iso/CTLA-4, CTLA-4 결합 부분에 커플링된 이소타입 대조군의 조합과 비교하였다. CTLA-4 코팅된 웰을 비-CTLA-4 코팅된 웰과 비교하였다. 37℃, 5% C02에서 72 시간 항온 처리 후, IFNγ 및/또는 IL-2 수준을 ELISA에 의해 상청액에서 측정하였다.
결과 및 결론
도 10의 결과는, α-CD3 및 CTLA-4로 코팅된 플레이트에서 배양된 경우에만 T 세포 IFNγ 생성 증가를 유도하는 가용성 이중특이적 항체의 용량-의존적 길항 효과를 나타내고, 단일특이적 GITR 항체 및 CTLA-4 결합 부분을 갖는 이소타입 대조군의 조합은 그렇지 않다. 시험관내 검정은 GITR 및 CTLA-4가 모두 종양의 미세 환경에서 상대적으로 과발현된 상황의 실험 모델을 나타낸다. 결과는, 이중특이적 항체가, 단일특이적 항체와 비교하여, 활성화된 T 세포 또는 Treg의 수준이 높은 환경, 예를 들어 종양 미세 환경에 존재하는 CTLA-4에 의존하는 증가된 작용제 효과를 가짐을 나타낸다. 또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 야생형 및 무푸코실화 2372/2373 변이체의 작용제 효과에는 차이가 보이지 않았다.
실시예 11 - FcγRIIIa 가교 결합에 대한 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 작용제 기능
많은 면역조절 항체에서, FcγR 맞물림은 그 효능에 있어 결정적이다. 이 실시예에서는, FcγRIIIa 가교 결합의 존재 하에 이중특이적 GITR/CTLA-4 항체의 작용제 활성을 조사하였다. 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 FcγRIIIa에 대한 향상된 결합으로 인해, 야생형 IgG1에 비해 이 변이체의 증가된 활성화가 예상된다.
재료 및 방법
이중특이적 GITR/CTLA-4 항체의 작용제 기능을, 반응 요소의 GITR 및 루시퍼라제 하류를 안정적으로 발현하는 주르카트 세포를 함유하는, GITR 활성화 검정 (GITR Bioassay, Promega, #CS184006)에서 시험하였다. 시험 항체에 의해 유도된 활성화를, 생성된 루시퍼라제를 통해 정량화하여 발광으로서 측정하였다. FcγRIIIa (V158)를 안정적으로 발현하는 트랜스펙션된 CHO 세포 (100,000 세포/웰)의 부재 또는 존재 하에 연속 희석된 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 및 이소타입 대조군에 반응하여 GITR 활성화의 유도를 측정하였다. 6 시간의 항온 처리 후, Bio-Glo Luciferase Assay Reagent를 첨가하여 발광을 측정하였다.
결과 및 결론
도 12a에 나타낸 바와 같이, 야생형 및 무푸코실화 2372/2373 항체에서 유사한 활성화가 나타났다. 그러나, FcγRIIIa 가교 결합의 존재 하에, GITR 활성화는 무푸코실화 이중특이적 항체에서 더 높다 (도 12b).
실시예 12 - ADCC 리포터 검정에서 표적 세포 고갈을 유도하는 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 능력
GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 한 가지 작용 방식은 표적-발현 세포의 ADCC를 유도하는 것이다. 종양 환경에서, 이들은 GITR 및 CTLA-4 모두의 발현이 높은 Treg를 구성한다. 이러한 환경을 모방하도록, 높으 수준의 GITR 및 CTLA-4의 안정적 발현을 갖는 트랜스펙션된 CHO 세포 (CHO-GITR고-CTLA4고 세포)뿐만 아니라 높은 수준의 GITR 및 낮은 수준의 CTLA-4를 갖는 세포 (CHO-GITR고-CTLA4저 세포)를 생성하였다. ADCC 리포터 검정을 사용하여 표적-발현 세포의 ADCC를 유도하는 야생형 및 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 능력을 시험하였다. 무푸코실화 항체가 FcγRIIIa에 대해 더 높은 친화성을 갖기 때문에, 이 형태의 향상된 ADCC가 예상된다.
재료 및 방법
FcγRIIIa (V158) 수용체를 안정적으로 발현하는 주르카트 효과기 세포 및 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 유도하는 NFAT 반응 요소를 함유하는, Promega로부터의 리포터-기반 시스템 (ADCC Reporter Bioassay Kit, #G7010)을 사용하였다. 시험 항체에 의해 유도된 효과기 세포 활성화를 생성된 루시퍼라제를 통해 정량화하여 발광으로서 측정하였다. CHO-GITRhi-CTLA4고 및 CHO-GITR고-CTLA4저 세포를 표적 세포로서 사용하여, 연속 희석된 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체, 모노클로날 대응물 (iso/CTLA-4 + αGITR mAb) 및 이소타입 대조군의 혼합물에 반응하여 ADCC의 유도를 측정하였다. 효과기:표적 세포 비율은 5:1이었다. 6 시간의 항온 처리 후, Bio-Glo Luciferase Assay Reagent를 첨가하여 발광을 측정하였다.
결과 및 결론
표적 세포로서 CHO-GITR고-CTLA4저 세포 사용시 도 13에 나타낸 바와 같이, 동일한 몰 농도에서 2 개의 모노클로날 대응물의 조합에 비해 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 우수한 효과가 나타난다. 이소타입 대조군에는 효과가 나타나지 않았다. 또한, ADCC의 모델로서 우수한 FcγRIIIa 활성화가 표적 세포로서 CHO-GITR고-CTLA4저 세포 (도 14a) 및 CHO-GITR고-CTLA4고 세포 (도 14b) 둘 다 사용시 무푸코실화 이중특이적 항체에서 나타났다.
실시예 13 - 표적-발현 세포의 PBMC-매개된 용해를 유도하는 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 능력
재료 및 방법
GITR/CTLA-4 이중특이적 항체가 표적-발현 세포의 고갈을 유도하는 능력을 결정하기 위해, 효과기 세포로서 1 차 PBMC에 의해 매개되는 ADCC의 수준을 조사하였다. 높은 수준의 GITR 및 CTLA-4를 안정적으로 발현하는 트랜스펙션된 CHO 세포 (CHO-GIT고-CTLA4고 세포)를 표적 세포로 사용하였다. LDH 세포독성 검정 (Pierce, #88953)을 사용하여 세포 용해를 평가하였다. PBMC를 건강한 공여자의 백혈구 필터로부터 정제하였다. 효과기 세포 및 표적 세포를 연속 희석된 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 또는 이소타입 대조군과 함께 4 시간 동안 50:1의 효과기:표적 세포 비율에서 항온 처리하였다. 그 후, 상청액 중의 LDH 수준을 측정하였다.
결과 및 결론
도 15에 나타낸 바와 같이, 야생형 IgG1 변이체에 비해 무푸코실화 이중특이적 항체에서 표적-발현 세포의 우수한 고갈이 나타났다.
실시예 14 - 1 차 T
reg
를 고갈시키는 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 능력
GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 시험관내 ADCC 활성을, 표적 세포로서 GITR 및 CTLA-4를 발현하는 Treg를 이용한 ADCC 리포터 검정을 사용하여 평가하였다.
재료 및 방법
FcγRIIIa (V158) 수용체를 안정적으로 발현하는 효과기 세포를 함유하는 ADCC 리포터 검정 (Promega, #G7010)을 사용하였다. CD4+CD25+CD127저 Treg를, EasySep™ 인간 CD4+CD127저CD25+ 조절 T 세포 단리 키트 (Stemcell Technologies, #18063)를 사용하여 음성 선택에 의해 단리하고, 표적 세포로서 사용하였다. Treg는 ADCC 리포터 검정에서 신선하게 사용하거나, GITR 및 CTLA-4의 발현을 상향 조절하기 위해 인간 T-활성자 CD3/CD28 Dynabeads (Gibco, #11131D)의 존재 하에 48 시간 동안 활성화시킨 후에 사용하였다. 연속 희석된 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체에 반응하여 ADCC의 유도를 평가하였다. 효과기 및 표적 세포를 6 시간 또는 18 시간 동안 5:1 비율로 배양하였다. GITR 및 CTLA-4의 발현을 유동 세포계측법에 의해 배양 전후에 측정하였다.
결과 및 결론
GITR/CTLA-4 이중특이적 항체는 신선한 Treg에서 ADCC를 매개하지 않았다 (도 16a). 그러나, αCD3/CD28 비드로 48 시간 동안 활성화시킨 후에, ADCC가 유도되었다. 유도는 야생형 IgG1 형태와 비교하여 무푸코실화 변이체에서 현저하게 더 높았다 (도 16b). 결과는 GITR 및 CTLA-4의 발현 수준과 상관되었다. 신선한 PBMC 및 Treg는 낮은 수준의 GITR 및 CTLA-4를 발현하였지만, 시험관내 활성화 후에 수준은 분명히 상향 조절되었다 (도 16c).
실시예 15- 사이토카인 방출을 유도하는 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 능력
사이토카인 방출 증후군은 항체를 이용한 암 면역요법에서 관찰된 잠재적으로 생명을 위협하는 독성이다. 여기서 본 발명자들은 야생형 및 무푸코실화된 GITR/CTLA-이중특이적 항체를 전혈에서의 사이토카인 방출을 유도하는 이들의 능력 및 PBMC-기반 사이토카인 방출 검정에서 비교하였다.
재료 및 방법
사이토카인 방출을 유도하는 야생형 및 무푸코실화 GITR/CTLA-이중특이적 항체 2372/2373의 능력을 KWS Biotest (Bristol, UK)에서 전혈 및 PBMC 사이토카인 방출 검정 (CRA)에서 시험하였다. 알렘투주맙, 뮤로모납 및 안셀 항-CD28 (ANC28.1)은 양성 대조군으로서, 비-특이적 IgG1, IgG4 및 IgG2a는 음성 대조군으로서 포함되었다. 모든 항체는 0.1, 1 및 10 ㎍/웰로 시험하였다.
전혈은 4 명의 건강한 공여자에게서 채취되었다. 시험 항체 및 대조군을 혈액에 이중으로 첨가하였다. 48 시간의 배양 후 사이토카인 생성을 평가하였다. 3 명의 건강한 공여자로부터 수집한 전혈 샘플로부터 PBMC를 분리하였다. 시험 항체 및 대조군을 PBMC를 첨가하기 전에 웰에 고정화시켰다. 코팅되지 않은 웰은 음성 대조군으로 작용하고 각 조건은 이중으로 시험되었다. 사이토카인 생성은 72 시간의 배양 기간 후에 평가되었다. 두 검정 모두에서, Luminex 플랫폼을 사용하는 배양 상청액 중의 IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, 및 TNFα의 정량 측정에 전염증성 패널 1 (인간)을 사용하였다.
Tukey의 사후 (post-hoc) 시험을 사용한 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)에 의한 선형 회귀를 사용하여 각 사이토카인에 대한 상이한 치료 그룹 사이의 기울기를 비교하여 데이터 분석을 수행하였다. 선형 회귀 분석은 일원 분산 분석을 수행 할 수 없는 일부 사이토카인에 대해 0과 동일한 기울기를 제공하였다. Tukey의 사후 시험이 뒤따르는 이원 분산 분석 (2-way ANOVA)를 사용하여 전혈 및 습윤 코팅 분석을 위해 각각의 사이토카인에 대한 상이한 농도의 처리 효과를 비교하였다.
결과 및 결론
시험된 모든 공여자에 대해, 자극받지 않은 세포는 CRA 형태 모두에서 예상되는 수준의 백그라운드 사이토카인 방출을 나타내었다. 양성 대조군 항체는 각각의 사이토카인 방출 분석 형태 내에서 예상되는 수준으로 강력한 사이토카인 반응을 제공하였다. 고정화된 CRA 형태와 비교하여, 전혈 CRA는 전형적으로 더 높은 공여자 가변성을 초래한다.
두 검정에서, GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 어느 것도 IgG1 이소타입 대조군에 의해 유도된 수준 초과로 IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, 및 TNFα 및 IFNγ를 유도하지 않았다. 두 검정 모두에서, 항체의 부재 하에 높은 수준의 IL-8이 유도되었고, 이는 이 사이토카인에 대해 예상치 못한 것은 아니다. 양성 대조군 배양에서 IL-8 수준이 약간 증가한 것은, 자극이 백그라운드 초과로 IL-8 생성 수준을 높일 수 있었음을 시사한다.
두 검정에서, 야생형 및 무푸코실화 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 어느 것도 IgG1 이소타입 대조군에 의해 유도된 수준 초과로 사이토카인 분비를 유도하지 않았다.
실시예 16 - 뮤린 대용 이중특이적 GITR/CTLA-4 항체의 작용제 기능
생체내 모델에서 이중특이적 항체를 연구하기 위해, 야생형 (2776/2777) 및 무푸코실화 변이체 (2776/2777 AF)에서 인간 IgG1 형태를 사용하여 뮤린 GITR/CTLA-4를 표적화하는 대용 이중특이적 항체를 생성하였다. 뮤린 T 세포를 활성화시키는 대용 이중특이적 GITR/CTLA-4 항체의 능력을 평가하기 위해, 비장세포 검정을 사용하여 IFN-γ 생성의 형태로 T 세포 활성화를 측정하였다. 두 이중특이적 변이체 모두 T 세포를 활성화시킬 수 있었고, 예상되는 바와 같이 야생형 및 무푸코실화 변이체 사이에는 활성화 수준의 차이가 관찰되지 않았다.
재료 및 방법
αCD3 (BD, 0.8 ㎍/㎖) 및 CTLA-4 (Orencia, 5 g/㎖)로 코팅된 96-웰 플레이트에 C57BL6 마우스 (Miltenyi, Pan-T 단리 키트 II)의 비장으로부터 단리된 뮤린 CD3+ T 세포를 첨가하였다. 이중특이적 GITR/CTLA-4 항체를 연속 희석하여 첨가하고, 이소타입 또는 이소타입/CTLA-4 대조군과 비교하였다. IFN-γ 방출 형태의 T 세포 활성화를 ELISA에 의해 48 시간 후에 측정하였다.
결과 및 결론
대용 이중특이적 항체의 작용제 효과를 비장세포 검정에서 조사하였다. 야생형 및 무푸코실화 변이체 모두, 작용제 T 세포 활성화 및 농도-의존적 IFN-γ 방출의 유도를 나타내었다 (도 17). 이 T 세포 활성화는 CTLA-4 코팅이 없는 웰, 또는 이소타입 대조군을 함유하는 웰에서는 보이지 않았다. 예상되는 바와 같이, 야생형 및 무푸코실화 2776/2777 변이체 사이에는 작용제 효과의 차이가 나타나지 않았다.
실시예 17 - 리포터 검정에서 ADCC를 유도하는 뮤린 대용 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 능력
종양 환경에서, Treg는 GITR 및 CTLA-4 모두의 높은 발현을 갖는다. GITR/CTLA-4 이중특이적 항체는 특히 종양 환경에서 표적-발현 세포의 ADCC를 유도 할 것으로 예상된다. ADCC를 유도하는 야생형 및 무푸코실화 변이체로서의 뮤린 이중특이적 대용물의 능력을, 뮤린 FcγRIV 특이적인 ADCC 리포터 검정을 사용하여 조사하였다. 이중특이적 항체의 두 변이체 모두 리포터 세포의 활성화를 나타내었다. 그러나, 무푸코실화 항체가 야생형 항체에 비해 뮤린 FcγRIV 대해 더 높은 친화성을 갖기 때문에, 무푸코실화 변이체는 향상된 ADCC 유도를 나타내었다.
재료 및 방법
mFcγRIV 수용체에 대한 리포터-기반 시스템 (Promega ADCC Reporter Bioassay Kit)을 사용하여, GITR/CTLA-4 이중특이적 항체 또는 이소타입 대조군 (mGITR 코팅된 웰 사용)에 반응하여, ADCC를 측정하였다. 효과기 세포를 일정 농도로 첨가하고 ADCC를 6 시간 동안 유도하였다.
결과 및 결론
ADCC를 유도하는 GITR/CTLA-4 이중특이적 대용 항체의 야생형 및 무푸코실화 변이체의 능력을 ADCC 리포터 검정을 사용하여 조사하였다. 두 변이체 모두 ADCC 유도에 대한 지표로서 작용하는 뮤린 특이적 FcγRIV 리포터 세포를 활성화시킬 수 있었다 (도 18). 야생형 항체보다 뮤린 FcγRIV에 대해 더 높은 친화성을 갖는 무푸코실화 항체와 일치되게, 야생형에 비해 무푸코실화 이중특이적 항체에서 우수한 ADCC 유도가 검출되었다. 이들 결과는, 마우스와 인간이 그들의 Fc 수용체 기능에 있어 상이하다는 사실에도 불구하고, ADCC 효과 및 작용 방식을 연구하기 위한 모델을 제공하면서, 인간과 비교된 뮤린 시스템의 관련 모방을 입증한다.
실시예 18 - CT26 결장암 모델에서 마우스 대용 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 항-종양 효능
대용 이중특이적 항체의 항-종양 효과를 BalbC 마우스를 사용한 CT26 결장암 모델에 대해 조사하였다. 야생형 및 무푸코실화 항체 변이체 둘 다, 종양 체적 억제 및 생존율 증가 형태로 통계적으로 유의한 항-종양 효능을 나타내었다.
재료 및 방법
실험에서는, Janvier (프랑스)로부터의 암컷 BalbC 마우스 (7-8주령)를 사용하였다. 모든 실험은 Malmo/Lund 윤리위원회의 승인을 받았다.
로그 상으로 성장하는 CT26 결장암을 0 일에 피하 주사하고 (0.1×106 세포), 마우스를 7, 10 및 13 일에 2776/2777 또는 2776/2777 AF (200 ㎍)으로 복강내 치료하였다. 래트 항-마우스 GITR 항체 DTA-1 (몰 당량, BioXcell, US)을 양성 대조군으로 사용하였다. 종양은 캘리퍼로 주당 3 회 측정하였고, 종양 체적은 ((폭/2) × (길이/2) × (높이/2) × pi × (4/3)) 공식을 사용하여 계산하였다. 통계 분석은, GraphPad Prism 프로그램, 종양 성장에 대한 Mann-Whitney 비모수 2-테일(tail) 시험 및 생존율에 대한 Kaplan-Meyer 생존율, 로그-랭크 (Mantel-Cox)를 사용하여 수행되었다.
결과 및 결론
이중특이적 GITR/CTLA-4 대용 2776/2777의 항-종양 효능을 CT26 결장암 모델을 사용하여, BalbC 마우스에서 조사하였다. 야생형 변이체 2776/2777은 종양 체적 억제의 형태로 비히클에 비해 통계적으로 유의한 항-종양 효능을 나타내었다 (p = 0.0002) (도 19a). 이 항-종양 효능은 양성 대조군 항체 DTA-1보다 우수하였다.
유사하게, 무푸코실화 변이체 2776/2777AF로의 치료는, 비히클 치료와 비교하여 마우스의 생존율이 유의하게 증가하였고 (p = 0.0029), 대략 30%의 뮤린은 치료에 의해 확립된 종양으로부터 치유되었다 (도 19b).
실시예 19 - MC38 결장암 모델에서 뮤린 대용 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 항-종양 효능
대용 이중특이적 항체의 항-종양 효과를 C57BL6 마우스를 사용하여 MC38 결장암 모델에 대해 조사하였다. 야생형 및 무푸코실화 이중특이적 항체는 종양 체적 억제 및 생존율 증가의 형태로 통계적으로 유의한 항암 효능을 나타내었다.
재료 및 방법
실험에서는, Janvier (프랑스)로부터의 암컷 C57BL6 마우스 (7-8주령)를 사용하였다. 모든 실험은 Malmo/Lund 윤리위원회의 승인을 받았다.
로그 상으로 성장하는 CT26 결장암을 0 일에 피하 주사하고 (0.1Х106 세포), 마우스를 7, 10 및 13 일에 2776/2777 또는 2776/2777 AF (200 ㎍)으로 복강내 치료하였다. 래트 항-마우스 GITR 항체 DTA-1 (몰 당량, BioXcell, US)을 양성 대조군으로 사용하였다. 종양은 캘리퍼로 주당 3 회 측정하였고, 종양 체적은 ((폭/2) Х (길이/2) Х (높이/2) Х pi Х (4/3)) 공식을 사용하여 계산하였다. 통계 분석은, GraphPad Prism 프로그램, 종양 성장에 대한 Mann-Whitney 비모수 2-테일(tail) 시험 및 생존율에 대한 Kaplan-Meyer 생존율, 로그-랭크 (Mantel-Cox)를 사용하여 수행되었*
결과 및 결론
이중특이적 GITR/CTLA-4 대용 2776/2777의 항-종양 효능을 MC38 결장암 모델을 사용하여 C57BL6 마우스에서 조사하였다. 2776/2777은 종양 체적 억제의 형태로 비히클에 비해 통계적으로 유의한 항-종양 효능을 나타내었다 (p = 0.0006) (도 20a). 유사하게, 무푸코실화 2776/2777 AF 치료는 마우스의 생존율을 유의하게 증가시켰고 (p = 0.001), 대략 30%의 마우스는 완전한 반응자였다 (도 20b).
실시예 20 - MC38 결장암 모델에서 뮤린 대용 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체로 처리 후 CD8/Treg 비율 형태의 항-종양 효능
종양내 CD8/Treg 비율의 형태로 대용 이중특이적 항체의 항-종양 효과를 C57BL6 마우스를 사용하여 MC38 결장암 모델에서 조사하였다. 야생형 2776/2777 및 무푸코실화 2776/2777 AF 이중특이적 항체 둘 다, 조절 T 세포의 고갈을 나타내었고, 예상되는 바와 같이, 무푸코실화 변이체는 야생형 변이체보다 우수한 고갈을 나타내었다.
재료 및 방법
실험에서는, Janvier (프랑스)로부터의 암컷 C57BL6 마우스 (7-8주령)를 사용하였다. 모든 실험은 Malmo/Lund 윤리위원회의 승인을 받았다.
로그 상으로 성장하는 MC38 결장암을 0 일에 피하 주사하고 (1×106 세포), 마우스를 10, 13 및 16 일에 2776/2777 또는 2776/2777 AF (200㎍)으로 복강내 치료하였다. 최종 주사 24시간 후, 종양 및 비장을 수확하고, 생존율 마커 뿐만 아니라 리니지 마커 (CD11b, CD19, MHCII 및 NK1.1), CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3에 대해 염색하고, 유동 세포계측법을 사용하여 분석하였다. 조절 T 세포는 생존/단일 세포/CD45/CD3/CD4/Foxp3/CD25로서 게이팅되었다.
결과
이중특이적 GITR/CTLA-4 항체의 약역학 효과를 MC38 결장암 모델을 사용하여 C57BL6 마우스에서 조사하였다. 도 21의 결과는, 두 이중특이적 항체 변이체에 의한 종양내 Treg 고갈을 나타내었지만, 예상되는 바와 같이 무푸코실화 변이체는 야생형에 비해 우수한 활성을 나타내었다 (도 21a). 이 효과는 CD8/Treg 비율에서도 나타났다 (도 21b). 비장에서는 CD8/Treg 비율의 변화를 볼 수 없으며, 이는 이중특이적 항체의 효과가 주로 종양 미세 환경으로 지향됨을 나타낸다 (도 21c).
실시예 21 - 인간 형질세포종 모델에서 인간 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 항-종양 효능
RPMI-8226 형질세포종의 피하 종양 모델에서 hPBMC를 투여하여 인간화된 면역결핍 마우스를 사용하여 야생형 및 무푸코실화 변이체로서의 인간 이중특이적 GITR/CTLA-4 이중특이적 항체의 항-종양 효과를 조사하였다. 이중특이적 변이체 (2372/2373 및 2372/2373 AF) 둘 다, 효과기 세포로서 인간 PBMC 유무에 관계없이 통계적으로 유의한 항-종양 효과를 나타내었으며, 이는 이중특이적 항체가 직접적 및 간접적 항-종양 효능을 가질 가능성이 있음을 나타낸다. 또한, 무푸코실화 항체는 이 모델에서 야생형 변이체보다 우수한 항-종양 효능을 나타내었다.
재료 및 방법
실험에서는, Taconic (덴마크)로부터의 암컷 SCID-Beige 마우스 (7-8주령)를 사용하였다. 모든 실험은 Malmo/Lund 윤리위원회의 승인을 받았다.
백혈구 필터는 룬드 대학 병원에서 얻었고, hPBMC는 피콜 원심분리로 단리하였다. 로그 상으로 성장하는 RPMI-8226 형질세포종을 0 일에 피하 주사하고 (10×106 세포), hPBMC (5×106 세포)를 5 일에 복강내 주사하고, 5, 11 및 18 일에 항체 치료 (대략 500 nmol)를 수행하였다. 종양 체적은 캘리퍼로 주당 3 회 측정하였고, 종양 체적은 ((w/2) × (l/2) × (h/2) × pi × (4/3)) 공식을 사용하여 계산하였다. 통계 분석은, GraphPad Prism 프로그램, 종양 성장에 대한 Mann-Whitney 비모수 2-테일 시험을 사용하여 수행되었다.
결과
GITR/CTLA-4 항체의 항-종양 효능을, RPMI-8226 형질세포종 모델을 사용하여 hPBMC 인간화 마우스 모델에서 조사하였다. 도 22 및 표 5 의 결과는 이중특이적 항체의 야생형 및 무푸코실화 변이체 둘 다, hPBMC의 존재 하에 (도 22a), 또한 hPBMC 없이 (도 22b) 종양 성장 억제의 형태로 통계적으로 유의한 항-종양 효과를 나타내었음을 보여준다. 무푸코실 변이체 (2372/2373 AF)는 종양 체적 억제의 형태로 야생형 변이체 (2372/2373)보다 통계적으로 유의한 우수성을 나타내었다. 비히클과 비교한 종양 체적 억제의 백분율은 표 5에서 찾아볼 수 있다.
[표 5-GITR/CTLA-4 치료된 종양에서의 항-종양 활성]
참고문헌
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<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
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1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Pro Pro Pro Asp His Ile Pro
245
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<210> 6
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Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln
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Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp
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<212> PRT
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Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu
35 40 45
Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp
50 55 60
Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys
65 70 75 80
Gly Ile Tyr Gln Cys Val Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile
85 90 95
Lys Ile His Glu Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Thr
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<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 904
<400> 8
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1 5 10 15
Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Ile Val Phe Trp
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu
35 40 45
Arg Phe Asp Ala Val Asp Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp
50 55 60
Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys
65 70 75 80
Gly Ile Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Ser Gly Met Val
85 90 95
Lys Ile His Gln Met Asp Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala
100 105
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<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 9
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1 5 10 15
Phe Ala Asn Ser Gln Asn Leu Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu
35 40 45
Arg Phe Asp Ser Val Asp Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp
50 55 60
Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys
65 70 75 80
Gly Phe Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Leu Val
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5 10 15
Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu
35 40 45
Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp
50 55 60
Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys
65 70 75 80
Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile
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<213> Artificial Sequence
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Gly Ile Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Val
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<211> 111
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 22
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<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1046
<400> 23
Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro
1 5 10 15
Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val
20 25 30
Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly
35 40 45
Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val Asp Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Met Val Lys Ile His Gln Met Asp Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1047
<400> 24
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Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Leu Ser Leu Ser Glu Leu Val Val
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Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly
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65 70 75 80
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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accagctttg atagcgacag ctggaccctg cgtctgcaca atctgcaaat caaagataag 240
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<212> DNA
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<211> 327
<212> DNA
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<220>
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<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 29
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cagaatcaaa gcctgagcga actggtggtt ttctggcagg atcaggagaa cctggttctg 120
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accagctttg atagcgacag ctggaccctg cgtctgcaca atctgcaaat caaagataag 240
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<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 908
<400> 30
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cagaatcaaa gcctgagcga actggtggtt ttctggcagg atcaggagaa cctggttctg 120
aacgaagtct atctgggcaa agagaaattc gacagcgtgc atagcaagta tatgggccgc 180
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<210> 31
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 910
<400> 31
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cagaatcaaa gcctgagcga actggtggtt ttctggcagg atcaggagaa cctggttctg 120
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<210> 32
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 915
<400> 32
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<210> 33
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 938
<400> 33
ctcaaaatcc aagcgtactt caacgaaact gcagacttac cgtgtcagtt tgccaattcg 60
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<210> 34
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1038
<400> 34
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<210> 35
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1039
<400> 35
gcccccctca aaatccaagc gtacttcaac gaaactgcag acttaccgtg tcagtttgcc 60
aattcgcaga atctgagcct gagcgaactg gtggttttct ggcaggatca ggagaacctg 120
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caccaaatgg actccgagtt gtctgtcctg gcg 333
<210> 36
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1040
<400> 36
gcccccctca aaatccaagc gtacttcaac gaaactgcag acttaccgtg tcagtttgcc 60
aattcgcaga atctgagcct gagcgaactg gtggttttct ggcaggatca ggagaacctg 120
gttctgaacg aagtctatct gggcaaagag cggttcgaca gcgtggacag caagtatatg 180
ggccgcacca gctttgatag cgacagctgg accctgcgtc tgcacaatct gcaaatcaaa 240
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<210> 37
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1041
<400> 37
gcccccctca aaatccaagc gtacctcaac gaaactgcag acttaccgtg tcagtttgcc 60
aattcgcaga atctgagcct gagcgaactg gtggttttct ggcaggatca ggagaacctg 120
gttctgaacg aagtctatct gggcaaagag aaattcgaca gcgtggacag caagtatatg 180
ggccgcacca gctttgatag cgacagctgg accctgcgtc tgcacaatct gcaaatcaaa 240
gataagggta tctaccagtg cattatccac cataagaagc cgacgggtct ggtgaagatt 300
cacgagatga actccgagtt gtctgtcctg gcg 333
<210> 38
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1042
<400> 38
gcccccctca aaatccaagc gtacttcaac gaaactgcag acttaccgtg tcagtttgcc 60
aattcgcaga atctgagcct gagcgaactg gtggttttct ggcaggatca ggagaacctg 120
gttctgaacg aagtctatct gggcaaagag attttcgaca gcgtgagtag caagtatatg 180
ggccgcacca gctttgatag tgacagctgg accctgcgtc tgcacaatct gcaaatcaaa 240
gataagggta tctaccagtg cattatccac cataagaagc cgagcggtat ggtgaagatt 300
caccaaatgg actccgagtt gtctgtcctg gcg 333
<210> 39
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1043
<400> 39
gcccccctca aaatccaagc gtacttcaac gaaactgcag acttaccgtg tcagtttgcc 60
aattcgcaga atctgagcct gagcgaactg gtggttttct ggcaggatca ggagaacctg 120
gttctgaacg aagtctatct gggcaaagag aaattcgaca gcgtggatag caagtatatg 180
ggccgcacca gctttgatag cgacagctgg accctgcgtc tgcacaatct gcaaatcaaa 240
gataagggta tctaccagtg cattatccac cataagaagc cgacgggtat gattaagatt 300
cacgagatga actccgagtt gtctgtcctg gcg 333
<210> 40
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1044
<400> 40
gcccccctca aaatccaagc gtacttcaac gaaactgcag acttaccgtg tcagtttgcc 60
aattcgcaga atctgaccct gagcgaactg gtggttttct ggcaggatca ggagaacctg 120
gttctgaacg aagtctatct gggcaaagag aaattcgaca gcgtgtctag caagtatatg 180
ggccgcacca gctttgatag cgacagctgg accctgcgtc tgcacaatct gcaaatcaaa 240
gataagggta tctaccagtg cattatccac cataagaagc cgacgggtat gattaagatt 300
cacgagatga gctccgagtt gtctgtcctg gcg 333
<210> 41
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1045
<400> 41
gcccccctca aaatccaagc gtacttcaac gaaactgcag acttaccgtg tcagtttgcc 60
aattcgcaga atctgaccct gagcgaactg gtggttttct ggcaggatca ggagaacctg 120
gttctgaacg aagtctatct gggcaaagag aaattcgaca gcgtggacag caagtatatg 180
ggccgcacca gctttgatag cgacagctgg accctgcgtc tgcacaatct gcaaatcaaa 240
gataagggtc tgtaccagtg cattatccac cataagaagc cgacgggtct ggtgaagatt 300
cacgagatga actccgagtt gtctgtcctg gcg 333
<210> 42
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1046
<400> 42
gcccccctca aaatccaagc gtacttcaac gaaactgcag acttaccgtg tcagtttgcc 60
aattcgcaga atcaaagcct gagcgaactg gtggttttct ggcaggatca ggagaacctg 120
gttctgaacg aagtctatct gggcaaagag aaattcgaca gcgtggacag caagtatatg 180
ggccgcacca gctttgatag cgacagctgg accctgcgtc tgcacaatct gcaaatcgaa 240
gataagggta tctaccagtg cattatccac cataagaagc cgagcggtat ggtgaagatt 300
caccaaatgg actccgagtt gtctgtcctg gcg 333
<210> 43
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86 mutant 1047
<400> 43
gcccccctca aaatccaagc gtacttcaac gaaactgcag acttaccgtg tcagtttgcc 60
aattcgcaga atctgagcct gagcgaactg gtggttttct ggcaggatca ggagaacctg 120
gttctgaacg aagtctatct gggcaaagag aaattcgaca gcgtggacag caagtatatg 180
ggccgcacca gctttgatag cgacagctgg accctgcgtc tgcacaatct gcaaatcaaa 240
gataagggta tctaccagtg cattatccac cataagaagc cgacgggtct ggtgaagatt 300
cacgagatga actccgagtt gtctgtcctg gcg 333
<210> 44
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe
20 25 30
Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln
35 40 45
Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val
50 55 60
Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg
85 90 95
Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile
100 105 110
His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser
115 120 125
Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile
130 135 140
Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile
145 150 155 160
His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys
165 170 175
Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn
180 185 190
Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro
195 200 205
Asp Val Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys
210 215 220
Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln
225 230 235 240
Pro Pro Pro Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val
245 250 255
Ile Ile Cys Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys
260 265 270
Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu
275 280 285
Arg Glu Glu Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro
290 295 300
Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser
305 310 315 320
Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe
325
<210> 45
<211> 223
<212> PRT
<213> Mus <mouse, genus>
<400> 45
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His
50 55 60
Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln
65 70 75 80
Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly
85 90 95
Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Val Ser Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 46
<211> 218
<212> PRT
<213> Mus <mouse, genus>
<400> 46
Met Thr Leu Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Asn Phe Phe Ser Val Gln
1 5 10 15
Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Leu Leu Val Val
20 25 30
Asp Ser Asn Glu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu
35 40 45
Ala Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asn Ser Asp Val
50 55 60
Glu Val Cys Val Gly Asn Gly Asn Phe Thr Tyr Gln Pro Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ser Asn Ala Glu Phe Asn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Asn Glu Thr Val
85 90 95
Thr Phe Arg Leu Trp Asn Leu His Val Asn His Thr Asp Ile Tyr Phe
100 105 110
Cys Lys Ile Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg
115 120 125
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr
130 135 140
Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val
145 150 155 160
Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp
165 170 175
Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Val Thr Thr Met Asn Met
180 185 190
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala
195 200 205
Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
210 215
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 47
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 48
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro
1 5 10
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 49
Asn Phe Ser Gln Pro
1 5
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 50
Lys Arg Thr Val Ala
1 5
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 51
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 52
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2348, heavy chain VH
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Pro Ser Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2348, heavy chain VH
<400> 53
gaggtgcagc tgttggagag cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgcctc 60
tcctgtgcag ccagcggatt cacctttggt tactactaca tgtcttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt atttcttctc cttcttctta cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtat attattgtgc gcgctactac 300
ggttcttact ttgactattg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 54
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2372 (VH)
<400> 54
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Pro Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2372 (VH)
<400> 55
gaggtgcagc tgttggagag cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgcctc 60
tcctgtgcag ccagcggatt caccttttct ggttactcta tgggttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtat attattgtgc gcgctacccg 300
tggggttact actttgacta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 56
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2396 (VH)
<400> 56
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Pro Val His Gly Tyr Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2396 (VH)
<400> 57
gaggtgcagc tgttggagag cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgcctc 60
tcctgtgcag ccagcggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtat attattgtgc gcgcgcttac 300
ccggttcatg gttactgggt ttttgactat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 58
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2404 (VH)
<400> 58
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2404 (VH)
<400> 59
gaggtgcagc tgttggagag cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgcctc 60
tcctgtgcag ccagcggatt caccttttct tactcttcta tgtcttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatac attggttctg gtggttctca cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtat attattgtgc gcgctactct 300
tactactttg actattgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 60
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2349 (VL) (mAb - without CTLA-4 binding domain)
<400> 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca ggctattagc gcttatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagtg gcagtggaag cgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tcttacggtt actacctgta cacttttggc 300
caggggacca agctggagat caaacgt 327
<210> 61
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2349 (VL) (mAb - without CTLA-4 binding domain)
<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Ala Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2373 (VL) (mAb - without CTLA-4 binding domain)
<400> 62
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggtattaga gcttatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gtatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagtg gcagtggaag cgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tactactacc cgccgctgtc cacttttggc 300
caggggacca agctggagat caaacgt 327
<210> 63
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2373 (VL) (mAb - without CTLA-4 binding domain)
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ala Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Tyr Pro Pro Leu
85 90 95
Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 64
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2397 (VL) (mAb - without CTLA-4 binding domain)
<400> 64
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagtg gcagtggaag cgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tctgtttcta ctccgcccac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgt 324
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2397 (VL) (mAb - without CTLA-4 binding domain)
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Val Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 66
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2405 (VL) (mAb - without CTLA-4 binding domain)
<400> 66
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagtg gcagtggaag cgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag agtcattact ggtacccgct cacttttggc 300
caggggacca agctggagat caaacgt 327
<210> 67
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2405 (VL) (mAb - without CTLA-4 binding domain)
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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<213> Artificial Sequence
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145 150 155 160
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165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
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1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2397 CDRL3
<400> 95
Gln Gln Ser Val Ser Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2405 CDRL3
<400> 96
Gln Gln Ser His Tyr Trp Tyr Pro Leu Thr
1 5 10
<210> 97
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 99
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified IgG4 constant region
<400> 99
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 100
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 101
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified IgG4 constant region
<400> 101
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 102
<211> 981
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA of the IgG4 constant region of SEQ ID NO: 99
<400> 102
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accttgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa a 981
<210> 103
<211> 2028
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Genomic DNA of the IgG4 constant region of SEQ ID NO: 99
<400> 103
agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac 60
gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca 120
tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc 180
cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt 240
ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt 300
caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg 360
cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 420
gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc 480
cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc 540
tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc 600
agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag gcctctgacc accccactca 660
tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg 720
cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca 780
tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact ctccactccc 840
tcagctcaga caccttctct cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga 900
gtccaaatat ggtcccccat gcccaccttg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc 960
cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg 1020
gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag 1080
tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca 1140
cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg 1200
atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt 1260
accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca 1320
agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca 1380
aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct 1440
gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag 1500
gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1560
ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1620
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1680
agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1740
atgcatgagg ctctgcacaa ccgctacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1800
tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt 1860
ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac 1920
tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc 1980
ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg 2028
<210> 104
<211> 981
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 104
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa a 981
<210> 105
<211> 2028
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 105
agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac 60
gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca 120
tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc 180
cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt 240
ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt 300
caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg 360
cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 420
gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc 480
cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc 540
tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc 600
agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag gcctctgacc accccactca 660
tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg 720
cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca 780
tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact ctccactccc 840
tcagctcaga caccttctct cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga 900
gtccaaatat ggtcccccat gcccatcatg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc 960
cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg 1020
gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag 1080
tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca 1140
cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg 1200
atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt 1260
accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca 1320
agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca 1380
aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct 1440
gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag 1500
gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1560
ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1620
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1680
agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1740
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1800
tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt 1860
ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac 1920
tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc 1980
ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg 2028
<210> 106
<211> 990
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 106
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 107
<211> 1596
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 107
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttggtgag 300
aggccagcac agggagggag ggtgtctgct ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac 360
gcatcccggc tatgcagccc cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac 420
ccggaggcct ctgcccgccc cactcatgct cagggagagg gtcttctggc tttttcccca 480
ggctctgggc aggcacaggc taggtgcccc taacccaggc cctgcacaca aaggggcagg 540
tgctgggctc agacctgcca agagccatat ccgggaggac cctgcccctg acctaagccc 600
accccaaagg ccaaactctc cactccctca gctcggacac cttctctcct cccagattcc 660
agtaactccc aatcttctct ctgcagagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 720
accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc 780
tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct 840
cttcctcagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca 900
aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc 960
acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca 1020
agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg 1080
tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc 1140
tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag 1200
ggccacatgg acagaggccg gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca 1260
acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1320
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1380
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1440
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1500
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1560
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1596
<210> 108
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 108
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 109
<211> 981
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA of the IgG4 region of SEQ ID NO: 101
<400> 109
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accttgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa a 981
<210> 110
<211> 2028
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Genomic DNA of the IgG4 region of SEQ ID NO: 101
<400> 110
agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac 60
gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca 120
tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc 180
cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt 240
ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt 300
caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg 360
cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 420
gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc 480
cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc 540
tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc 600
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tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg 720
cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca 780
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gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag 1080
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cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg 1200
atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt 1260
accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca 1320
agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca 1380
aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct 1440
gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag 1500
gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1560
ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1620
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1680
agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1740
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1800
tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt 1860
ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac 1920
tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc 1980
ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg 2028
<210> 111
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
225 230 235 240
Val
Claims (54)
- GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 결합 도메인(B1으로 지정됨), 및 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 결합 도메인(B2으로 지정됨)을 포함하는, 다중 특이적 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
- 제2항에 있어서,
상기 항원-결합 단편은 Fv 단편 (예컨대, 단쇄 Fv 단편, 또는 이황화-결합된 Fv 단편), Fab-유사 단편 (예컨대, Fab 단편; Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편) 및 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 이중특이적 항체인, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) B1는 IgG1 항체를 포함하거나 또는 이로서 이루어지고, B2는 scFv를 포함하거나 또는 이로서 이루어지거나, 또는 그 반대이고; 또는
(b) B1는 적어도 하나의 scFv를 포함하거나, 또는 이로서 이루어지고, B2는 적어도 하나의 scFv를 포함하거나 또는 이로서 이루어지는, 폴리펩타이드. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 비-항체 폴리펩타이드인, 폴리펩타이드.
- 제6항에 있어서, 상기 B1는 IgG1 항체를 포함하거나 또는 이로서 이루어지고, 상기 B2는 비-이뮤노글로불린 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 이로서 이루어지거나, 또는 그 반대인, 폴리펩타이드.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, B2가 CD86 도메인 또는 CTLA-4에 결합할 수 있는 이의 변이체를 포함하거나, 또는 이로서 이루어지는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, B1이 적어도 하나의 중쇄 (H) 및/또는 적어도 하나의 경쇄 (L)를 포함하고, B2가 상기 적어도 하나의 중쇄 (H) 또는 적어도 하나의 경쇄 (L)에 부착되는, 폴리펩타이드.
- 제9항에 있어서, B1가,
(a) 적어도 하나의 중쇄 (H) 및 적어도 하나의 경쇄 (L)를 포함하되, B2는 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나에 부착되거나; 또는
(b) 2개의 동일한 중쇄 (H) 및 2개의 동일한 경쇄 (L)를 포함하되, B2는 2개의 중쇄 또는 2개의 경쇄에 모두 부착되는, 폴리펩타이드. - 제9항 또는 제10항에 있어서,
N-C 방향으로 기재된 이하의 화학식들 중 적어도 하나에 따라 배열된 폴리펩타이드 사슬을 포함하거나 또는 이로서 이루어지는 폴리펩타이드로서,
(a) L-(X)n-B2;
(b) B2-(X)n-L;
(c) B2-(X)n-H; 또는
(d) H-(X)n-B2;
여기에서 X는 링커이고, n은 0 또는 1인, 폴리펩타이드. - 제12항에 있어서, X는 아미노산 서열 SGGGGSGGGGS (서열번호 47), SGGGGSGGGGSAP (서열번호 48), NFSQP (서열번호 49), KRTVA (서열번호 50), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 51) 또는 (SG)m을 갖는 펩타이드이고, m = 1 내지 7인, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Fc 부위 또는 상기 부위의 변이체를 포함하며, 상기 부위는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 부위이고, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 부위인, 폴리펩타이드.
- 제13항에 있어서,
상기 Fc 부위는 자연 발생적 (즉, 야생형) 인간 Fc 부위인, 폴리펩타이드. - 제13항에 있어서,
상기 Fc 부위는 비-자연 발생적 (예를 들어, 돌연변이된) 인간 Fc 부위인, 폴리펩타이드. - 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 부위는 무푸코실화되는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포 식균 작용 (ADCP), 보체-의존성 세포 독성 (CDC), 및/또는 아폽토시스를 유도할 수 있는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 종양 면역을 유도할 수 있는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 10×10-9 M, 4×10-9 M, 또는 1×10-9 M 미만의 Kd로 인간 GITR에 결합하거나, 그리고/또는 60×10-9 M, 25×10-9 M, 또는 10×10-9 M 미만의 Kd로 인간 CTLA-4에 결합하는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T 세포의 활성 증가를 유도하고, 선택적으로 상기 증가는 별도의 분자로서 T 세포에 투여된 제1 및 제2 결합 도메인의 조합에 의해 유도된 효과기 T 세포의 활성의 증가보다 적어도 1.5-배, 4.5-배 또는 7-배 더 높은, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는,
i) GITR 발현 종양 세포를 사멸시킬 수 있고; 그리고
ⅱ) 효과기 T 세포의 활성화를 통해 면역계를 활성화할 수 있는, 폴리펩타이드. - 제20항에 있어서, 상기 T 세포 활성의 증가는 T 세포에 의한 증식 및/또는 IFNγ 또는 IL-2 생성의 증가인, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, B1은 GITR에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고; B2는 CTLA-4에 특이적인 폴리펩타이드 결합 도메인이며, 이는 이하의 것들을 포함하거나 또는 이로서 이루어지는, 폴리펩티드:
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는
(b) 서열번호 3의 아미노산 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산이 변경되었고, 단 상기 결합 도메인은 야생형 인간 CD86보다 더 높은 친화성으로 인간 CTLA-4에 대해 결합하는, 아미노산 서열. - 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열에 비해 B2의 상기 아미노산 서열 (ii) 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산이 치환되고; 선택적으로 서열번호 3의 아미노산 서열에 비해 삽입 또는 결실이 없는, 폴리펩타이드.
- 제23항에 있어서, B2의 상기 아미노산 서열 내의 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 위치 122에 있고, 선택적으로 상기 아미노산 서열은 또한 위치 107, 121 및 125 중 적어도 하나에서도 치환되는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B2의 아미노산 서열은 서열번호 6 내지 24 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로서 이루어지는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 GITR 결합 도메인 (B1)은 서열번호: 61, 63, 65 및 67로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 부위 아미노산 서열, 및 서열번호 52, 54, 56 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는 항체의 인간 GITR에 대한 결합을 경쟁적으로 저해할 수 있는, 폴리펩타이드. - 제26항에 있어서, B1은 서열번호 88, 89 및 90의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 부위 아미노산 서열, 및/또는 서열번호: 76, 77 및 78의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제26항에 있어서, B1은 서열번호 91, 92 및 93의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 부위 아미노산 서열, 및/또는 서열번호: 79, 80 및 81의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제26항에 있어서, B1은 서열번호 94, 89 및 95의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 부위 아미노산 서열, 및/또는 서열번호: 82, 83 및 84의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제26항에 있어서, B1은 서열번호 94, 89 및 96의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 부위 아미노산 서열, 및/또는 서열번호: 85, 86 및 87의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, GITR 결합 도메인 (B1)는 서열번호: 61, 63, 65 및 67로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 부위 아미노산 서열, 및/또는 서열번호: 52, 54, 56 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제31항에 있어서, B1은 서열번호 61의 경쇄 가변 부위 아미노산 서열 및/또는 서열번호 52의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제31항에 있어서, B1은 서열번호 63의 경쇄 가변 부위 아미노산 서열 및/또는 서열번호 54의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제31항에 있어서, B1은 서열번호 65의 경쇄 가변 부위 아미노산 서열 및/또는 서열번호 56의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제31항에 있어서, B1은 서열번호 67의 경쇄 가변 부위 아미노산 서열 및/또는 서열번호 58의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B1이,
(a) 서열번호 61의 경쇄 가변 부위 아미노산 서열, 및 서열번호 52의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열;
(b) 서열번호 63의 경쇄 가변 부위 아미노산 서열, 및 서열번호 54의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열;
(c) 서열번호 65의 경쇄 가변 부위 아미노산 서열, 및 서열번호 56의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열; 또는
(d) 서열번호 67의 경쇄 가변 부위 아미노산 서열, 및 서열번호 58의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로서 이루어지는, 폴리펩타이드. - 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, GITR 결합 도메인은 인간 Fc 부위 또는 상기 부위의 변이체를 포함하고, 상기 부위는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 부위이고, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 부위인, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호 69, 71, 73 및 75로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열; 및
(b) 서열번호 52, 54, 56 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로서 이루어지는, 폴리펩타이드. - 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호: 52 및 69; 또는
(b) 서열번호: 54 및 71; 또는
(c) 서열번호 56 및 73; 또는
(d) 서열번호: 58 및 75
의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로서 이루어지는, 폴리펩타이드.. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 결합 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제40항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 결합 도메인은 Fv 단편 (예컨대, 단쇄 Fv 단편, 또는 이황화-결합된 Fv 단편), Fab-유사 단편 (예컨대, Fab 단편; Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편) 및 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된 항원-결합 단편인, 폴리펩타이드.
- 제40항 또는 제41항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 결합 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적인 치료적 모이어티를 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 폴리펩타이드, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 조성물.
- 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은, GITR에 특이적인 항체.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 폴리펩타이드 또는 이의 1 성분 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에게서 종양 질환 (neoplastic disease) 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 이중특이적 폴리펩타이드.
- 제48항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 암인, 이중특이적 폴리펩타이드.
- 제49항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 유방암, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 폐암, 자궁경부암, 횡문근육종, 신경모세포종, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 흑색종, 방광암, 위암, 두경부암, 간암, 피부암, 림프종 및 신경교종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이적 폴리펩타이드.
- 개체에게서 종양 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의약 제조를 위한, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 폴리펩타이드의 용도.
- 개체에게서 종양 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서,
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 폴리펩타이드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 제51항에 있어서, 상기 방법은 이중특이적 항체를 전신 또는 국소적으로, 예컨대 종양 부위 또는 종양 드레이닝(draining) 림프절에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 실질적으로 본 명세서에 대한 참고로 기재된 바와 같은 이중특이적 폴리펩타이드.
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