CN101175488B - 治疗眼病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供治疗由LFA-1介导的疾病的化合物和方法。尤其，本申请中描述了LFA-1拮抗剂，而且将这些拮抗剂用于治疗由LFA-1介导的疾病。本发明的一个方面提供治疗由LFA-1介导的疾病的诊断方法，和在诊断出病人患有LFA-1介导的疾病之后给药LFA-1拮抗剂。在一些实施方案中，被治疗的由LFA-1介导的疾病为干眼症。本申请还提供了鉴定作为LFA-1拮抗剂的化合物的方法。

Description

治疗眼病的组合物和方法
交叉参考
本申请要求下列申请的权益：2005年5月17日申请的美国临时申请No.60/681,684；2005年5月17日申请的美国临时申请No.60/681,722；2005年5月17日申请的美国临时申请No.60/681,772，和2005年5月17申请的美国临时申请No.60/681,723，每个申请的全文在此结合进来作为参考。
发明背景
眼科疾病，干眼病是眼疾患者的常见疾病。未解决的干眼病症状能够导致角膜上皮细胞表面的腐蚀和磨损，提高了对传染病的易感性。疾病的发展可能导致角膜溃疡，甚至失明。
各种刺激物、损伤和医疗设备使人们的泪腺分泌物开始减少，导致保护和滋养眼表面的泪水处于缺乏水平。还有一些环境因素能够引起和/或促使眼泪产生数量和质量的降低，所述因素例如为高纬度、干旱和多风的气候、空气污染、来自中央暖气和中央空调的干燥空气，以及暴露于香烟中。甚至于计算机的广泛使用也是一个起作用的因素，因为研究显示其使注意力集中于计算机屏幕上的使用者的眨眼率明显降低。一些眼护理方面的进步也促使最近干眼病患者数量增加，其开始于采用隐形眼镜，而目前流行LASIK法校正视力。使用隐形眼镜导致眼镜吸收了泪膜，引起眼睑中结膜的生理疼痛。LASIK可能具有因眼损伤而引起的继发副作用，因为在激光折射手术过程中神经通常被切断或融化，其会导致至少暂时的几个月的干眼病症状。
疾病和一些身体不适可能使人易于患干眼病，这些疾病包括过敏症、糖尿病、泪腺缺陷、狼疮、帕金森病、金格伦综合症、类风湿性关节炎、红斑痤疮和其它疾病。针对其它疾病的药物治疗可能导致干眼病或使其恶化，包括利尿剂、抗抑郁剂、抗过敏药物、避孕药丸、减充血剂和其它药剂。
与年龄有关的变化也可能诱使干眼病或使其恶化。更年期后的妇女经历激素水平的变化，其会产生干眼病或使其恶化，而且甲状腺不平衡也可能导致类似的变化。最后，变老现象本身也会导致油脂分泌减少，从而导致干眼病。
直至最近，治疗性措施仍只限于用以提高眼的水分水平的缓解措施。这种干预方法最通常是借助于作为人工眼泪的滴眼液来实现。这些液体通常为溶液，每天滴一次或多次。对于更严重的干眼病情况而言，结合了增稠剂或眼凝胶的人工泪液可以增加保留在眼部的膜层的量。或者，可以使用几种夜用药膏来治疗。增稠溶液、凝胶和药膏的局限性在于施用后会显著损害视力，因此其很少被用于需要在觉醒、活动时刻大量施用的一般患者中。另一个缓解措施是建立暂时性泪道阻塞，或者甚至是通过外科手术关闭眼泪进入与眼相邻的鼻腔的正常排泪途径。
但是，这些措施都不能有效治疗这种疾病。因此，希望研制出能够有效治疗干眼病，优选以最小的副作用治疗的药剂。
发明概述
一方面，本发明提供治疗由LFA-1介导的炎症性疾病的方法，该方法通过向患者施用有效量的单独的LFA-1拮抗剂或者与其它治疗药剂相结合的LFA-1拮抗剂来进行。在本发明的一些实施方案中，本发明的LFA-1化合物所要治疗的疾病为抗LFA-1抗体，Raptiva已显示出治疗效果或者已显示出对于疾病组织中的炎症细胞具有作用的疾病。可以用本发明的化合物治疗患有免疫介导的过敏性疾病，包括鼻炎的病人，用以减轻与LFA-1介导的免疫和/或过敏反应相关的炎症。在一些实施方案中，经口或鼻输送喷雾溶液或分散粉末的局部给药方式可以用于治疗哮喘或其它由LFA-1介导的肺部炎症性疾病。在一些实施方案中，本发明的乳膏制剂可以用于将LFA-1拮抗剂局部施用于患有由LFA-1介导的皮肤病，例如湿疹和牛皮癣的皮肤上。在一些实施方案中，在动物试验中通过口服途径给药LFA-1拮抗剂的口服制剂，已知该LFA-1拮抗剂口服制剂在系统水平下的吸收性很差，其可用于在胃肠道(GI)炎症疾病的治疗中局部输送LFA-1拮抗剂，所述胃肠道炎症疾病包括克罗恩氏病和过敏性肠综合征，或由LFA-1或其它白细胞整联蛋白，包括VLA4和Mac-1介导的其它GI疾病。
在一些实施方案中，由LFA-1介导的疾病为眼疾病。在一些实施方案中，由LFA-1介导的炎症性疾病为干眼病。尤其，本发明的方法可以用于治疗干眼综合症。该综合症包括由下述原因引起的症状：角膜结膜干燥、金格伦综合症、角膜受伤、与年龄相关的干眼病、史蒂文斯-约翰逊综合症、先天性无泪症、药物副作用、感染、赖利-戴综合症、结膜纤维化、眼压、腺体和组织的损坏、眼部瘢痕类天疱疮、睑炎、自体免疫和其它免疫缺陷疾病、过敏、糖尿病、泪腺缺乏、狼疮、帕金森病、金格伦综合症、类风湿性关节炎、红斑狼疮，在干燥空气、空气传播的颗粒、烟和烟雾环境中的过度暴露，以及不能眨眼，以及其它疾病。许多患有干眼病的病人还可能有潜在的自体免疫疾病，金格伦综合症。目前公认的确定病人的诊断标准包括临床征兆和口干症状。本发明化合物的漱口液或锭剂可以用于治疗该症状。将皮肤乳膏施用于眼睑外表面就会使LFA-1拮抗剂通过眼睑到达眼睑内衬和中间的结膜组织和副泪腺，人们就是希望将这种皮肤乳膏用于治疗由LFA-1介导的眼睑和眼的炎症，尤其是治疗干眼病。
本发明的另一个方面提供药物组合物，其包括在治疗由LFA-1介导的炎症性疾病的方法中施用的LFA-1拮抗剂。在一些实施方案中，由LFA-1介导的炎症性疾病为眼疾病，为了治疗该疾病而提供包括LFA-1拮抗剂的药物组合物。在一些实施方案中，由LFA-1介导的炎症性疾病为干眼病，为了治疗该疾病而提供包括LFA-1拮抗剂的药物组合物。还提供，该组合物可以进一步包括另一种治疗药剂，其在同一制剂中或者分别地共施用。在一些实施方案中，药物组合物经口服、注射、鼻内、吸入、直肠、局部、滴至眼表面或经皮肤给药。
在另一个方面中，本发明提供组合物制剂，其在治疗由LFA-1.介导的炎症性疾病的方法中给药。在一些实施方案中，提供组合物的胃滞留制剂，用于在治疗由LFA-1介导的炎症性疾病中给药。在一些实施方案中，提供组合物的胃滞留制剂，用于在眼疾的治疗中给药，该眼疾为由LFA-1介导的炎症性疾病。在一些实施方案中，提供组合物的眼用制剂，用于在眼疾的治疗中给药，该眼疾为由LFA-1介导的炎症性疾病。在一些实施方案中，提供眼用组合物制剂，用于在治疗由LFA-1介导的炎症性疾病中给药，其为溶液、乳膏、粉末、悬浮液、喷雾、凝胶、固体，等等。本发明的一些实施方案还提供了受控的释放剂型。在本发明的一些实施方案中，将本发明的化合物制成前药。
在另一个方面中，提供了用在本发明的方法中的化合物。可用于本发明的方法中的化合物包括抗体、抗体片段、多肽、肽、聚合物和有机小分子。在本发明的方法的另一个实施方案中，将Raptiva用在治疗干眼病的眼用制剂中。
本发明的一个方面将诊断过程与用LFA-1拮抗剂进行治疗的方法相结合。在一个实施方案中，对金格伦综合症进行诊断试验，并在对疾病进行诊断之后，向病人施用本文中所述的LFA-1拮抗剂。在另一个实施方案中，进行干眼病诊断试验，并在对干眼病进行诊断之后，向病人施用本文中所述的LFA-1拮抗剂。
将本申请中提供化合物施用于患有由LFA-1介导的炎症性疾病的患者，用以提高泪水或粘液素的产生。优选，所治疗的炎症性疾病为干眼病。
在另一个方面中，提供一种鉴定LFA-1抑制剂与ICAM-I之间的相互作用的方法。在一些实施方案中，经鉴定该抑制剂与ICAM-I针对在LFA-1αL亚基内的LFA-1上的结合进行直接竞争。在一些实施方案中，该方法采用竞争性结合试验来确定LFA-1拮抗剂：ICAM-I之间的相互作用。在一些实施方案中使用标记探针分子，已知该分子在金属离子依赖型黏着位上结合，所述黏着位为LFA-1：ICAM-1在LFA-1αL亚基上的相互作用位置。
在另一个方面中，描述了一种对用于人类疾病的可用药物试剂进行鉴定的方法，该方法使用siRNA(小的干扰RNA序列)的细胞生长抑制特性曲线，据此在一组培养的细胞系中鉴定出具有类似的细胞生长抑制特性曲线的化合物，其中所述的siRNA指向参与细胞生长和人类疾病的细胞靶标。本发明的方法还可以用于鉴定可用的LFA-1抑制剂、B-细胞受体BR3、Grb2(在信号级联反应中位于生长因子受体的下游的蛋白)和其他细胞内和细胞外的蛋白靶标。在本发明的另一个实施方案中，经鉴定与siRNA抑制细胞生长的活性特性曲线相反的化合物可以作为细胞生长的刺激剂，该刺激剂可用于治疗细胞生长减缓的疾病和病症。提高的细胞生长率可以用于伤口愈合和其它临床情况下。在本发明的另一个实施方案中，该方法使用siRNA细胞活性数据采用下述方式进行靶向或者选择靶标：通过对公用和/或私人化合物细胞活性数据库进行搜索来找寻对化合物或化合物集合产生响应的类似的细胞活性特性曲线，用以作为对可用于鉴定人类药物的化合物进行鉴定的方法。
参考文献的结合
本说明书中提及的所有公开物和专利申请都据此结合进来作为参考，每个单独的公开物或专利申请都按照具体和单独指定的程度结合进来作为参考。
附图简述
所附权利要求对本发明的新颖性进行了特殊阐释。参考下列阐述了说明性实施方案的详细描述可以对本发明的特征和优越性具有更好的理解，所述详细描述中采用本发明的原则和下述附图：
图1描述了由LFA-1：ICAM-1相互作用产生的滚动、白细胞黏着和穿过内皮的迁移。
图2描述了LFA-1：ICAM-1相互作用的抗原活化。
图3描述了LFA-1：ICAM-1相互作用的共刺激功能。
图4描述了用于鉴定方法中的小分子拮抗剂。
图5为表1，其显示了LFA-1的小分子拮抗剂的阳离子依赖性。
图6描述了化合物5交联的LFA-1的SDS-PAGE分析。
图7描述了化合物2B和ICAM-I-Ig与293细胞的结合，所述293细胞表达野生型LFA-1或缺失结构域I的LFA-1。
图8描述了化合物2A、3、A-286982和sICAM-1在LFA-1/ICAM-1和LFA-1/小分子ELISA中的拮抗剂竞争作用。
图9描述了LFA-1/ICAM-1与LFA-1/小分子ELISA进行拮抗剂竞争作用而得到的IC50值的相互关系。
图10描述了拮抗剂对结合在LFA-1/ICAM-1和LFA-1/小分子ELISA上的配体的作用效果。
图11描述了sICAM-1的Schild回归和化合物3的拮抗作用。
图12描述了用于治疗人类癌症和炎症的有效细胞生长抑制剂的发现流程图。
发明详述
I.白整联蛋白与黏着受体之间的相互作用：生物学和疾病
本发明的第一方面为治疗免疫和其它病症的炎症部分的方法。尤其，本申请中描述的方法可以用于治疗白细胞介导的炎症。该部分用于在所选疾病中引发和促进炎症，所述疾病例如为银屑病、湿疹、哮喘、皮炎、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、与炎症性肠炎有关的响应、Raynaud综合症、金格伦病、幼年发病的糖尿病、糖尿病、肉芽肿病、CNS炎性病症、多器官损伤疾病、所有类型的移植，包括移植物对抗宿主或宿主对抗移植物的疾病、HIV和鼻病毒感染和动脉粥样硬化，以及其它疾病。
本发明的优选实施方案用于治疗眼病。尤其，本发明的方法用于治疗干眼综合症。该综合症包括由下述原因引起的症状：干燥性角膜结膜炎、金格伦综合症、角膜损伤、与年龄有关的干眼症、史蒂文斯-约翰逊综合症、先天性无泪症、药物副作用、感染、赖利-戴综合症、结膜纤维化、眼压、腺体和组织破坏、眼部瘢痕类天疱疮、目疡、自体免疫和其它免疫缺陷病症、过敏、糖尿病、泪腺缺陷、狼疮、帕金森病、金格伦综合症、风湿性关节炎、环境暴露：暴露于过量的干燥空气、空气传播的颗粒、烟和物和不能眨眼，以及其它疾病。
并非意图限制作用机理，本发明的方法包括通过抑制LFA-1和ICAM-I之间的相互作用来抑制与炎症有关的疾病的开始和发展。LFA-1和ICAM-I为带有胞外受体域的分子，其参与淋巴细胞/白细胞的迁移和增殖过程，导致炎症级联反应。在优选实施方案中，这种方法提供体外和体内的抗-炎作用，例如如下面所作的详细描述，而且其可以用于治疗炎症介导的疾病，尤其是干眼病。
人类血液中含有白血球(白细胞)，其进一步分类为嗜中性粒细胞、淋巴细胞(分为B-和T-亚型)、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。这些类白细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞中的若干细胞参与炎性病症。LFA-1是表达于大部分白细胞上的白整联蛋白组中的一种，而且其被认为是与许多作为配体的ICAM发生相互作用的淋巴整联蛋白。干扰这些相互作用，并因此干扰免疫/炎症响应就可以使炎症，尤其是眼的炎症减弱。
例如，ICAM-1(CD54)是免疫球蛋白超家族中的ICAM家族黏着受体(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、ICAM-4)中的一员，而且其表达于被激活的白细胞、皮肤成纤维细胞和内皮细胞上。参见，Krensky，A.M.；Sanchez-Madrid，F.；Robbins，E.；Nagy，J.A.；Springer，T.A.Burakoff，SJ.“The functional significance，distribution，and structure ofLFA-1，LFA-2，and LFA-3：cell surface antigens associated with CTL-target interactions.”1983 J.Immunol.131，611-616。其正常情况下在沿着脉管细胞的内皮细胞上进行表达，而且在免疫/炎症开始时经暴露于细胞因子，例如IL-I、LPS和TNF下而得到正调节。
近十年来所作的研究有助于说明参与免疫系统分子运动和活化作用的分子事件，其集中级联反应中的细胞-细胞间引发性相互作用。参见Springer，T.A.“Adhesion receptors of the immune system.”Nature，1990，346，425-434。细胞间黏着分子(ICAMs)和白整联蛋白之间的相互作用在免疫系统的功能中起到一定作用。人们相信免疫过程，例如抗原呈递、T-细胞介导的细胞毒和白细胞跨内皮迁移(血细胞渗出)需要由ICAMs与白整联蛋白相互作用而介导的细胞黏着。参见Kishimoto，T.K.；Rothlein；R.R.“Integrins，ICAMs，and selectins：role and regulation of adhesion molecules in neutrophil recruitment toinflammatory sites.”AdV.Pharmacol.1994，25，117-138和Diamond，M.；Springer，T.A.“The dynamic regulation of integrin adhesiveness.”Current Biology，1994，4，506-532。
已经显示，ICAM-I和LFA-1(还称作αLβ2和CDlla/CD18)的相互作用参与黏着过程，如图1所示，白细胞跨内皮进行迁移、迁移至伤口位置，淋巴细胞在激活的靶标位置增殖。例如，目前认为在白细胞跨内皮迁移之前，炎症反应成分，细胞因子/趋化因子的存在将在白细胞上组成性表达的整联蛋白激活。血管内皮细胞也响应该细胞因子/趋化因子的存在而正调节ICAM-I。当滚动的白细胞接近被激活的内皮细胞时，其前进首先被这些正调节的ICAM-I受体延缓。之后被表达在血管内皮细胞表面上的LFA-1和ICAM-I之间的配体/受体相互作用延缓，其阻止淋巴细胞的进一步滚动。然后淋巴细胞变平，从而发生渗透作用(transvasation)。该过程对于淋巴细胞穿过血管内皮的迁移以及淋巴细胞由外部血液行至淋巴结而言都是很重要的。
LFA-1在产生和维持免疫突触中具有作用，如图2所示，其可以被定义为T细胞与抗原呈递细胞(APCs)的相互作用表面的物理结构。LFA-1使T-细胞与APC的作用稳定化，从而激活T细胞。如图3所示，LFA-1与ICAM-I的相互作用还表现为向停滞的T细胞提供共-刺激信号。CD4+T-细胞的增殖和细胞因子的合成由作为炎症反应一部分的该相互作用来介导。
假设ICAM-I与LFA-1的相互作用在免疫/炎性反应中具有作用，则希望对这些相互作用进行调节，以获得希望的治疗结果(例如，在过度活化的炎症反应情况下对该相互作用进行抑制)。而且，由于LFA-1具有多个属于ICAM族(ICAM-I、ICAM-2和ICAM-3)并涉及多个信号通道的配体对(ligand partners)，因此在一些实施方案中，希望选择性调节这些相互作用。还指出可以借助指向ICAMs和白整联蛋白中任何一个成分的试剂来实现对ICAMs和白整联蛋白之间的相互作用的拮抗作用。
本文中描述的方法和组合物可以调节一种或多种本文中描述的通道中的成分。除了抑制LFA-1和ICAM-I之间的相互作用之外，本发明的方法和组合物还可以干预发炎过程中的早期和晚期部分。例如，可以在粘连和跨内皮迁移之前，通过本文中描述的方法和组合物来调节对ICAM-I或LFA-1的内皮细胞或白细胞的正调节(活化)。本发明可以用于调节在白细胞通行过程中激活ICAM-I和LFA-1的细胞因子或趋化因子的表达、调节细胞因子或趋化因子的运输，防止停滞白细胞的渗透作用、调节参与白细胞在受伤或炎症部位进行增殖的其它机理的信号传输等。
II.治疗方法
如本文中所用的，术语“患者”包括动物，尤其是人以及其它哺乳动物。该方法通常包括施用一种或多种用于治疗一种或多种疾病的药物。组合试剂可以用于治疗一种疾病或多种疾病，或者用于调节组合中的一种或多种试剂的副作用。本文中描述的化合物可以与其它干眼症治疗试剂结合使用。而且，本发明的化合物还可以与引起作为副作用的干眼症的药物组合使用。
如本文中所用的，术语“治疗”及其等效措辞包括实现治疗性有益效果和/或预防性有益效果。治疗性有益效果意指根除或改善被治疗的主要病症。
而且，通过根除或改善一种或多种与主要病症有关的生理症状来实现治疗性有益效果，从而在患者身上观察到改善情况，尽管患者可能仍旧经受主要病症的折磨。对于预防性有益效果而言，即使还未给出疾病的诊断结论，也可以将组合物施用于患者，但有产生特殊疾病的危险，或者施用于记录具有一种或多种疾病生理症状的患者。可以将组合物施用于患者，以预防生理症状或主要病症的发展。
在一些实施方案中，治疗试剂以足以产生治疗效果的量存在，即该量足以除去平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、大于90％或基本上除去疾病或其至少一个主要症状。优选该治疗作用为针对炎症的治疗作用。
在一些实施方案中，治疗试剂以足以产生治疗效果的量存在，即该量减少平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、大于90％的干眼症症状或基本上除去干眼症症状。
在一些实施方案中，治疗试剂的有效量为日剂量1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1×101、1×102g。
可以以任何适当的方式施用治疗试剂。在一些实施方案中，通过口服给药方式施用治疗试剂。在一些实施方案中，通过皮肤施用方式施用治疗试剂。在一些实施方案中，通过注射方式施用治疗试剂。在一些实施方案中，局部施用治疗试剂。如果将组合试剂作为独立的组合物给药，则其可以以相同途径或不同途径给药。如果组合试剂在单一组合物中给药，则其可以以任何适当的途径给药。在一些实施方案中，将组合试剂作为单一组合物经口服给药方式给药。在一些实施方案中，将组合试剂作为单一组合物以皮肤给药方式施用。在一些实施方案中，将组合试剂作为单一组合物经注射方式给药。在一些实施方案中，将组合试剂作为单一组合物局部给药。
本文中描述的本发明方法为一种将LFA-1拮抗剂施用于患者以治疗其干眼症的方法。尤其，该拮抗剂可以调节由白细胞介导的炎症。本发明的优选实施方案通过施用LFA-1拮抗剂来调节与眼部炎症有关的炎症，从而治疗患者。本发明的另一个优选实施方案是通过施用LFA-1拮抗剂来治疗患有与干眼综合症有关的炎症的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因过敏引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因糖尿病引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因泪腺缺陷引起的干眼病症状的患者。本发明的实施方案治疗具有由狼疮引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有由帕金森病引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有由干燥病引起的干眼病(Sjoren’s)症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有由类风湿性关节炎引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有由红斑狼疮引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有由视力校正的LASIK治疗引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因使用隐形眼镜而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因暴露于干燥气候而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因暴露于空气污染而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因多风气候而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因暴露于香烟而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因干燥性角膜结膜炎而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因角膜损伤而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因结膜纤维化而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有与年龄-有关的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因史蒂文斯-约翰逊综合症而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因先天性无泪症而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因病人服用的其它药物的副作用而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因感染而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因赖利-戴综合症而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因眼压，包括因使用计算机而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因腺体和组织缺陷而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因眼瘢痕类天疱疮而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因目疡而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因自体免疫和其它免疫缺陷病症引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案治疗具有因不能眨眼而引起的干眼病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有银屑病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有湿疹症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有狼疮症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有Reynaud综合症症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有肉芽肿病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有CNS炎性病症症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有多个器官疾病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有过敏性鼻炎症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有肉芽肿病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有动脉粥样硬化症症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有移植物对抗宿主的疾病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有与移植有关的炎症反应症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有炎症性肠病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有幼年发病的糖尿病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有糖尿病症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有多发性硬化症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有哮喘症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有皮炎症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有系统性红斑狼疮症状的患者。本发明的一个实施方案用该方法的LFA-1拮抗剂治疗具有HIV和鼻病毒感染症状的患者。
在本发明的一些实施方案中，使用诊断步骤来确定需要使用本发明的方法进行治疗的患者。使用荧光素染色的角膜来诊断干眼病症状。使用孟加拉玫瑰红染色的角膜来诊断干眼病症状。使用眼泪中断时间(BUT)来诊断干眼病症状。使用Schirmer麻醉试验诊断干眼病症状。使用Schirmer试验分析法诊断干眼病症状。使用压迹细胞学来诊断干眼病症状。使用主观干眼症状来诊断干眼病症状。使用泪流分析法诊断干眼病症状。使用免疫组织化学方法，包括但不限于人类白细胞抗原II(HLA-DR)来诊断干眼病症状。使用抗核抗体试验(ANA)或荧光抗核抗体试验(FANA)诊断干眼病症状。使用眼部蒸发来诊断干眼病症状。使用红外睑板图(meibography)来诊断干眼病症状。使用连续扫描共焦显微术(TSCM)诊断干眼病症状。这是可用于诊断干眼病症状的示例方法的目录，其绝对不是用来进行限制的。
本发明方法的拮抗剂可以为抗体、抗体片断、肽或小分子。在优选的实施方案中，所用的LFA-1拮抗剂为非抗体的肽。本发明的拮抗剂为治疗试剂。
针对LFA-1拮抗剂的许多治疗指示都要求慢性疗法；因此，LFA-1/ICAM-1相互作用的小分子抑制剂是本发明的一组优选实施方案，因为其具有口服给药以及降低材料成本的潜力。
进一步优选的实施方案为使用治疗试剂治疗干眼病的方法，所述治疗试剂适于制剂和作为眼部疗法来给药。
此处和下文中描述了本发明的另一个方面，一种对ICAM-I和拮抗剂的结合进行比较的方法，其中所述拮抗剂可用于确定抗体、抗体片断、肽和作为LFA-1：ICAM-I相互作用的拮抗剂的小分子。参见Gadek等，2002。就小分子拮抗剂来描述该方法。但是，不应该将其解释为以排除其用于确定较大分子类型的LFA-1抑制剂的任何方式来限制该方法，其中所述LFA-1抑制剂例如为抗体、抗体片段或肽。
该方法包括选择一个或多个下列步骤作为确定拮抗剂的方法的一部分，其中所述拮抗剂作为LFA-1的直接竞争抑制剂：(a)使用全长野生型LFA-1进行竞争试验，对有潜力的拮抗试剂与sICAM-1(LFA-1的天然配体和竞争性LFA-1/ICAM-1抑制剂的胞外域)和A-286982(已知结合在结构域I(插入)变构位(IDAS)上的变构LFA-1/ICAM-1抑制剂)的结合作用进行比较。参见Liu，G.；Huth，J.R.；Olejniczak，E.T.；Mendoza，R.；DeVries，P.；Leitza，S.；Reilly；E.B.，Okasinski；G.F.；Fesik，S.W.和von Geldern，T.W.2001.“Novel p-arylthio cinnamidesas antagonists of leukocyte function-associated antigen-1/intracellularadhesion molecule-1 interaction.2.Mechanism of inhibition andstructure-based improvement of pharmaceutical properties.”J.Med.Cherα，44，1202-1210))，(b)对潜在的拮抗试剂和ICAM-I与LFA-1突变体的结合进行研究，和(c)化学交联研究。之前已经将靶向于此的ICAM-I结合位局限在包括位于LFA-1α亚基内结构域I内并依赖于金属离子的黏着位点(MIDAS)基序上。参见Shimaoka，M.，Xiao，T.，Liu，J.-H.，Yang，Y.，Dong，Y.，Jun，C-D.，McCormack，A.Zhang，R.，Joachimiak，A.，Takagi，J.，Wang，J.-H.和Springer，T.A.2003“Structures of the alpha L I domain and its complex with ICAM-I reveala shape-shifting pathway for integrin regulation”，Cell 2003，99-111。可以使用该方法的一个或多个步骤来确定具有下述作用方式的拮抗剂：通过直接竞争一个位于LFA-1上的普通高亲合力结合位而抑制ICAM-I的结合。
A.作为治疗试剂的抗体
本领域已知若干种适当的抗体。用指向其中之一或两个这些分子的抗体阻断CAM例如ICAM-I，或白整联蛋白例如LFA-1，则可以抑制炎症反应。之前的研究对于抗-CD11a Mab对体外许多T-细胞-依赖型免疫功能的影响和对体内许多免疫响应的影响作了考察。在体外，抗-CD11a Mab抑制T-细胞的活化(参见Kuypers T.W.，Roos D.1989“Leukocyte membrane adhesion proteins LFA-1，CR3 and p150，95：areview of functional and regulatory aspects”Res.Immunol.，140：461-465；Fischer A，Durandy A，Sterkers G，Griscelli C.1986，“Role of the LFA-1 molecule in cellular interactions required forantibody production in humans”，J.Immunol.，136，3198；target cell lysisby cytotoxic T-lymphocytes(Rrensky等，如前所述)，formation ofimmune conjugates(Sanders VM，Snyder JM，Uhr JW，Vitetta ES.，“Characterization of the physical interaction between antigen-specific Band T cells”.J.Immunol.，137：2395(1986)；Mentzer SJ，GromkoWskiSH，Krensky AM，Burakoff SJ，Martz E.1985，“LFA-1 membranemolecule in the regulation of homptypic adhesions of human Blymphocytesn”，J.Immunol.，135：9)，和T-细胞对血管内皮的黏着(LoSK，Van S eventer GA，Levin SM，Wright SD.，Two leukocyte receptors(CD1 1a/CD18 and CD1 1b/CD18)  mediate transient adhesion toendothelium by binding to different ligands.，J.Immunol.，143：3325(1989))。两种抗-CDlla MAbs、HI111和G43-25B可购自Pharmingen/BDBiosciences。此外，包括F8.8、CBR LFA 1/9、BL5、May.035、TS1/11、TS1/12、TS1/22、TS2/14、25-3-1、MHM2和依法丽珠单抗(efalizumab)的研究工作评价了这些抗体占据的位于LFA-1上的结合位的范围。参见Lu，C；Shimaoka，M.；Salas，A.；Springer，T.A.2004，“The BindingSites  for Competitive  Antagonistic，Allosteric Antagonistic，andAgonistic Antibodies to the I Domain of integrin LFA-1”，J.Immun.173：3972-3978，及其中的参考文献。
下述观察结果是试验这些分子的Mabs对人体内移植排斥现象的预防作用的基础：LFA-1：ICAM-1的相互作用是优化T-细胞在体内的功能所必需的，而且抗-CD1Ia Mabs诱发对于蛋白质抗原的耐受性(Beniamin RJ，Qin SX，Wise MP，Cobbold SP，Waldmann H.1988，“Mechanisms of monoclonal antibody-facilitated tolerance induction：apossible role for the CD4(L3T4)and CD1Ia(LFA-1)molecules inself-non-self discriminaTIon”，Eur，J.Immunol.，18：1079)，并且延长肿瘤移植物在小鼠体内的存活时间(Heagy W，Walterbangh C，MartzE.1984，“Potent ability of anti-LFA-1 monoclonal antibody to prolongallograft survival”，Transplantation，37：520-523)。还在灵长类动物动物体内作了试验。例如，基于在猴子体内所作的试验，人们得出结论指向ICAM-I的Mab可以预防或逆转肾移植排斥作用(Cosimi等，“Immunosuppression of Cynomolgus Recipients of Renal Allografts byR6.5，a Monoclonal Antibody to Intercellular Adhesion Molecule-1，”Springer等(eds.)，Leukocyte Adhesion Molecules New York：Springer，(1988)，274页；Cosimi等，J.Immunology，144：4604-4612(1990))。向猕猴体内施用抗-CD11a Mab延长了皮肤同种异体移植存物活时间。参见Berlin等，Transplantation，53：840-849(1992)。
B.小分子
对肽用于降低LFA-1与ICAM-I之间的相互作用的用途进行了研究。美国专利No.5,747,035中对不含有IgG的Fc区域的多肽进行了描述，该多肽可以用于治疗LFA-1介导的病症，尤其是干眼症。美国专利No.5,843,885中描述了使用二肽来降低LFA-1和ICAM-I的相互作用，其中所述二肽中第一个是ICAM-I调节剂，第二是具有从LFA-1获得的序列的阻断肽。美国专利No.6,630,447中对环肽进行了描述，所述环肽作为LFA-1：ICAM-I相互作用的抑制剂。
小分子拮抗剂包括结合在LFA-1 CD11结构域上的抑制素。参见Kallen，J.，Welzenbach，K.，Ramage，P.Geyl，D.Kriwacki，R.，Legge，G.，Cottens，S.，Weitz-Schmidt，G.，和Hommel，U.1999.“Structural basis for LFA-1 inhibition upon lovastatin binding to theCD1 Ia I-domain”，J.MoI.Biol.，292：1-9；和Weitz-Schmidt，G.，Welzenbach，K.，Brinkmann，V.，Kamata，T.，Kallen，J.，Bruns，C，Cottens，S.，Takada，Y.和Hommel，U.2001.Statins selectively inhibitleukocyte function antigen-1 by binding to a novel regulatory integrinsite，Nature Med.，7：687-692；和Frenette，P.S.2001.“Locking a leukocyteintegrin with statins”，N.Engl.J.Med.，345：1419-1421。衍生自美维诺林(mevinolin)/美伐他汀(compactin)基序的分子也显示抗LFA-1活性。参见Welzenbach，K.，Hommel，U.和Weitz-Schmidt，G.2002.“Small molecule inhibitors induce conformational changes in the Idomain and the I-like domain of Lymphocyte Function-AssociatedAntigen-1”，J.Biol.Chem.，277：10590-10598，和美国专利No.6,630,492。
基于乙内酰脲的抑制剂家族也可以用作拮抗剂。参见Kelly，T.A.，Jeanfavre，D.D.，McNeil，D.W.，Woska，J.R.Jr.，Reilly，P.L.，Mainolfi，E.A.，Kishimoto，K.M.，Nabozny，G.H.，Zinter，R.，Bormann，B.-J.和Rothlein，R.1999.“Cutting edge：a mall moleculeantagonist of LFA-1-mediated cell adhesion”，J.Immunol.，163：5173-5177。相信这些化合物是LFA-1的变构抑制剂。
新的对芳基硫代肉桂酰胺族可以用作LFA-1拮抗剂。参见Liu，G.；Link，J.T.；Pei，Z.；Reilly，E.B.；Nguyen，B.；Marsh，K.C.；Okasins ki，G.F.；von Geldern，T.W.；Ormes，M.；Fowler，K.；Gallatin，M.2000.“Discovery of novel p-arylthio cinnamides as antagonists ofleukocyte function-associated antigen-1/intracellular adhesionmolecule-1 interaction.1.Identification of an additional binding pocketbased on an anilino diaryl sulfide lead.”J.Med.Chem.43，4015-4030。
其它小分子抑制剂族在出版物(参见Gadek，T.R.，Burdick，D.J.，McDowell，R.S.，Stanley，M.S.，Marsters，J.C.Jr.，Paris，K.J.，Oare，D.A.，Reynolds，M.E.，Ladner，C，Zioncheck，K.A.，Lee，W.P.，Gribling，P.，Dennis，M.S.，Skelton，N.J.，Tumas，D.B.，Clark，K.R.，Keating，S.M.，Beresini，M.H.，Tilley，J.W.，Presta，L.G.，和Bodary，S.C.2002.“Generation of an LFA-lantagonist by thetransfer of the ICAM-I immunoregulatory epitope to a small molecule”，Science，295：1086-1089和在线补充资料)和专利，包括美国专利No.6,872,735、美国专利No.6,667,318、美国专利No.6803384、美国专利No.6,515,124、美国专利No.6331640，和美国申请，包括U.S.20020119994、U.S.20040058968、U.S.20050080119、WO99/49856、WO00/21920、WO01/58853、WO02/59114、WO05/044817，以及其它文献中进行了公开。所有引用文献的全部内容结合进来作为参考。
在一些实施方案中，本文中描述的化合物与丽眼达(restasis)(环孢霉素A)结合使用。本发明的化合物还可以用于提高T粘蛋白的产生和/或泪液的产生。因此，本发明的化合物除了降低炎症外还可以通过提高补偿一部分泪膜的粘蛋白的产生来提供附加的缓解。
已知LFA-1与ICAMs的相互作用参与各种自体免疫和炎症疾病，尤其是那些涉及淋巴细胞(T-或B-细胞)、树突状单环细胞的疾病，其中所述单环细胞将LFA-1表达在其表面上，它们是疾病的一部分炎症成分。LFA-1拮抗剂可以特别用于治疗这些疾病，因为治疗靶标在疾病组织内的表达被限制在免疫系统的浸润细胞内。LFA-1可以通过免疫系统的细胞而将炎症信号的黏着、迁移、增殖和释放阻断在周边组织内。对疾病组织内的炎症细胞具有效力的抗-LFA-1抗体，Raptiva可以用于治疗干眼症。
许多患有干眼症的病人可能也患有潜在的自体免疫疾病，金格伦综合症。目前认可的诊断标准包括临床病症和口干症状。本发明的化合物可以以漱口制剂或锭剂形式用于治疗该症状。结合了本发明化合物并混于固体或蜡状物质中的锭剂可以刺激唾液分泌，同时以持续释放的形式释放出化合物。
可以用本发明的化合物治疗患有免疫介导的过敏疾病，包括鼻炎的病人。例如，可将LFA-1拮抗剂局部输送至鼻、鼻管和/或鼻腔，以减少与免疫和/或过敏响应有关的炎症。
当对本发明化合物进行局部施用，经口或鼻输送作为雾状溶液或分散粉末的化合物时，其可以用于治疗哮喘或其它LFA-1介导的肺炎疾病。
本发明化合物的乳膏制剂可以用于将LFA-1拮抗剂局部输送至患有由LFA-1介导的皮肤病的皮肤处，所述皮肤病例如为湿疹和银屑病。可用于该问题的化合物包括LFA-1拮抗剂及其前药，所述前-药在用于炎性皮肤时转化为活性药物。将皮肤乳膏施用于眼睑外表面从而将LFA-1拮抗剂输送过眼睑而到达眼睑内衬和中间的结膜组织以及附属的泪腺处，人们希望使用这种乳膏来治疗LFA-1介导的眼睑和眼部炎症，尤其是治疗干眼症。
已知在动物研究中，LFA-1拮抗剂的口服制剂在系统水平下经口服途径施用时吸收性很差，则该制剂可以用以局部输送LFA-1拮抗剂，以用于治疗胃肠(GI)道的炎症疾病，包括克罗恩氏病和肠综合症，或者用于治疗由LFA-1或其它白细胞整联蛋白包括VLA4和Mac-1介导的其它GI疾病。
II.用于该方法中的化合物
A.定义
如本文中所用的，术语“脂肪族的”包括饱和和不饱和的、直链(非支链)或支链脂肪族烃，其任选被一个或多个官能团取代。本领域普通技术人员应该理解，本文中的“脂肪族的”意图包括但不限于烷基、链烯基、炔基部分。因此，如本文中所用的，术语“烷基”包括直链和支链烷基。类似的规则适用于其他同类的术语，例如“链烯基”、“炔基”等。
此外，如本文中所用的，术语“烷基”、“链烯基”、“炔基”等包括取代和未取代的基团。如本文中所用的，在某些实施方案中，“低级烷基”用于指示具有约1-6个碳原子的那些烷基(取代的、未取代的、支链的或非支链的)。
在某些实施方案中，本发明中所用的烷基、链烯基和炔基含有约1-20个脂肪族碳原子。在另外的某些实施方案中，本发明中所用的烷基、链烯基和炔基含有约1-10个脂肪族碳原子。在另外的其它实施方案中，本发明中所用的烷基、链烯基和炔基含有约1-8个碳原子。在进一步的其它实施方案中，本发明中所用的烷基、链烯基和炔基含有约1-6个碳原子。在另外的其它实施方案中，本发明中所用的烷基、链烯基和炔基含有约1-4个碳原子。因此，说明性脂肪族基团包括但不限于，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、烯丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、叔戊基、正己基、仲己基部分等，其同样可以含有一个或多个取代基。
链烯基包括但不限于，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基等。代表性的炔基包括但不限于乙炔基、2-丙炔基等。
如本文中所用的，术语“低级亚烷基”指与两个其它基团相连，即在两端分别与另一个基团键合的烃链，例如亚甲基、亚乙基、亚丁基等。这种取代基优选具有1-10个碳原子，更优选具有1-5个碳原子。这种基团可以被取代，优选被氨基、乙酰基氨基(通过氮原子键合的低级烷基羰基)取代，或者为环状低级烷基。后者意指饱和烃环，优选总计具有3-10个亚甲基(包括连接的碳)，更优选3-6个亚甲基。
如本文中所用的，术语“脂环的”指结合了脂肪族和环族化合物的性质的化合物，其包括但不限于单环或多环脂肪族烃和桥接环烷基化合物，其任选被一个或多个官能团取代。
本领域普通技术人员应该理解，本文中的“脂环的”意图包括但不限于环烷基、环链烯基和环炔基部分，其任选被一个或多个官能团取代。
因此，说明性的脂环族基团包括但不限于，例如环丙基、-CH2-环丙基、环丁基、-CH2-环丁基、环戊基、-CH2-环戊基、环己基、-CH2-环己基、环己烯基乙基、环己烷基乙基、降莰烷基部分等，其同样可以含有一个或多个取代基。
如本文中所用的，术语“烷氧基”或“烷基氧基”指贯穿氧原子的饱和或不饱和母体分子部分。在某些实施方案中，烷基含有约1-20个脂肪族碳原子。在另外的某些实施方案中，烷基含有约1-10个脂肪族碳原子。在另外的其它实施方案中，本发明中所用的烷基含有约1-8个脂肪族碳原子。在进一步的其它实施方案中，烷基含有约1-6个脂肪族碳原子。在进一步的其它实施方案中，烷基含有约1-4个脂肪族碳原子。
烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基、正己氧基等。
如本文中所用的，术语“低级烷氧基”指通过氧与另一个基团连接的如上定义的低级烷基(即，烷基醚)，同样如上面的定义该烷基可以为支链或非支链的。
如本文中所用的，术语“硫烷基”指通过硫原子与母体分子部分相连的饱和或不饱和(即，S-链烯基和S-炔基)基团。在某些实施方案中，烷基含有约1-20个脂肪族碳原子。在另外的某些实施方案中，烷基含有约1-10个脂肪族碳原子。在另外的其它实施方案中，本发明中所用的烷基含有约1-8个脂肪族碳原子。在进一步的其它实施方案中，烷基含有约1-6个脂肪族碳原子。在另外的其它实施方案中，烷基含有约1-4个脂肪族碳原子。硫烷基的例子包括但不限于甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、正丁硫基等。
如本文中所用的，术语“低级烷硫基“指通过二价硫原子键合的低级烷基，例如甲基巯基或异丙基巯基。低级亚烷基硫基意指在每个端基处键合的这种基团。
如本文中所定义的，术语“烷基氨基”指具有-NHR′结构的基团，其中R′为烷基。术语“氨基烷基”指具有NH2R′-结构的基团，其中R′如此处的定义。在某些实施方案中，烷基含有约1-20个脂肪族碳原子。在另外的某些实施方案中，烷基含有约1-10个脂肪族碳原子。在另外的其它实施方案中，本发明中所用的烷基含有约1-8个脂肪族碳原子。在进一步的其它实施方案中，烷基含有约1-6个脂肪族碳原子。在另外的其它实施方案中，烷基含有约1-4个脂肪族碳原子。烷基氨基的例子包括但不限于甲基氨基等。
本发明化合物的上述脂肪族(以及其它)部分的一些取代基的例子包括但不限于脂肪族；脂环族；杂脂肪族；杂环族；芳香族；杂芳香族；芳基；杂芳基；烷基芳基；杂烷基芳基；烷基杂芳基；杂烷基杂芳基；烷氧基；芳氧基；杂烷氧基；杂芳氧基；烷硫基；芳硫基；杂烷硫基；Rx独立地包括但不限于脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂烷基芳基或杂烷基杂芳基部分，其中上述和此处描述的任何脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、烷基芳基或烷基杂芳基取代基可以为取代或未取代的、支链或非支链的、饱和或不饱和的基团，而且其中上述和此处描述的任何芳基或杂芳基取代基可以为取代或未取代的基团。常用取代基的其它例子在本文所述实施例所显示的具体实施方案中进行了说明。
通常，如本文中所用的，术语“芳香族部分”指具有优选3-14个碳原子的稳定的单-或多环不饱和部分，每个环可以为取代或未取代的环。在某些实施方案中，术语“芳香族部分”指在每个环原子上具有垂直于环平面的p-轨道并且满足Huckel规则：其中环中的π电子数为(4n+2)(其中n为整数)的平面环。本文中将不满足一个或多个这些芳香性规则的单-或多环、不饱和部分定义为“非-芳香族的”，并且包括在术语“脂环族”中。
通常，如本文中所用的，术语“杂芳族部分”指具有优选3-14个碳原子的稳定的单-或多环不饱和部分，每个环可以为取代或未取代的环而且在环内的环碳原子位置处包括至少一个选自O、S和N的杂原子。在某些实施方案中，术语“杂芳香族部分”指包括至少一个杂原子、在每个环原子上具有垂直于环平面的p-轨道并且满足Huckel规则：其中环中的π电子数为(4n+2)(其中n为整数)的平面环。
应该理解，如本文中所定义的，芳香族和杂芳族部分可以通过烷基或杂烷基部分进行连接，因此其还包括-(烷基)芳香族、-(杂烷基)芳香族、-(杂烷基)杂芳族和-(杂烷基)杂芳族部分。因此，如本文中所用的，措辞“芳香族或杂芳族部分”和“芳香族、(杂烷基)芳香族、-(杂烷基)杂芳族和(杂烷基)杂芳族”是可以互换的。取代基包括但不限于之前提及的任何取代基，即针对脂肪族部分或本文中公开的其它部分所阐述的取代基，而且得到稳定的化合物。
如本文中所用的，术语“芳基”与该术语在本领域中的一般含义并没有显著差别，其指包括至少一个芳香族环的不饱和环部分。在某些实施方案中，“芳基”指具有一个或两个芳香族环的单-或双环碳环体系，其中所述芳香族环包括但不限于苯基苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。
如本文中所用的，术语“杂芳基”与该术语在本领域中的一般含义并没有显著差别，其指具有5-10个环原子的环芳族基团，其中环原子中的一个环原子选自S和N；0、1或2个环原子为另外的独立选自S和N的杂原子；剩余的环原子为为碳，该基团通过任何环原子连接在剩余分子上，例如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、硫苯基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基等。
应该理解，芳基和杂芳基(包括双环芳基)可以为未取代或取代的基团，其中的取代包括独立地以任意一个或多个下列部分代替基团上的一个或多个氢原子，所述部分包括但不限于：脂肪族；脂环族；杂脂肪族；杂环族；芳香族；杂芳香族；芳基；杂芳基；烷基芳基；杂烷基芳基；烷基杂芳基；杂烷基杂芳基；烷氧基；芳氧基；杂烷氧基；杂芳氧基；烷硫基；芳硫基；杂烷硫基；杂芳硫基；F；Cl；Br；I；-OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH；-CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(O)Rx；-C(O)N(Rx)2；-OC(＝O)Rx；-OCO2Rx；-OC(＝O)N(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx独立地包括但不限于脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族、杂芳族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂烷基芳基或杂烷基杂芳基，其中上述和此处描述的任何脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、烷基芳基或烷基杂芳基取代基可以为取代和未取代、支链或非支链、饱和或不饱和基团，而且其中上述和此处描述的任何芳香族、杂芳香族、芳基、杂芳基、-(烷基)芳基或-(烷基)杂芳基取代基可以为取代或未取代的基团。此外，应该理解，任何两个相邻的基团连接在一起可以代表4、5、6或7-元取代或未取代的脂环族-或杂环族部分。常用取代基的其它例子在本文所述实施例所显示的具体实施方案中进行了说明。
如本文中所用的，术语“环烷基”具体指具有3-7，优选3-10个碳原子的基团。适当的环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等，其在脂肪族、脂环族、杂脂肪族或杂环族部分的情况下可以任选被取代基取代，所述取代基包括但不限于脂肪族；脂环族；杂脂肪族；杂环族；芳香族；杂芳香族；芳基；杂芳基；烷基芳基；杂烷基芳基；烷基杂芳基；杂烷基杂芳基；烷氧基；芳基氧；杂烷氧基；杂芳基氧；烷基硫；杂芳基硫；F；Cl；Br；I；-OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH；-CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(＝O)Rx；-C(O)N(Rx)2；-OC(O)Rx；-OCO2Rx；-OC(O)N(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx独立地包括但不限于脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族、杂芳香族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂烷基芳基或杂烷基杂芳基，其中上述和此处描述的任何脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、烷基芳基或烷基杂芳基取代基可以为取代或未取代的、支链或非支链的、饱和或不饱和的基团，而且其中上述和此处描述的任何芳香族、杂芳香族、芳基或杂芳基取代基可以为取代或未取代的基团。常用取代基的其它例子在本文所述实施例所显示的具体实施方案中进行了说明。
如本文中所用的，术语“杂脂肪族”指主链上的一个或多个碳原子已被杂原子取代的脂肪族部分。因此，杂脂肪族基团指含有一个或多个代替碳原子的氧、硫、氮、磷或硅原子的脂肪族链。杂脂肪族部分可以为直链或支链，饱和或不饱和部分。在某些实施方案中，杂脂肪族部分上的一个或多个氢原子独立地被一个或多个包括但不限于下述基团的部分取代：脂肪族；脂环族；杂脂肪族；杂环族；芳香族；杂芳香族；芳基；杂芳基；烷基芳基；烷基杂芳基；烷氧基；芳基氧；杂烷氧基；杂芳基氧；烷硫基；芳硫基；杂芳硫基；F；Cl；Br；I；-OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH；-CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(＝O)Rx；-C(C＝O)N(Rx)2；-OC(＝O)Rx；-OCO2Rx；-OC(＝O)N(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中Rx在每次出现时独立地包括但不限于脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族、杂芳香族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂烷基芳基或杂烷基杂芳基，其中上述和此处描述的任何脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、烷基芳基或烷基杂芳基取代基可以为取代或未取代的、支链或非支链的、饱和或不饱和的基团，而且上述和此处描述的任何芳香族、杂芳香族、芳基或杂芳基取代基可以为取代或未取代的基团。常用取代基的其它例子在本文所述实施例所显示的具体实施方案中进行了说明。
如本文中所用的，术语“杂环烷基”、“杂环”或“杂环的”指结合了杂脂肪族和环化合物的性质的化合物，其包括但不限于具有5-16个原子的饱和和不饱和单-或多环环系，而且其中至少一个环原子为选自S和N的杂原子(其中氮和硫杂原子可以任选被氧化)，其中环系任选被一个或多个本文中定义的官能团取代。在某些实施方案中，术语“杂环烷基”、“杂环”或“杂环的”指其中至少一个环杂原子选自S和N(其中氮和硫杂原子可以任选被氧化)的非-芳香族5-、6-或7-元环或多环基团，其包括但不限于二-或三-基团，包括具有1-3个独立地选自氧、硫和氮的杂原子的稠合六元环，其中(i)每个5元环具有0-2个双键，每个6元环具有0-2个双键，每个7元环具有0-3个双键，(ii)氮和硫杂原子可以任选被氧化，(iii)氮杂原子可以任选被季铵化，和(iv)上面的任何杂环可以与芳环或杂芳环稠合。代表性的杂环包括但不限于杂环，例如呋喃基、吡喃基、吡咯基、噻吩基、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶子基、哌嗪基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑基、异噁唑烷基、二噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、四唑基、三唑基、噻三唑基、噻二唑基、噁二唑基、吗啉基、噻唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、二噻唑基、二噻唑烷基、四氢呋喃基，及其苯并稠合的衍生物。在某些实施方案中，使用“取代的杂环，或杂环烷基或杂环”基团，且如本文中所用的，其指上述定义的杂环，或杂环烷基或杂环基，环上的一个、两个或三个氢原子独立地被下述但并不限于此的基团取代：脂肪族；脂环族；杂脂肪族；杂环族；芳香族；杂芳香族；芳基；杂芳基；烷基芳基；杂烷基芳基；烷基杂芳基；杂烷基杂芳基；烷氧基；芳基氧；杂烷氧基；杂芳基氧；烷硫；芳基硫基；杂烷硫基；杂芳硫基；F；Cl；Br；I；-OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH；-CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(C＝O)Rx；-CC＝O)N(Rx)2；-OC(O)Rx；-OCO2Rx；-OC(＝O)N(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中Rx在每次出现时独立地包括但不限于脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族、杂芳香族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂烷基芳基或杂烷基杂芳基，其中上述和此处所述的任何脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、烷基芳基或烷基杂芳基取代基可以为取代或未取代的、支链或非支链的、饱和或不饱和的基团，而且其中上述和此处所述的任何芳香族、杂芳香族、芳基或杂芳基可以为取代或未取代的。此外，应该理解，上述和此处所述的任何脂环族或杂环族部分可以包括稠合在其上的芳基或杂芳基部分。
本文中所用的术语“卤代”和“卤素”选自氟、氯、溴和碘的原子。
术语“卤代烷基”意指连接有一个、两个或三个卤素原子的上述定义的烷基，其例如为这种基团：氯甲基、溴甲基、三氟甲基等。
如本文中所用的，术语“氨基”指伯(-NH2)、仲(-NHRx)、叔(-NRxRy)或季胺(-N+RxRyR2)，其中Ry和Rz独立地为本文中定义的脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族或杂芳香族部分。氨基的例子包括但不限于甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基、二乙基氨基羰基、异丙基氨基、哌啶子基、三甲基氨基和丙基氨基。
如本文中所用的，术语“酰基”指具有通式-C(＝O)R的基团，其中R为本文中定义的脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族或杂芳香族部分。
如本文中所用的，术语“磺酰氨基”指通式-SO2NRxRy的基团，其中Rx和Ry独立地为氢，或本文中定义的脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族、杂芳香族或酰基部分。
如本文中所用的，术语“苯甲酰氨基”指通式PhNRx的基团，其中Rx为氢，或本文中定义的脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳香族、杂芳族或酰基部分。
如本文中所用的，术语“C1-6亚烷基”指具有1-6个碳原子、在基团的两端都具有自由价“-”、仅由碳和氢原子组成的取代或未取代的、直链或支链的饱和二价基团。
如本文中所用的，术语“C2-6亚链烯基”指具有2-6个碳原子、在基团的两端都具有自由价“-”、仅由碳和氢原子组成的取代或未取代的、直链或支链的不饱和二价基团，而且其中的不饱和状态仅以双键形式存在，且双键可以存在于链的第一个碳原子和剩余分子之间。
如本文中所用的，术语“脂肪族”、“杂脂肪族”、“烷基”、“链烯基”、“炔基”、“杂烷基”、“杂链烯基”、“杂炔基”等包括取代和未取代的、饱和和不饱和的和直链和支链基团。类似地，术语“脂环族”、“杂环族”、“杂环烷基”、“杂环”等包括取代和未取代的和饱和和不饱和的基团。此外，术语“环烷基”、“环链烯基”、“环炔基”、“杂环烷基”、“杂环链烯基”、“杂环炔基”、“芳香族”、“杂芳香族”、“芳基”、“杂芳基”等包括被取代和未被取代基团。
如本文中所用的，术语“天然氨基酸”指在天然产生的蛋白质中发现的任何一种常见、天然产生的L-氨基酸：甘氨酸(GIy)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(VaI)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(He)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(GIu)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(GIn)、半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)。
如本文中所用的，术语“非天然氨基酸”指非天然氨基酸的所有氨基酸。其包括，例如α-、β-、D-、L-氨基酸残基，和下列通式的化合物：
Figure S2006800171884D00271
其中，侧链R不同于天然产生的氨基酸的侧链。
更通常，如本文中所用的，术语“氨基酸”包括天然氨基酸和非天然氨基酸。
如本文中所用的，术语“生物电子等排体”通常指拥有类似的分子形状和/或体积的两个或多个化合物或部分。在某些实施方案中，生物电子等排体具有大约相同的电子分布。在另外的某些实施方案中，生物电子等排体显示类似的生物学性质。在优选的实施方案中，生物电子等排体拥有类似的分子形状和体积；具有大约相同的电子分布；并且显示类似的生物学性质。
如本文中所用的，术语“药物可接受的衍生物”意指任何药物可接受的盐、酯或这种酯的盐、该化合物的盐，或施用于病人后能够提供(直接或间接)如本文中另外描述的化合物的任何其它加合物或衍生物，或其代谢物或剩余物。因此，除了其它物质之外，药物可接受的衍生物还包括前药。前药是通常能够显著降低药物活性的化合物衍生物，其含有在体内易于除去而产生作为药物活性物质的母体分子的另外部分。前药的例子是酯，其在体内裂解产生目标化合物。各种化合物和物质的前药以及衍生母体化合物产生前药的方法是已知的，而且可以用于本发明。下文中将详细讨论某些示例性药物组合物和药物可接受的衍生物。
如本文中所用的，术语“药物可接受的盐”指适于药物用途，优选适用于人和低级动物身体组织且没有不适当的疼痛、过敏反应等的那些盐。胺、羧酸和其它类型化合物的药物可接受的盐是本领域已知的。例如，S.M.Berge等在J Pharmaceutical Sciences，66：1-19(1977)中详细描述了药物可接受的盐，其在此结合进来作为参考。该盐可以在本发明化合物的最后分离和纯化过程中就地制备，或者如下文中总述的，通过使游离碱或游离酸的官能团与适当的试剂反应而单独制备。例如，游离碱官能团可以与适当的酸反应。此外，当本发明的化合物带有酸性部分时，其适当的药物可接受的盐可以包括金属盐，例如碱金属盐，如钠或钾盐；和碱土金属盐，如钙或镁盐。药物可接受的无毒酸加合盐的例子为氨基与无机酸形成的盐，所述无机酸例如为盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，或与有机酸形成的盐，所述有机酸例如为醋酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、丙二酸，或利用本领域采用的其它方法，例如离子交换法制备的盐。其它药物可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、硫氢酸盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、栉酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁盐等。其它药物可接受的包括，如果适当，无毒铵盐、季铵盐，和使用抗衡离子形成的胺阳离子，所述抗衡离子例如为卤化物离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、磺酸根和芳基磺酸根。
如本文中所用的，术语“药物可接受的酯”指在体内发生水解的酯，其包括那些在人体内容易分解释放出母体化合物或其盐的酯。适当的酯包括例如衍生自药物可接受的脂肪族醇化合物，尤其是烷醇、链烯醇、乙二醇、环烷醇等，其中每个烷基或链烯基部分有利地具有不大于6个的碳原子。这些物质只是示范，并不以任何方式限制本领域已知的酯的使用可能性。
如本文中所用的，术语“药物可接受的前药”指适于药物用途的本发明化合物的那些前药，优选用于人和低级动物的身体组织并且没有不当的毒性、疼痛、过敏反应等，而且对于意图的用途而言是有效的，以及如果可能的话指本发明化合物的两性离子形式。术语“前药”指在体内迅速转化得到上式的母体化合物的化合物，例如通过在血液中水解进行转化。T.Higuchi和V.Stella，Pro-drugs as Novel DeliverySystems，A.C.S.专题论文集系列14卷，和Edward B.Roche，ed.，Bioreversible Carriers in Drug Design，American PharmaceuticalAssociation and Pergamon Press，1987中提供了透彻的论述，该两篇文献据此结合进来作为参考。
B.该方法的示例化合物
在一个实施方案中，可用于本发明的方法中的化合物包括式I化合物：
Figure S2006800171884D00301
式I
其中，R1和R2彼此独立地为氢、氨基酸侧链、-(CH2)mOH、-(CH2)m芳基、-(CH2)m杂芳基，其中m为0-6、-CH(R1A)(OR1B)、-CH(R1A)(NHR1B)、U-T-Q，或任选被U-T-Q取代的脂肪族、脂环族、杂脂肪族或杂脂环族部分；其中U可以为不存在或下列之一：-O-、-S(O)0-2-、-SO2N(R1A)、-N(R1A)-、-N(R1A)C(＝O)-、-N(R1A)C(＝O)-O-、-N(R1A)C(＝O)-N(R1B)-、-N(R1A)-SO2-、-C(＝O)-、-C(O)-O-、-O-C(＝O)-、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、-C(＝O)-N(R1A)-、-OC(＝O)N(R1A)、-C(＝N-R1E)-、-C(＝N-R1E)-O-、-C(＝N-R1E)-N(R1A)-、-O-C(＝N-R1E)-N(R1A)-、-N(R1A)C(＝N-R1E)-、-N(R1A)C(＝N-R1E)-O-、-N(R1A)C(＝N-R1E)-N(R1B)-、-P(＝O)(OR1A)-O-或-P(O)(R1A)-O-；其中T为不存在，或脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分；Q为氢、卤素、氰基、异氰酸酯、-OR1B；-SR1B；-N(R1B)2、-NHC(＝O)OR1B、-NHC(＝O)N(R1B)2、-NHC(＝O)R1B、-NHS O2R1B、NHSO2N(R1B)2、-NHSO2NHC(＝O)OR1B、-NHC(＝O)NHSO2R1B、-C(＝O)NHC(＝O)OR1B、C(＝O)NHC(＝O)R1B、-C(＝O)NHC(＝O)N(R1B)2、-C(＝O)NHSO2R1B、-C(＝O)NHSO2N(R1B)2、C(＝S)N(R1B)2、-SO2R1B、-SO2OR1B、-SO2N(R1B)2、-SO2-NHC(＝O)OR1B、-OC(＝O)-N(R1B)2、-OC(＝O)R1B、-OC(＝O)NHC(＝O)R1B、-OC(＝O)NHSO2R1B、-OSO2R1B，或脂肪族杂脂肪族、芳基或杂芳基部分，或其中R1和R2连接在一起为脂环族或杂环族部分，或一起为
Figure S2006800171884D00311
其中，R1A和R1B每次出现时独立地为氢、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分、-C(＝O)R1C，或-C(＝O)NRICR1D；其中R1C和R1D每次出现时独立地为氢、羟基或脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分；和R1E为氢、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分、-CN、-OR1C、-NR1CR1D或-SO2R1C；
其中R3为-C(＝O)OR3A、-C(＝O)H、-CH2OR3A、-CH2OC(＝O)-烷基、-C(＝O)NH(R3A)、-CH2X0；其中R3A每次出现时独立地为氢、保护基团、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂烷基芳基、杂烷基杂芳基部分，或药物可接受的盐或酯，或者R3A与R1和R2连接在一起形成杂环族部分；其中X0为选自F、Br或I的卤素；
R4每次出现时独立地为氢、卤素、-CN、-NO2、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分，或为GRG，其中G为-O-、-S-、NRG2-、-CO-、-SO-、-SO2-、C(＝O)O-、-C(＝O)NRG2-、C(＝O)-、-NRG2C(＝O)-或-SO2NRG2-，和RG1和RG2独立地为氢、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分；
n为0-4的整数；
AR1为单环或多环芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、脂环族或杂环族部分；
按照价态允许的情况，A、B、D和E通过单键或双键连接；其中A、D和E每次出现时独立地为C＝O、CRiRii、NRi、CRi、N、O、S、-S(＝O)或SO2；其中Ri每次出现时独立地为氢、卤素、-CN、-NO2、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分，或者为-GRG1，其中，G为-O-、-S-、-NRG2、-CO-、-SO-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRG2-、-OC(＝O)-、-NRG2C(＝O)-或-SO2NRG2-，和RG1和RG2独立地为氢、脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分，或任意两个相邻基团连接在一起代表脂环族、杂脂环族、芳基、或杂芳基部分；
p为0-4的整数；和
L为不存在或V-W-X-Y-Z，其中V、W、X、Y和Z每次出现时独立地为不存在、C＝O、NRL1、-O-、-C(RL1)＝、＝C(RL1)-、-C(RL1)(RL2)、C(＝N-ORL1)、C(＝NRL1)、-N＝、S(O)0-2；取代或未取代的C1-6亚链烯基(alkenylidene)或C2-6亚链烯基(alkenylidine)链，其中最多两个不相邻亚甲基单元独立地任选被下述基团代替：-C(＝O)-、-CO2-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(C＝O)NRL3-、-OC(＝O)、-OC(＝O)NRL3-、-NRL3NRL4-、-NRL3NRL4C(＝O)-、-NRL3C(＝O)-、NRL3CO2-、NRL3C(＝O)NRL4-、-S(＝O)-、-SO2-、-NRL3SO2-、-SO2NRL3、-NRL3SO2NRL4、-O-、-S-，或-NRL3-；其中RL3和RL4每次出现时独立地为氢、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基或酰基；或脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分；RL1和RL2每次出现时独立地为氢、羟基、被保护的羟基、氨基、被保护的氨基、硫代、被保护的硫代基团、卤素、氰基、异氰酸酯、羧基、羧烷基、甲酰基、甲酰氧基、叠氮基、硝基、脲基、硫脲基、硫氰基、烷氧基、芳氧基、巯基、亚磺酰氨基、苯甲酰氨基、甲苯磺酰基，或脂肪族、脂环族、杂脂肪族、杂脂环族、芳基、杂芳基、烷基芳基或烷基杂芳基部分，或其中的一个或多个RL1和RL2连接在一起，或者与V、W、X、Y或Z之一连接在一起形成脂环族或杂环族部分或形成芳基或杂芳基部分。
本发明方法的一些优选实施方案为式II化合物：
Figure S2006800171884D00331
其中，R28为下列基团之一：
Figure S2006800171884D00333
或
Figure S2006800171884D00334
且R27为下列基团之一：
Figure S2006800171884D00335
Figure S2006800171884D00336
或
Figure S2006800171884D00337
式II
且R29为氢、药物可接受的盐或酯。
本发明的一些优选实施方案为II′化合物
Figure S2006800171884D00341
式II′
其中的取代情况如式II中所示。
本发明方法的化合物的一些特别优选的实施方案为式IIA、IIB和IIC的化合物：
Figure S2006800171884D00342
式IIA
其中各自的R17可以各自选自氢、药物可接受的盐和酯。
本发明方法的化合物的另一组优选实施方案为式III化合物：
Figure S2006800171884D00351
式III
其中，Cy为任选被下述基团取代的芳香族碳环、芳香族杂环或非-芳香族碳环或杂环：羟基(-OH)、巯基(-SH)、硫烷基、卤素(例如，F、Cl、Br、I)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氨基、氨基烷基、脒基(-C(NH)-NH2)、胍基(-NH2-C(NH)-NH2)、硝基、烷基或烷氧基。在特殊的实施方案中，Cy为3-5元环。在优选的实施方案中，Cy为任选被羟基、巯基、卤素(优选F或Cl)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氨基、脒基、胍基、硝基、烷基或烷氧基取代的5或6元非芳香族杂环。在更优选的实施方案中，Cy为任选被羟基、氧代、硫代、Cl、C1-4烷基(优选甲基)或C1-4烷酰基(优选乙酰基、丙酰基或丁酰基)取代的5元非芳香族杂环。更优选，该非芳香族杂环包括一个或多个杂原子(N、O或S)，并且任选被羟基、氧代、巯基、硫代、甲基、乙酰基、丙酰基或丁基取代。在特殊的实施方案中，该非芳香族杂环包括至少一个任选被甲基或乙酰基取代的氮原子。在特别优选的实施方案中，该非-芳香族杂环选自下组：哌啶、哌嗪、吗啉、四氢呋喃、四氢噻吩、噁唑烷、噻唑烷，其任选被羟基、氧代、巯基、硫代、烷基或烷酰基取代。在最优选的实施方案中，Cy为选自下组的非-芳香族杂环：四氢呋喃-2-基、噻唑烷-5-基、噻唑烷-2-酮-5-基和噻唑烷-2-硫酮-5-基和环丙烷吡咯烷。在优选的实施方案中，Cy为任选被羟基、巯基、卤素(优选F或Cl)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氨基、脒基、胍基、硝基、烷基或烷氧基取代的5或6元芳香族碳环或杂环。在更优选的实施方案中，Cy为任选被羟基、氧代、硫代、Cl、C1-4烷基(优选甲基)或C1-4烷酰基(优选乙酰基、丙酰基或丁酰基)取代的5元芳香族碳环或杂环。更优选，芳香族或杂环包括一个或多个杂原子(N、O或S)，并且任选被羟基、氧代、巯基、硫代、甲基、乙酰基、丙酰基或丁基取代。
在另一个优选的实施方案中，Cy为任选被羟基、巯基、卤素、氧代、硫代、氨基、脒基、胍基、烷基、烷氧基或酰基取代的3-6元碳环。在一个具体的实施方案中，碳环为饱和或部分不饱和环。在一个具体的实施方案中，Cy为选自下组的碳环：环丙基、环丙烯基、环丁基、环丁烯基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基。
X2为任选具有一个或多个被N、O、S、SO或SO2代替的碳原子并且任选被羟基、巯基、卤素、氨基、氨基烷基、硝基、氧代或硫代取代的C1-5二价烃连接基团。在优选的实施方案中，X2具有至少一个碳原子。经代替和取代可以在烃链内或在各端或两端处形成酰胺部分(-NRC(＝O)-或-C(＝O)NR-)。其它部分包括氨磺酰基(-NRSO2-或-SO2NR)、酰基、醚、硫醚和胺。在特别优选的实施方案中，X2为基团-CH2-NR10-C(O)-，其羰基-C(O)-部分与Cy相邻(即，共价键合)，且R10为烷基，即甲基，更优选为H。
K为任选被羟基、巯基、卤素、氧代、硫代、烃、卤素-取代的烃、氨基、脒基、胍基、氰基、硝基、烷氧基或酰基取代的碳环或杂环。在具体的实施方案中，K为任选被卤素、羟基取代的芳基或杂芳基。在特别优选的实施方案中，K为被卤素(优选Cl)或羟基取代的苯基、呋喃-2-基、噻吩-2-基、苯基，优选在间位取代。
L2为具有一个或多个被N、O、S、SO或SO2代替的碳原子并且任选被羟基、卤素、氧代、或硫代取代的二价烃；或者该烃的三个碳原子被氨基酸残基代替。优选L2的长度为小于10个原子，更优选为5或更小，最优选长度为5或3个原子。在特别优选的实施方案中，L2选自下组：-CH＝CH-C(O)-NR-CH2-、-CH2-NR10-C(O)-、-C(O)-NR10-CH2-、-CH(OH)-(CH2)2-、-(CH2)2-CH(OH)-、-(CH2)3-、-C(O)-NR10-CH(R7)-C(O)-NR10-、-NR10-C(O)-CH(R16)-NR10-C(O)-、-CH(OH)-CH2-O-和-CH(OH)-CF2-CH2-，其中每个R10独立地为H或烷基，R16为氨基酸侧链。优选的氨基酸侧链包括非天然形成的侧链，例如苯基，或者天然形成的侧链。优选的侧链为选自Phe、Tyr、Ala、GIn和Asn的侧链。在优选的实施方案中，L2为-CH＝CH-C(O)-NR10-CH2-，其中，其-CH＝CH-部分与K相邻(即，共价键合)。在另一个优选的实施方案中，L2为-CH2-NR10-C(O)-，其中，其亚甲基部分(-CH2-)与K相邻。
R5为H、OH、氨基、O-碳环或任选被氨基、碳环、杂环取代的烷氧基，或药物可接受的盐或酯。在优选的实施方案中，R5为H、苯基或任选被碳环，例如苯基取代的C1-4烷氧基。在特别优选的实施方案中，R5为H。在另一个特别优选的实施方案中，R5为甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、苯氧基或苄氧基。在又一个特别优选的实施方案中，R5为NH2。在特别优选的实施方案中，R5为乙氧基。在另一个特别优选的实施方案中，R5为异丁氧基。在另一个特别优选的实施方案中，R5为被氨基取代的烷氧基，所述氨基例如为2-氨基乙氧基、N-吗啉代乙氧基、N，N-二烷基氨基乙氧基、季铵羟基烷氧基(例如，三甲基铵羟基乙氧基)。
R6-9独立地为H、羟基、巯基、卤素、氰基、氨基、脒基、胍基、硝基或烷氧基；或R7和R8在一起形成任选被羟基、卤素、氧代、硫代、氨基、脒基、胍基或烷氧基取代的稠合碳环或杂环。在一个特殊的实施方案中，R6和R7独立地为H、F、Cl、Br或I。在另一个特殊的实施方案中，R8和R9均为H。在另一个特殊的实施方案中，R6和R7之一为卤素，而另一个为氢或卤素。在特别优选的实施方案中，R7为Cl而R6、R8和R9各自为H。在另一个特别优选的实施方案中，R6和R7均为Cl而R8和R9均为H。
R10为H或任选被碳环或杂环取代的烃链。在优选的实施方案中，R10为H或烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。在具体的实施方案中，R10为H。
本发明方法的进一步优选的实施方案为式IV的化合物：
Figure S2006800171884D00381
式IV
其中，R11为下式基团
Figure S2006800171884D00382
其中，A为氢、羟基、氨基或卤素，B为氨基、羧基、氢、羟基、氰基、三氟甲基、卤素、低级烷基，或低级烷氧基；
R12为下式基团：
Figure S2006800171884D00391
其中，R13为氢、羧基或低级烷基；n为0或1；U2、V2和W2独立地为氢、卤素或低级烷基，条件是U2和V2不都为氢；X3为羰基、苯基-取代的低级亚烷基、亚氨基、取代的亚氨基或磺酰基；Y2为低级亚烷基，其可以被一个或多个氨基、取代的氨基、低级烷基或环低级烷基取代，或Y2为低级亚链烯基或低级亚烷基硫基；
k为0或1；当k为1时，Z2为氢、低级烷硫基、-COOH、-CONH2、氨基；当k为0或1时，Z2为1-金刚烷基、二苯基甲基、3-[[(5-氯代吡啶-2-基)氨基]羰基]吡嗪-2-基、羟基、苯基甲乙÷氧基、2-氯-4-[[[(3-羟基苯基)甲基]氨基]羰基]苯基、[2，6-二氯苯基)甲氧基]苯基；此外，当k为0或1时，Z2可以为含有0-3个相同或不同的杂原子的环烷基或芳基，或者为含有2或3个环的稠合环系，该环可以独立地为含有0-3个相同或不同的杂原子的环烷基或芳基，任何一个环可以为未取代的，或被至少下列之一取代：卤素、氰基、氨基、取代的氨基、氨基磺酰基、硝基、氧代、羟基、芳基、芳氧基、未取代的低级烷基、卤素取代的低级烷基、低级烷氧基取代的低级烷基、低级烷氧基、低级烷磺酰基、低级烷硫基、乙酰基、氨基羰基、肼基、羧基、烷氧基羰基、乙酰氧基、或者还可以被氨基低级烷基取代；R20为氢、药物可接受的盐或酯。
式IV化合物的优选实施方案具有式指示的立体化学结构：
式IV’
本发明方法的化合物的另一组优选实施方案为式V化合物：
Figure S2006800171884D00402
式V
其中，R14为下式基团：
Figure S2006800171884D00403
Figure S2006800171884D00404
或
Figure S2006800171884D00405
其中，R15为氢、羧基或低级烷基；U3、V3和W3独立地为氢、卤素；或U3、V3和W3为低级烷基，条件是U3和V3不都为氢；X4为羰基、苯基取代的低级亚烷基、亚氨基，包括氰基，或磺酰基的取代的亚氨基；Y3为低级亚链烯基、低级亚烷基硫基，或为低级亚烷基，其可以被氨基、乙酰基氨基、或环低级烷基取代；
k2为0或1；当k2为1时，Z为氢、低级烷基硫基、-COOH、-T-CONH2-或氨基；当k2为0或1时，Z3为1-金刚烷基、二苯基甲基、3-[[(5-氯吡啶-2-基)氨基]羰基]吡嗪-2-基；当k2为0或1时，Z可以为含有0-3个相同或不同的杂原子的环烷基或芳基，或者为含有2或3个环的稠合环系，其中该环独立地为含有0-3个相同或不同的杂原子的环烷基或芳基，其中任何一个环都可以为未取代的，或者被至少下列之一取代：卤素、氰基、氨基、取代的氨基、氨基磺酰基、硝基、氧代、羟基、芳基、芳氧基、未取代的低级烷基、卤素-取代的低级烷基、低级烷氧基-取代的低级烷基、低级烷氧基、羧基、烷氧基羰基或乙酰氧基；和，
R21为氢、其药物可接受的盐或酯。
式V化合物的优选实施方案中具有式V所指示的立体化学：
Figure S2006800171884D00411
式V’
该方法的另一类优选化合物由式VI代表
Figure S2006800171884D00421
式VI
其中，D4为单-、二-或三环饱和、不饱和，或芳香族环，每个环的环中具有5-、6-或7个原子，其中环内的原子为碳或为1-4个选自氮、氧和硫的杂原子，其中，任何碳或硫原子可以任选被氧化，每个环被0-3个R31取代；L3为选自下列基团的二价连接基团
-L3-L2-L1-，
-L4-L3-L2-L1-，和
-L5-L4-L3-L2-L1-，
其中，L1选自氧代(-O-)、S(O)3、C(＝O)、CR32、R32、CR32 het、NR30和N，
L2选自氧代(-O-)、S(O)3、C(＝O)、C(＝N-O-R33)、CR34R34′、CR34、het NR30和N，
L3选自氧代(-O-)、S(O)3、C(＝O)、C(＝N-O-R33)、CR35R35′、CR35、het NR30和N，
L4为不存在，或选自氧代(-O-)、S(O)3、C(＝O)、C(＝N-O-R33)、CR36R36′、CR36、NR30和N，
L5为不存在，或选自氧代(-O-)、S(O)3、C(＝O)、CR37R37′、CR37、NR30和N，条件是L1-L3中只有一个可以为het，而且当L1-L3之一为het时，L1-L5中的另一个可以为不存在，
其中，
R32、R32′、R34、R3 4′、R35、R35′、R36、R36′、R37和R37′各自独立地选自R38、R39和U-Q-V-W，
任选地，R24和R34′独立地或者一起可以通过位于B上的取代基RP而与B3形成饱和、不饱和或芳香族稠合环，该稠环在环中含有5、6或7个原子，并且任选含有1-3个选自O、S和N的杂原子，其中，任何S或N可以任选被氧化；任选地，R35和R35独立地或者一起，R36和R36′独立地或者一起可以通过位于D3上的取代基R31而与D3形成饱和、不饱和或芳香族稠环，该稠环的环中含有5、6或7个原子，并且任选含有1-3个选自O、S和N的杂原子，其中，任何S或N可以任选被氧化，同样任选地，每个R32-R37、NR30或L1-L5中的N与任何其它的R32-R37、NR30或L1-L5中的N一起可以形成5、6或7元饱和、不饱和的同素-或杂环或芳香族，其任选含有1-3个另外的，选自N、O和S的杂原子，其中，任何碳或硫原子可以任选被氧化，每个环被0-3个R31取代；其中，s为0-2；B选自下列基团
Figure S2006800171884D00431
和
Figure S2006800171884D00432
其中
其为含有5、6或7个原子的稠合杂或同素环，该环为不饱和、部分饱和或芳香族环，杂原子选自1-3个O、S和N，
Y3选自CH和NR30；n为0-3；
G3选自氢和C1-C6烷基，任选G与T一起可以形成任选被-V-W取代的C3-C6环烷基；
T3选自天然形成的α-氨基酸侧链，和U4-Q4-V4-W4；
U4为选自下列的任选被取代的二价基团：
C1-C6烷基、C0-C6烷基-Q、C2-C6链烯基-Q，和C2-C6炔基-Q：
其中，任何烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38；
Q4为不存在或选自下列基团：
-O-、-S(O)s-、-SO2-N(R30)-、-N(R30)-、-N(R30)-C(＝O)-、-N(R30)-C(＝O)-N(R30)-、-N(R30)-C(＝O)-O-、-N(R30)-SO2-、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-het-、-C(＝O)-N(R30)-、-O-C(＝O)-N(R30)-、-PO(OR30)O-和-P(O)O-；
其中，
s为0-2，且
het为单-或双环的5、6、7、9或10元杂环，每个环含有1-4个选自N、O和S的杂原子，其中杂环可以为饱和、部分饱和或芳香族环，而且任何N或S任选被氧化，该杂环被0-3个R41取代；
V4为不存在，或为选自C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C0-C6烷基-C6-C10芳基和C0-C6烷基-het的任选取代的二价基团；
其中，任何烷基上的取代基为1-3个R38，而且任何芳基或het上的取代基为1-3个R31；
W4选自下列基团：
氢、OR33、SR42、NR30R30、NH-C(＝O)-O R43、NH-C(＝O)-NRnRn，NH-C(＝O)-R43、NH-SO2-R37、NH-SO2-NR30R30、NH-SO2-NH-C(＝O)-R43、NH-C(＝O)-NH-SO2-R37、C(＝O)-NH-C(＝O)-O-R43、C(＝O)-NH-C(＝O)-R43、C(＝O)-NH-C(＝O)-NR30R30′、C(＝O)-NH-SO2-R37、C(＝O)-NH-SO2-NR30R30′、C(＝S)-NR30R30′、SO2-R37、SO2-O-R37、SO2-NR37R37′、SO2-NH-C(＝O)-O-R43、SO2-NH-C(＝O)-NR30R30′、SO2-NH-C(＝O)-R43、O-C(＝O)-NR30R30′、O-C(＝O)-R43、O-C(＝O)-NH-C(＝O)-R43、O-C(＝O)-NH-SO2R46和O-SO2-R37；
R44选自C(＝O)-R45、C(＝O)-H、CH2(OH)和CH2O-C(＝O)-C1-C6烷基；
R38为被1-3个R38′取代的R38’或R38″；其中，
R38′选自下列基团：
氢、卤代(F、Cl、Br、I)、氰基、异氰酸酯、羧基、羧基-C1-C11烷基、氨基、氨基-C1-C8烷基、氨基羰基、羧酰胺基、氨基甲酰基、氨基甲酰氧基、甲酰基、甲酰氧基、叠氮基、硝基、咪唑基、脲基、硫脲基、硫氰基、羟基、C1-C6烷氧基、巯基、亚磺酰氨基、het、苯氧基、苯基、苯甲酰氨基、甲苯磺酰基、吗啉代、吗啉基、哌嗪基、哌啶基，吡咯啉基、咪唑基和吲哚基；
R38″选自下列基团
C0-C10烷基-Q-C0-C6烷基、C0-C10链烯基-Q-C0-C6烷基、C0-C10炔基-Q-C0-C6烷基、C3-C11环烷基-Q-C0-C6烷基、C3-C10环链烯基-Q-C0-C6烷基、C1-C6烷基-C6-C12芳基-Q-C0-C6烷基、C6-C10芳基-C1-C6烷基-Q-C0-C6烷基、C0-C6烷基-het-Q-C0-C6烷基、C0-C6烷基-Q-het-C0-C6烷基、het-C0-C6烷基-Q-C0-C6烷基、C0-C6烷基-Q-C6-C12芳基和-Q-C1-C6烷基；
R43选自氢和取代或未取代的C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C2-C10炔基、C3-C11环烷基、C3-C10环链烯基、C1-C6烷基-C6-C12芳基、C6-C10芳基-C1-C6烷基、C1-C6烷基-het、het-C1-C6烷基、C6-C12芳基和het，
其中，任何烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38，任何芳基或het上的取代基为1-3个R31；
R31选自R40和R41；
R41选自下列基团：
OH、OCF3、OR43、SR42、卤代(F、Cl、Br、I)、CN、异氰酸酯、NO2、CF3、C0-C6烷基-NR30 R30′、C0-C6烷基-C(＝O)-NR30R30′、C0-C6烷基-C(＝O)-R38、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、C3-C6环烷基、C3-C6环链烯基、C1-C6烷基苯基、苯基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基羰基、苯基C0-C6烷氧基、C1-C6烷基-het、het-C1-C6烷基、SO2-het、-O-C6-C12芳基、-SO2-C6-C12芳基、-SO2-C1-C6烷基和het，其中任何烷基、链烯基或炔基可以任选被1-3个选自OH、卤代(F、Cl、Br、I)、硝基、氨基和氨基羰基的基团取代，而且任何芳基或het上的取代基为1-2个羟基、卤代(F、Cl、Br、I)、CF3、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、硝基和氨基；
R42选自S-C1-C6烷基、C(＝O)-C1-C6烷基、C(＝O)-NR30R30′、C1-C6烷基、卤代(F、Cl、Br、I)-C1-C6烷基、苄基和苯基；
R30选自下列基团：R43、NH-C(＝O)-O-R43、NH-C(＝O)-R43、NH-C(＝O)-NHR43、NH-SO2-R46、NH-SO2-NH-C(＝O)-R43、NH-C(＝O)-NH-SO2-R37、C(＝O)-O-R43、C(＝O)-R43、C(＝O)-NHR43、C(＝O)-NH-C(＝O)-O-R43、C(＝O)-NH-C(＝O)-R43、C(＝O)-NH-SO2-R46、C(＝O)-NH-SO2-NHR37、SO2-R37、SO2-O-R37、SO2-N(R43)2、SO2-NH-C(＝O)-O-R43、SO2-NH-C(＝O)-O-R43和SO2-NH-C(＝O)-R43；
R30′选自氢、羟基和取代或未取代的C1-C11烷基、C1-C11烷氧基、C2-C10链烯基、C2-C10炔基、C3-C11环烷基、C3-C10环链烯基、C1-C6烷基-C6-C12芳基、C6-C10芳基-C1-C-6烷基、C6-C10芳基-C0-C6烷氧基、C1-C6烷基-het、het-C1-C6烷基、C6-C12芳基、het、C1-C6烷基羰基、C1-C8烷氧基羰基、C3-C8环烷基羰基、C3-C8环烷氧基羰基、C6-C11芳氧基羰基、C7-C11芳基烷氧基羰基、杂芳基烷氧基羰基、杂芳基烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳基烷基磺酰基、杂芳基磺酰基、C1-C6烷基磺酰基、和C6-C10芳基磺酰基，其中任何烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38，而且任何芳基、het或杂芳基上的取代基为1-3个R31；
R30和R30′与相连的氮一起可以形成任选取代的杂环，所述杂环选自吗啉基、哌嗪基、硫吗啉基、吡咯烷基、咪唑烷基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、1，2，3，4-四氢-喹啉基、1，2，3，4-四氢异喹啉基、噻唑烷基和氮杂二环壬基，其中的取代基为1-3个R38；R33选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基、C1-C6烷基羰基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基和苯甲酰基，其中任何烷基上的取代基为1-3个R38，而且任何芳基上的取代基为1-3个R40；
R40选自下列基团：OH、卤代(F、Cl、Br、I)、CN、异氰酸酯、OR43、SR42、SOR43、NO2、CF3、R43、NR30R30′、NR30C(＝O)-O-R43、NRC(＝O)-R43、C0-C6烷基-SO2-R43、C0-C6烷基-SO2-NR30R30′、C(＝O)-R43、O-C(＝O)-R43、C(＝O)-O-R43和C(＝O)-NR30R30′，其中任何烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38，而且任何芳基上的取代基为1-3个R31；
R46为取代或未取代的、选自下列的基团：
C1-C8烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烷基、C3-C6环链烯基、C0-C6烷基苯基、苯基-C0-C6烷基、C0-C6烷基-het和het-C0-C6烷基，
其中，任何烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38，而且任何芳基或het上的取代基为1-3个R31；
R45为取代或未取代的、选自下列的基团：羟基、C1-C11烷氧基、C3-C12环烷氧基、C8-C12芳烷氧基、C8-C12芳环烷氧基、C6-C10芳氧基、C3-C10烷基羰氧基烷氧基、C3-C10烷氧基羰氧基烷氧基、C3-C10烷氧基羰基烷氧基、C5-C10环烷基羰氧基烷氧基、C5-C10环烷氧基羰氧基烷氧基、C5-C10环烷氧基羰基烷氧基，C8-C12芳氧基羰基烷氧基、C8-C12芳氧基羰氧基烷氧基、C8-C12芳基羰氧基烷氧基、C5-C10烷氧基烷基羰氧基烷氧基、(R30)(R30)N(C1-C10烷氧基)-，
Figure S2006800171884D00471
Figure S2006800171884D00472
和
Figure S2006800171884D00473
其中，任何烷基、链烯基或炔基上的取代基为1-3个R38，而且任何芳基或het上的取代基为1-3个R31，及其药物可接受的盐。
式I-VI的化合物还包括药物可接受的盐，和包括式I-VI的前药化合物的酯，其中，R3A、R5R10、R17、R18、R19、R20、R21、R29和R44上的羧酸酯可以为低级烷基或-CH2CH2-R22，其中R22为下列基团之一：
Figure S2006800171884D00481
或
其中，R23为氢或甲基，R24为低级烷基或低级环烷基。
式VI化合物的优选实施方案具有式VI′所指示的立体化学。
Figure S2006800171884D00484
式VI’
本文中描述的一些化合物可以包括一个或多个不对称中心，因此其可以包括单独的立体异构体、单独的非对映体及其任意的混合物。此外，本发明的化合物可以含有双键的几何异构体，包括Z和E异构体，而且可以作为纯的几何异构体或其混合物存在。
在一些优选实施方案中，本发明的方法采用下列化合物或其药物可接受的盐或酯来实施：
本发明的化合物包括下列化合物或其药物可接受的盐或酯：
Figure S2006800171884D00501
Figure S2006800171884D00511
Figure S2006800171884D00521
Figure S2006800171884D00531
本发明的化合物可以通过本领域熟练技术人员公知的方法制备，并且可以以多种方式纯化，包括在不同条件下结晶或沉积得到一种或多种多晶型物。因此，本发明包括上述发明的化合物、其多晶型物、其药物可接受的盐、其药物可接受的溶剂化物，及含有这些物质的药物可接受的组合物。
本发明的化合物可以通过本领域熟练技术人员公知的方法制备，并且可以以多种方式纯化，包括在不同条件下经结晶或沉积而得到一种或多种多晶型物。因此，本发明包括上述发明的化合物、其多晶型物、其药物可接受的盐、其药物可接受的溶剂化物，及含有这些物质的药物可接受的组合物。
上述优选实施方案的例子意图说明一些潜在的治疗试剂，并不意图以任何方式限制发明。本发明的方法可以采用抗体、抗体片断、肽和其它合成分子来实施，从而用来治疗干眼病，其中所述其它合成分子为采用上述的确定治疗试剂的方法可以确定的分子，其中上述确定方法确定的治疗试剂为针对LFA-1和ICAM-I相互作用的选择性的、有效的和直接的竞争性抑制剂。
本发明还提供了使用本发明中描述的化合物和诊断及治疗方法的商业方法。一种商业方法包括确定肽或小分子的LFA-1拮抗性质，和研发治疗由LFA-1介导的疾病的方法，优选通过局部输送的方式进行治疗。由于未对该化合物进行系统给药，因此这些药物的系统药物代谢动力学特征通常并未确定，因而针对可用于研发的药物的试验对象群是庞大的。在一个实施方案中，将LFA-1拮抗剂研制成眼用制剂，之后再改进并销售出去以用于治疗眼病，例如干眼症。Hut78试验通常用于确定LFA-1的拮抗性质。除了LFA-1的拮抗性质之外，还可以确定白细胞的拮抗性质。
III.给药
本发明的方法可以采用许多适当的给药方式，用以输送本文中描述的方法的LFA-1拮抗剂。可以通过局部或系统给药来实现药物至受影响的身体区域的输送。适当的制剂和附加载体在Remington“TheScience and Practice of Pharmacy”(20版，Lippincott Williams &Wilkins，Baltimore MD)中进行了描述，其全部教导据此结合进来作为参考。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于施用于患者的药物组合物，其含有：(i)有效量的治疗试剂；和(ii)适于口服给药的药物赋形剂。在一些实施方案中，该组合物进一步含有：(iii)有效量的第二治疗试剂。
为了减少眼病的炎症，优选将本发明的药物组合物输送至眼表面、连通的神经分布、结膜、泪腺或睑板腺。预计的有效治疗可包括通过下述途径施用本发明的治疗试剂：口服给药、局部给药、注射、鼻内、直肠、经皮肤、经浸渍或涂覆装置，例如眼注入或移植，或者经离子电渗，以及其它给药途径。
对于注射给药，可以经肌内、动脉内、皮下或静脉内注射药物组合物。可以利用泵机理在预定时间内施用药物组合物。对于本发明的一些实施方案，希望局部输送药物，因此可以在眼周、眼内、结膜下(subconjunctively)、眼球后或眼房内进行注射。对于本发明的一些实施方案，优选采用系统输送方式。
对于系统给药，可以将本发明的化合物制成口服药剂并口服给药。对于可以将治疗试剂局部或系统分布的给药方式，可以经鼻内、皮肤，或经一些口服给药形式施用本发明的组合物，例如使用漱口液或锭剂，其中结合了根据G.I.而言吸收率很差的本发明化合物。对于可以经部位或局部输送本发明组合物的给药方式，可以使用离子电渗或局部给药。
此外，可以经泵-导液管体系将本发明的药物组合物施用至眼表面，或者从连续或选择性释放装置内释放出来，所述装置例如为膜，例如但不限于用作OcusertTM系统(Alza Corp，Palo Alto，CA)中的那些装置。可以将药物组合物结合至隐形眼镜内、由隐形眼镜运载或者附着在隐形眼镜上，然后该隐形眼镜被患者用废。可以将药物组合物喷在眼表面上。
本发明的药物组合物可以与用于治疗病症或潜在疾病的其它疗法结合给药。例如，在患者接受免疫抑制力疗法治疗的过程中，将本发明的LFA-1拮抗剂同时或分别给药，其中所述免疫抑制疗法例如为咪唑硫嘌呤、环磷酰胺、甲氨蝶呤、抗疟药、麦考酚酸酯(mycophenolanmofetile)、达可如美(daclizumab)、静脉内免疫球蛋白疗法等。在另一个例子中，在患者接受其它抗-炎治疗的治疗期间，将本发明的LFA-1拮抗剂同时或分别给药，所述抗-炎治疗例如为环孢霉素A、皮质甾类、NSAIDS、阿司匹林、脱氧土霉素。在进一步的例子中，在患者接受激素疗法等的治疗期间，将本发明的LFA-1拮抗剂同时或分别给药。在更进一步的例子中，在患者接受抗-过敏疗法、干眼症缓解护理的治疗期间，将本发明的LFA-1拮抗剂同时或分别给药，所述干眼症缓解护理包括人工泪液或人工唾液、毒蕈碱M3受体拮抗剂以提高含水分泌物、自体同源血清、透明质酸钠滴液等。这些实施例仅用于说明并不意图限制本发明。在一些实施方案中，以单一剂量给药LFA-1拮抗剂。当与另一种物质(例如，止痛药)共施用以治疗急性病症时，也可以使用单一剂量的LFA-1拮抗剂。在一些实施方案中，分多个剂量给药LFA-1拮抗剂(其本身或与其它药物结合)。剂量给药可以为每日约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或多于10次。剂量给药还可以为约每月1次、每两周1次、每周1次，或每隔一天1次。在一个实施方案中，该药物为止痛药。在另一个实施方案中，LFA-1拮抗剂和另一种物质一起给药，每日施用约1次-约10次。在另一个实施方案中，LFA-1拮抗剂和另一种治疗物质持续给药小于约7天。在又一个实施方案中，共施用持续进行大于约6、10、14、28天、2个月、6个月或1年。在一些情况下，共施用的给药方式维持尽量长的时间，例如在针对慢性炎症进行剂量给药时。本发明组合物的给药可以持续尽可能长的时间。在一些实施方案中，将本发明的组合物给药大于1、2、3、4、5、6、7、14或28天。在一些实施方案中，将本发明的组合物给药小于28、14、7、6、5、4、3、2或1天。在一些实施方案中，基于病情进展状态而长期给药本发明的化合物，例如用于治疗慢性疼痛。
在本发明的方法中，通过常规试验可以找到LFA-1拮抗剂的给药剂量。每日剂量可以为约1×10-7g-5000mg。每日剂量范围可以取决于LFA-1拮抗剂的形式，例如所用的酯或盐，和/或给药途径。例如，对于系统给药，常用的每日剂量范围为例如，约1-5000mg，或约1-3000mg，或约1-2000mg，或约1-1000mg，或约1-500mg，或约1-100mg，或约10-5000mg，或约10-3000mg，或约10-2000mg，或约10-1000mg，或约10-500mg，或约10-200mg，或约10-100mg，或约20-2000mg，或约20-1500mg，或约20-1000mg，或约20-500mg，或约20-100mg，或约50-5000mg，或约50-4000mg，或约50-3000mg，或约50-2000mg，或约50-1000mg，或约50-500mg，或约50-100mg，约100-5000mg，或约100-4000mg，或约100-3000mg，或约100-2000mg，或约100-1000mg，或约100-500mg。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的每日剂量为约100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mg。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为10mg。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为100mg。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为500mg。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为1000mg。
对于局部输送至眼表面的情况而言，常用的日剂量范围为例如，约1×10-7g-5.0g，或约1×10-7g-2.5g，或约1×10-7g-1.00g，或约1×10-7g-0.5g，或约1×10-7g-0.25g，或约1×10-7g-0.1g，或约1×10-7g-0.05g，或约1×10-7g-0.025g，或约1×10-7g-1×10-2g，或约1×10-7g-5×10-3g，或约1×10-7g-2.5×10-3g，或约1×10-7g-1×10-3g，或约1×10-7g-5×10-3g，或约1×10-6g-5.0g，或约1×10-6g-2.5g，或约1×10-6g-1g，或约1×10-6g-0.5g，或约1×10-6g-0.25g，或约1×10-6g-0.1g，或约1×10-6g-5×10-2g，或约1×10-6g-5×10-2g，或约1×10-6g-2.5×10-2g，或约1×10-6g-1×10-2g，或约1×10-6g-5×10-3g，或约1×10-6g-2.5×10-3g，或约1×10-6g-1×10-3g，或约1×10-6g-5×10-4g，或约1×10-5g-5g，或约1×10-5g-2.5g，或约1×10-5g-1g，或约1×10-5g-0.5g，或约1×10-5g-0.25g，或约1×10-5g-0.1g，或约1×10-5g-0.05g，或约1×10-5g-2.5×10-2g，或约1×10-5g-1×10-2g，或约1×10-5g-5×10-3g，或约1×10-5g-2.5×10-3g，或约1×10-5g-1×10-3g，或约1×10-5g-5×10-4g。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为约1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3g、1×10-2g、1×10-1g或1g。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为1×10-7g。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为1×10-5g。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为1×10-3g。在一些实施方案中，LFA-1拮抗剂的日剂量为1×10-2g。在一些实施方案中，单独的剂量范围为约1×10-7g-5.0g，或约1×10-7g-2.5g，或约1×10-7g-1.00g，或约1×10-7g-0.5g，或约1×10-7g-0.25g，或约1×10-7g-0.1g，或约1×10-7g-0.05g，或约1×10-7g-0.025g，或约1×10-7g-1×10-2g，或约1×10-7g-5×10-3g，或约1×10-7g-2.5×10-3g，或约1×10-7g-1×10-3g，或约1×10-7g-5×10-4g，或约1×10-6g-5.0g，或约1×10-6g-2.5g，或约1×10-5g-1g，或约1×10-6g-0.5g，或约1×10-6g-0.25g，或约1×10-6g-0.1g，或约1×10-6g-5×10-2g，或约1×10-6g-5×10-2g，或约1×10-6g-2.5×10-2g，或约1×10-6g-1×10-2g，或约1×10-6g-5×10-3g，或约1×10-6g-2.5×10-3g，或约1×10-6g-1×10-3g，或约1×10-6g-5×10-4g，或约1×10-5g-5g，或约1×10-5g-2.5g，或约1×10-5g-1g，或约1×10-5g-0.5g，或约1×10-5g-0.25g，或约1×10-5g-0.1g，或约1×10-5g-0.05g，或约1×10-5g-2.5×10-2g，或约1×10-5g-1×10-2g，或约1×10-5g-5×10-3g，或约1×10-5g-2.5×10-3g，或约1×10-5g-1×10-3g，或约1×10-5g-5×10-4g。在一些实施方案中，将如上所述的单一剂量每日重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
对于其它给药形式，日剂量可以为约所述的用于系统给药的范围，或者可以为约所述的用于局部给药的范围。
IV制剂
可以将本发明的化合物制成本领域公知的混在适当载体中的无菌溶液或悬浮液。适当的制剂和附加载体在Remington″The Scienceand Practice of Pharmacy″(20版，Lippincott Williams & Wilkins，Baltimore MD)中进行了描述，其全部教导据此结合进来作为参考。
对于可注射制剂，载体可以选自本领域公知的适当载体，包括水溶液或油悬浮液，或乳液和芝麻油、玉米油、棉籽油和花生油，以及酏剂、甘露糖醇、葡萄糖或无菌水溶液，以及类似的药物载体。
可以对药物浓度进行调节，如本领域公知的，可以将缓冲液pH值和等渗性调节至与静脉注射相容。
口服制剂可以为片剂、胶囊、药片、药丸、干胶片(wafers)、口胶、锭剂、水溶液或悬浮液、油状悬浮液、糖浆、酏剂或可分散的粉末或颗粒等，而且可以按照本领域已知的任何方式制备。口服制剂还可以含有甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。
用于片剂形式的药物可接受的赋形剂可以包括无毒成分，例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠等。
在用于口服使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉，而且通常加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药，可用的载体包括乳糖和玉米淀粉。载体和赋形剂的其它非限制性例子包括牛乳、糖、某些类型的粘土、凝胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或油、口胶和乙二醇。
可用于形成药物组合物和本发明的剂型的表面活性剂包括但不限于亲水性表面活性剂、亲油性表面活性剂及其混合物。也就是说，可以使用亲水性表面活性剂的混合物，可以使用亲油性表面活性剂的混合物，或者可以使用至少一种亲水性表面活性剂和至少一种亲油性表面活性剂的混合物。
适当的亲水性表面活性剂通常具有至少10的HLB值，而适当的亲油性表面活性剂通常具有小于约10的HLB值。用于表征非离子型两性化合物的亲水性和亲油性的经典参数是亲水-亲油平衡(“HLB”值)。具有较低HLB值的表面活性剂亲油性或疏水性更强，并且在油中的溶解性更大，而具有较高的HLB值的表面活性剂亲水性更强，并且在水溶液中的溶解性更大。通常认为亲水性表面活性剂为HLB值大于约10的那些化合物，以及HLB范围通常不适用的阴离子、阳离子或两性离子化合物。类似地，亲油性(即，疏水性)表面活性剂为HLB值等于或小于约10的化合物。但是，表面活性剂的HLB值仅是常用于进行工业、药物和化妆品乳液判断的粗略的指导。
亲水性表面活性剂可以为离子型或非离子型。适当的离子型表面活性剂包括但不限于烷基铵盐；梭链孢酸盐；氨基酸、低聚肽和多肽的脂肪酸衍生物；氨基酸、寡肽和多肽的甘油酯衍生物；卵磷脂和氢化卵磷脂；溶血卵磷脂和氢化溶血卵磷脂；磷脂及其衍生物；溶血磷脂及其衍生物；肉毒碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸酯；单和二甘油酯的单和二乙酰基化酒石酸酯；琥珀酰化的单和二甘油酯；单和二甘油酯的柠檬酸酯；及其混合物。
在前面提及的组中，优选的离子型表面活性剂包括例如：卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂、溶血磷脂及其衍生物；肉毒碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸酯；单和二甘油酯的单和二乙酰基化酒石酸酯；琥珀酰化的单和二甘油酯；单和二甘油酯的柠檬酸酯；及其混合物。
离子型表面活性剂可以为卵磷脂、溶血卵磷脂、卵磷脂、脑磷酯、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、PEG-磷脂酰乙醇胺、聚乙烯吡咯烷酮-磷脂酰乙醇胺、脂肪酸乳酸盐、硬脂酰-2-乳酸盐、硬脂酰乳酸盐、琥珀酸单甘油酯、单/二甘油酯的单/二乙酰化酒石酸酯、单/二甘油酯的柠檬酸酯、肌氨胆酸盐、已酸盐、辛酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、十四烷酸盐、棕榈酸盐、油酸盐、蓖麻醇酸盐、亚油酸盐、亚麻酸盐、硬脂酸盐、月桂烷硫酸盐、四乙酰基硫酸盐、多库酸盐、月桂酰肉毒碱、棕榈酰肉碱、十四酰肉毒碱，及其盐和混合物。
亲水性非离子型表面活性剂可以包括但不限于烷基糖苷；烷基麦芽糖苷；烷基硫糖苷；月桂酰聚乙二醇甘油酯；聚氧化烯烷基醚，例如聚乙二醇烷基醚；聚氧化烯烷基酚，例如聚乙二醇烷基酚；聚氧化烯烷基酚脂肪酸酯，例如聚乙二醇脂肪酸单酯和聚乙二醇脂肪酸二酯；聚乙二醇脂肪酸甘油酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧化烯山梨聚糖脂肪酸酯，例如聚乙二醇山梨聚糖脂肪酸酯；多元醇与至少一个下组物质的亲水性酯交换产物：甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾醇；聚氧乙烯甾醇，其衍生物和类似物；聚氧乙烯化维生素及其衍生物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；及其混合物；聚乙二醇山梨聚糖脂肪酸酯，和多元醇与至少一个下组物质的亲油性酯交换产物：甘油三酸酯、植物油和氢化植物油。多元醇可以为甘油、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇、丙二醇、季戊四醇或糖类。
其它亲水性-非-离子型表面活性剂包括但不限于PEG-10月桂酸酯、PEG-12月桂酸酯、PEG-20月桂酸酯、PEG-32月桂酸酯、PEG-32二月桂酸酯、PEG-12油酸酯、PEG-15油酸酯、PEG-20油酸酯、PEG-20二油酸酯、PEG-32油酸酯、PEG-200油酸酯、PEG-400油酸酯、PEG-15硬脂酸酯、PEG-32二硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-20二月桂酸酯，PEG-25甘油基三油酸酯、PEG-32二油酸酯、PEG-20甘油基月桂酸酯，PEG-30甘油基月桂酸酯，PEG-20甘油基硬脂酸酯、PEG-20甘油基油酸酯、PEG-30甘油基油酸酯、PEG-30甘油基月桂酸酯、PEG-40甘油基月桂酸酯、PEG-40棕榈仁油、PEG-50氢化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-6癸酸酯/辛酸酯甘油酯、PEG-8癸酸酯/辛酸酯甘油酯、聚甘油基-10月桂酸酯，PEG-30胆甾醇、PEG-25植物甾醇、PEG-30大豆甾醇、PEG-20三油酸酯、PEG-40山梨聚糖油酸酯、PEG-80山梨聚糖月桂酸酯、多山醇酯20、多山醇酯80、POE-9月桂基醚、POE-23月桂基醚、POE-10油烯基醚、POE-20油烯基醚、POE-20硬脂酰基醚、儿茶酚基PEG-100琥珀酸酯、PEG-24胆甾醇、聚甘油基-10油酸酯、Tween 40、Tween 60、蔗糖单硬脂酸酯、乳糖单月桂酸酯、乳糖单棕榈酸酯、PEG 10-100壬基酚同系物、PEG 15-100辛基酚同系物，和泊洛沙母。
仅作为举例的形式，适当的亲油性表面活性剂包括：脂肪醇；脂肪酸甘油酯；乙酰基化甘油脂肪酸酯；低级醇脂肪酸酯；丙二醇脂肪酸酯；山梨聚糖脂肪酸酯；聚乙二醇山梨聚糖脂肪酸酯；甾醇和甾醇衍生物；聚氧乙烯化甾醇和甾醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖醚；单和二甘油酯的乳酸衍生物；多元醇与至少一个下组物质的疏水性酯交换产物：甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾醇；油溶性维生素/维生素衍生物；及其混合物。在该组中，优选的亲油性表面活性剂包括脂肪酸甘油酯、脂肪酸丙二醇酯及其混合物，或者为多元醇与至少一个下组物质的疏水性酯交换产物：植物油、氢化植物油和三甘油酯。
表面活性剂可以用在本发明的任何制剂中，只要其使用不会产生矛盾。在本发明的一些实施方案中，优选不使用或使用有限种类的表面活性剂。
当本发明的化合物制成口服给药形式时，可能希望采用胃滞留制剂，用以提高胃肠(GI)道的吸收。在胃中停留若干小时的制剂可以缓慢释放出本发明的化合物并且可以提供持续的释放，这在本发明的一些实施方案中可能是优选的。这种胃滞留制剂的公开内容可以在下述文献中找到：Klausner，E.A.；Lavy，E.；Barta，M.；Cserepes，E.；Friedman，M.；Hoffman，A.2003“Novel gastroretentive dosage forms：evaluation of gastroretentivity and its effect on levodopa in humans.”Pharm.Res.20，1466-73，Hoffman，A.；Stepensky，D.；Lavy，E.；Eyal，S.Klausner，E.；Friedman，M.2004“Pharmacokinetic andpharmacodynamic aspects of gastroretentive dosage forms”Int.-J.Pharm.11，141-53，Streubel，A.；Siepmann，J.；Bodmeier，R.；2006“Gastroretentive drug delivery systems”Expert Opin.Drug Deliver.3，217-3，和Chavanpatil，M.D.；Jain，P.；Chaudhari，S.；Shear，R.；Vavia，P.R.“Novel sustained release，swellable and bioadhesivegastroretentive drug delivery system for olfo×acin”Int.J.Pharm.2006epub 3月24。可以采用扩展、浮动和生物黏着技术来使本发明化合物的吸收率最大化。
鼻内给药可以采用由本发明化合物组成的可呼吸的颗粒的气溶胶悬浮液，其被患者吸入。经肺部吸收或经由鼻泪管而与泪囊组织接触从而将药物有效量的本发明化合物吸收到血液流中，随后将其输送到泪囊组织中。可呼吸的颗粒可以为具有适当粒度的固体或液体，如本领域已知的吸收有效的情况。吸入或吹入组合物包括药物可接受的、水或有机溶剂的溶液和悬浮液或其混合物，和粉末。液体或固体组合物可以含有适当的如前所述的药物可接受的赋形剂。优选，该组合物通过口服或鼻内呼吸途径进行局部或系统给药。可以使用惰性气体对溶于优选的药物可接受的溶剂中的组合物进行喷雾。可以从喷雾装置直接吸入喷雾溶液，或者可以将喷雾装置连接在面罩或间歇式正压呼吸机上。可以从以适当形式输送制剂的装置中施用溶液、悬浮液或粉末组合物，优选通过口或鼻内形式。
对于经皮肤给药，可以采用本领域已知的任何适当制剂，所述制剂为溶液、悬浮液、凝胶、粉末、乳膏、油、固体、二甲基亚砜(DMSO)-基溶液或用于贴剂的脂质体制剂或本领域已知的其它输送体系。药物组合物还可以包括适当的固体和凝胶相载体或赋形剂，其为具有下述作用的化合物：能够提高治疗分子的透过性或者有助于治疗分子的输送，即透过皮肤角质层渗透障碍的透过性和输送。对于局部制剂领域的熟练技术人员而言，有许多已知的渗透性-增强分子。这种载体和赋形剂的例子包括但不限于湿润剂(例如，尿素)、乙二醇类(例如，丙二醇)、醇类(例如，乙醇)、脂肪酸(例如，油酸)、表面活性剂(例如，十四酸异丙酯和月桂基硫酸钠)，吡咯烷酮、单月桂酸甘油酯，亚砜，萜烯(例如，薄荷醇)、胺类、酰胺类、链烷烃、烷醇、水、碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、凝胶和聚合物，例如聚乙二醇。用于输送药物试剂的皮肤贴剂的组成和用途是本领域已知的。参见，例如，美国专利No.5,023,252、4,992,445和5,001,139。这种贴剂可以制成连续、脉动或按需输送药物试剂的形式。
对于局部给药，如本领域中已知的，可以使用眼科领域使用的用于眼局部给药的所有制剂(例如，滴眼液、插入物、眼罩(eye pack)、浸渍的隐形眼镜、泵送体系、二甲基亚砜(DMSO)-基溶液悬浮液、脂质体和眼膏)，和皮肤科和耳鼻喉科领域使用的用于外部使用的所有制剂(例如，药膏、乳膏、凝胶、粉末、油膏、洗液、晶体形式、泡沫和喷雾)。此外，可以使用用于局部给药于皮肤和鼻部通道的黏液薄膜的所有适当制剂来输送本发明的化合物。本发明的药物组合物可以为用于局部或口服给药的脂质体制剂，适合于本发明目的的任何一种形式都是本领域已知的。
可以用于形成本发明的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸酯钙、硬脂酸酯镁、矿物油、轻矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇、其它二醇、硬脂酸、月桂基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂，或其混合物。其它润滑剂包括，例如硅酸盐硅胶、合成硅的凝结气雾剂，或其混合物。任选以小于药物组合物的约1重量％的量加入润滑剂。
此外，预计可以将本发明的化合物可释放地连接在用于持续释放制剂的生物相容聚合物中，其中所述持续释放型制剂位于用于局部或系统给药的插入物上、内部或与其连接。可以采用水溶性聚合物从生物相容的聚合物中受控释放，用以同样形成可点滴的制剂。
可以将活性成分溶解在无菌水溶液，例如生理盐水、缓冲溶液等中，或者在使用之前将粉末组合物结合进来并使其溶解而制得滴眼液。如本领域中已知的，还可以选择其它载体，包括但不限于：平衡盐溶液、食盐溶液、水溶性聚醚，例如聚乙二醇、聚乙烯，例如聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素衍生物，例如甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、石油衍生物，例如矿物油和白矿脂、动物脂肪，例如羊毛脂，丙烯酸聚合物，例如羧基聚亚甲基凝胶、植物脂肪，例如花生油和多糖，例如右旋糖苷和葡糖胺聚糖基，例如透明质酸钠。如果希望，还可以加入常用于滴眼液中的添加剂。这种添加剂包括等渗试剂(例如，氯化钠等)，缓冲试剂(例如，硼酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠等)，防腐剂(例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、三氯叔丁醇等)，增稠剂(例如糖，如乳糖、甘露糖醇、麦芽糖等；例如透明质酸或其盐，如透明质酸钠、透明质酸钾等；例如粘多糖，如硫酸软骨素等；例如聚丙烯酸钠、羧基乙烯基聚合物、交联聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素，或本领域熟练技术人员已知的其它试剂)。
通过在组合物中使用表面活性剂或其它适当的共溶剂可以提高本发明组合物的组分溶解性。这种共溶剂包括多山醇酯20、60和80、Pluronic F68、F-84和P-103、环糊精或本领域熟练技术人员已知的其它试剂。所用的这种共溶剂的水平可以为约0.01％-2％重量。
可以将本发明的组合物制成不含防腐剂的无菌单元剂型。可以将本发明的组合物包装为多剂量形式。优选在使用过程中采用防腐剂来防止微生物污染。适当的防腐剂包括：苯扎氯铵、硫汞撒、三氯叔丁醇、甲基帕拉贝、丙基帕拉贝、苯乙醇、依地酸钙钠、山梨酸、OnamerM，或本领域熟练技术人员已知的其它试剂。在现有技术的眼用产品中，这种防腐剂的使用水平为0.004％-0.02％。在本申请的组合物中，防腐剂，优选苯扎氯铵的使用水平为0.001％-小于0.01％，例如0.001％-0.008％，优选约0.005％重量。已经发现，0.005％的苯扎氯铵浓度足以使本发明的化合物防止微生物的侵袭。
用于本发明中的活性成分的给药量和给药次数根据病人的性别、年龄和体重、治疗症状、希望的治疗效果、给药途径和治疗周期而变化。对于成人用滴眼液来说，含有本发明化合物的制剂的浓度可以为约0.0001-10.0 W/V％、约0.005-10.0 W/V％、约0.01-10.0 W/V％、约0.05-10.0 W/V％、约0.1-10.0 W/V％、约0.5-10.0 W/V％、约1.0-10.0 W/V％、约20-10.0 W/V％、约3.0-10.0 W/V％、约4.0-10.0 W/V％，或约5.0-10.0 W/V％。本发明一个实施方案的制剂具有约1.0-10.0 W/V％的本发明化合物。本发明一个实施方案的制剂具有约0.01-10.0 W/V％的本发明化合物。本发明一个实施方案的制剂具有约5.0-10.0 W/V％的本发明化合物。给药方式可以为每日每只眼施用若干次，优选1-10次，更优选1-4次，最优选每日1次。给药的液滴大小可以为约10-100μl、约10-90μl、约10-80μl、约10-70μl、约10-60μl、约10-50μl、约10-40μl、约10-30μl、约20-100μl、约20-90μl、约20-80μl、约20-70μl、约20-60μl、约20-50μl、约20-40μl或约20-30μl。本发明的一个实施方案给药10-30μl的滴眼液。本发明的一个实施方案给药10-100μl的滴眼液。本发明的一个实施方案给药20-50μl的滴眼液。本发明的一个实施方案给药10-60μl的滴眼液。
本发明的制剂可以每次给药若干滴，1-4滴，优选1-3滴，更优选1-2滴，最优选每日1滴。
在软膏、乳膏、洗液或喷雾制剂中，制剂中的本发明化合物的浓度可以为约0.0001-10.0 W/V％、约0.005-10.0 W/V％、约0.01-10.0W/V％、约0.05-10.0 W/V％、约0.1-10.0 W/V％、约0.5-10.0 W/V％、约1.0-10.0 W/V％、约20-10.0 W/V％、约3.0-10.0 W/V％、约4.0-10.0 W/V％，或约5.0-10.0 W/V％。本发明一个实施方案的制剂具有约1.0-10.0 W/V％的本发明化合物。本发明一个实施方案的制剂中含有约0.01-10.0 W/V％的本发明化合物。本发明一个实施方案的制剂中含有约5.0-10.0 W/V％的本发明化合物。这些制剂可以每日施用或喷雾若干次，优选1-6次，更优选1-4次，最优选每日1次。可以根据炎症或感染的程度适当提高和降低每种成分的化合比例。
本发明的制剂可以进一步包括其它药物活性成分，只要其不与本发明的目的相矛盾。在多种活性成分相结合的情况下，考虑到其效果和安全性可以适当提高或降低其各自的含量。
V.试剂盒
本发明还提供试剂盒。试剂盒包括适当包装的本发明的化合物，和可以包括使用说明、临床研究讨论、副作用列表等的书写材料。试剂盒还可以进一步含有与本发明的LFA-1共施用的另一种治疗试剂。在一些实施方案中，将该治疗试剂和本发明的LFA-1拮抗剂作为在试剂盒的分隔容器内的分开组合物来提供。在一些实施方案中，将该治疗试剂和本发明的LFA-1拮抗剂作为试剂盒容器内的单一组合物来提供。适当的包装和其它使用物件(例如，用于液体制剂的量杯、使在空气中的暴露最小化的铝箔包装、配药器等)是本领域已知的，其也可以包括在试剂盒中。
VI.可用于本发明治疗方法中的新化合物的确定方法
A.试验方式背景
1.配体亲合力对二价阳离子的依赖性
二价阳离子在整联蛋白/配体的结合中起至关重要的作用，而且其存在对于这些相互作用的试验研究是必需的。参见Hynes，R.O.1992.Integrins：Versatility，modulation，and signaling in cell adhesion，Cell，69：11-25；Humphries，M.J.1996.Integrin activation：the link betweenligand binding and signal transduction，Curr.Op.Cell Biol.，8：632-640.在两组常用的二价阳离子条件下，使用荧光偏振测量ICAM-I-Ig和化合物1、3和4对LFA-1(结构如表4所示)的亲合力。首先在直接结合试验中测量化合物1对LFA-1的亲合力，然后在与亲合LFA-1的化合物1进行竞争的条件下测量ICAM-I-Ig和化合物3和4对LFA-1的亲合力(图4和图5中的表1)。未对结合在IDAS上的A-286982的亲合力进行测量，因为其不与结合在LFA-1上的化合物发生竞争(参见下文)。在对于ICAM-I-Ig而言的不同的阳离子条件下测量化合物1、3和4对LFA-1的亲合力的类似变化。在MnCl2存在下测得的小分子亲合力是在CaCl2和MgCl2存在下测得的亲合力的至少10倍。不存在二价阳离子时这些小分子不与LFA-1结合(数据未给出)。类似地，在MnCl2存在下以同样方法测量在溶液中可溶性蛋白，ICAM-I-Ig对LFA-1的结合亲合力，其比在CaCl2和MgCl2存在下的亲合力至少好4倍。因此，与包括A-286982的LFA-1拮抗剂类型不同，A-286982已知与结构域I的IDAS区域结合(Liu，G.，Huth，J.R.，Olejniczak，E.T.，Mendoza，R.，DeVries，P.，Leitza，S.，Reilly，E.B.，Okasinski，G.F.，Fesik，S.W.，和von Geldern，T.W.2001.Novel p-arylthiocinnamides as antagonists of leukocyte function-associatedantigen-1/intracellular adhesion molecule-1 interaction.2.Mechanism ofinhibition and structure-based improvement of pharmaceuticalproperties，J.Med.Chem.，44：1202-1210.，Huth，J.R.，Olejniczak，E.T.，Mendoza，R.，Liang，H.，Harris，E.A.S.，Lupher，M.L.Ir.，Wilson，A.E.，Fesik，S.W.，和Staunton，D.E.2000.NMR andmutagenesis evidence for an I domain allosteric site that regulateslymphocyte function-associated antigen 1 ligand binding，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.，97：5231-5236.)，而且据报导其以非阳离子-依赖型方式与LFA-1结合(Welzenbach，K.，Hommel，U.，和Weitz-Schmidt，G.2002.Small molecule inhibitors induce conformational changes in the Idomain and the I-like domain of lymphocyte Function-AssociatedAntigen-1，J.Biol.Chem.，277：10590-10598)，ICAM-I-Ig和由化合物1-4代表的LFA-1类拮抗剂共享一个对LFA-1结合敏感的二价阳离子(表1)。因此，为了确定以类似方式与ICAM-I-Ig和化合物1-4结合的LFA-1/ICAM-I拮抗剂，在MnCl2存在下，在类似条件下进行本文中报道的所有结合试验，已知其可以使ICAM-I和这些阳离子-敏感拮抗剂的结合都达到最大化。
2.化合物5对LFA-1αL亚基的交联
为了确定小分子拮抗剂的结合点，将化合物5、化合物3的氚-标记的光激活类似物结合在LFA-1上，之后进行光致交联。为了使特定的、高亲合力交联作用最大化，必须用凝胶过滤样品，用以在辐射之前除去未结合或弱结合的化合物5(图6，通道e对f，和g对h)。不进行凝胶过滤则化合物5对LFA-1α亚基、β亚基和杂二聚物具有显著的交联作用(约200,000的带)，而在凝胶过滤试样中不会观察到非特定的交联作用(数据未示出)。在凝胶过滤条件下，化合物5具体地只与αL亚基发生交联(图6，泳道c和g)。而且，在温育过程中化合物3的存在会充分降低氚对αL亚基的结合(图6，道e对g)。类似地，在不进行凝胶过滤的条件下，化合物3的存在会使氚结合入αL亚基、β2亚基和杂二聚体的情况下稍微减少(图6，泳道fVs.h)。当使用分离出来的、结构完好的αL或β2亚基的凝胶过滤试样时，没有发生化合物5的交联(数据未示出)。因此，借助LFA-1杂二聚体提供了在凝胶过滤之后所必需的高亲合力结合位。在分离出来的αL亚基中高亲合力位的缺少与之前的、表明xVA143与分离出来的结构域I之间缺少相互作用的研究(Welzenbach等，2002)相一致。
通过下述方式进一步定义交联位：用羟胺打碎亲合标记的αL亚基，用电泳法分离该片段，然后在放射性同位素标记的片段上进行N-末端排序，用以确定其在蛋白质序列中的位置。确定两个序列，第一个从残基1开始(实际序列：YNLDVRGARSFS)，第二个从残基30开始(实际序列：GVIVGAPGEGNST)(Larson，R.S.，Corbi，A.L.，Berman，L.，和Springer，T.1989.Primary structure of the leukocytefunction-associated molecule-1 alpha subunit：an integrin with anembedded domain defining a protein superfamily，J.Cell Biol，.108：703-712)。在SDS-PAGE(50-60 kDa)上对其大小进行确定，两种肽均为约500个氨基酸长；该片段大小与接下来的两个预测的羟胺裂解位(N-G)，N507和N530相一致(Larson等，1989，Bornstein，P.1969.Thenature of a hydroxyamine-sensitive bond in collagen，Biochem.Biophys.Res.Comm.，36：957-964)。未将标记结合在亚基一半处的C-末端上。试图对交联位作进一步改进，但是并未成功。用溴化氰或Lys-C对标记的αL亚基进行有限地消化之后，不能重新获得可定义的肽。
3.化合物2B与缺少结构域I的LFA-1的结合
通过制备缺少结构域I的αL构建体来说明结构域I在化合物2B和相关的类似物与LFA-1的结合中的作用。将单独的β2构建体(模拟物)或与缺少结构域I的构建体或野生型αL结合在一起的β2构建体转染到293细胞中，并且考察化合物2B对转染细胞的结合(图7)。化合物2B显示出对野生型αL转染细胞的充分的结合力，但是也说明与对于模拟(B2)转染细胞的结合力相比，其对于被缺少结构域I的αL转染的细胞没有显著的结合力。还对转染物对于ICAM-I-Ig的黏着能力进行了试验，正如所预计的，缺少结构域I的LFA-1转染细胞和模拟转染物显示出没有区别的背景结合水平，而野生型αL转染细胞显示出很强的黏着力(图7B)(Yalamanchili，P.，Lu，C，Oxvig，C和Springer T.A.2000.Folding and function of I domain-deleted Mac-1 andlymphocyte function-associated antigen-1，J.Bio1.Chem.，275：21877-21882)。对一组LFA-1抗体对转染细胞的结合力的评价显示，除了对应于结构域I的抗体的结合损失之外，在缺少αL结构域I的转染细胞中的LFA-1杂二聚体看起来是不受影响的(数据未示出)。
数据支持下述结论：化合物3和相关分子结合至LFA-1上的高亲合力位上，该位置与ICAM-I结合位重叠，且之前已经显示ICAM-I结合位包括在LFA-1αL亚基内的结构域I上的MIDAS基序(Shimaoka，M.，xiao，T.，Liu，J.-H.，Yang，Y.，Dong，Y.，Jun，C-D.，McCormack，A.Zhang，R.，Joachimiak，A.，Takagi，J.，Wang，J.-H.，和Springer，T.A.2003a.Structures of the alpha L I domain and itscomple×with ICAM-I reveal a shape-shifting pathway for integrinregulation，Cell，112：99-111.)。
从删除ICAM-I-Ig与化合物2B结合处的结构域I的一般效果中可以看出，有确凿证据表明ICAM-I和小分子拮抗剂在LFA-1上的结合位极其相近。化合物2B和ICAM-I都不能结合至缺少结构域I的LFA-1上，而ICAM-I的结合位就位于该结构域中。而且，A-286982对于ICAM-I-Ig与化合物2B的结合的变构改进能力与下述情况一致：其结合位与LFA-1α亚基I域内的IDAS基序内的A-286982结合位极其相近(Liu，G.2001b.Small molecule antagonists of the LFA-1/ICAMrI interaction as potential therapeutic agents，E×pert Opin.Ther.Patents，11：13 83-1393，Liu等，2001)。化合物5与LFA-1α链的选择性光化学结合作用使其结合位局限在该亚基的残基30-507中。上面提到的所有发现都与位于LFA-1α链的结构域I内的单一的高亲合力小分子相一致。
利用较高浓度的化合物5(4.1μM，图6)进行光化学交联研究的密切考察，其提供直接证据表明在LFA-1上具有另外的低亲合力小分子结合位。在存在和不存在凝胶过滤的情况下观察到大大不同的蛋白质和交联特性曲线。当在辐射之前对样品进行凝胶过滤以除去未结合或弱结合的分子时，只观察到高亲合力标记的α亚基。但是，在不存在凝胶过滤步骤的情况下，对化合物5与LFA-1的复合物进行辐射后导致其以高强度交联至α亚基上，并以较低强度交联至β亚基中的低亲合力结合位上，该亚基与化合物5的复合情况太弱以致于不能经历凝胶过滤。在两种情况下，观察到的交联都部分受到大量过量的(290μM)化合物3的抑制(图6，道e和g，f和h)，其说明了与两个位置的结合的特殊性质。试图将化合物5结合至分离出来的α或β亚基上，但是未能提供能够经过凝胶过滤过程的高亲合力复合物。因此，可以看出化合物3代表的化合物类型的高亲合力竞争性结合需要存在完整全长的LFA-1杂二聚体。试图获得在LFA-1亚基或分离出来的结构域I构造内的该结合位，结果导致LFA-1对于ICAM-I和化合物3的小分子类似物(例如，xVA143)的亲合力减小(Shimaoka，M.，Lu，C，Palframan，R.T.，von Andrian，U.H.，McCormack，A.，Takagi，J.，和Springer，T.A.200 1.Reversibly locking a protein fold in an activeconformation with a disulfide bond：integrin alphaL I domains with highaffinity and antagonist activity in vivo，Proc.Natl.Acad.Sci，美国，98：6009-6014.，Welzenbach等，2002)。尤其有趣的是可以看到少量LFA-1杂二聚体的存在，其通常出现在不存在凝胶过滤的情况下(图6，＞200,000道尔顿的带)。根据考马斯蓝染色和放射自显影术的判断，LFA-1带的强度与在使杂二聚体稳定化的β链上的第二位具有的低亲合力相一致。
公开的凝胶稳定化研究显示(Shimaoka，M.，Salas，A.，Yang，W.，Weitz-Schmidt，G.和Springer，T.2003b.Small molecule integrinantagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signalsin one direction and block them in another，Immunity，19：391-402，Salas，A.，Shimaoka，M.，Kogan，A.N.，Harwood，C，von Andrian，U.H.，和Springer，T.A.，2004.Rolling adhesion through an extendedconformation of integrin αLβ2 and relation to α I and β I-like domaininteraction，Immunity，20：393-406，Yang，W.，Shimaoka，M.，Salas，A.，Takagi，J.，和Springer，T.A.2004.Intersubunit signal transmissionin integrins by a receptor-like interaction with a pull spring.PNAS，101：2906-2911)，对LFA-1至SDS-PAGE的稳定化负责的结合位位于β亚基的类似结构域I区域中。本文中提供的数据显示该β亚基结合位与α亚基内的高亲合力结合位没有关联，而α亚基内的高亲合力结合位对直接的竞争性抑制ICAM-I结合负责。但是，通过化合物3而对LFA-1稳定化作用负责的β亚基结合位可以与我们观察到的低亲合力β亚基交联位相同。
总而言之，本文中提供的交联和结合试验的结果指出，本文中所用的LFA-1类小分子拮抗剂探针具有两个不同的结合位。第一个是位于LFA-1 αL亚基内的高亲合力结合位，通过该结合位小分子与LFA-1形成足够稳定以经历凝胶过滤过程的复合物(例如，Kd＜25 nM)。此处报导的结合试验对这个小分子结合位进行了表征，表明其与ICAM-I结合位重叠并且与下述作用相关：通过化合物3和4有效抑制LFA-1/ICAM-I的结合(化合物4的IC50＝1.4 nM)；其在体外对LFA-1的有效抑制作用诱使淋巴细胞增殖(化合物4的IC50＝3 nM)；而且其在体内抑制免疫系统的响应(Gadek等，2002)。第二个位点是β亚基内的低亲合力结合位(例如，Kd＞1μM)，其在SDS-PAGE作用下参与LFA-1杂二聚体的稳定化。该位点的性质更加活跃(即，更快的解离速率)，而且不能经历凝胶过滤/光解过程。该第二低亲合力位的特征与最近描述的在β亚基的I-类域内的α/β I-类变构拮抗剂结合位相一致(Welzenbach等，2002，Shimaoka等，2003b，等，2004，Yang等，2004)。本文中描述的ICAM-I模拟物在LFA-1β亚基(假设为类似结构域I的结构域)上的低亲合力结合很可能是由于I和结构域I类似结构域之间的序列同源性，尤其是在下述情况时：MIDAS基序与其对于这类拮抗剂中常有的羧酸部分的亲合力具有类似性。假设包括MAC-I的β2族整联蛋白共用该亚基，则为了选择特定用于LFA-1的拮抗剂，化合物对于β2亚基的类似结构域I的结构域的亲合力必须衰减(Keating，S.，Marsters，J.，Beresini，M.，Ladner，C，Zioncheck，K.，Clark，K.，Arellano，F.，和Bodary，S.2000.Putting the pieces together：Contribution of fluorescence polarization assays to small molecule leadoptimization，SPIE Proceedings，3913：128-137)。
上述试验证实了化合物3和4对于LFA-1具有高亲合力，结合方式与ICAM-I相似，结合位与包括LFA-1亚基结构域I内的MIDAS基序的ICAM-I结合位重叠(Shimaoka，M.，xiao，T.，Liu，J.-H.，Yang，Y，Dong，Y.，Jun，C-D.，McCormack，A.Zhang，R.，Joachimiak，A.，Takagi，J.，Wang，J.-H.，和Springer，T.A.2003a.Structures of thealDha L I domain and its complex with ICAM-I reveal a shape-shiftingpathway for integrin regulation，Cell，112：99-111)。该现象与提出的对其ICAM-I表位的模拟相一致(Gadek等，2002)，而且与具有下述内容的任何结论都不一致：其功能是作为LFA-1/ICAM-I的α/β类I变构拮抗剂(Shimaoka等，2003b，Shimaoka，M.，和Springer，TA.2004.Therapeutic antagonists and the conformational regulation of the β2integrins，Curr.Topics Med.Chem.，4：1485-1495)。这些ICAM-I模拟物对β2整联蛋白亚基的结合虽然只有较低的亲合力，但是其提出了如下问题：作为反馈机理的一部分，ICAM-I本身是否结合至类I结构域内的第二位点上(Welzenbach等，2002，Shimaoka等，2003b，Salas等，2004，Yang等，2004，Shimaoka和Springer 2004)。本发明中所用的试验细节为：为了确保形成LFA-1的活性构象而对二价阳离子提出的要求，和对于探针分子1-5、已知的LFA-1调节剂与ICAM-I直接进行竞争所进行的物理证实，通过这些试验细节形成了确定新的拮抗剂的方法，所述新拮抗剂为直接竞争性LFA-1拮抗剂。该方法可用于确定新的LFA-1拮抗剂，该方法将被用在本发明的治疗干眼病的方法中。
之前已经显示，小分子可以以高亲合力结合至α-L亚基上，这相对于LFA-1而言是独一无二的。因此，这些化合物可以选择性用于LFA-1(αLβ2)而非Mac-1(αMβ2)。本发明的一个优选实施方案是确定和使用选择性的LFA-1抑制剂，其可以带来治疗安全性方面的优越性。
B.试验方法：竞争性结合试验
1.拮抗剂在LFA-1/ICAM-1和LFA-1/小分子ELISA中的竞争
使用化合物2A和3、A-286982和sICAM-1来说明该方法。为了说明对于ICAM-I-Ig与LFA-1的结合的抑制作用，将这些拮抗剂滴定至LFA-1/ICAM-1 ELISA中。通过加入1/5系列稀释的化合物3(-●-)、化合物2A(-▲-)、A-286982(-◆-)和sICAM-1(-
Figure 2006800171884_0
-)来进行试验，在含有捕获的LFA-1的板上用CAM-1-Ig(A)或化合物2B(B)对其进行培养。显示的数据是来自单个试验的两个板的平均值，其是若干个独立测量的代表结果。实线是数据的拟合值。在图例中提供了IC50值(nM)。
图8A中显示了针对ELISA中的这些抑制剂的典型竞争曲线。化合物3有效抑制ICAM-I-Ig与LFA-1的结合，其IC50为2nM。化合物2A、化合物3的类似物也抑制结合，但是其IC50值约高出10倍。A-2869S2和sICAM-1抑制ICAM-I-Ig与LFA-1的结合，但是IC50值比化合物3高出100倍。
还说明了这些相同化合物对于FITC标记的小分子拮抗剂、化合物2B与LFA-1的结合的抑制能力(图8B)。化合物2A和3以及可溶的ICAM-I作为化合物2B的结合抑制剂的效力与其作为ICAM-I-Ig的结合抑制剂的效力类似。化合物3、化合物2A和sICAM-1抑制化合物2B与LFA-1的结合，其IC50值分别为3，56和1200 nM。吸收值经历短暂提高-在约4μM处达到最大值，之后降低，这说明A-286982不能抑制而是提高化合物2B对LFA-1的结合。
将对于LFA-1/小分子和LFA-1/ICAM-1 ELISAs中的IC50值的评价扩展到更大的化合物组中，所述化合物组包括蝮蛇毒素衍生的肽和代表该LFA-1小分子拮抗剂类的小分子(Gadek等，2002)。如图9所示(由LFA-1：ICAM-I和LFA-1：小分子ELISAs中的拮抗剂竞争而得的IC50值关系)，将与化合物2B竞争的多组化合物的IC50值(4种肽，5个小分子和sICAM-1)相对于与ICAM-I-Ig和LFA-1的结合进行竞争而确定的IC50值进行作图。图的斜率为0.964，y-截距为0.237且R＝0.940。每个数据点为来自两个板的IC50值平均值，在该多组化合物的两个配体结合试验中，每个配体的竞争IC50值之间具有良好的关联(R＝0.94)，该关联特性曲线经历5个效力对数单位，其中所述多组化合物包括sICAM-1、化合物2A和3。相竞争的两个拮抗剂ELISAs和ICAM-I-Ig与作为配体的化合物2B之间的一般效力趋势说明每个化合物都按照类似的机械方式中断ICAM-I和小分子配体的结合。该类似的抑制效力说明ICAM-I-Ig和化合物2B都结合在LFA-1上的相同位点上(Wong，A.，Hwang，S.M.，Johanson，K.，Samanen，J.，Bennett，D.，Landvatter，S.W.，Chen，W.，Heys，J.R.，AIi，F.E.，Ku，T.W.，Bondinell，W.，Nichols，A.J.，Powers，D.A.，和Stadel，J.M.1998.Binding of[3H]-SK&F 107260 and[3H]-SB 214857 topurified integrin alphallbbeta3：evidence for a common binding site forcyclic arginyl-glycinyl-aspartic acid peptides and nonpeptides，J.Pharmacol.Exp.Therapeutics，285：228-235)。
2.结合在LFA-1/ICAM-I和LFA-1/小分子ELISAs上的配体的拮抗剂调节
通过与目标配体直接竞争而产生抑制作用的拮抗剂显示出如下性质：当拮抗剂浓度增大时，其在配体结合曲线中经不可饱和的向右迁移而移到较高的表观EC50值处，而且不使配体的最大结合值减小(Lutz，M.，和Kenakin，T.1999.Quantitative Molecular Pharmacology andInformatics in Drug Discovery，John Wiley & Sons，Ltd.，New York，Pratt，W.B.，和Taylor，P.1990.Principles of Drug Action；The Basis ofPharmacology，Churchill Livingstone，New York Matthews，J.C.1993.Fundamentals of Receptor，Enzyme，and Transport Kinetics，CRC Press，Boca Raton，Kenakin，T.1997.Pharmacologic Analysis of Drug-ReceptorInteraction，Lippincott-Raven，Philadelphia)。可以克服这种抑制作用，但是需要在提高直接竞争的抑制剂浓度的条件下提高配体的量(Gaddum，I.H.，Hameed，K.A.，Hathway，D.E.，和Stephens，F.F.1955.Quantitative studies of antagonists for 5-hydroxytryptamine，Q.J.Exp.Physiol.，40：49-74)。图10显示了直接竞争的化合物3、A-286982和sICAM-1对于ICAM-I-Ig和化合物2B与LFA-1相结合所得的曲线的影响，其为显示直接竞争作用的拮抗剂的例子。在不存在(-◇-)或存在拮抗剂的条件下将ICAM-I-Ig(A，C，E)或化合物2B(B、D、F)滴定至LFA-1/ICAM-1和LFA-1/小分子ELISAs中。加入稀释了2倍的拮抗剂，起始浓度为2.4(A)和2.7(B)μM的sICAM-1，0.040(C)和0.10(D)μM的化合物3和20(E)和50(F)μM的A-286982。拮抗剂浓度的数量级为，-□-(加入的最低拮抗剂浓度)，-△-，-○-，-◆-，-■-，-▲-至-●-(最高的拮抗剂浓度)。该组数据如实线所示。所示数据都来自一个板，并且代表两个试验的最小值。(注意：A-286982(F)导致化合物2B对LFA-1的结合力增大)。相反，变构抑制剂可以通过减小最大结合力或使曲线的向右饱和位移减小来改变配体的结合曲线。(Lutz和Kenakin 1999，Matthews 2993)。如图10A所示，增大的sICAM-1浓度明显使ICAM-I-Ig结合曲线向右移至较高的EC50值处。此外，正如预期的，当相同的天然配体的两种分子形式直接竞争于结合在受体的一个位置上时，在存在和不存在sICAM-1的条件下观察到相同的ICAM-I-Ig至LFA-1的最大结合程度(Lutz和Kenakin 1999，Pratt，W.B.，和Taylor，P.1990.Principles of Drug Action：The Basis ofPharmacology，Churchill Livingstone，New York，Matthews 1993，Kenakin，T.1997.Pharmacologic Analysis of Drug-Receptor Interaction，Lippincott-Raven，Philadelphia)。类似地，化合物3浓度的增大还会使ICAM-I-Ig的结合迁移至较高的EC50值，并使ICAM-I-Ig的最大结合发生最小的变化(图10C)。虽然在竞争性拮抗剂存在下，在配体结合曲线中的向右迁移通常是平行的，但情况并非总是如此(Coultrap，S.J.，Sun，H.，Tenner，T.E.Jr.，和Machu，T.K.1999.Competitiveantagonism of the mouse 5-hydroxytryptamine3 receptor bybisindolylmaleimide I，a″selective″protein kinase C inhibitor，Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics.290：76-82)。在存在或不存在化合物3的条件下，LFA-1/ICAM-I-Ig结合曲线的非平行斜率可能是因为在异种配体结合的ELISA条件下其不能实现与该化合物的完全平衡。在LFA-1/化合物2B形式的配体结合的ELISA中，化合物3浓度的增大明显地使化合物2B的结合曲线向右迁移至较高的EC50值处，并且不使最大结合力减小(图10D)。sICAM-1浓度的增大也显示出类似的作用(图10B)，虽然在曲线中的迁移程度受到在2.7μM处可获得的最大sICAM-1浓度的限制。因此，sICAM-1和化合物3对ICAM-I-Ig和化合物2B至LFA-1的结合的影响就是如上所述的直接竞争的特征。
A-286982对ICAM-I-Ig和化合物2B至受体的结合的影响则明显不同(图10E和10F)。在LFA-1/ICAM-1 ELISA中，ICAM-I-Ig曲线向右迁移至较高的EC50值处；但是，随着A-286982浓度增大，ICAM-I-Ig至LFA-1的最大结合显著降低。随着A-286982浓度的增大，最大结合力和配体结合曲线的向右迁移也减小，该减小即是如上所述的变构抑制作用的反映。A-286982使配体亲合力和结合能力都减小(Lutz，M.，and Kenakin，T.1999.Quantitative MolecularPharmacology and Informatics in Drug Discovery，John Wiley & Sons，Ltd.，New York，Matthews 1993)；这说明A-286982是一种不能克服的ICAM-I-Ig结合拮抗剂。相反，在LFA/小分子ELISA中，微摩尔浓度的A-286982的存在使化合物2B的结合曲线迁移至较低的EC50值处，并且显示可以增强化合物2B至LFA-1的结合(图10F)。A-286982对化合物2B和ICAM-I-Ig的结合的作用差异可能是由于已知的结合至LFA-1 IDAS位上的化合物的变构作用引起的。在阐述该方法的结合试验中，A-286982结合数据用以说明对于小分子和结合至LFA-1上的蛋白配体的变构抑制作用。
Schild分析法还可以用于研究化合物是否通过竞争一个结合位而抑制配体的结合(Lutz and Kenakin 1999，Pratt和Taylor 1990，Matthews1993，Kenakin 1997，Coultrap 1999)。该模型基于下述假设：在试验中同等活性的反应是配体占据等量受体的结果，而且拮抗剂的存在并不改变最大结合。在Schild分析法中，剂量比为存在或不存在拮抗剂时的EC50值的比，而且其是产生等活性响应的配体浓度的量度。针对各个拮抗剂的浓度确定该剂量比，并且如图11所示，对Schild回归进行作图。在Schild回归中，斜率为1的线性响应表示拮抗剂的抑制作用是直接竞争和不可逆的(Lutz和Kenakin 1999，Kenakiα 1997)。在不会使最大结合减小的变构抑制剂的情况下，Schild分析法会产生非线性关系和/或显著偏离1的斜率(Lutz和Kenakin 1999，Kenakin1997)。图11中显示了sICAM-1和化合物3的Schild回归，其可比的斜率分别为1.26和1.24。根据图5(A)和(C)的数据，分别对s-ICAM-1 (-▲-)和化合物3(-●-)在LFA-1/ICAM-1配体结合的ELISA中的拮抗作用进行Schild回归作图。化合物3的斜率为1.24，y-截距为10.9且R＝0.99832。sICAM-1图的斜率为1.26，y-截距为8.51且R＝0.99131。虽然Schild分析法需要斜率接近1的线性回归，用以说明直接的竞争抑制作用，但是大量文献中并没有指出何种范围是可以接受的Schild值。斜率1.24和1.26落入了许多公开的用于支持竞争性结合结论的Schild值内，因此，这些斜率值并不被认为是显著不同于1。回归图的线性和斜率关系的类似性与配体(ICAM-I-Ig)的结合相一致，而且两种拮抗剂(sICAM-1和化合物3)以相同方式结合至同一位置上。
上述结合试验和所讨论的分析法用于形成确定直接竞争性LFA-1抑制剂的方法。使用一种或多种本文中描述的试验类型可以对潜在的直接竞争性治疗试剂进行研究，用以确定该有益试剂是否确实与已知的天然和合成配体形成竞争，从而在ICAM-1进行结合的相同的LFA-1位上结合。因此，直接竞争性拮抗治疗剂被确定为可用于本发明的方法中，用以治疗需要对由LFA-1及其与ICAM-I的相互作用介导的炎性病症进行治疗的病人。
VII.确定可用于治疗人类疾病的化合物的方法
本文中描述了一种精细的研究方法，其使用细胞增长的siRNA(小分子干扰RNA序列)抑制特性曲线来确定在一组培养的细胞系中具有类似的细胞增长特性曲线的化合物，其中所述siRNA指向参与细胞增长和人类疾病的细胞靶标。人们希望使用siRNA数据，因为siRNA使靶标基因静止并且直接与由该靶标产生的细胞增长抑制作用相联系。因此，siRNA数据可用于将对靶标功能的抑制与对细胞增长的抑制关联起来。以此方式确定的化合物可以用于治疗人类疾病。
图12为用于鉴定用以治疗人类疾病的化合物的流程图，所述鉴定过程使用siRNA生长抑制数据。
该方法包括选择参与细胞生长并含有所述靶标的细胞靶标(例如，蛋白质或其它二元共聚物，而且其形成受到基因转录和/或转译的控制)，所述靶标的抑制作用可用于控制细胞生长。可以从包括科学文献的公开物中的这种靶标列表中进行选择，其包括酶、受体和参与蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质。一种该可用的靶标是β-连环蛋白与TCF族蛋白，例如TCF-4的缔合。这些蛋白质位于Wnt路径中并且参与多种人体肿瘤包括常见癌的生长和增殖。与β-连环蛋白结合并阻挡其与TCF-4结合的化合物可用于阻止所选基因的转录和人体癌，尤其是结肠癌内的肿瘤的生长。靶标独有的小的干扰RNA(siRNA)序列可购自商业供应商，例如Dharmacon，Boulder CO。从NationalCancer Institute获得60个与癌(例如，衍生自结肠和乳腺的NCI细胞系)和/或炎症(例如，NCI白血病细胞系)有关的细胞系，在增大量的、指向靶标的siRNA存在下使这些细胞系生长，直到细胞生长受到抑制为止。可选地，单一浓度的siRNA可以用于拮抗所有细胞系，而且可以测量对细胞生长的相对抑制。生长依赖于靶标的存在的细胞系将受到抑制，而其它细胞系的依赖性可能较小，因此其生长会受到较小的抑制。因此，对NCI的60细胞系组的抑制会产生对于各个siRNA和试验靶标的一种生长抑制。预计使用不普遍存在于NCI-60细胞系组的细胞系也是该方法的一部分。此外还预计诸如LipofectinTM，LipofectamineTM等的试剂可以调节siRNA至细胞的输送。可以使用NCI的COMPARE程序搜索所得的剂量滴定化合物对于该60个细胞系的生长的NCI影响数据，或者用以确定具有类似活性特性曲线的化合物(例如，与未抑制的生长相比，以50％比例抑制细胞生长的化合物的浓度，化合物的GI50值)。可以通过统计或其它方法对该类似性进行定量，所述其它方法包括用在NCI COMPARE程序中的Pearson相关性。可以将不同于NCI COMPARE的其它检索算法用于定义化合物与siRNA的类似性。可以通过互联网在线分析从NCI获得数据，或者可以将其下载到计算机或计算机网络上并进行离线分析。其它数据库包括将化合物结构与其细胞生长抑制性结合起来的公用和私人数据库，这些数据库也可以用于本发明的目的中。对于每个靶标而言，当某化合物的生长活性模式与由siRNA试验产生的生长抑制的模式类似时，该化合物应具有常见的亚结构特征(例如，苯基、羧基、氢键供体基团等)，该特征可以定义结构活性关系(SAR)。药物研发领域的熟练药剂师通常使用这种SAR关系，用以将拮抗靶标的化合物的活性与常见的结构图连接起来。对SAR的研发和改进可用于确定和设计可能显示类似或改善的细胞活性的结构类似的化合物。通过对结构相关的化合物进行比较来研发和改进SAR。在NCI数据库或其它数据库中进行计算机检索以查找可商购获得的化合物，或在计算机图书馆内检索目标和不同结构特性和计算性质(例如‘药物类似性’)的化合物，从而合成或确定可用的化合物。可以在细胞生长试验中检验商购或合成的化合物，以改善其细胞生长抑制效力，而且该试验数据(用于效力的改善和降低)可以用于改善SAR对于由靶标介导的细胞生长的抑制性能。重复循环性的数据采集、SAR的改善、化合物的获取、化合物的试验/数据采集可以确定在10微摩尔以下就具有细胞生长抑制作用的化合物。这种化合物可以用于药物研发中，因为其在用作人类疾病模型的动物中通常可以实现大于10微摩尔的循环水平(例如，人类癌症的小鼠异种移植模型，作为非限制性例子)。为了改善效力、效能和作用时间而在动物模型中进行的其它试验可以确定用于临床治疗人类疾病的候选分子，所述疾病包括由异常细胞生长引起的癌症和炎症疾病。可选地，经确定与siRNA抑制细胞生长的活性特性曲线相反的化合物可以作为细胞生长的刺激剂，该刺激剂可用于治疗细胞生长减缓的疾病和病症。提高的细胞生长速度可以用于伤口愈合和其它临床情况下。本文中描述的方法还可以利用已知蛋白质调节剂的基因转染来帮助确定区别性足够大的抑制特性曲线，其中要求该区别足以用来确定具有类似活性特性曲线的分子。
该方法可用于确定有效的化合物，该化合物在10微摩尔以下就具有显著的抑制细胞生长的能力。这些化合物可以用于患有人类癌症和炎症的动物模型中。更优选的是在1微摩尔以下就能抑制细胞生长(GI50)的化合物。再更优选的是生长抑制(GI50)小于100nM的化合物。最优选的是GI50值小于10nM的化合物。本发明的方法还可以用于确定可用的LFA-1、B-cel受体BR3、Grb2(在串联信号中的生长因子受体的下游蛋白质)和在细胞内和外的其它蛋白质靶标的抑制剂。其尤其可用于抵抗位于Wnt路径的靶标，所述靶标包括用于治疗人类结肠癌的β-连环蛋白。还可以用于抵抗与疾病有关的其它靶标，所述靶标位于淋巴瘤、白血病、结肠癌、黑素瘤、乳腺癌、脑瘤、肺癌、肾癌和其它人类癌症。该方法还可用于确定可用于治疗由炎症细胞的生长和增殖介导的人类炎症疾病的化合物。这些包括但不限于银屑病、湿疹、哮喘、风湿性关节炎和干眼症。以上述方式确定并且在人类疾病的动物模型中具有活性的化合物可用于治疗包括癌症和炎症疾病的人类疾病。涉及非癌症和炎症疾病的靶标也可以用于该方法中，而所述癌症和炎症疾病涉及异常细胞的增殖。
此外，预计的方法是使用siRNA细胞活性数据按照下述方式进行靶向或者选择靶标：通过对共用和/或私人化合物细胞活性数据库进行搜索来找寻对化合物或化合物集合产生响应的类似的细胞活性特性曲线，用以作为对可用于确定人类药物的化合物进行确定的方法。
VIII.实施例
A.材料
在人体293细胞中制备全长的重组人类膜结合的LFA-1和重组人类结构域5ICAM-I-Ig融合体(ICAM-I-Ig)，并按照所述方式进行纯化(Fisher等，1997，Keating等，2000)。sICAM-1(为了方便用在体外试验中，其为不具有跨膜和胞浆结构域的天然ICAM-I的截短形式，但是具有完整的LFA-1结合表位)和MEM-48得自R&D系统(Minneapolis，MN)。使用标准步骤产生小鼠单细胞系抗人类β2整联蛋白(克隆PLM2)(Fisher等，1997)。按照描述的方式合成小分子和肽拮抗剂(Gadek等，2002，Burdick 1999，Liu等，2000)。化合物1-5和A-286982如图4所示。化合物1、2A和2B与化合物3类似，但是加入连接物而使其与荧光素(化合物1和2B；2A未与荧光素结合)结合。通过使胺官能团与荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)偶合来制备荧光素缀合物(Keating等，2000)。其它被分析的分子包括化合物6和7(Gadek等，2002)、蝮蛇毒素(Dennis等，1990)、蝮蛇毒素七肽H2N-CGFDMPC-CO2H和H2N-CGY(m)DMPC-CO2H、环蝮蛇毒素肽CRIPRGDMPDDRC和四肽H2N-CN(F)PC-CO2H，其中Y(m)为β-酪氨酸和N(F)为N′-3-苯基丙基天冬酰胺。
Figure S2006800171884D00821
化合物6  化合物7
将所有小分子拮抗剂制成50％DMSO中的10mM溶液，贮存于-20℃下。化合物5为Hoffman-La Roche Inc.(Nutley，NJ)赠送的赠品。
B.试验
实施例1：亲合力的测量
按照之前的描述，使用与小分子拮抗剂、化合物1(图2)呈竞争形式的荧光偏振(FP)(Lakowicz 1999，Panvera 1995)测量小分子对LFA-1的亲合力(Keating等，2000)。在含有50mM Hepes，pH 7.2，150mMNaCl，0.05％正辛基糖苷和0.05％牛γ球蛋白(BGG)以及1mMMnCl2，或1mM CaCl2和1mM MgCl2的缓冲溶液中进行所有的测量。首先按照下述方式测量化合物1对LFA-1的亲合力：将2nM化合物1加入到LFA-1的系列稀释液中，最初为在含有MnCl2或CaCl2和MgCl2的缓冲液中的1μM溶液。通过将拮抗剂的系列稀释液加入到2nM化合物1(使用3nM的LFA-1(溶于MnCl2)或40nM的LFA-1(溶于CaCl2和MgCl2))中来进行竞争试验。在ICAM-I-Ig竞争试验中，将LFA-1浓度降低至溶于二价阳离子缓冲液中的2和20nM LFA-1，用以使ICAM-I-Ig的抑制作用最大化。试验中使用的不同LFA-1浓度要考虑在亲合力的计算中(参见下文)。在37℃下，在96-孔黑色HE96板(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上培养溶液2小时。在分析读板器上485nm的激发态光、530nm的发射光和505nm的二向色过滤器测量荧光偏振(FP)。测定不含化合物1的适当试样的强度，通过减去该试样强度来校正除去所有粗略强度数据的背景发射。用KaleidaGraph软件(Synergy Software，Reading，PA)，使用非线性最小二乘方拟合的4参数方程式分析LFA-1结合和拮抗剂竞争数据，用以获得LFA-1滴定的EC50值和拮抗剂的IC50值。用于拟合数据的方程式为Y＝((A-D)/(1+(×/C)λB))+D，其中Y为试验响应，A为Y-在最上端渐近线处的值，B为斜率因子，C为IC50或EC50，且D为Y-在最下端渐近线处的值。通常，在下述的同类FP和异种ELISA形式中测量的数据含有较大的信号-背景比例，而且在拟合的数据中偏差估计值通常小于拟合参数终值的10％。使用Klotz和Hill分析法计算存在和不存在A-286982时LFA-1对化合物1的平衡离解常数(Kd)(Panvera，1995)。使用IC50值、化合物1/LFA-1的Kd和化合物1和LFA-1在竞争试验中的浓度计算拮抗剂对于LFA-1的亲合力(Kj)(Keating等，2000，Jacobs等，1975)。
实施例2：LFA-1/ICAM-I和LFA-1/小分子酶-结合的免疫吸收试验(ELISAs)。
(A)拮抗剂竞争：在竞争形式下评价小分子和sICAM-1对ICAM-I-Ig或荧光素-标记的小分子拮抗剂、化合物2B至LFA-1的结合的破坏能力(Gadek等，2002，Burdick 1999，Quan等，1998)。化合物2B与化合物1类似，但是其在小分子和荧光素之间具有更长的连接，用以使抗-荧光检测抗体的结合最大化。4℃下，在96-孔板上涂覆5μg/ml(33.3nM)溶于磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中的小鼠抗-人类B2整联蛋白(非官能阻断抗体)并经历整夜。室温下用试验缓冲液(20mM Hepes，pH7.2，140mM NaCl，1mM MnCl2，0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％Tween-20)封闭该板1小时。在缓冲液中洗涤(50mMTris-HCl，pH7.5，100mM NaCl，1mM MnCl2和0.05％Tween-20)之后，加入8nM LFA-l(LFA-1/ICAM-1 ELISA)或2nM LFA-1(LFA-1/小分子ELISA)，之后在37℃下培养1小时。洗涤该板，且对于LFA-1/ICAM-A ELISA而言，将小分子拮抗剂或sICAM-1的系列稀释液加入到板中并保持30分钟，之后在37℃下加入0.89nM的ICAM-I-Ig(终浓度)并保持2小时。再次洗涤之后，加入山羊抗-huIgG(特定的Fc)-HRP并在37℃下培养1小时。在LFA-1/小分子ELISA中，将稀释的拮抗剂和25nM化合物2B同时加入到板中，之后在37℃下培养2小时。洗涤之后加入绵羊抗荧光素-HRP，并在37℃下再培养1小时。对于两次试验而言，在洗涤之后通过下述方式检测结合的HRP-缀合抗体：加入四甲基联苯胺(TMB)，之后在加入1M H3PO4使反应停止之后测量产物在450nm处的吸收率。使用KaleidaGraph软件拟合出上述的4参数方程式，从而确定每个曲线的IC50值。LFA-1/ICAM-1试验的形式和结果与之前报道的情况类似(Gadek等，2002，Burdick 1999)；但是，由于抗体是捕获LFA-1而非直接被涂覆在ELISA板上，因此该形式更加稳固。
(B)配体结合：按照上述方式进行LFA-1/ICAM-1和LFA-1/小分子ELISAs，只是在存在或不存在拮抗剂的情况下将ICAM-I-Ig或化合物2B的系列稀释液加入到板中。在所有情况下配体都与拮抗剂同时加入。在加入拮抗剂和配体之后，进行洗涤和加入检测抗体之前，在37℃下将板培养6小时以达到平衡状态。通过拟合如上所述的4参数模型来确定每个曲线的EC50值。通过Schild回归来分析存在和不存在拮抗剂的情况下所产生的EC50值(Arunlakshana和Schild 1959，Lutz和Kenakin 1999，Pratt和Taylor 1990，Matthews 1993，Kenakin，1997)。按照下述方式计算Log(浓度比-1)对拮抗剂浓度的Schild图：(浓度比-1)＝((带有拮抗剂的配体EC50)/(没有拮抗剂的配体EC50))-1。通过将线拟合到线性方程式Y＝A+BX中来计算Log(浓度比-1)对拮抗剂浓度的图的斜率。
实施例3：放射性同位素标记的、可光激活的化合物3的类似物对LFA-1的交联
在存在或不存在290μM化合物3的情况下，在37℃下用4.1μM化合物5、氚标记的可光激活的化合物3的类似物(Kauer等，1986)将全长的人体膜结合的LFA-1或BSA(0.35mg/mL[分别为1.4和5.3μM]，溶于20mM Hepes、150mM NaCl、5mM CaCl2、5mM MgCl2、1mM MnCl2和1％正辛基糖苷中，pH7.2)培养过夜。化合物5与LFA-1的摩尔比为3∶1。使用预涂了1％BSA的96孔板进行培养。在即将进行交联之前通过凝胶过滤迅速除去过量的化合物5，所述凝胶过滤采用与同一缓冲液达到平衡的96孔形式的G-25微旋柱。通过暴露在高压汞蒸汽灯下(450瓦，一级玻璃，Vineland，NJ)而使LFA-1/化合物5复合物发生交联。在照射过程中，在冰上冷却试样并用5mm厚的硼硅玻璃进行保护，以使蛋白质的降解最小化。按照上述方式用凝胶过滤法(G-25)除去剩余的未连接的化合物5。然后在8M胍基盐酸盐(GuHCl)中使交联复合物变性并还原和烷基化。使经处理的蛋白质经历SDS-PAGE，之后进行考马斯蓝染色。用自身放射线照相法观察放射性同位素标记的蛋白质。
为了确定化合物5的结合位，在6M GuHCl，20mM Hepes，10mMEDTA，pH6.8存在下，用粒度排除色谱分离经处理的αL和B2亚基，然后在75℃下用具有7M GuHCl且溶于10％醋酸的2.6 M羟胺进行化学裂解。用SDS-PAGE分离放射性同位素标记的蛋白质，并且用声放射线照相法观察或将其转移至聚偏二氟乙烯膜上，用考马斯蓝染色，之后用N末端蛋白质序列进行确定。
实施例4：缺少结构I的αL构建体的产生
所用的构建体，pLFA.huID.Δp，含有从结构域I的Narl限制性位点5′至结构域I的第二PfIM1限制位3′的αL基因序列，其中删除了结构域I的第一PfIM1限制性位点3′(Edwards等，1995)。为了产生缺少结构域I的突变体，制备了下列引物：正向引物
CACTGTGGCGCCCTGGTTTTCAGGAAGGTAGTGGATCAGGCACAAGCAAACAGGACCTGACTTC，含有从Narl位点至结构域I开始处的序列、编码GSGSG的DNA序列和在结构域I结束之后的αL序列的2bp，以及反向引物TCTGAGCCATGTGCTGGTATCGAGGGGC，其在结构域I之后的第二PfIM1限制性位点上引发聚合反应。使用这些引物和经BgI II线性化的pLFA.huID.Δp进行PCR，其在结构域I内的位置内剪切。该DNA片段被扩增，所述片段含有从Nar 1位点至第二PfIM1位点的序列，而且其中整个结构域I，从C125至G311均被编码为GSGSG的DNA序列代替。纯化该段DNA，用Nar1和PfIM1对其进行消化并将其插入到人的αL质粒的(pRKLFAαm)相应的Nar1和PfIM1位点上。通过序列分析对编码为GSGSG的DNA序列的插入进行确认。
实施例5：缺少结构域I的LFA-1与ICAM-I或化合物2B的结合
用单独的β2构建体(模拟物)或用野生型αL构建体(wt)或缺少结构域I(I-less)的αL构造转染293细胞，并使其恢复3天。分离细胞并将其重新悬浮在黏着缓冲液(0.02M HEPES，pH7.2，0.14MNaCl，0.2％葡萄糖)中。按照所述方式与结合在板上的ICAM-I-Ig相结合(Edwards等，1998)。为了使化合物2B进行结合，将2×105个细胞加入到圆底96孔板的每个孔中，所述板位于含有0.5％BGG，0.1mM MnCl2，1μg/ml抗B2活化抗体MEM-48和1μM化合物2B的黏着缓冲液中。在37℃下将细胞培养1小时，用冷PBS洗涤并用1％的甲醛/PBS固定。然后在室温下用1∶500的绵羊抗荧光素-HRP稀释液培养细胞1小时，用PBS洗涤并用TMB培养15分钟。用1MH3PO4终止反应并在450nm下读数。平行地对转染物进行试验，用以试验表面表达的αL/B2复合物的结构完整性，并通过FACS分析法，使用一组具有已知的结合表位的抗体来试验结构域I的存在或不存在(Edwards等，1998)。
实施例6：人类T细胞黏着试验(细胞粘接试验)
使用人类T淋巴细胞系HuT 78进行T-细胞黏着试验。在PBS中将山羊抗-HuigG(Fc)稀释至2mg/ml，并在37℃下将96孔板的每个孔涂覆50ml而且保持1小时。用PBS洗涤盘并在室温下用溶于PBS的1％BSA封闭1小时。在PBS中将结构域5ICAM-Ig稀释至100ng/ml，并在4℃下以50ml/孔的量将其加入到板O/N中。对100g HuT 78细胞进行离心，并在37℃下于5％CO2培养箱中用5mM EDTA处理细胞团5分钟。在0.14 M NaCl，0.02M Hepes，0.2％葡萄糖和0.1mMMnCl2(试验缓冲液)中洗涤细胞并离心。将细胞重新悬浮在试验缓冲液中，使浓度达到3.0×106c.ml。在试验缓冲液中将抑制剂稀释至2×终浓度，并在室温下用HuT78细胞预培养30分钟。将100μl/孔的细胞和抑制剂加入到板中并在室温下培养1小时。加入100μl/孔的PBS并将板密封，在将100g物质离心转化5分钟。将未粘接的细胞从板中轻轻弹出，并将过量的PBS印迹在纸巾上。将60μl/孔的对硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(0.257g，成为100ml柠檬酸盐缓冲液)加入到盘中，并在37℃下培养1.5小时。用90μl/孔的50mMglycione/5mM EDTA终止酶反应，并在读板器上读取405 nM处的读数。使用Langegren对硝基苯基法测量黏着在5dICAM-Ig上的HUT 78细胞，U.(1984).J.Immunol.Methods 57，379-388。
实施例7：T细胞增殖试验
该试验为由激活作用产生的淋巴细胞增殖的体外模型，其由T细胞受体和LFA-1的参与而被诱发，对与抗原呈递细胞之间的相互作用产生影响(Springer等，1990，Nature)。在4℃下经整夜时间用溶于无菌PBS中的50μl的2μg/ml山羊抗人Fc(Caltag H1 0700)和50μl的0.07μg/ml单克隆抗体至CD3(免疫技术0178)预包被微滴定盘(经认证的Nunc 96孔ELISA)。
第二天吸入包被溶液。然后用PBS洗涤板2次，在37℃下加入100μl的17ng/ml 5d-ICAM-Ig并保持4小时。在加入CD4+T细胞之前用PBS洗涤板2次。从取自健康献血者的肝素化全血中分离末梢血的淋巴细胞。一种可选方法是通过增白细胞防病法(leukophoresis)从健康的献血者体内获得全血。用盐水将血液稀释为1∶1、分层并在LSM上离心分离2500×g物质30分钟(每100ml中含有6.2g Ficoll和9.4g泛影葡胺钠)(Organon Technica，NJ)。使用骨髓样细胞消耗试剂法消耗单核细胞(Myeloclear，Labs，Hornby，Ontario，Canada)。将PBL重新悬浮在90％的热减活胎牛血清和10％的DMSO中，等分试样并贮存在液氮中。融解后，将细胞重新悬浮在RPMI 1640培养基中(Gibco，Grand Island，NY)，所述培养基中补充了10％的热减活胎牛血清(Intergen，Purchase，NY)、1mM丙酮酸钠、3mM L-谷氨酰胺、1mM非必需氨基酸、500μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μg/ml庆大霉素(Gibco)。
通过负选择法对CD4+T细胞进行纯化(人CD4细胞回收柱Kit #CLl10-5精确的)。37℃下在100ml含有5％CO2的培养培养基(RPMI1640(Gibco)，其中补充了10％的热减活FBS(Intergen)、0.1mM非必需氨基酸、1nM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μg/ml庆大霉素、10mM Hepes和2mM谷氨酰胺)中对100,000个纯化的CD4+T细胞(90％纯度)/微滴定板孔进行72小时培养。在培养开始时将抑制剂加入到板中。在收集细胞之前的最后6小时内滴定加入1μCi/孔的胸腺嘧啶，用以测量这些培养物的增殖响应。通过液体闪烁计数来测量放射性标记的结合(Packard 96孔收集器和计数器)。结果用计数/分钟(cpm)表达。
实施例8：体外混合淋巴细胞培养模型
混合淋巴细胞培养模型为体外移植模型(A.J.Cunningham，″Understanding Immunology，Transplantation Immunology″157-159页(1978))，用其考察各种LFA-1拮抗剂在人类混合淋巴细胞响应的增殖和效应臂中的影响。
细胞的分离：从取自健康献血者的肝素化全血中分离出末梢血(PBMC)的单核细胞。用盐水将血液稀释至1∶1、分层并在LSM上对×2500g物质离心分离30分钟(每100ml中含有6.2g Ficoll和9.4g泛影葡胺钠)(Organon Technica，NJ)。一种可选方法是通过增白细胞防病法从健康的献血者体内获得全血。按照上述方式分离PBMC，将其重新悬浮在90％的热减活胎牛血清和10％的DMSO中，等分试样并贮存在液氮中。融解后，将细胞重新悬浮在RPMI 1640培养基中(Gibco，Grand Island，NY)，所述培养基中补充了10％的热减活胎牛血清(Intergen，购得，NY)、1mM的丙酮酸钠、3mM的L-谷氨酰胺、1mM的非必需氨基酸、500μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μg/ml庆大霉素(Gibco)。
混合淋巴细胞的反应(MLR)：在96孔平底微滴定板内建立单向人体混合淋巴细胞的培养。在200μl的完全培养基中，对1.5×105个响应子(responder)PBMC和等数量的异基因辐射(3000拉得，3分钟，52秒)刺激子PBMS进行共培养。在培养开始时加入LFA-1拮抗剂。
在37℃下，在5％的CO2中将培养物培养6天，然后用3H-胸腺嘧啶核苷(6.7 Ci/mmol，NEN，Boston，MA)脉冲6小时。在Packard细胞收集器中收集细胞(Packard，Canberra，加拿大)。用液体闪烁计数法测量[3H]TdR的结合。结果表示为每分钟的计数(cpm)。
实施例9：用以逆转干眼症发病的兔子模型
通过手术闭合泪腺排泄管而使兔子患上干眼症，并使兔子在不治疗的情况下维持至少4周。参见Gilbard，J.P，1996“Dry Eye：phramcological approaches，effects，and progress”CLAO J.22，141-145。经Schirmer试验确定了干眼症和眼表面的染色之后，滴入本发明的LFA-1拮抗剂，其为溶于中性、等渗缓冲水溶液中的浓度为0.01、0.1和1.0％的溶液。给药方式为向眼表面滴入一滴50微升的液滴，每日5次，持续4周每天滴入。每天对干眼症的症状进行一次监测，监测4周，Schirmer分数的升高和/或眼表面染色量的降低表明了LFA-1拮抗剂在治疗干眼病中的作用。
实施例10：I期人体研究
多达56个健康个体参加了试验。进行了单次和多次给药LFA-1拮抗剂的随机、受控、逐步提高剂量的试验。在6-8个LFA-1拮抗剂剂量水平中的各水平下对同龄的7个患者(5个治疗，2个对照)各自进行治疗，其中所述拮抗剂制成无菌、中性、等渗的缓冲水溶液。患者每天接受单一的眼内给药。在随后的一周内获得是试样的药物代谢动力学和药效评价。第8天开始，患者每天接受同样剂量的LFA-1拮抗剂，总共持续14天。评价了PK/PD评价、安全性试验室研究、Schirmer试验、角膜染色和结膜活组织检查。
实施例11：II期人体研究
150个患有干眼病的成年患者参加了试验，所述干眼症如主要的包含/排除标准所作的定义。患者可以患有或不患有干燥综合症或干燥病。对LFA-1拮抗剂进行随机、受控的剂量测定试验。三组患者接受标记剂量的丽眼达或者两个LFA-1拮抗剂剂量水平中的一个剂量，所述拮抗剂被制成中性、缓冲、等渗的水溶液，每日给药，持续12周。随后在接下来的三个月时间内，在Schirmer′s试验、角膜染色和整个疾病严重性中对病人进行安全性和改进性的证明试验。在一小组病人中获得了结膜活组织检查。
虽然本文中描述和显示了本发明的优选实施方案，但是对本领域熟练技术人员而言显而易见这种实施方案只是提供作为实施例。在不偏离本发明的情况下，本领域熟练技术人员现可以进行各种变型、改变和替换。应该理解，在本发明的实施中可以采用本文中描述的本发明实施方案的各种替换形式。意图利用下列权利要求定义本发明的范围，以及在这些权利要求及其覆盖的等效范围内的方法和结构。

Claims (26)

1.LFA-1拮抗剂在制备用于治疗干眼病的药物中的用途，其中所述治疗包括向需要治疗的患者施用有效量的所述LFA-1拮抗剂，其中所述LFA-1拮抗剂包括式II的化合物或其药物可接受的盐或酯
式II
其中，R28选自下列基团：
Figure FSB00000445733100012
和R27选自下列基团：
Figure FSB00000445733100013
且R29为氢。
2.淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)拮抗剂在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述治疗包括向需要治疗的患者施用有效量的所述LFA-1拮抗剂，其中所述LFA-1拮抗剂包括式II的化合物或其药物可接受的盐或酯
式II
其中，R28选自下列基团：
和R27选自下列基团：
且R29为氢。
3.包含LFA-1拮抗剂的药物组合物在制备用于治疗干眼症的药物中的用途，其中所述治疗包括向需要治疗的患者施用有效量的所述药物组合物，从而所述施用有效促进所述患者的所述眼部的泪液分泌或粘蛋白的产生，其中所述LFA-1拮抗剂包括式II的化合物或其药物可接受的盐或酯
Figure FSB00000445733100031
式II
其中，R28选自下列基团：
Figure FSB00000445733100032
和R27选自下列基团：
Figure FSB00000445733100033
且R29为氢。
4.LFA-1拮抗剂在制备用于治疗干眼病的药物中的用途，其中所述治疗包括对患者进行干眼诊断试验；基于所述诊断步骤的结果来确定所述患者是否患有干眼病；和在所述干眼病的诊断之后，向所述患者给药有效量的淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)的拮抗剂，其中所述LFA-1拮抗剂包括式II的化合物或其药物可接受的盐或酯
Figure FSB00000445733100041
式II
其中，R28选自下列基团：
Figure FSB00000445733100042
和R27选自下列基团：
Figure FSB00000445733100043
且R29为氢。
5.权利要求1、2、3或4的用途，其中式II化合物进一步包括如式II’所示的立体化学：
Figure FSB00000445733100044
式II’。
6.权利要求1、2、3或4的用途，其中所述LFA-1拮抗剂为：
Figure FSB00000445733100051
7.权利要求1、2、3或4的用途，其中所述LFA-1拮抗剂选自下组化合物：
Figure FSB00000445733100052
8.根据权利要求1的用途，其中所述施用包括借助载体局部施用所述化合物，其中载体选自滴眼液、液体洗液、凝胶、软膏、喷雾剂和脂质体。
9.根据权利要求8的用途，其中所述局部施用包括借助装置将所述化合物输注至所述患者眼部，所述装置选自泵导管系统、连续或选择性释放装置和隐形眼睛。
10.根据权利要求1的用途，其中所述施用包括通过滴鼻液或鼻部喷雾或喷雾液体将所述化合物的液体或液体悬浮液系统施用至所述患者的口或鼻咽道内，从而使治疗有效量的所述化合物与所述患者眼部的泪腺、结膜组织、眼泪或眼表面中的一个或多个部位接触。
11.根据权利要求1的用途，其中所述施用包括施用所述化合物的口服形式，从而使治疗有效量的所述化合物通过系统吸收和循环而与所述患者眼部的泪腺、结膜组织、眼泪或眼表面中的一个或多个部位接触。
12.根据权利要求1的用途，其中通过施用所述化合物的可注射形式来实现所述给药，从而使治疗有效量的所述化合物通过系统吸收和循环而与所述患者眼部的泪腺组织、结膜组织、眼泪或眼表面中的一个或多个部位接触。
13.根据权利要求1的用途，其中通过施用所述化合物的栓剂形式来实现所述施用，从而使治疗有效量的所述化合物通过系统吸收和循环而与所述患者眼部的泪腺组织、结膜组织、眼泪或眼表面中的一个或多个部位接触。
14.根据权利要求1的用途，其中通过施用所述化合物的凝胶、乳膏、粉末、泡沫、晶体、脂质体、喷雾剂或液体悬浮液形式的眼内滴注来实现所述施用。
15.根据权利要求1的用途，其中将所述化合物施用至所述患者的眼表面，给药量为足以获得约1×10-7-约1×10-1摩尔/升的浓度。
16.根据权利要求1的用途，其中所述施用是经持续释放型插入物或植入物、结膜下注射、眼内注射、眼周注射、眼球后注射或眼房内注射。
17.根据权利要求9的用途，其中所述连续或选择性释放装置是眼部插入物或植入物。
18.根据权利要求9的用途，其中有效量的所述化合物局部分布到鼻、鼻道和鼻腔中一处或多处。
19.根据权利要求9的用途，其中所述连续或选择性释放装置包含生物相容的聚合物。
20.根据权利要求19的用途，其中所述施用包括控制释放来自所述生物相容的聚合物的所述化合物。
21.根据权利要求4的用途，其中通过对所述患者的眼进行成像或者对所述患者的眼生理试样进行分析来进行所述诊断步骤。
22.一种包含浓度为0.1-10.0％w/v的权利要求1的LFA-1拮抗剂的眼部药物制剂，其中所述制剂在pH 7下缓冲。
23.根据权利要求22的制剂，其中所述制剂用磷酸一氢钠和磷酸二氢钠中的一种或多种缓冲，且其中所述制剂可选地包含作为防腐剂的甲基帕拉贝和/或丙基帕拉贝。
24.根据权利要求22或23的制剂，其中所述制剂适于作为局部眼滴液每日施用1-4次，可选每日两次。
25.根据权利要求24的制剂，其中所述液滴为10-60微升。
26.根据权利要求24的制剂，其中所述液滴为25-50微升。
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