JPH08501773A

JPH08501773A - 可溶性補体受容体１の新規なグリコフォーム

Info

Publication number: JPH08501773A
Application number: JP6505581A
Authority: JP
Inventors: シー．ジュニアマーシュ，ヘンリー; エイ．ジー．スミス，リチャード; グレイスイエ，チャン−ジン; リフター，ジョン; マリーフリーマン，アン; エル．ゴッセリン，マイケル
Original assignee: ティーセルサイエンシズ，インコーポレーテッド; スミスクラインビーチャムピー．エル．シー．
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1996-02-27
Anticipated expiration: 2020-06-22
Also published as: US5858969A; EP0656061B1; ES2210241T3; JP3662250B2; EP0656061A1; CA2141842A1; CA2141842C; IL106558A; DE69333287T2; DK0656061T3; ZA935728B; DE69333287D1; MX9304800A; IL106558A0; CN1089951A; PT656061E; ATE253591T1; AU670453B2; US6057131A; WO1994003603A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、可溶性補体受容体１型（ｓＣＲ１）の新規なグリコフォームおよび調製物、ならびに炎症や不適当な補体活性化を伴う補体媒介疾患および障害、さらに血栓症やショック症状の治療におけるその使用に関する。本発明は、新規なグリコフォームおよび該グリコフォームを生産、検出、富化、精製するための方法を提供する。さらに、本発明は、組換えによりまたは化学的に該グリコフォームを特定的に製造する方法も提供する。本発明の好ましい実施態様は、シアリル化グリコフォームおよびクロマトフォーカシングにより測定してｐＩ≦5.1を有するかまたはシアル酸対マンノースのモル比が≧0.25であるグリコフォームを包含する。このグリコフォームは単独でまたは血栓溶解剤と組み合わせて治療用組成物に製剤化し得る。

Description

【発明の詳細な説明】可溶性補体受容体１の新規なグリコフォーム発明の分野本発明は、可溶性補体受容体１型（ｓＣＲ１）の新規なグリコフォーム（glyc oform）、ならびに補体活性を伴う疾患および種々の炎症および免疫疾患の診断ならびに治療におけるその使用に関する。本発明はまた、前記グリコフォームを生産し、検出し、精製する方法を提供する。発明の背景補体系正常血清中のグロブリンの約10％を占める補体系は、外来抗原に対する免疫系の応答において重要な、多くの異なるタンパク質から構成されている。補体系はその一次成分が断片化されるときに活性化され、その断片が、単独でまたは他のタンパク質と一緒になって、別の補体タンパク質を活性化してタンパク質加水分解カスケードをもたらす。補体系の活性化は、血管透過性の増加、食細胞の化学走性、炎症細胞の活性化、外来粒子のオプソニン化作用、細胞の直接的殺傷、および組織の損傷へと導く。補体系の活性化は抗原−抗体複合体（古典経路）が引き金となるか、または、例えば病原細菌の細胞壁に存在するリポ多糖（第二経路）が引き金となり得る。膜結合補体受容体１型補体受容体１型（ＣＲ１）は赤血球、単球／マクロファージ、顆粒球、Ｂ細胞、一部のＴ細胞、牌臓の濾胞樹状細胞、および糸球体の有足細胞の膜に存在している。ＣＲ１は補体成分Ｃ３ｂおよびＣ４ｂと結合することから、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体とも呼ばれている。ＣＲ１の構造的機構および一次配列は知られている（Klicksteinら，1987，J．Exp．Med．165：1095―1112，Klicksteinら，1988， J．Exp．Med．168：1699−1717； Hourcadeら，1988，Ｊ．Exp．Med．168：125 5−1270）。これは60〜70個のアミノ酸を含有する30のショートコンセンサスリピート（shortconsensus repeat：S C R）から構成されている。各ＳＣＲにおいて、平均65個のアミノ酸のうち29個が保存されている。各ＳＣＲはジスルフィド架橋を介して三次元三重ループ構造を形成すると示唆されており、ジスルフィド結合中に第３と第１の、そして第４と第２の半システインを有する。さらに、ＣＲ１は７つのＳＣＲの４つのロング相同リピート（long homologous repeat：ＬＨＲ）として配列される。翻訳後に除かれるリーダー配列に続いて、ＣＲ１分子は、Ｃ４ｂ結合ドメインを含む大半のＮ末端ＬＨＲ−Ａと、これに続くＣ３ｂ結合ドメインを含む２つのリピートＬＨＲ−ＢおよびＬＨＲ−Ｃと、大半のＣ末端ＬＨＲ−Ｄと、これに続く２つの追加のＳＣＲ、25残基の推定上の膜貫通領域および43残基の細胞質尾部とから構成される。ＣＲ１はこのＳＣＲ相同により特徴づけられるタンパク質スーパーファミリーのメンバーである。Ｃ３／Ｃ４結合機能を有するスーパーファミリーの一部のメンバーとして、ＣＲ２、Ｃ４結合タンパク質、Ｈ因子、Ｂ因子、およびＣ２を挙げることができ、一方、この機能を欠くタンパク質としてはインターロイキン−２受容体、β２グリコプロテインＩ、Ｃ１ｒ、ハプトグロビンα鎖、およびXIIIb因子を挙げることができる。ＣＲ１は糖タンパク質で、その推定アミノ酸配列は細胞外領域に25の潜在的なＮ結合グリコシル化部位（アミノ酸共通配列ＮＸＳまたはＮＸＴ）をもつことが知られている。利用可能な部位のうち６〜８部位のみがオリゴ糖と結合していると報告された（Sim，1985，Biochem．J．232：883）。ＣＲ１の非グリコシル化形態はツニカマイシンの存在下で生産されたことがあり、ｉＣ３への結合低下を示した（Lublinら，1986，J．Biol．Chem．261：5736）。この糖タンパク質のＮ末端はブロックされているらしい。これまでに、４つの異なるＣＲ１の対立形質またはアロタイプが同定されており、大きさが30〜50 kDa増加する点で異なっている。これらのアロタイプの遺伝子頻度はヒト集団において相違する（Holerら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci． USA 84：2459−2463）。Ｆ（またはＡ）アロタイプは４つのＬＨＲから構成され、約250 kDaの分子量をもつ。より大きいＳ（またはＢ）アロタイプは分子量が約290 kDaで、ＬＨＲ−Ｂの５’半分とＬＨＲ−Ａの３’半分とのキメラである第５のＬＨＲを含み、第３のＣ３ｂ結合部位をもつと想定される（Wongら，19 89，J．Exp．Med.169：847）。最も小さいＦ’ （またはＣ）アロタイプは、ＬＨＲ−Ｂと１つのＣ３ｂ結合部位の欠失により生じたらしく、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者に多く見られる（Van Dyneら，1987，Clin．Exp． Im munol．68：570； Dykmanら，1983，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 80：1698）。可溶性補体受容体１型天然に存在する可溶性形態のＣＲ１は、正常な個体と一部のＳＬＥ個体の血漿中に検出された（Yoonら，1985，J．Immunol．134：3332−3338）。その特性は構造的にも機能的にも赤血球の（細胞表面）ＣＲ１の特性に似ている。Hourcade ら（1988，J．Exp．Med．168：1255−1270）も、分泌型のＣＲ１をもたらすと想定されたヒトＣＲ１転写単位中に別のポリアデニル化部位を見いだした。この末端切断型（truncated）配列によりコードされるｍＲＮＡはＣＲ１の最初の8.5のＳＣＲを含み、Ｃ４ｂ結合ドメインを含有する約80 kDaのタンパク質をコードする。この末端切断型配列に対応するｃＤＮＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクトして発現させたところ、それは予期されたＣ４ｂ結合活性を示したが、Ｃ３ｂと結合しなかった（Krychら，1989，FASEB J．3：A368）。Krychらも、いくつかのヒト細胞系において想定されたものに類似したｍＲＮＡを見いだし、Ｃ４ｂ結合活性を有する末端切断型の可溶性ＣＲ１がヒトにおいて合成されうると予想した。また、いくつかの可溶性ＣＲ１断片が、発現すべきＤＮＡから膜貫通領域を除去することにより組換えＤＮＡ法によって作製された（Fearonら，Intl．Patent Publ．WO 89／09220，10／5／89；Fearonら，Intl．Patent Publ．WO 91／0504 7，4／18／91）。可溶性ＣＲ１断片は機能的に活性で、Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂと結合し、これらが含む領域に応じてＩ因子の補因子活性を示した。かかる構築物は好中球の酸化的バースト（oxidative burst）、補体媒介溶血、Ｃ３ａおよびＣ５ａの生産といった補体活性化の結果をin vitroで阻害した。可溶性構築物のｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃも逆受身アルサス反応においてin vivo活性を示し（Fearonら，1989，1991，前掲； Yehら，1991，J．Immunol．146：250）、虚血後の心筋炎症および壊死を抑制し（Fear onら，前掲；Weismanら，Science，1990，249：146−151）、移植後の生存率を高めた（Pruitt & Bollinger，1991，J．Surg．Res 50：350；Pruittら， 1991 Transplantation 52：868）。さらに、ベクターｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃの可溶性産物とｐ−アニソイル化ヒトプラスミノーゲンーストレプトキナーゼーアクチベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）との同時処方がｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃの産物単独と同様の抗溶血活性をもたらし、補体阻害剤ｓＣＲ１と血栓溶解剤との併用が可能であることを示した（Fearonら，前掲）。 1989年10月5日に公開された国際特許公開番号WO 89／09220および1991年4月18 日に公開されたWO 91／05047をここに参考としてそのまま組み入れることにする。発明の概要本発明は、可溶性補体受容体１タンパク質（ｓＣＲ１）の新規なグリコフォーム、ならびに補体活性を伴う疾患および種々の炎症および免疫疾患の治療におけるその使用に関する。本発明者らは、ある種の生産条件のもとで、ｓＣＲ１の新規なグリコフォームが得られ、これらは顕著な機能活性を保持しつつ血液からの持続的クリアランスの望ましい性質を示すことを見いだした。長期の機能的半減期は単純なボーラス用量の投与を可能にし、in vivo効力に寄与する。本発明者らは、特定のｓＣＲ１グリコフォームを分離し、富化するために多様な精製法を適用した。かくして、本発明は、１つ以上の複合オリゴ糖構造（１つ以上の該構造が平均して１個以上のシアル酸残基で終わっている）を含有する可溶性補体受容体１（ｓＣＲ１）糖タンパク質分子を提供する。１つの実施態様において、ｓＣＲ１糖タンパク質の調製物が提供され、該分子は１つ以上の複合オリゴ糖構造を含み、該オリゴ糖構造の少なくとも40％が平均して少なくとも１個の末端シアル酸残基を含有する。好ましくは、該分子は１つ以上の複合オリゴ糖構造を含み、その少なくとも70％が平均して少なくとも１個の末端シアル酸残基を含有する。１つの態様では、ｓＣＲ１調製物は、主要なグリコフォームがクロマトフォーカシングにより測定して5.1より低いかまたはこれに等しい等電点ｐＩを示し、ノイラミニダーゼ処理後にはこのｐＩが増加する、ｓＣＲ１糖タンパク質分子を含有する。他の態様では、ｓＣＲ１調製物は、糖タンパク質中のシアル酸対マンノースのモル比が0.25より大きいかまたはこれに等しいｓＣＲ１糖タンパク質を含有する。好ましくは、本発明によるｓＣＲ１調製物は、脱グリコシル化ｓＣＲ１の少なくとも２５％の機能的補体阻害活性を有する。本発明の分子または調製物の好ましい態様において、ｓＣＲ１糖タンパク質のタンパク質バックボーンはＬＨＲ−Ａ、ＬＨＲ−Ｂ、ＬＨＲ−Ｃ、ＬＨＲ−Ｄ、ＳＣＲ２９、およびＳＣＲ30（膜貫通領域の最初のアラニン残基までで、このアラニン残基を含む）を含有する。本発明はまた、治療上有効な量の上記のようなｓＣＲ１糖タンパク質分子および医薬上許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物に関する。１つの態様では、医薬組成物は治療上有効な量の血栓溶解剤をさらに含有する。好ましくは、血栓溶解剤は次の群から選ばれる：（ａ）プラスミノーゲンアクチベーターまたはその変異型；（ｂ）アニソイル化プラスミノーゲンーストレプトキナーゼーアクチベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）；（ｃ）一本鎖ウロキナーゼ；（ｄ）二本鎖ウロキナーゼ；（ｅ）ストレプトキナーゼ；（ｆ）第１の二本鎖プロテアーゼの１つの鎖を第２の二本鎖プロテアーゼの１つの鎖に結合させた繊維素溶解活性ハイブリッドタンパク質であって、前記第１または第２のプロテアーゼの少なくとも一方が繊維素溶解活性を示すことから、前記ハイブリッドタンパク質が繊維素溶解活性に不可欠な触媒部位（除去しうる遮断基でブロックされていてもよい）を有するもの；および（ｇ）可逆的にブロックされたin vivo繊維素溶解酵素であって、該酵素の繊維素溶解活性に不可欠な触媒部位が、加水分解の擬一次速度定数がｐＨ7.4の等張水溶液中37℃で10^-6／秒〜10^-3／秒の範囲となるような速度で加水分解により除去しうる基でブロックされているもの。本発明はまた、炎症または不適当な補体活性化に関連した疾患または障害の治療方法を提供し、該方法は、かかる治療を必要とする患者に治療上有効な量の上記のようなｓＣＲ１医薬組成物を投与することから成っている。また、血栓症の治療方法も提供され、該方法は、かかる治療を必要とする患者に有効量のｓＣＲ１医薬組成物、好ましくは血栓溶解剤を含有する上記のような医薬組成物を投与することから成っている。上記方法において、患者はヒトであることが好ましい。本発明は、さらに、上記のようなｓＣＲ１糖タンパク質またはｓＣＲ１調製物の生産方法に関し、該方法は、（ａ）オリゴ糖鎖をシアリル化する能力がある培養下の咄乳動物宿主細胞において、ｓＣＲ１のタンパク質バックボーンをコードするＤＮＡ分子を、細胞の生育が栄養素の供給によって制限されない条件下で発現させ、そして（ｂ）培養物からｓＣＲ１糖タンパク質を単離する、ことから成っている。好ましい態様において、この方法は、（ｃ）段階（ｂ）で得られた物質からシアル酸含有分子を単離する段階をさらに含んでいる。上記方法において、好適な培養条件は流動床バイオリアクター、ホローファイバーバイオリアクター、ローラーボトル培養または攪拌タンクバイオリアクターシステムを含み、後者の２つのシステムには細胞マイクロキャリアを備えたものと、備えていないものがある。上記細胞培養物のｓＣＲ１糖タンパク質産物はアフィニティー、サイズ排除、イオン交換および／または疎水的相互作用クロマトグラフィーによって精製することができる。シアル酸含有分子の富化はカチオン−またはアニオン−交換樹脂を用いるＨＰＬＣまたはイオン交換ソフトゲルクロマトグラフィーにより行うことが好ましく、その際、より酸性の画分を集める。また、シアル酸含有分子はクロマトフォーカシングやレクチンアフィニティークロマトグラフィーによっても単離することができる。哺乳動物宿主細胞は、好ましくは、発現されたｓＣＲ１糖タンパク質中のオリゴ糖の実質的なシアリル化を確実にするに足るレベルでシアリルトランスフェラーゼを発現する能力を有するものである。適当な宿主細胞としてはＣＨＯ細胞系があり、DUX Bll細胞系が好ましい。略号および定義ＡＰＳＡＣ＝アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ−アクチベーター複合体ｐＩ＝等電点ＨＰＬＣ＝高性能液体クロマトグラフィーＩＨ50％＝溶血の50％阻止をもたらす濃度ＳＲＢＣ＝ヒツジ赤血球ＥＩＡ＝酵素イムノアッセイｗ／ｖ＝重量／容量比ｖ／ｖ＝容量／容量比ｋＤａ＝キロダルトンＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着検定法ｇｕ＝グルコース単位 SDS−PAGE＝ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動グリコフォーム＝炭水化物含量、クロマトグラフ挙動および／または電荷によって特徴づけられる、本発明の可溶性ＣＲ１糖タンパク質のような糖タンパク質の種 TP10HD＝ＬＨＲ−Ａ、ＬＨＲ−Ｂ、ＬＨＲ−Ｃ、ＬＨＲ−Ｄ、ＳＣＲ29、ＳＣＲ30領域（膜貫通領域の最初のアラニン残基までで、このアラニン残基を含む）を含有する特定の可溶性ＣＲ１構築物；TP10HDはプラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ中のＣＲ１コード配列に相当する（Fearonら，国際特許公開No．WO 89／09220，1989年10月5日） TP10HD−CC＝流動床潅流バイオリアクターで培養した細胞から産生され、本明細書中に記載する組合せクロマトグラフィーにより精製されたTP10HD TP10HD−CCW＝分離用ＨＰＬＣカチオン交換クロマトグラフィーにより単離された弱カチオン型のTP10HD−CC TP10HD−CCS＝分離用ＨＰＬＣカチオン交換クロマトグラフィーにより単離された強カチオン型のTP10HD−CC TP10HD−CX ＝ホローファイバーバイオリアクターで培養した細胞から産生され、ＨＰＬＣカチオン交換クロマトグラフィーにより精製されたTP10HD（Fear onら，前掲） TP10HD−CXD＝ｎ−グリカナーゼにより酵素的に脱グリコシル化されたTP10H D−CX 図面の簡単な説明図１は、異なる方法で精製されたＴＰ１０ＨＤ調製物の分析用ＨＰＬＣの結果を示す280nmでの一連の吸光度トレーシングである。ＴＰ１０ＨＤグリコフォームの存在を実証するために、 Hydropore−SCX ＨＰＬＣ精製法の変法を採用した。パネルＡ：アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたＴＰ１０ＨＤ物質は多数のグリコフォームを含み、主要なグリコフォームは強カチオン性であった（すなわち、約125 mM（７）ＮａＣ１で溶出した）。パネルＢ：組合せクロマトグラフィーにより精製されたＴＰ１０ＨＤ物質は多数のグリコフォームを含み、弱カチオン性対強カチオン性グリコフォームの濃度比は70：30から80：20の範囲であった。パネルＣ：ＨＰＬＣカチオン交換クロマトグラフィーにより精製されたＴＰ１０ＨＤは強カチオン性グリコフォームのみを含んでいた。図２は、50〜250 mM（７）ＮａＣ１勾配を用いたS-SepharoseカラムからのＴＰ１０ＨＤの溶出プロフィールを示す。プール１およびプール２に対応するピークを示してある。流速を2 ml／分とした。チャート速度は0.25 cm ／分とした。感度は280 nmのフルスケールで0.2吸光度単位であった。図３は、図２のS-Sepharoseカラムから溶出された物質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルパターンを示す。レーン１：高分子量標品；レーン５および８：S−Sepharose プール１（それぞれ2.4μｇ）；レーン６および９：S−Sepharoseプール２（それぞれ5.0および 6.7 μｇ）図４は、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷ（右のパネル）およびＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳ（左のパネル）からのオリゴ糖鎖の４つのラジオエレクトロフォーレトグラムを示す。下段の２つのパネルはノイラミニダーゼ処理後のパターンを示す。図５は、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳ（Ａ）およびＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷ（Ｂ）からのオリゴ糖鎖の大きさおよび相対割合を示す２つのクロマトグラムである。図６は、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣ（上）およびＴＰ１０ＨＤ−ＣＸ（下）に関するクロマトフォーカシングカラムからのトレーシングを示す。好ましい実施態様の詳細な説明本発明は、可溶性補体受容体１タンパク質（ｓＣＲ１）の新規なグリコフォーム、ならびに補体活性を伴う疾患および種々の炎症および免疫疾患の診断ならびに治療におけるその使用に関する。本明細書では、可溶性補体受容体１（ｓＣＲ１）は30の細胞外ＳＣＲドメインをすべて含有するヒトＣＲ１の可溶性形態として定義される。ｓＣＲ１およびその調製方法は、国際特許公開WO 89／09220（1989年10月5日）およびWO 91／05047（1991年4月18日）に記載されている。好ましくは、ｓＣＲ１物質は、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＵＸＢ１１細胞を流動床灌流バイオリアクターで培養することにより調製される（上記WO91／05 047を参照）。好ましい面では、プラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔを保有するＣＨＯ細胞系ＤＵＸＢ１１（ＡＴＣＣ受託番号 CRL 10052）を使用することができる。本発明のｓＣＲ１グリコフォームはその炭水化物含量、クロマトグラフ挙動および／または電荷により特徴づけられる。従って、本発明は次のものを提供する：（１）１個またはそれ以上のシアル酸残基で終わる複合オリゴ糖を含有するｓＣＲ１；（２）クロマトフォーカシングにより測定して等電点ｐＩ≦５．１を有し、ノイラミニダーゼ処理後にはこのｐＩが増加するｓＣＲ１；（３）オリゴ糖の少なくとも40％が１個またはそれ以上のシアル酸残基で終わる複合オリゴ糖を含有するｓＣＲ１調製物；（４）オリゴ糖構造の少なくとも70％がシアル酸を末端基とする分子である、好ましくはオリゴ糖構造を含有するｓＣＲ１調製物；（５）シアル酸対マンノースのモル比が≧０．２５であるｓＣＲ１調製物；および（６）非グリコシル化ｓＣＲ１の少なくとも２５％の機能的抗補体活性を有する好適なｓＣＲ１グリコフォームおよび調製物。好ましい糖タンパク質は、自然界でヒト糖タンパク質中に存在するオリゴ糖に類似した、またはこれと同一のオリゴ糖を含有するものである。この種のオリゴ糖を含むｓＣＲ１調製物の利点としては、ヒトに投与した際にそれらが免疫原となる危険性が比較的低い点を挙げることができる。本発明のｓＣＲ１グリコフォームおよび調製物はその機能活性によっても特徴づけられる。かくして、それらは下記のものを含むがこれらに限らないｓＣＲ１分子に関連した活性のいずれか１つまたはそれ以上を示すことが好ましい：（１）単量体および／または高分子Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂもしくはＣ４ｍａと結合すること；（２）補体活性化血清におけるＣ３ａまたはＣ５ａ生産の阻害；（３）Ｉ因子の補因子活性；（４）補体誘導好中球酸化的バーストの阻止；および（５）補体媒介溶血の阻止。培養、精製およびｓＣＲ１グリコフォームの富化本発明のｓＣＲ１グリコフォームおよび調製物は、組換えｓＣＲ１コード化ＤＮＡを発現する細胞を、流動床バイオリアクター、ホローファイバーバイオリアクター、ローラーボトル培養または攪拌タンクバイオリアクターシステム（後者の２つのシステムには細胞マイクロキャリアを備えたものと、備えていないものがある）を含むがこれらに限らない種々の細胞培養条件下で生育させることにより調製し得る。本発明のｓＣＲ１グリコフォームは、ｓＣＲ１をコードするかまたはｓＣＲ１の断片をコードするＤＮＡを哺乳動物宿主細胞内で発現させることにより得られる。哺乳動物宿主細胞は、好ましくは、１個以上の末端シアル酸残基を有するオリゴ糖鎖を含有するｓＣＲ１グリコフォームの生産をもたらす機能的シアリルトランスフェラーゼを発現する能力のあるものである。本発明に適した宿主細胞としてはＣＨＯ細胞系があり、ＤＵＸＢ１１細胞系が好ましい。細胞の培養条件は希望するレベルのシアリル化を達成するように選ばれる。シアリル化の程度に影響を及ぼすプロセスパラメーターには酸素レベルとグルコースレベルが含まれる。細胞密度、時間、温度のような貯蔵条件もシアリル化に影響する。複合オリゴ糖構造あたり２個またはそれ以上のシアル酸残基を含むｓＣＲ１グリコフォームはin vivoで比較的長いクリアランス速度を有する。かくして、調製物のクリアランス速度は調製物の全体的なシアリル化度によって広範囲に操作することができる。血清（または血漿）クリアランスに対する炭水化物含量の影響は機能活性に弱く関係している。つまり、脱グリコシル化は速やかな血漿クリアランスをもたらすが、in vitro機能活性の最小限の増強へ導くだけである。これら培養物により産生されたｓＣＲ１グリコフォーム発現産物は、常套手段を使って、例えばアフィニティー、サイズ排除、イオン交換および／または疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により精製することができる。アフィニティークロマトグラフィーを用いる場合には、いくつかのＣＲ１特異的抗体が利用される（Changelianら，1985，J．Immunol．134：1851）。ＨＩＣカラムの調製には多くのマトリックスを利用することができ、最も広く用いられているものはアガロースである。シリカや有機ポリマー樹脂も使用し得る。有用な疎水性リガンドとして約2〜10個の炭素原子を有するアルキル基（例えば、ブチル、プロピル、オクチル）またはアリール基（例えば、フェニル）を挙げることができるが、これらに限らない。ゲルおよびカラム用の TOYOPEARL Butyl 650M(Fractogel TSK Butyl−650）またはTSK-GELフェニル-5P W（日本、東京、Tosoh Corporation）；アルキル基が2〜10個の炭素原子を含有するアルキル−アガロース（イスラエル、レホボット、Miles−Yeda）；およびB akerbond WP-HI-プロピル（ニュージャージー州フィリップスバーグ、J．T．Bak er）という商品名で商業的に入手可能である。また、通常の化学を用いて希望のＨＩＣカラムを調製することもできる。例えば、Er-el，Z．ら， Biochem．Biophys．Res．Comm．49：383（1972）； Ulbr ich，V．ら，Coll．Czech．Chem．Commum．9：1466（1964）を参照されたい。どのゲルを選ぶかは当業者が決めることができる。一般に、タンパク質とＨＩＣリガンドとの相互作用の強さはアルキルリガンドの鎖長とともに増加するが、大抵の分離には約４〜８個の炭素原子を有するリガンドが適している。ＨＩＣカラムへのタンパク質の吸着は高い塩濃度によって促進されるが、実際の濃度はタンパク質の性質および所定のＨＩＣリガンドに応じて広範囲にわたって変化しうる。一般的に、約0.75〜2Ｍの硫酸アンモニウムまたは約１〜４ＭのＮａＣ１の塩濃度が有効である。溶出は、段階的であろうと勾配の形であろうと、いろいろな方法で、例えば、（ａ）塩濃度を変えることにより、（ｂ）溶媒の極性を変えることにより、または（ｃ）界面活性剤を添加することにより、達成し得る。ＨＩＣは他のタンパク質精製法と組み合わせて使用するとき特に有用である。イオン交換クロマトグラフィーに関して当分野で公知であるように、アニオン性またはカチオン性支持体を形成するために種々のアニオンまたはカチオン置換基がマトリックスに結合される。アニオン交換置換基としてはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）および４級アミン（Ｑ）基が挙げられる。カチオン交換置換基としてはカルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）が挙げられる。市販されているイオン交換材料には次のものが含まれる：セルロース系イオン交換樹脂、例えばDE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32およびCM -52（英国ケント、メイドストーン、Whatman Ltｄ．）；SEPHADEXをベースとした架橋イオン交換体、例えばDEAE-、QAE-、CM-およル／メタクリレートコポリマー、例えばTOYOPEARL DEAE-650SおよびTOYOPEARL C M-650S（ペンシルバニア州フィラデルフィア、Toso Haas Co．）。サイズ排除またはゲル濾過クロマトグラフィーは分子の大きさに基づいて分離するものである。好ましいマトリックス材料は化学的に不活性で、硬質で、高度に多孔質の材料である。大規模法の場合は、全体的な流速を確立する上で硬さが最も重要となる。最近開発された硬さの増したゲルが好ましく、例えば、 TOYOPEARL HW系列マトリックス（Toso Haas）がある。本発明の所望のｓＣＲ１グリコフォームは、カチオン−またはアニオン−交換樹脂を用いるＨＰＬＣまたはイオン交換ソフトゲルクロマトグラフィーによってシアル酸含有分子について富化することができ、その際、より酸性の画分を集める。ｓＣＲ１グリコフォームを分離するのに適したマトリックスはS-Sepharose である。全タンパク質精製法の初期段階でS-Sepharoseクロマトグラフィーにかけると、所望のｓＣＲ１グリコフォームを他のグリコフォームから分離することができ、残りの精製段階をこのグリコフォームに対して行う。これとは別に、下記の実施例Ｖに示すように、多段階タンパク質精製法の終わりに、グリコフォームを分離するように設計された追加のS-Sepharose精製段階を行ってもよい。また、特定のｓＣＲ１グリコフォームはレクチンアフィニティークロマトグラフィーやクロマトフォーカシングによっても選択することができる。ｓＣＲ１グリコフォームの複合炭水化物部分は、必要に応じて、炭水化物の通常の分析法により容易に分析することができる。かくして、例えば、当分野で公知のレクチンブロッティングのような技法を使うと、低割合の末端マンノースまたは他の糖（例えば、ガラクトース）を分析し得る。シアル酸によるモノ−、ジ −、トリ−、またはテトラ−アンテナリー（antennary）オリゴ糖の末端化は、無水ヒドラジンまたは酵素的方法を使ってタンパク質から糖を放出させ、イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーもしくは当分野で公知の他の方法を用いてオリゴ糖を分画化することにより、確認することもできる。グリコフォームの同一性についての別の試験では、シアル酸を除くためのノイラミニダーゼ処理の前と後にｐＩを測定する。ノイラミニダーゼ処理後のｐＩの増加はそのグリコフォームにシアル酸が存在することを示すものである。ＣＲ１グリコフォームの治療用途本発明のｓＣＲ１グリコフォームおよび調製物は、表１に挙げた疾患および障害を含むがこれらに限らない、多くの補体媒介または補体関連疾患および障害の治療もしくは診断において有用である。表１補体が関与する疾患および障害神経障害多発性硬化症発作ギラン・バレー症候群外傷性脳障害パーキンソン病不適当なまたは望ましくない補体活性化の障害血液透析合併症超急性同種移植拒絶反応異種移植拒絶反応インターロイキン−２治療中のＩＬ−２誘導毒性炎症疾患自己免疫病の炎症クローン病成人呼吸窮迫症候群火傷を含む熱傷または凍傷虚血後再灌流状態心筋梗塞バルーン血管形成心肺バイパスまたは腎臓透析におけるポンプ後症候群腎臓虚血感染症または敗血症免疫複合障害および自己免疫病慢性関節リウマチ全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）ＳＬＥ腎炎増殖性腎炎糸球体腎炎溶血性貧血重症筋無力症不適当な補体活性化または炎症と関連した疾患または障害の治療方法では、かかる治療を必要としている患者に、治療上有効な量のｓＣＲ１グリコフォームまたは調製物を投与する。患者はヒトであることが好ましい。疾患または障害を治療するためのｓＣＲ１グリコフォームの有効量は、0.01〜 100 mg／kg、好ましくは0.1〜10 mg／kgの用量範囲である。ｓＣＲ１グリコフォームまたは調製物は、投与のために、適当な医薬組成物または治療用組成物に製剤化すべきである。こうした組成物は、一般に、治療上有効な量のｓＣＲ１グリコフォームまたは調製物および医薬上許容される賦形剤または担体（例えば、食塩水、緩衝溶液、ブドウ糖、水）を含有する。また、組成物は糖（マンノースおよびマンニトールを含む）のような安定化剤、および注射組成物用の局所麻酔剤（例えば、リドカイン）を含んでいてもよい。補体活性化を阻止し、同時に血栓溶解治療を施すために、本発明は、治療上有効な量の血栓溶解剤をさらに含有する組成物を提供する。血栓溶解剤の有効量は 0.01〜10 mg／kg、好ましくは0．1〜 5 mg／kgの用量範囲である。好ましい血栓溶解剤としては、ストレプトキナーゼ、ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター、およびウロキナーゼ分子とその誘導体、断片または結合体を挙げることができるが、これらに限らない。血栓溶解剤は、例えばプラスミンに結合されたウロキナーゼ（EP-A-0152736）、水溶性ポリマーに結合された繊維素溶解酵素（EP -A-0183503）といったハイブリッド分子（EP-A-0297882およびEP 155387）を形成するために他の作用剤に融合されるかまたは可逆的に結合される１つ以上の鎖を含みうる。血栓溶解剤はまた、プラスミノーゲンアクチベーターのミューテインであってもよい（EP-A-0207589）。好ましい態様において、血栓溶解剤は、米国特許第4，285，932号に記載されるような、可逆的にブロックされたin vivo繊維素溶解酵素であり得る。最も好ましい酵素は、米国特許第4，808，405号に記載されるような、ｐ−アニソイルプラスミノーゲン−ストレプトキナーゼアクチベーター複合体であり、EMINASEという商標名でSmithKline Beecham Pharmaceuticalsから販売されている（一般名はアニストレプラーゼで、APSACとも呼ばれる； Monkら，1987，Drugs 34：25-49）。補体活性化の阻止または上記のような併用治療に適する治療用組成物は、顕著な機能活性を保持しつつ血液からの持続的クリアランスを示す本発明の新規なｓＣＲ１グリコフォームまたは調製物を含有する。このような持続する機能的半減期は単純なボーラス用量の投与を可能にし、in vivo効力に寄与する。治療用組成物中の好ましい補体活性化阻害剤は、例えば、次のようなｓＣＲ１グリコフォームまたは調製物を含有する：（１）１個またはそれ以上のシアル酸残基で終わる複合オリゴ糖を含有するｓＣＲ１グリコフォーム；（２）クロマトフォーカシングにより測定して等電点ｐＩ≦5.1を有し、そのｐＩがノイラミニダーゼ処理に感受性である調製物；（３）複合オリゴ糖の少なくとも40％が１個またはそれ以上のシアル酸残基で終わる複合オリゴ糖を含有するｓＣＲ１調製物；または（４）シアル酸対マンノースのモル比が≧0.25であるｓＣＲ１調製物。より好ましくは、治療上有効なｓＣＲ１グリコフォームおよび調製物は少なくとも70％のシアル酸を末端基とする分子を含有し、かつ非グリコシル化ｓＣＲ１の少なくとも25％の抗補体活性をもつべきである。治療用組成物のさらに好ましい治療上有効な補体活性化阻害剤は、自然界でヒト糖タンパク質中に存在するものに類似したまたはこれと同一のオリゴ糖を含有すべきである。本発明の別個のまたは併用治療組成物の投与経路としては標準的な経路、例えば静脈内注射またはボーラス注射を挙げることができる。有効な補体遮断剤と血栓溶解剤を一緒に、または連続的に任意の順序で投与してもよい。本発明はまた、ヒトまたはヒト以外の動物の血栓状態、特に急性心筋梗塞の治療方法を提供する。この方法は、かかる治療を必要とするヒトまたは動物に、有効量の本発明によるｓＣＲ１グリコフォームまたは調製物および有効量の血栓溶解剤を投与することから成っている。また、ヒトや動物の血栓状態を治療するための医薬の製造における本発明のｓＣＲ１グリコフォームまたは調製物および血栓溶解剤の使用も提供される。前記方法および使用は以前（国際特許公開WO 91／05047、参考としてここに組み入れる）に記載されたとおりに行うことができる。本発明は、さらに、ヒトまたはヒト以外の動物の成体呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の治療方法を提供する。この方法は、患者に有効量の本発明によるｓＣＲ１グリコフォームまたは調製物を投与することから成っている。また、本発明は、有効量の本発明によるｓＣＲ１グリコフォームまたは調製物を投与することにより、移植を受けるヒトまたはヒト以外の動物において超急性同種移植または異種移植拒絶反応を遅らせる方法を提供する。本発明について一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより本発明はさらに理解しやすくなるだろう。実施例は例示するためのものであって、特に明記しないかぎり、本発明を制限するものではない。実施例１ＴＰ１０ＨＤ調製物の製造ならびに精製組織培養の調整培地から調製したＴＰ１０ＨＤを、アフィニティクロマトグラフィー；ＨＰＬＣである（あるいはＨＰＬＣでない）カチオン交換クロマトグラフィー；ならびにカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって精製した。調整培地の起源Ａ．ホローファイバーバイオリアクターｓＣＲ１遺伝子の生成物であるＴＰ１０ＨＤ（Fearon et al.，1989，1991、上掲）を発現する組換えＣＨＯＤＵＸＢ１１細胞を、分子量のカットオフ値が30，000ＤａであるモデルＩＶ−Ｌのカートリッジ（セル−ファーム・セル・カルチャー・システムＩ（Cell-Pharm Cell Culture System I）、ＣＤメディカル（CD Medical）、米国フロリダ州マイアミレークス（MiamiLakes，FL））を利用して、ホローファイバーバイオリアクターの適当な生育培地、たとえば、グルタミン（ギブコ（GIBCO）、米国ニューヨーク州グランドアイランド（Grand Isl and，NY））ならびに１−１０％ウシ胎仔血清（ハイクローン・ラボラトリーズ社（HyClone Laboratories，Inc．）、米国ユタ州ローガン（Logan，UT））を加えたＣＨＯ−１完全培地システム（ベントレックス・ラボラトリーズ社（Ventre x Laboratories，Inc．）、米国メイン州ポートランド（Portland，ME）に接種し、製造業者の指示にしたがって操作した。合成されたＴＰ１０ＨＤは、生育培地中へと分泌され、この分泌物は分子量が約２００ｋＤａと高いので、リアクターのカートリッジの細胞コンパートメント中に保持された。１−３日間隔で、細胞コンパートメントの調整培地を取り出し、混入している細胞ならびに細胞残渣を遠心分離によって取り除き、透明となった調整培地を使い捨てのプラスチック製実験容器に入れ、精製を行うまで、２−８°Ｃに保持した。こうした条件下で、調整培地は、５００μｇ／ｍｌ以下のＴＰ１０ＨＤを含有していた。Ｂ．ローラーボトル細胞培養ＴＰ１０ＨＤを発現する組換えＣＨＯＤＵＸＢ１１細胞を、ローラーボトルの適当な生育培地、たとえば、グルタミン（ギブコ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）、ウシ血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、ならびにウシインシュリン（ペンタックス−マイルズ社（Pentex-Miles Inc．）、米国イリノイ州カンカキー（Kankakee，IL）；インタージェン（Intergen）、米国ニューヨーク州パーチェス（Purchase，NY））を加えたＨａｍｓＦ１２とＤＭＥＭ（ＪＨＲバイオサイエンス社（JHR Bioscience，Inc．）、米国ペンシルバニア州デンバー（Denver，PA））の混合物から製造した無血清培地に接種した。３日ほどたって、培地の色が桃色から黄色に変化して培養が確立されたことが示唆されたら、約１０ｍｌのコラーゲンマイクロキャリア（ベラックス社（Verax Corporat ion）、米国ニューハンプシャー州レバノン（Lebanon，NH））を新鮮な培地とともに加えた。３日間隔で、１／２の培地（約１５０ｍｌ）を交換した。調整培地から、細胞ならびに細胞残渣を濾過によって取り除き、透明となった調整培地を使い捨てのプラスチック製実験容器に入れ、精製を行うまで、 −７０゜Ｃ以下で保存した。こうした条件下で、調整培地は、約１５μｇ／ｍｌのＴＰ１０ＨＤを含有していた。Ｃ．流動床灌流バイオリアクターＴＰ１０ＨＤを発現する組換えＣＨＯＤＵＸＢ１１細胞を、流動床灌流バイオリアクター（システムＳ２００（System S200）およびシステムＳ２０００（System S2000）、ベラックス社、米国ニューハンプシャー州レバノン）の適当な生育培地、たとえば、グルタミン（ギブコ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）、ウシ血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、ならびにウシインシュリン（ペンタックス−マイルズ社、米国イリノイ州カンカキー；インタージェン、米国ニューヨーク州パーチェス）を加えたＨａｍｓＦ１２とＤＭＥＭ（ＪＨＲバイオサイエンス社、米国ペンシルバニア州デンバー）の混合物から製造した無血清培地に接種し、バイオリアクターを、製造業者の指示にしたがって操作した。約２日間隔で、集まった調整培地を、バイオリアクターのハーベスト槽から取り出し、細胞ならびに細胞残渣を濾過によって取り除き、分子量のカットオフ値が５０ｋＤａあるいは１００ｋＤａである限外濾過膜（ミリポア社（Millipor e Corp．）、米国マサチューセッツ州ベッドフォード（Bedford，MA））を通して限外濾過することによって１０倍から１００倍に濃縮した。濃縮した調整培地をプラスチック製実験容器に入れ、精製を行うまで、−７０゜Ｃ以下で保存した。こうした条件下で、濃縮調整培地は、９００μｇ／ｍｌ以上のＴＰ１０ＨＤを含有していた。精製方法Ａ．アフィニティクロマトグラフィーホローファイバーバイオリアクターで得た調整培地を、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）アフィニティ樹脂を使用して精製した。モノクローナル抗体ＹＺ１は、天然のヒトＣＲ１（Changelian，PS et al.，J．Immunol．134：1851，1985； Wong，W．et al.，J．Immunol．Methods，82：303−313，1985）の細胞外部分のエピトープを同定するものである。このモノクローナル抗体を、製造業者（（バイオラッド社（BioRad Corporation）、米国カリフォルニア州リッチモンド（Ri chmond，CA））の指示にしたがってアフィゲル−１０（Affigel-10）に結合させて、ウシ血清由来の混入物を含有している調整培地から、既に記載されているようにして（Yoon et al．、上掲）、ＴＰ１０ＨＤを特異的に単離しうるアフィニティマトリックスを得た。簡単に説明すると、調整培地をアフィニティマトリックスとともに、穏やかにかきまぜながら、４°Ｃで一晩インキュベートした。この混合物をクロマトグラフィーのカラムに注ぎ、１０ｍＭＨＥＰＥＳＮ０．１ＭＮａＣ１の緩衝液（ｐＨ７）で十分に洗浄して、非特異的に結合している物質をマトリックスからすべて取り除いた。マトリックスから、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．７ＭＮａＣ１の緩衝液（ｐＨ１２）で、ＴＰ１０ＨＤを取り除き、得られたカラム分画中のタンパク質の存否を、市販の検定（バイオラッド社、米国カリフォルニア州リッチモンド）で調べた。タンパク質を含有している分画をプールし、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２−７．４）に対して４°Ｃで透析した。調製物中のＴＰ１０ＨＤの存否は、ＴＰ１０ＨＤに対して特異的なイムノアッセイによって確認した。この手順によって、４−２０％の線形勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度が９０％以上であると推定されるＴＰ１０ＨＤの調製物が得られた。Ｂ．組合せクロマトグラフィーローラーボトルの培地あるいは流動床潅流バイオリアクターの培地から得た調整培地を、一連のクロマトグラフィー工程で処理した。調整培地を１ＮのＨＣ１で酸性とし、ｐＨを５．２−５．５まで下げた。酸性とする間に培地が不透明となったので、０．４５ならびに０．２μｍの膜を通して濾過を行い、透明とした。酸性とし、透明とした調整培地を、リン酸ナトリウム（０．０２Ｍ）、塩化ナトリウム（０．０６Ｍ）の緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化しておいたカチオン交換カラムのＳ−セファロース（S-Sepharose）（ファルマシア・ファインケミカルス（Pharmacia Fine Chemicals）、米国ニュージャージー州ピスキャッタウェイ（Piscataway，NJ））に加えた。試料を加えた後、出発緩衝液によるカラムの洗浄を、吸収が基準線に戻るまでつづけた。こうした条件下では、ＴＰ１０ＨＤのグリコフォームがいずれも樹脂に結合したのに対し、組織培養液から混入したタンパク質の大半はカラムに結合せず、カラムを通過した。ＴＰ１０ＨＤは、リン酸ナトリウム（０．０２Ｍ）、塩化ナトリウム（０．５０Ｍ）の緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてカラムから溶出させた。２８０ｎｍでの吸収によって、ＴＰ１０ＨＤ含有プールの溶出を監視した。Ｓ−セファロースの溶出液を硫酸アンモニウムと混合して、最終濃度を０．８ −０．９Ｍとし、リン酸ナトリウム（０．１Ｍ）、硫酸アンモニウム（０．９Ｍ）の緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいた疎水性相互作用カラムであるブチル−セファロース（Butyl−Sepharose）（ファルマシア・ファインケミカルス、米国ニュージャージー州ピスキャッタウェイ）に加えた。試料を加えた後、出発緩衝液によるカラムの洗浄を、吸収が基準線に戻るまでつづけた。こうした条件下では、ＴＰ１０ＨＤのグリコフォームがいずれも樹脂に結合したのに対し、混入タンパク質はカラムに結合せず、カラムを通過した。ＴＰ１０ＨＤは、リン酸ナトリウム（０．１Ｍ）の緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてカラムから溶出させた。溶出緩衝液から硫酸アンモニウムを除去すると、ＴＰ１０ＨＤが樹脂から取り除かれる。２８０ｎｍでの吸光度によって、ＴＰ１０ＨＤ含有プールの溶出を監視した。ブチルーセファロースの溶出液を、リン酸緩衝液（リン酸ナトリウム（０．０１Ｍ）、塩化ナトリウム（０．１５Ｍ）））（ｐＨ７．２−７．４）で平衡化しておいたサイズ排除カラムであるセファクリルＳ−３００（Sephacryl S-300 ）（ファルマシア・ファインケミカルス、米国ニュージャージー州ピスキャッタウェイ）に加えた。試料を加えた後、吸光度によって、ＴＰ１０ＨＤ含有プールの溶出を監視した。カラムの排除体積の直後に溶出した物質を集め、ＴＰ１０ＨＤに対して特異的な酵素イムノアッセイによって、精製ＴＰ１０ＨＤの量を測定した。この分画を−７０°Ｃ以下で凍結保存した。このプロトコールによって、４−２０％の線形勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度が９０％以上であると推定されるＴＰ１０ＨＤの調製物が得られた。結論変異したｓＣＲ１のＤＮＡを発現し、ＴＰ１０ＨＤと称するｓＣＲ１タンパク質を産生する組換えＣＨＯＤＵＸＢ１１細胞の培養を、実験室条件下で、たとえばホローファイバーバイオリアクターあるいはローラーボトルを用いて行ったり、大規模培養条件下で、たとえば流動床灌流バイオリアクターを用いて行ったりして、分泌ＴＰ１０ＨＤを含有する調整培地を得ることができる。分泌された組換えタンパク質は、いくつかのプロトコール、特に、アフィニティクロマトグラフィー；カチオン交換ＨＰＬＣ；あるいはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって単離して、精製調製物を得ることができる。実施例ＩＩＴＰ１０ＨＤ調製物に特徴的な分子の差異の特定各種の条件で生成され、複数の過程で精製されたＴＰ１０ＨＤ調製物は、さまざまな程度にグリコシル化されたポリペプチドバックボーンを有している。手順４−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ、実施例Ｉに記載したようにしてカチオン交換ＨＰＬＣによって単離したＴＰ１０ＨＤ調製物と、組合せクロマトグラフィーによって単離した調製物とでは、みかけの分子量が異なっていることがわかった。カチオン交換ＨＰＬＣによって調製した物質の分子量は約３０ｋＤａであり、クロマトグラフィーを用いた方法で調製した物質より分子量が低かった。双方の調製物を、製造業者（ジェンザイム社（Genzyme Corporation）、米国マサチューセッツ州ボストン（Boston，MA）、下記の実施例ＶＩを参照のこと）の記載通りにｎ−グリカナーゼで消化して、脱グリコシル化したところ、分子量は、ＴＰ１０ＨＤ分子に対するポリペプチド鎖の理論上の分子量寄与分である約２００ｋＤａに相当する値まで低減した。結論こうした結果から、相異なる細胞培養条件で生成し、複数の精製計略によって単離したＴＰ１０ＨＤ分子は、同様のポリペプチド鎖から構成されているものの、そのグリコシル化の程度にはバラツキがあり、その結果、分子量に測定可能な差異が生じていることが立証された。このことによって、炭水化物の組成が互いに異なるＴＰ１０ＨＤの各種のグリコフォームが存在していることが、まずもって示唆された。実施例ＩＩＩＴＰ１０ＨＤに各種のグリコフォームが存在していることのさらなる例証ＨＰＬＣでの分析によって、（ａ）ホローファイバーバイオリアクター、（ｂ）マイクロキャリアを備えたローラーボトル、あるいは（ｃ）流動床灌流バイオリアクターといった相異なる条件のいずれかで、調整培地からのＴＰ１０ＨＤの生成を行い、そして、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせ、あるいはアフィニティクロマトグラフィーのいずれかによって精製を行った場合には、ＴＰ１０ＨＤが各種のグリコフォームの混合物から構成されていることが示された。分析方法いくつかの相異なる手順によって精製したＴＰ１０ＨＤの試料を、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、塩化ナトリウム（３０ｍＭ）の緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、０．２μｍの膜を通して濾過した。１０×１００ｍｍのハイドロポア−ＳＣＸ（Hydropore−SCX）ＨＰＬＣカラム（レイニン・インストラメント社、（Rainin Instrument Company）、米国カリフォルニア州エメリービル（Emeryville，CA））を、透析に用いたのと同じ緩衝液で平衡化し、試料を２ｍｌ／分で加え、出発緩衝液を用いたカラムの洗浄を、吸収が基準線に戻るまでつづけた。緩衝液のＮａＣｌ濃度を５０ｍＭまで上昇させたところ、弱カチオン性と規定されるＴＰ１０ＨＤのグリコフォームが樹脂から溶出した。吸収が基準線に戻った後に、５０−２５０ｍＭの線形のＮａＣｌ勾配で、強カチオン性のグリコフォームが溶出した。結果を図１に示す。試料をこうした条件で加えた場合には、いずれのグリコフォームのＴＰ１０ＨＤも樹脂に結合した。吸収されず、カラムを素通りした物質は、以下の規準、すなわち、（ａ）紫外スペクトルの光を吸収したこと、（ｂ）タンパク質を検出する化学検定で反応性でなかったこと、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の物質を可視化する際に使用されるタンパク質特異的染料に対して反応性でなかったこと、及び（ｄ）ＴＰ１０ＨＤ特異的イムノアッセイで反応性でなかったことに基づいて、タンパク質ではなく、ＴＰ１０ＨＤではない混入物質、おそらくは細胞性ＤＮＡであることが示された。試料を加えた後、緩衝液のＮａＣｌ濃度を５０ｍＭまで上昇させたところ、弱カチオン性のグリコフォームであると規定されるＴＰ１０ＨＤ分子が樹脂から溶出した。弱カチオン性のグリコフォームとして溶出した物質は、いずれも、特異的なイムノアッセイで、ＴＰ１０ＨＤであると特定することができた。最後に、ＮａＣｌの濃度を線形に上昇させることによって、さらに強固に結合しているタンパク質を樹脂から溶出させた。ＮａＣｌ濃度を約１２５ｍＭとしたところで、強カチオン性のグリコフォームであると定義されるＴＰ１０ＨＤ分子が樹脂から溶出した（図１）。強カチオン性のグリコフォームとして溶出した物質は、いずれも、特異的なイムノアッセイで、ＴＰ１０ＨＤであると特定することができた。アフィニティクロマトグラフィーによって精製したＴＰ１０ＨＤアフィニティクロマトグラフィーによって精製したＴＰ１０ＨＤ物質を、ＨＰＬＣカチオン交換法によって分析したところ、この物質は、複数のグリコフォームを含んでいた。図１Ａに示す吸収の軌跡から、主要なグリコフォームが強カチオン性であること（すなわち、約１２５ｍＭのＮａＣｌで溶出していること）が立証された。組合せクロマトグラフィーによって精製したＴＰ１０ＨＤ流動床灌流バイオリアクター由来の物質を、ＨＰＬＣカチオン交換法によって分析したところ、この物質は、複数のグリコフォームのＴＰ１０ＨＤを含んでいた。（弱カチオン性のグリコフォーム）対（強カチオン性のグリコフォーム）の濃度比は、７０：３０から８０：２０の範囲であった（図１Ｂ）。ローラーボトルの培養由来の物質も、複数のグリコフォームのＴＰ１０ＨＤを含んでおり、（弱カチオン性のグリコフォーム）対（強カチオン性のグリコフォーム）の濃度比は、７６：２４であった。ＨＰＬＣカチオンクロマトグラフィーによって精製したＴＰ１０ＨＤこの物質は、強カチオン性のグリコフォームのＴＰ１０ＨＤのみを含有していた（図１Ｃ）。すでに開示されているように（国際特許公開ＷＯ８９／０９２２０およびＷＯ９１／０５０４７；Weisman，HF et al.，Science 249：146， 1990；Yeh，CG et al.，J．Imunol．146：250，1991）、この方法によって単離された物質は、ヒトｓＣＲ１タンパク質のインビトロならびにインビボでの機能的特性を示した。結論こうした結果から、カチオン交換クロマトグラフィーによって区別しうる複数のＴＰ１０ＨＤのグリコフォームが、流動床灌流バイオリアクター由来の調整培地、ローラーボトルの培地、ならびにホローファイバーバイオリアクター由来の調整培地中に存在するものの、各種起源培地中の各種のグリコフォームの割合は、有意に異なっている可能性があることが示された。実施例ＩＶ弱カチオン性ならびに強カチオン性のグリコフォームを有する精製調製物の単離弱カチオン性ならびに強カチオン性のグリコフォームを有する調製物を、ＨＰＬＣによって調製することが可能である。方法２１．４ｍｍ×１００ｍｍの、スルホプロピルで置換したイオン交換樹脂カラム（ハイドロポア−ＳＣＸ（Hydropore-SCX）、レイニン・インストルメント社、米国カリフォルニア州エメリービル）で分取用ＨＰＬＣを実施した。カラムを、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３０ｍＭＮａＣｌの緩衝液（ｐＨ７．０）中で平衡化させた。上述したようにして組合せクロマトグラフィーで精製したＴＰ１０ＨＤの試料を、平衡化に使用したのと同一の緩衝液に対する透析を行ってから使用した。試料を加えた後、同一緩衝液によるカラムの展開を、代表的には２０分間つづけて、非特異的に結合したタンパク質を樹脂から洗い落とした。緩衝液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭＮａＣｌの緩衝液（ｐＨ７．０）に変更し、代表的にはさらに２０分間、弱カチオン性のグリコフォームがすべてカラムから溶出してしまうまで展開をつづけた。最後に、５０−２５０ｍＭの線形勾配のＮａＣｌの緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を使用して、カラムの展開を終了した。強カチオン性のグリコフォームは、代表的には、約１２５ｍＭのＮａＣｌでカラムから溶出した。結果調製に際しては、代表的には、約１００ｍｇのＴＰ１０ＨＤを含有する１２５ｍｌの試料を、カラムに加えた。弱カチオン性のグリコフォーム（ＴＰ１０ＨＤ −ＣＣＷ）、ならびに強カチオン性のグリコフォーム（ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳ）に対応する分画を、上述したようにしてプールし、ＴＰ１０ＨＤの量を、ＴＰ１０ＨＤに対して特異的なイムノアッセイで測定した。結論インビトロおよびインビボでの機能についての研究、ならびに生化学的分析を行うのに十分な量の複数のグリコフォームのＴＰ１０ＨＤが単離された。実施例ＶＴＰ１０ＨＤを精製した後の、Ｓ−セファロースを用いたカチオン交換クロマトグラフィーによるＴＰ１０ＨＤのグリコフォームの分離上述したＨＰＬＣカチオン交換精製のプロトコールによって、ＴＰ１０ＨＤのグリコフォームは、２つの分画（たとえば、図１Ｂを参照のこと）、すなわち、「ピーク２」と称する左側から２つ目のピーク（より重度にグリコシル化された物質）と、最も右側のピークである「ピーク３」（より軽度にグリコシル化された物質）に分離された。当初のプロトコールは、ＨＰＬＣカチオン交換カラムとして、レイニン・インストルメント社から購入したハイドロポア−ＳＣＸを使用して開発されたものである。しかし、このクロマトグラフィー工程の結果には、長時間が経過すると、バラツキが生じてくることが観察された。こうしたバラツキは、このＨＰＬＣ用カラムの使用ならびに貯蔵条件でのカラムの使用可能期間が限定されていることによるものであると考えた。したがって、本発明の発明者は、時間が経過してもバラツキを生じることなく再現が可能な、ｓＣＲ１グリコフォームを分離するためのもっと別の精製方法を見いだすべく研究を行った。調べるにあたっては、他の多くの供給業者が販売しているＨＰＬＣ用カラムの評価を行うのではなく、通常のカチオン樹脂であるＳ −セファロース・ファースト・フロー（S-Sepharose Fast Flow）樹脂（ファルマシア）を選んだ。この樹脂を選んだのは、まず、Ｓ−セファロースの官能基が、上述のハイドロポア−ＳＣＸカラムの官能基と同じであるからである。これらの樹脂の唯一のちがいは、担持するマトリックスが、Ｓ−セファロースではアガロースであるのに対し、ＳＣＸでは、シリカ系の充填剤を親水性の重合体層で覆ったものであることにある。充填寸法が２．５×１．８ｃｍのＳ−セファロースと、インラインのＵＡ−６紫外線モニター（イスコ（Isco））を使用して、２．５ｃｍのコンテスーフレックス（Kontes-Flex）カラムを調製した。この研究で調べるＴＰ１０ＨＤ物質は、流動床灌流バイオリアクター（ベラックスシステムＳ２００、上掲）を使用することによって生成し、タンパク質濃度は５．５ｍｇ／ｍｌであった。濃縮調整培地から得たＴＰ１０ＨＤ物質は、まず、一連の精製工程で処理してから、この研究に使用した（1992年3月24日に出願された、Gail Folena-Wassermanらの「タンパク質の精製」（米国特許出願第０７／８５７，０２２号、同一譲受人）を参照のこと。この文献の全体を、参考として、本明細書に組み込むものとする。）。まず、粗培養液を、Ｓ−セファロースでのカチオン交換クロマトグラフィーに供し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌの緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出させた。溶出したタンパク質を硫酸アンモニウムで沈殿させ、再度溶解し、１００ｍＭリン酸ナトリウムへの０．８Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄溶液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいた、疎水性相互作用クロマトグラフィーの担体であるブチル −トヨパール（butyl-TOYOPEARL）カラムに吸着させた。目的物質は、１００ｍＭリン酸ナトリウムへの０．７Ｍ（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄ 溶液（ｐＨ７．０）で溶出した。溶出液を、アニオン交換の担体であるＤＥＡＥ−トヨパール（DEAE-TOYOPEARL）に吸着させ、溶出させ、担体としてトヨパールＣＭ６５０Ｓ（TOYOPEARL CM650S）を使用する２回目のカチオン交換クロマトフラフィー工程に供した。５０ｍＭのＭＥＳ／ＭＥＳ．Ｎａへの線形勾配の０−２５０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ５．５）５カラム容量で、タンパク質を溶出させ、１／１０容量の０．５Ｍの二塩基リン酸Ｎａで中和した。次に、トヨパールＣＭの生成物を、あらかじめ１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（ｐＨ７）で平衡化しておいたトヨパールＨＷ６５Ｓ（TOYOPEARL HW65S）のカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーに供した。生成物のピークの全体を集め、濃縮して貯蔵した。ＴＰ１０ＨＤ物質は、これで、本研究で調べうる状態となったわけである。Ｓ−セファロースによる分画に際しては、以下の緩衝液を使用した。平衡化および洗浄用緩衝液−２０ｍＭリン酸Ｎａ、３０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．２。洗浄用緩衝液２および緩衝液Ａ−２０ｍＭリン酸Ｎａ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０。緩衝液Ｂ−２０ｍＭリン酸Ｎａ、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０。試料である１．５ｍｌの精製ＴＰ１０ＨＤ（８．２５ｍｇのタンパク質）を、あらかじめｐＨ５．２に平衡化しておいたＳ−セファロースカラムに加えた。次に、溶出液が基準線の読み（Ａ₂₈₀）を示すまで、カラムを洗浄した。次に、カラムを２．５ベッド容量の洗浄用緩衝液２で洗浄した。線形勾配（１０ベッド容量）の緩衝液Ａならびに緩衝液Ｂ（５０−２５０ｍＭＮａＣｌ）を、カラムに加えた。溶出したＴＰ１０ＨＤ分画を、紫外線吸収にもとづいて、単一のプールとして集めた。Ａ２８０による各分画のタンパク質濃度の測定を、１％溶液に対する吸光計数Ｅ（１％／２８０）として１０ｃｍ^-1を使用して行った。結果結果を図２および３に示す。プール１と称する、図１Ｂの「ピーク２」に対応する図２の小さい方のピークは、加えた試料の２％に相当した。プール２と称する、（図１Ｂの「ピーク３」に対応する）図２の大きい方のピークは、加えた試料の約８９％に相当した。この２つのプールについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。結果を図３に示す。プール１の物質の方が、プール２の物質より、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量が大きかった。結論以上の結果から、ＴＰ１０ＨＤの２つの主要なグリコフォームの分画を再現性をもって分離するうえで、Ｓ−セファロースを使用した、ＨＰＬＣではないカチオン交換クロマトグラフィーによる方法が有用な手段であり、この方法は、さきに述べたＨＰＬＣでＳＣＸカラムを用いた方法より好適であるとの結論に達した。この精製工程は、上記のように、調整培地からＴＰ１０ＨＤを複数の工程で精製した後に単離することもできる。また、複数の工程からなる精製過程のうち、最初のＳ−セファロースの工程を、各種のグリコフォームの分離に使用して、分離されたグリコフォームを、それぞれ、さらに精製することも可能である。実施例ＶＩｓＣＲ１グリコフォームの薬物動態学的研究異なるグリコフォーム調製物の血漿薬物動態学的半減期および／またはクリアランス速度を測定した。弱カチオン性グリコフォームは、強カチオン性グリコフォームに比べ、増大した血漿半減期および／またはより低い全クリアランス速度を示した。そして、両方のグリコフォームとも、酵素によって脱グリコシル化したグリコフォーム調製物に比べ、有意により大きい血漿半減期および／またはより低い全クリアランス速度を示した。材料および方法Ａ．研究材料の供給源種々のＴＰ１０ＨＤ調製物（ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸ、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣ、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷ、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳおよびＴＨ１０ＨＤ−ＣＸＤ）の定義については、前述の「定義」の分節を参照されたい。試験材料は、実施例１に記述した方法で精製した。Ｂ．薬物動態学的研究９つの異なる薬物動態学的研究を下記の表２に掲げる。Ｃ．研究材料のヨウ素化研究１、２、４、５、７および９では、クロラミン−Ｔ法によるヨウ素化を行なった。リン酸ナトリウム緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ７．６，５０μｌ）を、１ｍＣｉの供給されたままのＮａ−¹²⁵ Ｉ（New England Nuclear，Boston，MA）に加えた。ＴＰ１０ＨＤのサンプルを典型的には１００μ１につき１００μｇ（研究５＝６９μｇ；研究７＝３４μｇ；研究９＝９１μｇ）加え、次に５０μ１の新たに調製したクロラミン−Ｔの１５ｍｇ／ｍ１溶液を加えた。反応混合物を６０秒間強く振とうした。メタ重亜硫酸ナトリウム（５０μｌ、１５ｍｇ／ｍｌ）およびヨウ化ナトリウム（１００μ１、１０ｍｇ／ｍｌ）を連続的にピペットで反応バイアルに加えた。この反応混合物を０．１％ウシ血清アルブミン（Shigma Chemical Company，St．Louis，MO）を含有するリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２〜７．４）で前平衡化したＰＤ１０カラム（Pharmacia Fi ne Chemicals，Piscataway，NJ）に通した。０．５ｍｌの画分を１０個集め、２ μｌのアリコートを直接、および１００μｌの０．１％ウシ血清アルブミン溶液ならびに１ｍｌの２０％トリクロロ酢酸と混合後に、計測した。０℃で１時間インキュベーションした後、放射能を伴なう酸沈降可能なタンパク質を１０００ｘｇで１０分間遠心にかけて回収し、シンチレーションカウンティングにより定量した。酸沈降物中に全放射能の＞９０％を含有する画分を後の使用のためプールした。研究６および８では、ヨードゲン（iodogen）法（Frakerら、1978， Biochem Biophys Res Commun 80：849）によってヨウ素化を行なった；研究６では¹²⁵Ｉ置換の平均的度合は０．５６原子／タンパク質分子で、比活性が２２．７ｋＢｑ／ｍｇであり、研究８では¹²⁵Ｉ置換の平均的度合は０．７６原子／タンパク質分子で、比活性は２９．５ｋＢｑ／ｍｇであった。Ｄ．投与溶液の調製研究１：放射性ヨウ素化ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸを精製非標識ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸと混合して、１６〜２５ｘ１０⁶ ｃｐｍの放射性標識ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸを含有する、１ｍｇ／ｋｇの全ＴＰ１０ＨＤ用量を投与するのに好適な投与液を調製した。研究２：放射性ヨウ素化ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸ（約５％ｗ／ｗ）を精製非標識ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸと混合し、０．1ＭＨｅｐｅＳおよび０．１５ＭＮａＣｌを含有する緩衝液ｐＨ７．４中に１ｍｇ／ｍｌのＴＰ１０ＨＤ−ＣＸを含有する投与液を調製した。研究３：供給されたままのＴＰ１０ＨＤ−ＣＣを、最終用量１ｍｇ／ｋｇまで投与した。研究４：放射性ヨウ素化ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣを精製非標識ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣと混合して、約２０ｘ１０⁶ｃｐｍを含有する、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの全ＴＰ１０ＨＤ用量を投与するのに好適な投与液を調製した。研究５：放射性ヨウ素化ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷを精製非標識ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷと混合して、約２０ｘ１０⁶ｃｐｍを含有する、１ｍｇ／ｋｇの全ＴＰ１０ＨＤ用量を投与するのに好適な投与液を調製した。研究６および８：放射性ヨウ素化ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷを約１％ｗ／ｗまで加えたほかは、研究２に記述した通り。研究７：放射性ヨウ素化ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳを精製非標識ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳと混合して、約２０ｘ１０⁶ｃｐｍを含有する、１ｍｇ／ｋｇの全ＴＰ１０ＨＤ用量を投与するのに好適な投与液を調製した。研究９：放射性ヨウ素化ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸＤを精製非標識ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸＤと混合して、約２０ｘ１０⁶ｃｐｍを含有する、１ｍｇ／ｋｇの全ＴＰ１０ＨＤ用量を投与するのに好適な投与液を作製した。Ｅ．プロトコール研究１、４、５、７および９では、試験材料を４匹のスプラーグードーリー（ Sprague-Dawley）ラット（雄２匹、雌２匹）に静脈注射した。注射の１、３、５、１０、２０、３０、４５および６０分後に血液サンプルを眼窩後部の血管叢より採取し、放射能を測定した。追加の注入後血液サンプルを注射の２、３および４時間後に（研究４）、および１２０分後に（研究５）に採取した。残りの血液サンプルの血漿画分を、さらに分析するために保持した。血漿サンプルは、以下の測定により残留試験材料について分析した。（１）全残留放射能（２）ＴＣＡによって沈降させた放射性標識材料のパーセンテージ（３）ＳＤＳの存在下で酸沈降可能なタンパク質の残留放射能；および（４）エンザイムイムノアッセイにおいてＴＰ１０ＨＤとして免疫学的に同定可能な材料放射性同位体データは、血液または血漿１ｍｌあたりの全ｃｐｍとして、また理論的時間ゼロ値のパーセンテージとして量的に表わした。薬物動態学的半減期は、放射能分析データより計算した。研究２では、試験材料を１群５匹の雄ダッチ（Dutch）ウサギ（約１ｋｇ）２群に１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射した。血液サンプル（２ｍｌ）を投与直前に、および投与の５、１０、２０、４５、６０、１２０および１８０分後に耳動脈より採取し、ヘパリンと混合した（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）。放射能はシンンチレーションカウンティングによりアリコートを測定した。また、２０００ｘｇで５分間遠心にかけて得た血漿は、−４０℃で保存した。血漿サンプルは、in vitro機能アッセイであるヒト補体による抗体塗布ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）溶血の阻害によって、残留試験材料を分析した。薬物動態学的半減期は、残留機能活性の力価より計算した。研究３では、試験材料は頚静脈カニューレを介して体重４．５〜６．１ｋｇの子ブタに静注した。血液サンプルは、あらかじめ埋め込んでおいた頸静脈カニューレを経て、リチウムヘパリンを最終濃度１５単位／ｍｌで含有する注射器に取った。注入前サンプル（１０ｍｌ）をゼロ時間に採取し、注入後サンプル（１．０ｍｌ）を注入の５、１０、１５、３０、４５、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０分後および２４時間後に採取した。抗凝血化血液サンプルを約３０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心にかけ、血小板に乏しい血漿をアリコートに分割し、−７０℃またはそれ以下で保存した。血漿サンプルは、ヒト補体ではなくブタ補体を用いて、上記のようなにin vit ro機能アッセイにより、残留試験材料について分析した。薬物動態学的半減期は、残留機能活性の力価より計算した。研究６および８では、試験材料を５匹のダッチウサギ（約１ｋｇ）からなる１群に１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射した。血液サンプル（１ｍｌ）を投与直前に、および投与の５、１０、２０、３０、６０、１２０および１８０分後に耳動脈より採取し、ヘパリンと混合し、トリクロロ酢酸を用いて沈降させた後シンチレーションカウンティングによりアリコートの放射能を測定した。血漿サンプルは、ＴＰ１０ＨＤに特異的なエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）により残留試験材料を分析した。薬物動態学的半減期は、放射能分析およびイムノアッセイの両方のデータより計算した。Ｆ．Ｎ−グリカナーゼ処理研究９では、Ｎ−結合オリゴ糖鎖の除去をＮ−グリカナーゼ消化によって行なった。これは製造者の指示に従って実施された（Genzyme Corporation，Boston ，MA）。典型的には、５８μｇのＴＰ１０ＨＤ−ＣＸを１０．５単位のＮ−グリカナーゼと共に１８時間、３７℃で、０．２Ｍリン酸ナトリウムを含有するｐＨ８．６の緩衝液中でインキュベートした。Ｃ．酸沈降トリクロロ酢酸による沈降を以下のように実施した：血漿（２０μｌ）に、０．１３ＭトリスＨＣ１、４％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するｐＨ６．８の緩衝液４５０μ１、次に３０μｌのウシ胎児血清および５００μｌの２０％トリクロロ酢酸を逐次加えて沈降させた。各添加の後、試験管を強く混ぜ、７２時間４℃でインキュベートした。１０００ｘｇで１０分間遠心にかけて、沈降可能なタンパク質のペレットを回収し、上清を分離して廃棄し、残留放射能をシンチレーションカウンティングにより測定した。Ｈ．エンザイムイムノアッセイ市販されているアッセイを利用した（Cellfree^TM CD35，T Cell Diagnostic s， Inc．Cambridge，MA）。簡単に述べると、ポリクローナルウサギ抗ＴＰ１０ＨＤ抗体を塗布したポリスチレンビーズを、希釈した試験サンプルおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ポリクローナルウサギ抗ＴＰ１０ＨＤ抗体と同時にインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを反応混合物より取り出し、非特異的に結合した物質を洗い落とし、次に適切な希釈度の基質の存在下でインキュベートした。硫酸を添加して発色を停止させ、ＴＰ１０ＨＤ濃度の指標として吸光度（光学濃度）を測定した。Ｈ．溶血アッセイチオエステル基をアミド化し、また内因性補体成分Ｃ３およびＣ４を不活性化するため、ウサギ血漿サンプルを５６℃で１時間、メチルアミン（１２．５ｍＭ）の存在下で加熱した。この処置は、ＴＰ１０ＨＤの活性に重大な影響を与えることなく、試験サンプルにおける内因性ウサギ補体活性を消失させた。次ぎに、試験サンプルを０．１ＭＨｅｐｅｓ，０．１５ＭＮａＣｌを含有する緩衝液ｐＨ７．４で１：５０に希釈し、アッセイを行なった。ウサギ抗ＳＲＢＣ抗体（Diamedix，Miami，FL）で前感作したＳＲＢＣを、Ｖ底マイクロタイターウエル（Costar，Cambridge，MA）において、適切な希釈度の試験血漿および補体供給源としての希釈されたヒト血清のアリコートと混合した。３７℃で１時間インキュベーションした後、未溶解赤血球を遠心によりペレット化し、上清を対応する平底マイクロウエル（Costar，Cambridge，MA）に移し、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。抗体を塗布したＳＲＢＣの補体媒介溶血の阻害は、試験サンプルの存在下における吸光度の減少として測定された。既知量のＴＰ１０ＨＤを用いた標準曲線を使って、アッセイの結果が時間に対する血漿中に残留するＴＰ１０ＨＤ（ｍｇ／ｍｌ）として表されるように、アッセイをキャリブレートすることができる。研究３．溶血アッセイＴＰ１０ＨＤ−ＣＣの注入に先だって、各ブタから溶血アッセイのためのサンプル希釈物および補体供給源として使用される血漿を採取した。試験サンプルは０．１ＭＨｅｐｅｓ，０．１５ＭＮａＣｌを含有する緩衝液ｐＨ７．４で最低１：５０に希釈した。より大きい希釈度については、試験サンプルをすでに同じ緩衝液で１：５０に希釈した注入前血漿で希釈し、それによって最終血漿濃度を１：５０に維持した。この希釈度で、上記のように、溶血の程度はヒト補体による溶血と等価であった。他の操作は上に記述した通りである。既知量のＴＰ１０ＨＤを用いた標準曲線を使って、アッセイの結果が時間に対する血漿中に残留するＴＰ１０ＨＤ（ｍｇ／ｍｌ）として表されるように、アッセイをキャリブレートことができる。結果薬物動態学的研究の結果は、表３〜７に示されている。ラットを用いた研究１、４、５、７および９については、血中からの¹²⁵Ｉ−ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸ、¹²⁵ Ｉ−ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣ、¹²⁵Ｉ−ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷ、¹²⁵Ｉ−ＴＰ１０ＨＤ −ＣＣＳおよび¹²⁵Ｉ−ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸＤのクリアランスをそれぞれ測定した。全血（約３００μｌ）を各ラットの後部眼窩血管叢より採取した。それぞれの時点からの１００μｌサンプル２個を計測し、グループごとに平均し、ｃｐｍ／ｍｌに標準化した。各時点からのサンプルをＳＤＳの存在下でＴＣＡを用いて沈降させ、計測し、グループごとに平均し、ｃｐｍ／ｍｌに標準化した。クリアランスは、¹²⁵Ｉ−標識材料の全ＴＣＡ−沈降可能カウントおよびＥＩＡによって測定された。表３に示す結果は、各研究における、短いα相半減期とより長いβ相半減期をもつ２相からなるクリアランスパターンを示している。投与の２４時間後に採取した血漿サンプルは、対照レベルと区別のつかないＴＰ１０ＨＤ−ＣＣレベルを示した。クリアランス速度、コンパートメント（comp artment）容量、速度定数および半減期に関する薬物動態学的パラメーターは、各ブタについてのデータを２および３コンパートメントモデルに合わせて調整して得た。統計的分析は、一部のブタについては３−コンパートメントモデルの方がよく適合するが、別のブタについては２−コンパートメントモデルの方がよく適合することを示した。すべてのブタについて複雑なデータを避けるため、このデータは２−コンパートメントモデルを使って処理した。平均半減期はα相については８．３分、およびβ相については６時間であることが分かった。これらの相は与えられた投与量のそれぞれ６９％および３１％に相当し、投与量の約１／３がゆっくりと清浄化された。この研究はＴＰ１０ＨＤ−ＣＣ調製物が顕著な２相クリアランスパターンを示し、そこではβ相がα相よりもはるかに遅いことを実証した。これらの結果は、ある種のものが非常にゆっくり除去される、グリコフォーム集団の示差的クリアランスと一致している。研究６の結果は下の表６に要約されている。放射能分析によって測定されたＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷの薬物動態学的半減期は、α相については約８分、β相については約２１６分であった。全投与量の約３０％が速いα相の間に清浄化され、全投与量の約７０％がより長いβ相の間に清浄化された。このグリコフォームの全クリアランス速度は０．２６ml／分／kgで、β相のコンパートメント容量は約２３ ml／kgであった。研究８の結果は下の表７に要約されている。放射能分析によって測定されたＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳの薬物動態学的半減期は、α相については約６分、β相については約２１６分であった。全投与量の約７５％が速いα相の間に清浄化され、全投与量の約２５％がより長いβ相の間に清浄化された。このグリコフォームの全クリアランス速度は０．８５ ml／分／kg で、β相のコンパートメント容量は約１６２ ml／kgであった。研究９では、放射能分析によって測定されたＴＰ１０ＨＤ−ＣＸＤの薬物動態学的半減期は、α相については＜１分、β相については６．１分であった。要約上記の結果は、ＴＰ１０ＨＤの精製調製物はクリアランス速度の異なる複数のグリコフォームを含有することを示す。そのような差異はグリコシル化のバラツキによるものである、という結論は以下の結果と一致する：（１）精製ＴＰ１０ＨＤ調製物の脱グリコシル化は、共通の分子量を有する分子を生じ、すべてのＴＰ１０ＨＤ調製物のポリペプチド鎖が同一であることを証明する；（２）脱グリコシル化ＴＰ１０ＨＤは、急速に清浄化される；そして（３）増大したグリコシル化による比較的大きい分子量を特徴とするＴＰ１０ＨＤ調製物（例えば、ＴＰ１０ＨＤ調製物ＣＣおよびＣＣＷ）は、グリコシル化の度合がより低いため比較的低い分子量を有する調製物（例えば、調製物ＣＸおよびＣＣＳ）に比べ、より長い血漿半減期および／またはより低い全クリアランス速度を示す。研究６および８の結果の比較から、調製物ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷとＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳの間の主要な差異は、２相のクリアランスを特徴づける半減期にあるのではなく、緩慢に清浄化される材料の比率（高比率のＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷ）にあることがわかる。以下に示すように、詳細な炭水化物分析は、ＴＰ１０ＨＤグリコフォーム間の差異がグリコシル化の度合、オリゴ糖鎖の組成、および末端オリゴ糖炭水化物残基の本体によることを例証する。実施例ＶＩＩＴＰ１０ＨＤの複数のグリコフォームの末端オリゴ糖残基の決定ＴＰ１０ＨＤの末端オリゴ糖残基の決定は、弱カチオン性グリコフォームがより高いレベルのシアリル化を示すことを実証した。方法ＴＰ１０ＨＤ調製物の末端炭水化物構造を評価した。各調製物のサンプル（１ μｇ）を、市販のドットブロット（Dot-Blot）装置（Bio-Rad，Richmond，CA）を使用してニトロセルロース膜に固定した。糖タンパク質の末端オリゴ糖残基を同定する市販のグリカン示差キット（Boehringer Mannheim Biochemicals，Indi anapolis，IN）を製造者の指示にしたがって使用した。このキットは、５個のジゴキシゲニン−レクチンプローブを含有する。すなわち、ガランタス・ニバリス（Galanthus nivalis）アグルチニン（ＧＮＡ）；サンブカス・ニグラ（Sambucu s nigra ）アグルチニン（ＳＮＡ）；マーキア・アムレンシス（Maackia amurens is ）アグルチニン（ＭＡＡ）；ピーナツアグルチニン（ＰＮＡ）およびダツラ・ストラモニウム（Datura stramonium）アグルチニン（ＤＳＡ）である。簡単に述べると、各ＴＰ１０ＨＤ調製物の多数サンプルをジゴキシゲニン−レクチン複合体を用いて検索した。レクチンを変えることによってプローブの特異性が変更され、多様な炭水化物残基の検出が可能となる。結合後、プローブはアルカリフォスファターゼ結合ヒツジ抗ジゴキシゲニンFab’試薬を用いたジゴキシゲニンエピトープの検出によって可視化された。基質の添加後５分以内に発色が起った。結果は表８に要約される。ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸはＧＮＡレクチンとのみ反応し、この調製物が末端マンノース残基をもつことを示した。ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸＤは、予想された通り、どのプローブとも反応せず、Ｎ−グリカナーゼ処理がオリゴ糖鎖を除去してしまったことを示した。ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷはＭＡＡと強く、またＤＳＡと弱く反応し、末端シアル酸α（２，３）ガラクトースおよびガラクトースβ（１，４）Ｎ−アセチルグルコサミン構造を示した。ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳはＧＮＡと強く反応し、末端マンノース残基の優勢を示し、またＭＡＡおよびＤＳＡと弱く反応して、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷによる交差汚染を示唆した。結論これらの結果は、精製ＴＰ１０ＨＤグリコフォームが異なるオリゴ糖構造を提示することを実証する。すなわち、弱カチオン性グリコフォームＴＰ１０ＨＤ− ＣＣＷは末端シアル酸によって特徴づけられ、強カチオン性グリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＸおよびＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳは末端マンノース残基によって特徴づけられる。これらの知見は、末端シアル酸残基の存在は、より緩慢な血漿クリアランスに帰着すること、または末端マンノース残基は細胞性炭水化物受容体へのＴＰ１０ＨＤのより高い結合レベルをもたらし、より速い血漿クリアランスに帰着することを示唆する。実施例ＶＩＩＩＴＰ１０ＨＤのオリゴ糖炭水化物組成および構造の決定実施例ＩＩに記載のように調製したＴＰ１０ＨＤのオリゴ糖の炭水化物組成および構造の決定は、よりカチオン性の強いＴＰ１０ＨＤグリコフォームのシアル酸含量が、弱カチオン性グリコフォームのそれよりも低いことを示した。急速な血漿クリアランスはオリゴ糖鎖にシアル酸がほとんど、または全くないこと、および（推論によれば）マンノースまたはガラクトース受容体へのタンパク質の近づき安さに関連付けられる。緩慢な血漿クリアランスは、１つまたはそれ以上の末端シアル酸残基に関連していた。ＴＰ１０ＨＤグリコフォームの単糖組成Ａ．試験材料の供給源ＴＰ１０ＨＤを上記実施例ＩおよびＶに記載のように単離し、弱カチオン性グリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷおよび強カチオン性グリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳに分割した。Ｂ．方法以下の工程を用いて分析を実施した：１．緩衝液の塩類をすべて除去するための、サンプル（約２７０〜２８０ｍｇ）の脱イオン水に対する透析、およびそれに続く凍結乾燥。２．無水ヒドラジンを用いた無傷のオリゴ糖鎖の放出。３．個々の単糖をＯ−メチル誘導体として遊離させるための、無傷なオリゴ糖鎖の無水メタノール性ＨＣｌによる処理。４．任意の一次アミノ基のＮ−アセチル化５．ペル−Ｏ−トリメチルシリルメチルグリコシドを生じさせるための誘導体化（derivatization）。６．ＣＰ−ＳＩＬ８カラムを用いた毛管ＧＬＣ（気−液クロマトグラフィー）による、これら誘導体の分離。７．公知の標準品と比較したＧＬＣの保持時間および質量分析による個々のグリコシド誘導体の同定。８．内部標準品（１３−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース）を用いたＦＩＤによる各誘導体の定量。Ｃ．結果２つのＴＰ１０ＨＤグリコフォームにおける各単糖の相対的モル含量を下の表９に示す。Ｄ．ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣとの比較以下のＴＰ１０ＨＤ、すなわち先に記述したようにホローファイバーバイオリアクターで産生されたＴＰ１０ＨＤ（ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸ）、分画されたグリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷおよびＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳ、および流動床バイオリアクターで産生された未分画材料（ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣ）の間に存在するかもしれない単糖組成における何らかの差異を特徴付けるため、これら材料のバッチを別の分析的方法を用いて比較した。中性糖およびアミノ糖を、パルス電流測定検出と組み合わせた高速アニオン交換クロマトグラフィー（HPAE-PAD CarbohydrateSystem，Dionex Corp．）により測定した。糖を２０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸中１００℃６時間の加水分解により放出させ、加水分解物を凍結乾燥により、またはスピード−バック（Spee d-Vac）（Savant Instruments）を用いて乾燥した。残留物を１％酢酸ナトリウム３水和物溶液に溶解し、ＨＰＬＣ−ＡＳ６カラムでAnumulaら、［Anal．Bioch em．195：269-280（1991）］が記述するように分析した。サンプルは４回反復して分析を行なった。シアル酸は、別途、Yaoら［Anal．Biochem．179：332-335（1989）］の直接比色定量法により３回の反復実験で測定した。結果を下の表１０に示す。結論グリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷおよびＴＰ１０ＨＤ−ＣＣの単糖組成は、Ｎ−結合タンパク質置換部位の近くでフコシル化されかつトリ−マンノースコアを含有する、シアル酸を末端に持つモノ−、バイ−およびトリアンテナリー（触角状）複合オリゴ糖によくみられる。以下のように結論することができる。すなわち、グリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷは、グリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳより有意に高い比率のシアル酸および／またはより低い比率のマンノースを含有する。ガラクトースおよび（Ｎ−アセチル）−ガラクトサミン含量の相違はおそらく重要ではない。ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸのシアル酸／マンノース比は、この材料（上記Fearonらに記述されている）がグリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳに似ており、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷおよびＴＰ１０ＨＤ−ＣＣとは異なることを示している。後者は、上に示した他のデータと一致して、主として弱カチオン性グリコフォームからなるようである。これらの結果は、より緩慢な血漿クリアランス（ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷ）がより高いシアル酸含量またはシアル酸／マンノース比（＞０．２５）と相互に関連していることを示す。相対的に低いマンノース含量は、この材料におけるより高度の分枝（つまり、バイ−およびトリアンテナリー構造体がより多い）をも反映しているかもしれない。実施例ＩＸＴＰ１０ＨＤグリコフォームから放出されたオリゴ糖の電荷およびサイズ分布分析各グリコフォームサンプル（０．６ｍｇ）からヒドラジン分解により複合オリゴ糖を放出させた。オリゴ糖鎖を還元的トリチウム化により放射性標識した。荷電オリゴ糖をアルカリ条件下の高電圧紙電気泳動にかけ、ピークを検出し、トリチウムラジオグラフィーにより定量した。オリゴ糖鎖をアルトロバクター・ウレアフアシエンス（Arthrobacter ureafaciens）ノイラミニダーゼで処理してシアル酸を除去し、電気泳動を繰り返した。放射性標識脱シアリル化（すなわち中性）オリゴ糖鎖を、BioGel P4、400メッシュ、2m x 15mm（BioRad Corporation，Richmond，CA）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーに以下のようにかけた。クロマトグラフィーは、水中で５５℃ で流量０．２ｍｌ／分で実施した。サンプルを、内部標準品としてのデキストランの非標識部分酸性加水分解物と混合した。放射性標識グリコフォームのオリゴ糖鎖を、インラインフローラジオアイソトープモニター（in−line flow radioi sotope monitor）により検出し、オリゴ糖標準品をインライン示差屈折計により検出した。以下に述べる結果では、各オリゴ糖の流体力学的量は見掛けグルコース単位（ｇｕ）として表され、数値はオリゴ糖アルジトールに直接隣接しているグルコースオリゴマー間の立方スプライン（spline）内挿法により決定した。図４は、ノイラミニダーゼ処理の前および後におけるＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷおよびＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳのラジオエレクトロフォーレトグラムを比較する。どちらの場合にも、ノイラミニダーゼ処理はすべての標識オリゴ糖鎖を中性にし、陰性電荷がすべてシアル酸に起因することを示した。グリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳにおいては、約６４％のオリゴ糖鎖は最初中性で、残りは単一のシアル酸単位に対応する移動度を有していた。グリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷ由来のオリゴ糖鎖については、はるかに高い比率（６９％）の酸性オリゴ糖が存在し、そのうちの４０〜５０％が２個またはそれ以上のシアル酸残基に対応する移動度を有していた。グリコフォームＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷ由来のオリゴ糖鎖の約３１％のみがノイラミニダーゼ処理前に中性であった。サイズプロフィール分析によって調べられた脱シアリル化グリコフォームオリゴ糖鎖のサイズを下の表１１に示す。このように、グリコフォームから誘導されたオリゴ糖鎖はサイズが非常に似ていた。しかし、図５に示されるように、種々のサイズの相対的比率は異なっていた。ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷはＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳに比べ、大きいサイズのオリゴ糖鎖、特に主要な１５ｇｕオリゴ糖をより高い比率で含有し、１４ｇｕのオリゴ糖はより低い比率で含有した。結論電荷分布データからは、さらに、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷによって示された高いシアル酸含量と緩慢な血漿クリアランスとの相関関係を確認できる。２つのグリコフォームについて、酸性および中性オリゴ糖鎖の相対的比率は、急速におよび緩慢に血漿から清浄化された試験材料の比率と類似していた（実施例ＶＩ参照）。これは、主要なＮ−結合オリゴ糖鎖が１個またはそれ以上のシアル酸残基を有する糖タンパク質分子は血漿からゆっくり清浄化されるであろうことを示唆する。他方、中性オリゴ糖鎖は、いまだに不明なメカニズムによって急速な血漿クリアランスと関連づけられている。オリゴ糖鎖のサイズプロフィール単独では、複合オリゴ糖鎖の精巧な構造の明確な同定ができない。しかし、組成およびサイズのデータは両方とも、トリマンノースコア（すなわちバイアンテナリー）を含有し、末端ガラクトースが様々にシアリル化され、また様々にフコシル化されている主要構造体と一致する。付加的可能性は、３個のＧａｌ単位をもつトリアンテナリー構造を生じるための、さらなる分枝を含む。サイズプロフィール自体は、緩慢な血漿クリアランスに関連した主要構造タイプを何ら示唆しないことは明らかである。緩慢な血漿クリアランスは、少数の上記タイプのコア構造体のシアリル化の度合とのみ相互に関連しているのである。実施例Ｘ弱カチオン性ＴＰ１０ＨＤグリコフォームのｐＩは強カチオン性グリコフォームのｐＩよりも低い高度にシアリル化されたグリコフォームのｐＩは、軽度にシアリル化されたグリコフォームのｐＩよりも低くなる。方法クロマトフォーカシングは、イオン交換カラムおよび異なるｐＨの両性緩衝液から生成したｐＨ勾配を用いて、等電点ｐＩに従ってタンパク質のイソフォームを分離する方法である。この実験では、７．１〜４．０のｐＨ勾配を用いて、ＴＰ１０ＨＤ調製物の分析を行った。クロマトグラフ樹脂はMono P，Hr5／5（ニュージャージー州ピスカタウェイ、Pharmacia Fine Chemicals）であり、出発緩衝液は飽和イミノ二酢酸でpH 7.1に滴定した0.025 MBis/Trisであり、溶離剤は水で1：10（ｖ／ｖ）に希釈してＨＣｌでpH 4.0に調整したポリバッファー 7-4（ニュージャージー州ピスカタウェイ、Pharmacia Fine Chemicals）であり、洗浄緩衝液は２ＭのＮａＣｌ水溶液であった。実験条件は、7.1〜4.0単位の線状ｐＨ勾配が得られるように選択した。結果この実験の結果を図６にまとめてある。ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸの主要量のイソフォームは約6.0〜5.7のｐＩを有し、pI 5.0以下の物質が少量存在する。ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣ調製物では、pI 5.7イソフォームが少量成分で、主要量のイソフォームは5.1〜4.8のｐＩを有していた。ピークの積分は、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣ調製物の約40％がｐＩ＜4.9であることを示唆する。ＴＰ１０ＨＤ− ＣＸ調製物に含まれるｐＩ＜4.9の物質はごく少量であるので、この調製物中の低ｐＩ物質の割合を正確に評価することはできなかつた。結論ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸはＴＰ１０ＨＤ−ＣＣよりも高い平均ｐＩを有することがわかり、翻訳後に誘導される酸性基の含量が比較的低いことと一致する。しかし、２つのＴＰ１０ＨＤ調製物間にはイソフォームのプロフィールにおいて若干の重複が存在した。低いｐＩ（ｐＩ＜4.9）を有するＴＰ１０ＨＤ−ＣＣのパーセンテージはブタ血漿から得られるクリアランスの遅い物質のパーセンテージと関連していた（実施例ＶＩ参照）。これらの結果は、より高レベルの末端シアル酸残基を有するグリコフォームがより低いｐＩを示すという、実施例VIIIに記載した知見と合致する。実施例ＸＩＴＰ１０ＨＤグリコフォームの機能活性：in vitro補体媒介溶血の阻害種々のＴＰ１０ＨＤグリコフォームは、以下に示した結果により示されるように、アッセイの信頼区間内で匹敵するin vitro抗溶血機能活性を有する。方法溶血阻害アッセイは、補体源としてのヒト血清の存在下でウサギポリクローナル抗体により感作されたＳＲＢＣの溶解を阻止するＴＰ１０ＨＤの溶液の能力に基づいており、上記の実施例ＶＩに記載してある。活性は標準アッセイ条件下で溶血の50％阻害（ＩＨ50）をもたらすＴＰ１０ＨＤの濃度として表される。50％阻害をもたらすＴＰ１０ＨＤまたはＴＰ１０ＨＤグリコフォームの濃度が低ければ低いほど、この調製物の効力は強くなる。7.8 〜1000 ng／mlのＴＰ１０ＨＤまたはＴＰ１０ＨＤグリコフォームの希釈範囲を各試料につき検討した。結果ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸは20±7 ng／mlの典型的ＩＨ₅₀を示し、一方、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣの値はこれより高く、約50±3 ng／mlであった。このことは、弱カチオン性高度シアリル化グリコフォームを多量に含有する調製物の効力が強カチオン性グリコフォームより約２倍低いことを示唆している。ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷは 44ng/mlの典型的ＩＨ₅₀を有し、一方、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳは27ng/mlの範囲のＩＨ₅₀値を有していた。これらの結果は、非分画化調製物ＴＰ１０ＨＤ−ＣＸおよびＴＰ１０ＨＤ−ＣＣの値と一致する。脱グリコシル化はＩＨ₅₀をＴＰ１０ＨＤ−ＣＸの80ng/mlからＴＰ１０ＨＤ−ＣＸＤの40 ng/mlへと低下させた。結論このアッセイのアッセイ内バラツキは15〜20％の範囲内であり、従って、ＩＨ 50値の２倍差の有意性は判断が難しいが、４倍またはそれ以上の変化は有意であると考えられる。かくして、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣ、ＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＷおよびＴＰ１０ＨＤ−ＣＣＳがこのアッセイにおいて効力が異なると結論づける根拠は何もない。これらグリコフォームの増大したグリコシル化またはシアリル化は、 in vivo血漿半減期を著しく増加させるものの、溶血阻害でのin vitro効力に対しては大きな影響を及ぼさないことが明らかである。プラスミドｐＢＳＣＲＩｃ／ｐＴＣＳｇｐｔを担持するチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系ＤＵＸＢ１１は、1989年3月23日にメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号CRL 10052を指定された。上で引用した文献はすべて参考としてここに組み入れるものとする。本発明について詳しく説明してきたので、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、また、不当な実験を行うことなく、広範囲の均等なパラメーター、濃度および条件のもとで本発明を実施し得るだろう。本発明を特定の実施態様に関連させて説明してきたが、更なる修飾が可能であることが理解されよう。本出願は、一般には本発明の原理に従う本発明のあらゆる変更、使用または改作を包含するものであり、本発明が属する分野において公知のまたは通常のプラクティスに含まれかつ請求の範囲に記載される本質的特徴にあてはまる本開示からの逸脱をも包含するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/46 ＡＣＢＣ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/54 ＡＣＢ 37/02 ＡＢＣ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者マーシュ，ヘンリーシー．ジュニアアメリカ合衆国 01867 マサチューセッツ州リーディング，ハイストリート 218番地 (72)発明者スミス，リチャードエイ．ジー. イギリス国ケイティー18 ５エックスキューエプソンサリー，ユーツリーボトムロード，グレイトバーフ（番地なし) (72)発明者イエ，チャン−ジングレイスアメリカ合衆国 02158 マサチューセッツ州ニュートン，アダムズストリート 298番地 (72)発明者リフター，ジョンアメリカ合衆国 02181 マサチューセッツ州ウェルズレイ，ベレアロード 23 番地 (72)発明者フリーマン，アンマリーイギリス国ケイティー18 ５エックスキューエプソンサリー，ユーツリーボトムロード，グレイトバーフ（番地なし) (72)発明者ゴッセリン，マイケルエル. アメリカ合衆国 02151 マサチューセッツ州レヴィア，フランクリンストリート 105番地

Claims

【特許請求の範囲】１．１つまたはそれ以上の複合オリゴ糖構造を含む、精製された可溶性補体受容体１（ｓＣＲ１）糖タンパク質分子であって、１つまたはそれ以上の該構造が構造あたり平均１個またはそれ以上の末端シアル酸残基を含有する、上記の分子。２．ｓＣＲ１糖タンパク質分子を含有するｓＣＲ１調製物であって、主要なグリコフォームがクロマトフォーカシングにより測定して5.1より低いかまたはこれに等しい等電点ｐＩを示し、該分子のｐＩがノイラミニダーゼ処理後に増加する、上記の調製物。３．ｓＣＲ１分子を含有するｓＣＲ１調製物であって、該分子が１つまたはそれ以上の複合オリゴ糖構造を含み、該オリゴ糖構造の少なくとも約40％がオリゴ糖構造あたり１個またはそれ以上の末端シアル酸残基を含有する、上記の調製物。４．前記分子が１つまたはそれ以上の複合オリゴ糖構造を含み、該オリゴ糖構造の少なくとも約70％がオリゴ糖構造あたり１個またはそれ以上の末端シアル酸残基を含有する、請求項３に記載の調製物。５．本質的にｓＣＲ１分子からなるｓＣＲ１調製物であって、該調製物中のシアル酸対マンノースのモル比が0.25より大きいかまたはこれに等しい、上記の調製物。６．前記糖タンパク質分子の少なくとも40％がクロマトフォーカシングにより測定して5.1より低いかまたはこれに等しい等電点を示す、請求項２に記載のｓＣＲ１調製物。７．前記糖タンパク質分子の少なくとも75％がクロマトフォーカシングにより測定して5.1より低いかまたはこれに等しい等電点を示す、請求項６に記載のｓＣＲ１調製物。８．脱グリコシル化ｓＣＲ１の少なくとも25％の機能的補体阻害活性を有する、請求項１に記載の分子を含有するｓＣＲ１調製物。９．脱グリコシル化ｓＣＲ１の少なくとも25％の機能的補体阻害活性を有する、請求項２、３、４または５に記載のｓＣＲ１調製物。 10．前記ｓＣＲ１糖タンパク質のタンパク質バックボーンが、膜貫通領域の最初のアラニン残基まで（このアラニン残基を含む）のＬＨＲ−Ａ、ＬＨＲ−Ｂ、ＬＨＲ−Ｃ、ＬＨＲ−Ｄ、ＳＣＲ２９、およびＳＣＲ３０領域を含有する、請求項１に記載の分子。 11．前記ｓＣＲ１糖タンパク質のタンパク質バックボーンが、膜貫通領域の最初のアラニン残基まで（このアラニン残基を含む）のＬＨＲ−Ａ、ＬＨＲ−Ｂ、ＬＨＲ−Ｃ、ＬＨＲ−Ｄ、ＳＣＲ２９、およびＳＣＲ３０領域を含有する、請求項２、３、４または５に記載のｓＣＲ１調製物。 12．治療上有効な量の請求項１に記載のｓＣＲ１糖タンパク質分子および医薬上許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物。 13．治療上有効な量の請求項２に記載の調製物および医薬上許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物。 14．治療上有効な量の請求項３に記載の調製物および医薬上許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物。 15．治療上有効な量の請求項４に記載の調製物および医薬上許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物。 16．治療上有効な量の請求項５に記載の調製物および医薬上許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物。 17．治療上有効な量の血栓溶解剤をさらに含有する、請求項12に記載の医薬組成物。 18．治療上有効な量の血栓溶解剤をさらに含有する、請求項13に記載の医薬組成物。 19．治療上有効な量の血栓溶解剤をさらに含有する、請求項14に記載の医薬組成物。 20．治療上有効な量の血栓溶解剤をさらに含有する、請求項15に記載の医薬組成物。 21．治療上有効な量の血栓溶解剤をさらに含有する、請求項16に記載の医薬組成物。 22．前記血栓溶解剤が次の群：（ａ）プラスミノーゲンアクチベーターまたはその変異型；（ｂ）アニソイル化プラスミノーゲンーストレプトキナーゼーアクチベーター複合体；（ｃ）一本鎖ウロキナーゼ；（ｄ）二本鎖ウロキナーゼ；（ｅ）ストレプトキナーゼ；（ｆ）第１の二本鎖プロテアーゼの１つの鎖を第２の二本鎖プロテアーゼの１つの鎖に結合させた繊維素溶解活性ハイブリッドタンパク質であって、該第１または第２のプロテアーゼの少なくとも一方が繊維素溶解活性を示し、それゆえ、該ハイブリッドタンパク質が繊維素溶解活性に不可欠な触媒部位（除去しうる遮断基でブロックされていてもよい）を有するもの；および（ｇ）可逆的にブロックされたin vivo繊維素溶解酵素であって、該酵素の繊維素溶解活性に不可欠な触媒部位が、加水分解の擬一次速度定数がｐＨ7.4の等張水溶液中37℃で10^-6／秒〜10^-3／秒の範囲となるような速度で加水分解により除去しうる基でブロックされているもの；から選ばれる、請求項17、18、19、20または21に記載の医薬組成物。 23．患者の炎症または不適当な補体活性化を伴う疾患または障害を治療する医薬を製造するための請求項１の精製ｓＣＲ１または請求項２、３、４または５のｓＣＲ１調製物の使用。 24．患者の血栓症を治療する医薬を製造するための請求項１の精製ｓＣＲ１または請求項２、３、４または５のｓＣＲ１調製物の使用。 25．患者の血栓症を治療する医薬を製造するための請求項１の精製ｓＣＲ１または請求項２、３、４または５のｓＣＲ１調製物および血栓溶解剤の使用であって、該血栓溶解剤が次の群：（ａ）プラスミノーゲンアクチベーターまたはその変異型；（ｂ）アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ−アクチベーター複合体；（ｃ）一本鎖ウロキナーゼ；（ｄ）二本鎖ウロキナーゼ；（ｅ）ストレプトキナーゼ；（ｆ）第１の二本鎖プロテアーゼの１つの鎖を第２の二本鎖プロテアーゼの１つの鎖に結合させた繊維素溶解活性ハイブリッドタンパク質であって、該第１または第２のプロテアーゼの少なくとも一方が繊維素溶解活性を示し、それゆえ、該ハイブリッドタンパク質が繊維素溶解活性に不可欠な触媒部位（除去しうる遮断基でブロックされていてもよい）を有するもの；および（ｇ）可逆的にブロックされたin vivo繊維素溶解酵素であって、該酵素の繊維素溶解活性に不可欠な触媒部位が、加水分解の擬一次速度定数がｐＨ7.4の等張水溶液中37℃で10^-6／秒〜10^-3／秒の範囲となるような速度で加水分解により除去しうる基でブロックされているもの；から選ばれる、上記の使用。 26．患者の成体呼吸窮迫症候群を治療する医薬を製造するための請求項１の精製ｓＣＲ１または請求項２、３、４または５のｓＣＲ１調製物の使用。 27．患者の移植拒絶反応を治療する医薬を製造するための請求項１の精製ｓＣＲ１または請求項２、３、４または５のｓＣＲ１調製物の使用。 28．前記移植が異種移植または同種移植である、請求項27に記載の使用。 29．前記患者がヒトである、請求項23に記載の使用。 30．前記患者がヒトである、請求項24に記載の使用。 31．前記患者がヒトである、請求項25に記載の使用。 32．前記患者がヒトである、請求項26に記載の使用。 33．前記患者がヒトである、請求項27に記載の使用。 34．前記患者がヒトである、請求項28に記載の使用。 35．請求項１に記載のｓＣＲ１糖タンパク質の調製方法であって、（ａ）オリゴ糖鎖をシアリル化する能力がある培養下の噛乳動物宿主細胞において、ｓＣＲ１のタンパク質バックボーンをコードするＤＮＡ分子を、細胞の生育が栄養素の供給によって制限されない条件下で発現させ、そして（ｂ）該培養物からｓＣＲ１糖タンパク質を単離する、ことからなる方法。 36．（ｃ）段階（ｂ）で得られた物質からシアル酸含有分子を単離することをさらに含む、請求項35に記載の方法。 37．請求項２、３、４または５に記載のｓＣＲ１調製物の調製方法であって、（ａ）糖タンパク質のオリゴ糖鎖をシアリル化する能力がある培養下の噛乳動物宿主細胞において、ｓＣＲ１糖タンパク質のタンパク質バックボーンをコードするＤＮＡ分子を、細胞の生育が栄養素の供給によって制限されない条件下で発現させ、そして（ｂ）該培養物からｓＣＲ１調製物を単離する、ことからなる方法。 38．（ｃ）段階（ｂ）で得られた物質からシアル酸含有分子を単離することをさらに含む、請求項37に記載の方法。