CN1634990A

CN1634990A - 一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法

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Publication number: CN1634990A
Application number: CN 200410067157
Authority: CN
Inventors: 潘卫; 徐容; 王金华; 谢天培; 李云华; 王德贵; 沈毅珺; 扬华; 王锦红; 许浩坤
Original assignee: SHANGHAI RUNLONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Nature Standard Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2004-10-14
Filing date: 2004-10-14
Publication date: 2005-07-06
Anticipated expiration: 2024-10-14
Also published as: CN1319988C

Abstract

本发明涉及一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法。该方法是以来自不同种属免疫球蛋白结合分子葡萄球菌A蛋白protein A的A、B、C、D、E结构域、大消化链球菌protein L的B1、B2、B3、B4、B5结构域、C和G群链球菌蛋白G protein G的G1、G2为结构单元，将上述结构单元随机连接，构建重组Ig结合分子文库，将该文库展示在噬菌体表面；以免疫球蛋白对噬菌体展示重组Ig结合分子文库进行3－4轮亲和筛选，获得系列高亲和力免疫球蛋白结合分子。这种分子显示出很高的免疫球蛋白结合活性，可用于抗体的检测和纯化，在酶联免疫吸附试验、免疫层析检测、免疫组化等免疫学诊断中具有广阔的应用前景。

Description

一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学及免疫诊断学领域，尤其涉及一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法。

背景技术

酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测抗体已广泛用于各种临床疾病的诊断，尤其是传染病如肝炎、HIV感染的免疫诊断、献血者筛选和流行病学调查。但目前ELISA法检测敏感度不高，往往造成漏检而影响疾病的早期诊断，贻误病情或者引起输血后丙型肝炎及HIV感染，严重危害着人们的健康。从用于献血员筛选抗-HCV及抗-HIV ELISA试剂来看，目前最新的检测试剂(第三代试剂)，仍然存在漏检。其中，这些漏检很大一部分是检测系统中另一个关键物质—酶结合物与被抗原捕获的抗体的结合数量不足引起的。因此，提高酶结合物与捕获抗体的结合是提高ELISA抗体检测试剂敏感度关键因素之一。

目前用于检测的酶结合物主要是辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)的多克隆抗体或单克隆抗体、金黄色葡萄球菌蛋白A(protein A)、C和G群链球菌蛋白G(protein G)和大消化链球菌属蛋白L(protein L)。

研究发现，一些细菌表面蛋白能与Ig结合且不影响抗体结合抗原的活性，因此被作为酶结合物应用于酶联等免疫学检测。这些Ig结合分子主要是金黄色葡萄球菌蛋白A(proteinA)、C和G群链球菌蛋白G(protein G)和大消化链球菌属蛋白L(protein L)。protein A主要与Ig的Fc段结合，与人以及几乎所有哺乳动物的IgG的Fc段都有很强的结合，但只结合其中的IgG₁、IgG₂和IgG₄亚类，不能结合IgG₃亚类，与其他类型Ig的结合活性很弱，其与IgM的结合效果不佳。与protein A结合特性相似，protein G也可与人及几乎所有哺乳动物的IgG的Fc段结合，其结合力比protein A略强，不同的是，protein G不能结合除IgG以外的其他类型的免疫球蛋白，因此，不是很适合用作免疫检测。另一种抗体结合蛋白-厌氧菌大消化链球菌属protein L与protein A及protein G的结合特性完全不同，它主要与Ig的κ轻链可变区结合，能结合不同类型Ig的Fab片段，且不影响抗原结合位点，与人以及几乎所有哺乳动物的各类及各亚型的Ig都有较强的结合，并且亲和力相当，适合用作免疫检测。

1992年，瑞典学者Kihlberg等构建了protein L和protein G的融合蛋白Protein LG，发现Protein LG有广泛的抗体结合活性能结合大多数Ig的Fc、Fab段和Ig轻链。与单一的protein L或protein G相比，其抗体结合特性更完全，除人类Ig外，还可用于鼠源性抗体的检测。1998年，瑞典学者Svensson等将protein L的四个结合Igκ轻链的结构域与proteinA四个结合IgG的结构域融合，构建出一种新型融合蛋白Protein LA，结合谱广，不仅能结合人及一些哺乳动物的不同类型Ig和IgG所有亚类，还能结合基因工程单链抗体Fv(ScFv)片段而不影响抗体的抗原结合能力，可用于免疫检测及亲和色谱纯化各类Ig及Fv(ScFv)片段。证明Protein LA是一种多功能的抗体结合分子。目前，Protein LA可溶的、HRP标记、或结合琼脂糖形式的多种制剂已被CLONTECH公司开发成商品。国内至今未有类似产品出现。

蛋白质分子体外定向进化是近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略，通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛选，借以改变、优化生物大分子特性，获得具有改进功能或全新功能的蛋白质，使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现，是改造生物活性分子的重要方法。DNA重排是目前为止最简便、最有效的体外定向分子进化技术，它将一组紧密相关的核酸序列随机片段化，再重新组装成全长核酸序列，通过序列迅速进化，可获得功能更强的新的蛋白分子。DNA重排技术在医药方面已得到广泛应用并在许多酶、抗体及重要蛋白的改造、新型毒素分子及蛋白类药物的制备上取得成功。

protein A、protein L和protein G的抗体结合区各自由多个序列高度重复的结构域组成，protein A的Ig结合区由5个(A、B、C、D、E)58-62个氨基酸残基序列高度同源的结构域串联而成；各单结构域间仅有少量的氨基酸序列差异，如A与B、B与C结构域各有5个氨基酸不同。protein L的Ig结合区也由5个(B1、B2、B3、B4、B5)72-76氨基酸残基序列高度同源的抗体结合结构域重复串联而成，各结构域氨基酸组成大多相同，仅有某些位点不同，如B2与B3结构域只有4个氨基酸不同。protein G的Ig结合活性被定位于2个高度重复的B结构域(G1、G2)，每个结构域由55个氨基酸残基组成。其中protein L的B1、B2、B3、B4、B5结构域分别具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5所示的基因序列；protein A的A、B、C、D、E结构域分别具有如SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示的基因序列；protein G的G1、G2结构域分别具有如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示的基因序列。实验证明上述蛋白的单个的抗体结合结构域也同样具有Ig结合能力。本发明利用DNA重排技术将12种protein L，proteinA和Protein G单结合域(B1、B2、B3、B4、B5、A、B、C、D、E、G1、G2依次代表三种蛋白protein L，protein A和Protein G的不同抗体结合结构域，共12种)为结构单位进行重新随机排列组合，构建重组Ig结合分子文库。利用该文库进行DNA重排可形成多种不同的Ig结合分子，从中可以筛选出与Ig结合能力更强的高亲和力免疫球蛋白(Ig)结合分子(highaffinity immunoglobulin binding molecules HAIBMs)，实现本发明的蛋白质分子体外定向进化。

噬菌体展示技术作为高通量的筛选方法，使得大容量组合基因文库建立后目的分子的体外筛选成为可能。噬菌体展示技术是1985年建立的一种将外源多肽基因插入噬菌体外壳蛋白PIII或PVIII基因中，将外源多肽展示于噬菌体颗粒表面的方法。它外源多肽的基因型和表型巧妙的结合起来，展示在噬菌体表面的外源蛋白直接与其编码基因相关联，通过噬菌体繁殖扩增可直接进行外源蛋白的活性鉴定与序列分析。经特定配基的筛选，可获得特异结合的目的分子，而且通过“吸附”一“洗脱”一“扩增”的重复过程使含有目的蛋白的噬菌体得到上万倍乃至10⁸倍的富集，是一种高效分子进化研究的高通量筛选体系。我们应用的噬菌体展示载体pCANTAB5S，在《新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建》，安徽医科大学学报，2004年第39卷第2期第83～86页中，以及中国专利文献-文献号1508254中具有详细描述，这里简单的说，是在引物中加入SacI酶切位点，将用该引物扩增的IFN-αA-2b衔接片段PCR产物克隆到pMD-18T中，再将该片段插入pCANTAB5L中，经SacI酶切，回收线性载体片段，再连接形成新型噬菌体展示载体pCANTAB5S。pCANTAB5S校正了pCANTAB5L克隆位点的读框并引入了新的限制酶切位点SacI。重组噬菌粒pCANTAB5S的结构示意见图12。pCANTAB5S可以对重组Ig结合分子文库进行展示，并可以通过Ig对噬菌体展示重组Ig结合分子文库进行亲和筛选，获得系列HAIBMs。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组Ig结合分子文库。

本发明的另一个目的是提供一种重组Ig结合分子文库的噬菌体展示方法。

本发明的另一个目的是提供一种获得高亲和力Ig结合分子的方法。

本发明的另一个目的是提供一种高亲和力Ig结合分子。

本发明的另一个目的是提供一种高亲和力Ig结合分子编码基因。

本发明的另一个目的是提供本发明的高亲和力Ig结合分子应用于免疫学诊断或抗体的检测和纯化。

在本发明的第一方面，本发明涉及一种重组Ig结合分子文库，该文库以不同的Ig结合分子葡萄球菌A蛋白的A、B、C、D、E结构域，大消化链球菌L蛋白的B1、B2、B3、B4、B5结构域，G群或C群链球菌G蛋白的G1、G2结构域的单个抗体结合结构域为结构单元，随机地进行任意个结构单元的DNA重排形成Ig结合分子文库。

在本发明的第二方面，本发明涉及一种重组Ig结合分子文库的噬菌体展示方法，该方法将按所述Ig结合分子文库克隆于噬菌粒载体pCANTAB5S中，以该载体进行3+3形式的噬菌体展示。

在本发明的第三方面，本发明涉及一种获得高亲和力Ig结合分子的方法，该方法用Ig包板，利用所述的噬菌体展示方法使所述重组Ig结合分子文库经3-4轮体外定向进化IgG亲和筛选获得高亲和力Ig结合分子。

在本发明的第四方面，本发明涉及一种高亲和力Ig结合分子，其序列特征是由葡萄球菌A蛋白的单个结构域、大消化链球菌protein L的单个结构域及G群或C群链球菌G蛋白的单个结构域间隔排列或重复排列连接而成。

更佳地，以ML、MA、MG分别代表大消化链球菌L蛋白的单个结构域、葡萄球菌A蛋白的单个结构域、G群或C群链球菌G蛋白的单个结构域，则上述高亲和力Ig结合分子的序列的排列方式为(ML-MA)n或(ML-MG)n或(ML-MA-MG)n或(ML-MG-MA)n或ML-(MA-ML)n或ML-(MG-ML)n，其中n为该序列的重复次数。

更佳地，上述高亲和力Ig结合分子序列的排列方式为B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1之任一种。

更佳地，上述高亲和力Ig结合分子具有SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32任一所示的序列特征。

在本发明的第五方面，本发明涉及一种高亲和力Ig结合分子的编码基因，它可以编码上述的高亲和力Ig结合分子。

更佳地，上述高亲和力Ig结合分子的编码基因，具有SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31任一所示的序列。

在本发明的第六方面，本发明提供的高亲和力Ig结合分子应用于免疫学诊断或抗体的检测和纯化。尤其是应用于酶联免疫吸附试验或免疫层析检测或免疫组化。

本发明的技术路线是采用分子生物学技术构建重组Ig结合分子文库；将该文库以3+3的方式展示丝状噬菌体上；用Ig对噬菌体展示文库进行3-4轮亲和筛选，获得系列高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)；序列分析测定所获HAIBM的DNA序列，并确知其氨基酸序列，分析其分子的构成特点；原核表达、纯化HAIBM分子，测定其与Ig的结合能力；测定展示有HAIBM分子噬菌体与Ig的结合能力及在ELISA抗体检测中的作用。

本发明的优点是利用蛋白质分子体外定向进化的策略，通过构建重组Ig结合分子基因文库筛选到与免疫球蛋白高亲和力结合的一系列Ig结合分子(HAIBMs)，HAIBMs作为具有高亲和力的新的Ig结合分子可以广泛用于酶联免疫吸附试验、免疫层析检测、免疫组化等免疫学诊断及抗体的检测和纯化。

附图说明

图1Protein A的A、B、C结构域基因片段的PCR扩增产物电泳示意图，其中：

m：DL2000 Marker

1-4：Mu-Protein A A结构域基因片段PCR扩增产物

5-6：Mu-Protein A B结构域基因片段PCR扩增产物

7-8：Mu-Protein A C结构域基因片段PCR扩增产物

C：空白对照

图2Protein A的D结构域基因片段的PCR扩增产物电泳示意图，其中：

m：DL2000 Marker

1-4：Mu-Protein A D结构域基因片段PCR扩增产物

C：空白对照

图3Protein A的E结构域基因片段的PCR扩增产物电泳示意图，其中：

m：DL2000 Marker

1-4：Mu-Protein A E结构域基因片段PCR扩增产物

C：空白对照

图4Protein L B1-B5结构域基因片段的PCR扩增产物电泳示意图，其中：

1：Protein L B1结构域基因片段的PCR扩增产物

2：Protein L B2结构域基因片段的PCR扩增产物

3：Protein L B3结构域基因片段的PCR扩增产物

4：Protein L B4结构域基因片段的PCR扩增产物

5：Protein L B5结构域基因片段的PCR扩增产物

C：空白对照

m：DL2000Marker

图5Protein G G1-G2结构域基因片段的PCR扩增产物电泳示意图，其中：

1：Protein G G1结构域基因片段的PCR扩增产物

2：Protein G G2结构域基因片段的PCR扩增产物

C：空白对照

m：DL2000Marker

图6Protein A单结构域+Protein L单结构域+Protein G单结构域连接反应产物电泳示意图，其中：

1：连接前 2：连接30’ 3：连接1h

4：连接2h 5：连接4h 6：连接24h

m：DL2000Marker

图7PALGn/phage文库Ig筛选F1代文库中单克隆噬菌体插入片段的PCR扩增1-8：单克隆1-16#；C：阳性对照LT/pCANTAB5L；m：DL2000Marker；n：阴性对照pCANTAB5S

图8PALGn/phage文库Ig筛选F2代文库中单克隆噬菌体插入片段的PCR扩增1-8：单克隆1-16#；C：阳性对照LT/pCANTAB5L；m：DL2000Marker；n：阴性对照pCANTAB5S

图9PALGn/phage文库Ig筛选F3代文库中单克隆噬菌体插入片段的PCR扩增1-8：单克隆1-16#；C：阳性对照LT/pCANTAB5L；m：DL2000Marker；n：阴性对照pCANTAB5S

图10PALGn/phage文库Ig筛选F4代文库中单克隆噬菌体插入片段的PCR扩增1-8：单克隆1-16#；C：阳性对照LT/pCANTAB5L；m：DL2000Marker；n：阴性对照pCANTAB5S

图11各筛选轮次IgG结合分子文库中HAIBM分子中的单结构域(domain)组成分布的比例

图12重组噬菌粒pCANTAB5S的结构示意图

具体实施方式

一、重组Ig结合分子基因文库的构建

与传统的DNA重排—将目的片段DnaseI随机消化后重组装实现体外定向进化的方式不同，本发明以不同种属的Ig结合分子的单个抗体结合结构域作为结构单位(protein A的A、B、C、D、E结构域，protein L的B1、B2、B3、B4、B5结构域和protein G的G1、G2结构域)经PCR扩增引入相同的限制酶切位点作为Linker，经酶切消化后，再用T4连接酶将各单结构域进行随机连接重组，构成重组Ig结合分子文库。在该文库中DNA重排可形成不同长度(2-5个结构域或更多)以55-76个氨基酸残基组成的抗体结合结构域为最小单位的重组Ig结合分子，其随机重复串联可产生12n以上种的不同Ig结合分子(n为重复串联的最小功能单位个数)；与Protein LA分子相比，其多样的排列形式可用P(L/A/G)n来表示，P为多肽，(L/A/G)为5种Protein L、5种Protein A及2种Protein G单结构域中的任何一种，n为重复串联的单结构域的个数。与Protein LA(LLL-AAAA)及Protein LG单一的结构形式相比，分子库中L与A/G距离的多样性、(L/A/G)重复串联数的多样性以及各种L/A/G氨基酸差异产生的序列多样性使得产生出与Ig结合能力更强的高亲和力Ig结合分子。该分子文库中各单结构域是具有一定结构的有序多肽，本身具有Ig结合能力，在新的蛋白中其基本的构架结构得以继续保存，从而保证了组合分子的Ig结合能力得到提高和优化。另外因各单结构域自身具有二级结构(α螺旋或β折叠)，重组分子的空间结构比随机片段重组分子有更高的稳定性，有利于新的蛋白空间构象的维持。为了保证重组分子的多样性，发明人通过调整各片段的浓度，使各片段比例相当，同时控制连接反应条件，将不同时间的连接产物混合，得到不同长度的各种排列的重组Ig结合分子基因文库，说明书附图图1-图6即分别显示了Protein A的A、B、C片段的PCR扩增产物电泳示意图，Protein A的D片段的PCR扩增产物电泳示意图，Protein A的E片段的PCR扩增产物电泳示意图，Protein L的B1-B5片段的PCR扩增产物电泳示意图，Protein G的G1-G2片段的PCR扩增产物电泳示意图，ProteinA单结构域+Protein L单结构域+Protein G单结构域连接反应产物电泳示意图。

二、重组Ig结合分子文库的噬菌体展示

将重组Ig结合分子文库克隆于噬菌粒载体pCANTAB5S中，以噬菌粒为载体进行3+3形式的展示。外源基因插入噬菌粒的III基因中，转化大肠杆菌TG1，M13KO7辅助噬菌体拯救，构建展示Ig结合分子噬菌体文库。所建的库容量为3.4×10⁷个菌落形成，噬菌体的滴度为4.1×10¹²单位转化单位/毫升(tramsformation unit/ml，TU/ml)。pCANTAB5S噬菌粒载体不仅保留原pCANTAB5L载体的多克隆位点和[G4S]3接头，保证了大分子量(＞300个氨基酸)重组Ig结合分子的功能维持和活性展示，还增加了SacI克隆位点，能更方便，有效地展示外源基因文库，有利于扩大库容量。

三、Ig体外定向分子进化筛选高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)

利用噬菌体展示技术建立的高通量筛选结合Ig体外定向分子进化筛选。用Ig包板，噬菌体展示Ig结合分子文库经3-4轮Ig亲和筛选获得HAIBMs。我们在每轮库筛选中选用了的IgG结合实验菌落计数、插入片段PCR阳性克隆数等指标直观评价筛选的效果，结果见表1，表2，图7，图8，图9，图10，图11。

四、高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的分子结构特点及序列

制备筛选后单克隆的重组噬菌体，提取噬菌粒DNA，用pCANTAB5S的上下游引物pCANTAB5-S1和pCANTAB5-S6双向测定其DNA序列，所测序列用DNASTAR软件分析其序列特征。高亲和力Ig结合分子序列分析显示其结构域组成的多样性：由来自不同Ig结合分子的单个抗体结合结构域-protein A的A/B/C/D/E、protein L的B1/B2/B3/B4/B5、protein G的G1/G2重组连接形成(B1-B5代表protein L的B1-B5结构域，A、B、C、D、E代表protein A的A、B、C、D、E结构域，G1、G2代表protein G的B1、B2结构域)，如B1-B2-G1-A、B3-D-B3、B1-B3-B1、G1-B2-A-B1、B1-G2-B1、D-B2-B-B3、B3-D-B3-D-B3、B-G1-B2-D-B1等。以ML、MA、MG分别代表大消化链球菌L蛋白的单个结构域、葡萄球菌A蛋白的单个结构域、G群或C群链球菌G蛋白的单个结构域，则HAIBMs所具备的分子结构特征为：(ML-MA)n或(ML-MG)n或(ML-MA-MG)n或(ML-MG-MA)n或ML-(MA-ML)n或ML-(MG-ML)n结构，HAIBMs均由protein L的单结构域(ML)、protein A的单结构域(MA)或protein G的单结构域(MG)间隔排列连接而成(n为该序列的重复次数)。其中的代表序列的连接方式为：B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1。在代表序列protein L、protein A、proteinG的单结构域之间以核苷酸以GAGCTC连接。本发明特别揭示了具有SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32任一所示的序列的高亲和力Ig结合分子。

五、HAIBM重组噬菌体的Ig结合活性测定

用Ig包板分别对各单克隆HAIBM重组噬菌体进行Ig结合活性测定。以两种方式检测重组噬菌体与Ig的结合，第一种在重组噬菌体与抗体结合后的样孔中加入大肠杆菌TG1使其感染，将单克隆重组噬菌体感染菌液涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数，以辅助噬菌体为阴性对照，菌落数的多少表示噬菌体与Ig结合能力的大小；第二种在重组噬菌体Ig结合后的样孔中加入酶标抗噬菌体抗体(HRP/Anti-M13 conjugate)，TMB显色，测OD₄₅₀nm值，直接检测被人Ig特异吸附的重组噬菌体的数量，结果见表3。

六、高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的功能

将HAIBMs克隆于原核表达载体pET32(a)，IPTG诱导表达HAIBMs蛋白，用Ni亲和层析柱纯化HAIBMs蛋白。用纯化的HAIBMs包被96孔酶标板，同时设SPA阳性对照，LT阴性对照，加入IgG HRP酶标抗体，可以检测HAIBMs与Ig的结合活性，结果见表4。

七、高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的应用

将HCV抗原包被于酶标排条板上，洗涤后，加入丙型肝炎病毒感染阳性病人的血清，作用后洗去未结合的抗体，加入不同的HAIBM单克隆重组噬菌体(各滴度调至同一水平)，设噬菌体阴性对照，将反应后的样品分成两组，第一组每孔加入大肠杆菌TG1使其感染，将单克隆重组噬菌体感染的菌液涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数，以辅助噬菌体为阴性对照；第二组每孔加入噬菌体抗体HRP/Anti-M13 conjugate，TMB显色，测OD₄₅₀nm值，用于检测被病人血清特异吸附的重组噬菌体的数量，结果见表4、表5、表6。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 重组Ig结合分子文库的构建

1.合成引物

1.1用于protein A、protein L、protein G单结构域基因扩增

(1)从Mu-protein A/pGEM-T easy质粒上扩增Protein A-A、Protein A-B/C、Protein A-D、Protein A-E序列的上游引物分别为：

PA-uA：5’-cacgagctcGCTGACAACAATTTCAAC-3’

PA-uB：5’-cgcgagctcGCGGATAACAAATTCAAC-3’

PA-uC：5’-cgcgagctcGCTGACAACAAATTCAAC-3’

PA-uD：5’-tccgagctcGCTGATGCGCAACAAAAT-3’

PA-uE：5’-cgcgagctcGCTCAACAAAATGCTTTT-3’

下游引物分别为：

PA-dA：5’-tctgagctcTTTCGGTGCTTGAGATTC-3’

PA-dB：5’-tctgagctcTTTTGGTGCTTGTGCATC-3’

PA-dC：5’-acggagctcTTTTGGTGCTTGAGCATC-3’

PA-dD：5’-tcggagctcAAAGCCACGAACTCTAAG-3’

PA-dE：5’-agagagctcTTTTGGAGCTTGAGAGTC-3’

(2)从Protein L/pGEM-T easy质粒上扩增Protein L的B1-B5序列的上游引物分别为：

pLB1-u：5’-tctgagctcAAAGAAGAAACACCAGAA-3’

pLB2-u：5’-acggagctcAAAGAAAAAACCCCGGAA-3’

pLB3-u：5’-cgtagactCAAAGAAAAAACACCAGAA-3’

pLB4-u：5’-cgtagactcAAAGAAAAAACACCAGAA-3’

pLB5-u：5’-cgcagactcAAGAAAGTTGACGAAAAA-3’

下游引物分别为：

pLB1-d：5’-cgcagactcTCCAGCAAATTTAATATT-3’

pLB2-d：5’-cgcagactcTCCAGCAAATTTAATATT-3’

pLB3-d：5’-tgcgagctcACCAGCGAATTTGATGTT-3’

pLB4-d：5’--cgcagactcACCTGCAAATCTAATATT-3’

pLB5-d：5’--cgtagactcTCCAGCAAATCTAATGTT-3’

(3)从Protein G/pGEM-T easy质粒上扩增Protein G B1-B2序列的上游引物分别为：

pG1-u：5’-tctgagctcACTTACAAATTAATCCTT-3’

pG2-u：5’-tctgagctcACTTACAAACTTGTTATT-3’

下游引物分别为：

pG1-d：5’-tatgagctcTTCAGTTACCGTAAAGGT-3’

pG2-d：5’-tctgagctcTTCAGTAACTGTAAAGGT-3’

上述引物均引入了SacI(-GAGCTC-)酶切位点。

1.2用于PCR扩增检测阳性克隆插入片段的引物序列，为pCANTAB5S克隆位点上、下游序列上游引物为：

pCANTAB5-S1：5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’

下游引物为：

pCANTAB5-NOT2：5’-GCCCAGCCGGCC-3’

1.3用于阳性克隆DNA测序的引物序列，为pCANTAB5E的上、下游序列上游引物为：

pCANTAB5-S1：5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’

下游引物为：

pCANTAB5-S6：5’-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3’

2各抗体结合结构域的PCR扩增

所使用的模板protein A序列见GenBank AB050857，protein L序列见GenBank M86697，protein G见GenBankY00428。以含葡萄球菌A蛋白的5个抗体结合结构域(A-E)的protein A/pGEM-T easy质粒为模板，用PA-uA/PA-d A、PA-u B/PA-d B、PA-u C/PA-d C、PA-u D/PA-dD、PA-u E/PA-d E分别扩增Protein A的A、B、C、D及E片段；以Protein L/pGEM-T easy质粒为模板，用pL B1-u/pL B1-d、pL B2-u/pL B2-d、pL B3-u/pL B3-d、pL B4-u/pL B4-d和pL B5-u/pL B5-d为引物，PCR分别扩增Protein L的B1，B2，B3，B4及B5片段；以Protein G/pGEM-T easy质粒为模板，用pG1-u/pG1-d和pG2-u/pG2-d为引物，PCR分别扩增ProteinG的B1，B2片段。PCR反应体积50μl，加质粒模板5ng，上、下游引物各1μmol，dNTP 100μmol，Mg++2mmol，1U Taq酶。扩增条件为94℃30sec；60℃30sec；72℃30sec；35个循环。各PCR产物用申能博彩公司的胶试剂盒纯化，按说明书进行。相应的PCR扩增产物电泳图见图1-图5。

3PCR回收产物的酶切

各PCR回收产物取40μl作SacI酶切，反应体积80μl。SacI 4μl(40U)、10×buffer8μl，分80μl/支，37℃酶切过夜，1％琼脂糖电泳后，用手术刀片割下目的条带，用申能博彩公司的胶试剂盒回收PA-A、PA-B、PA-C、PA-D、PA-E，PL B1、PL B2、PL B3、PL B4、PL B5及PG1、PG2酶切片段。

4Ig结合分子文库的构建

上述各酶切回收片段取5μl(1μg)，10×连接缓冲液8μl，T4 DNA连接酶4μl(20U)，反应体积100μl。先将DNA片段与水一起加入管中于65℃温育5分钟，在连接反应试剂加入之前，将DNA溶液于0℃预冷5分钟，加入T4 DNA连接酶，连接混合物分5支，20μl/支，16℃分别连接30min、1h、2h、4h、24h，再将不同时间的连接产物混合起来用于与pCANTAB5S DNA的连接。图6显示连接成功。

实施例2、重组Ig结合分子文库的噬菌体展示

1.噬菌粒载体pCANTAB5S DNA的制备及线性化：

pCANTAB5S噬菌粒DNA用申能博彩公司质粒回收试剂盒抽提，按说明书进行。琼脂糖电泳定量。SacI酶切后碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化处理，试剂盒从溶液中胶回收线性化载体，琼脂糖电泳定量。

2.Ig结合分子文库与噬菌粒载体连接：

将12种回收的protein A的A、B、C、D、E单结合域酶切片段，protein L的B1、B2、B3、B4、B单结合域酶切片段，Protein G的G1、G2单结合域酶切片段的混合物80μl(5μg)加T4 DNA连接酶5μl(25U)，10×Buffer1.5μl，反应总体积100μl。将100μl分为20μl/支，共5支，16℃连接，分别连接30min、60min、90min、120min、150min后合并，加入载体2μl(2μg)，65℃处理10min冷却至室温，再加入T4 DNA连接酶5μl(25U)，10×Buffer2μl，反应总体积120μl，分6支16℃分别连接30min、60min、90min、120min、150min和180min后合并。

3.感受态细胞的制备：

原始TG1菌划线LB平板，37℃温箱中培养过夜，挑取活化平板上单克隆菌落接种于2mlPsi培养基的试管中，37℃250rpm摇床振荡培养过夜；再将培养细菌1∶50转接于Psi培养基中，37℃250rpm，摇荡培养至OD值0.4。将菌液1ml/支分装于1.5ml离心管中，冰水浴15分钟，4000rpm，4℃离心10min；去除上清，用1ml 0.1M CaCl₂小心将细菌悬浮起来；冰水浴15min，3500rpm，4℃离心10min；去除上清，沉淀用200μl 0.1M CaCl₂将细菌小心复悬，冰浴备用。

4.重组噬菌体的制备：

120μl连接产物加入2ml感受态细胞中，轻轻混匀，冰水浴30min，42℃水浴60s，冰水浴2min，加8ml SOC培养基，37℃ 150rpm，摇床振荡培养1h，取100μl均匀涂布LB氨卞青霉素(100ng/ml)平板37℃培养过夜，计数菌落数以计算库容量，其余液体37℃ 150rpm摇床振荡培养过夜。第二天，转化培养物用100ml 2×YT(1.6％胰蛋白胨，1％酵母膏，0.5％氯化钠)活化培养1小时，加入10ml 4×10¹⁰TU/ml的M13KO7辅助噬菌体拯救，37℃，250rpm振荡培养1小时，加卡那霉素至浓度50ng/ml，37℃，250rpm振荡培养过夜。培养物5000rpm离心10分钟，取上清经0.22μm滤膜过滤，获得原代(F₀代)重组噬菌体PALGn库。其转化效率为3.4×10⁷(自连对照为0)。因此，所建文库容量为3.4×10⁷个菌落形成单位。分子文库由12种构成元件组成：protein A的A-E domain、protein L的B1-B5 domain和protein G的G1，G2 domain，如按最长可形成5个domain的PAL分子算，每个domain均有正反两种方式插入，该库应含24+24²+24³+24⁴+24⁵即8.3×10⁶种不同排列组合方式的外源PALGn分子，因此，我们构建的PALGn-pCANTAB5S组合文库完全能较好地包含所有的随机组合PALGn分子。

5.重组噬菌体滴度测定

将重组噬菌体10倍系列稀释，各取重组噬菌体10μl感染对数生长期的大肠杆菌TG1 100μl，37℃培养1小时后涂LB(含氨卞青霉素100ng/ml)平板，置37℃培养过夜。计数不同稀释度平皿上的菌落数，生长菌落数的稀释倍数乘以100即为每毫升噬菌体的转化单位数(transformation unit，TU)。检测结果展示F₀代Ig结合分子PALGn库的重组噬菌体的滴度为4.1×10¹²TU/ml，用相同的方法在含卡那霉素抗性的平板上计数检测的M13KO7野生型噬菌体的滴度为6.1×10¹²TU/ml，重组噬菌体的滴度与野生型噬菌体的滴度水平基本一致。

实施例3、Ig体外定向分子进化筛选高亲和力Ig结合分子

1.重组噬菌体库的Ig亲和筛选：

用PH9.6的碳酸盐缓冲液200μl包被人Ig(终浓度为10μg/ml)于酶标排条板上37℃，2小时，用150μl封闭液(PBS+10％脱脂奶)封闭排条板1小时，4℃保存。用洗液(PBS+0.05％Tween20)洗5遍后用于噬菌体文库的亲和力筛选。排条板每孔加100μl封闭液和100μlPALGn重组噬菌体，37℃反应3小时，洗液(0.25％Tris+0.05％Tween20)洗涤30遍，加100μl对数生长期的大肠杆菌TG1，37℃反应1小时，收集后取10μl、1μl、0.1μl涂LB(含氨卞青霉素100ng/ml)平板37℃过夜培养计数，用以评估噬菌体文库与Ig分子的结合情况。其余菌液加入5ml 2×YT中，37℃，250rpm振荡培养1小时，加入氨卞青霉素至100ng/ml，加1ml4×10¹⁰TU/ml的M13KO7辅助噬菌体，37℃，250rpm振荡培养1小时，加卡那霉素至50ng/ml，37℃，250rpm振荡培养过夜。培养物5000rpm离心10分钟，上清经0.22μm滤膜过滤，即为Ig亲和筛选后的PALGn重组噬菌体文库。设阳性对照Protein A/phage两条作IgG同步筛选(Protein A/phage的制备：取Protein A/pCANTAB5L质粒600ng转化TG1感受态细胞，其余过程同PALGn/phage)。按上述过程，Ig亲和筛选重复4轮，同时进行每轮筛选库的滴度测定。每轮筛选均设阴性对照LT/phage两孔(LT/phage制备过程同Protein A/phage)，空白对照两孔(不加phage)，作IgG结合实验，各取10μl、1μl、0.1μl涂LB(含Amp 100ng/μl)平板37℃过夜培养计数。每轮的Ig结合实验菌落计数(空白对照均为0)及滴度测定结果如表1。由表可见PALGn/phage文库与Ig的结合能力随着筛选轮次的增加而不断提高，反应了筛选过程能有效地使文库地Ig的结合能力不断进化。

表1每轮Ig筛选过程中噬菌体文库的Ig结合菌落计数

注：F表示菌落数＞300个。

2.插入片段的PCR鉴定：噬菌体原始库及每一轮噬菌体筛选库随机挑取PALGn/phage Ig结合试验平板上单克隆菌落48个至0.5ml离心管中培养5h，以培养菌液为模板，pCANTAB5-S1为上游引物，pCANTAB5-NOT1为下游引物，进行PCR扩增以检测插入片段的大小。PCR扩增条件为94℃30sec；53℃30sec；72℃45sec；35个循环。设阳性对照LT/pCANTAB5L，阴性对照pCANTAB5S。该实验用以了解筛选过程中噬菌体文库中所展示的Ig结合分子分子量大小的变化情况。表2与图7-11的结果显示，随着筛选轮次的不断增加，文库中大分子量的HAIBM分子的比例不断增加，反应了筛选过程使文库中的分子不断向有利于Ig结合的方向进化。

表2各筛选轮次文库中48个随机挑选HAIBM分子中的单结构域组成的分布情况

单结构域组成 F₀ F₁ F₂ F₃ F₄

0domain 8 8 8 5 4

1domain 5 5 2 1 0

2domain 35 35 37 26 23

3domain 0 0 1 7 12

＞3domain 0 0 0 9 9

总计 48 48 48 48 48

以上结果表明每轮筛选库的IgG结合实验菌落计数、插入片段PCR阳性克隆数能迅速直观地反应体外定向进化的效果。从IgG结合条件实验菌落计数看，随着筛选轮次的增加，PALGn/phage IgG结合活性接近(F₃代)并高于(F₄代)阳性对照IgG结合活性；插入片段PCR鉴定结果显示阳性克隆数随着筛选轮次增加而增加并趋于稳定，阳性克隆组成也有明显变化：随着筛选轮次增加，大片段(≥2个domain)数目及其阳性百分率增加，小片段数目及其阳性百分率降低。说明经过IgG筛选，与IgG亲和力低的短片段被淘汰，而与IgG亲和力高的较长片段被筛选出来。IgG结合实验结果与插入片段PCR鉴定结果一致，均与理论相符，体现了噬菌体展示技术中利用亲和力选择的强大功效。

实施例4、高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的分子结构特点

从第4轮筛选所得到的噬菌体文库中，挑选插入片段较大的阳性克隆进行序列分析，阳性克隆的重组噬菌粒用DNA抽提试剂盒纯化，委托上海申能博彩公司进行序列测定，测序引物为pCANTAB5E的上、下游引物pCANTAB5-S1和pCANTAB5-S6，测序结果用DNASTAR软件分析。结果见表3-6。序列分析显示其结构域组成的多样性：(1)被选择出的分子包括由来自不同种属Ig结合分子的单个抗体结合结构域-protein A的A/B/C/D/E、protein L的B1/B2/B3/B4/B5和protein G的G1/G2重组连接形成；(2)文库中单个分子中的单结合结构域的排列方式多样，包括：B1-B2-G1-A、B3-D-B3、B1-B3-B1、G1-B2-A-B1、B1-G2-B1、D-B2-B-B3、B3-D-B3-D-B3、B-G1-B2-D-B1等等。比较各HAIBMs分子结构发现他们具有一定的排列特征：(ML-MA)n或(ML-MG)n或(ML-MA-MG)n或(ML-MG-MA)n或ML-(MA-ML)n或ML-(MG-ML)n结构，由protein L的单结构域(ML)、protein A的单结构域(MA)或protein G的单结构域(MG)间隔排列连接而成(n为该序列的重复次数)。其中的代表序列的排列方式为：B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1。在代表序列protein L、protein A、protein G的单结构域之间以核苷酸GAGCTC连接。核苷酸GAGCTC可编码接头肽EL(氨基酸单字母表示)代表序列的核苷酸序列如下：

1、代表序列B3-G1-B2-G2-B5(SEQ ID NO：13)：

AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAAC

AGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTA

AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTACAAATTAATCCTT

AATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACGC

TAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAAGAGCTCAAAGAAA

AAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAA

TTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATGCATTAAAGAAGGACAATGGAGAATATAC

AGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTACAAACTTGTTATTAATGGTA

AAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTAGACGCAGAAACTGCAGAAAAAGCCTTCAAACAATACGCTAACGAC

AACGCTGTTGATGGTGTTTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGTAACTGAAGAGCTCAAGAAAGTTGACGA

AAAACCAGAAGAAAAAGAACAAGTAACAATTAAAGAAAATATATATTTTGAAGATGGAACAGTACAAACTGCAACATTTA

AAGGAACATTTGCAGAAGCGACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATTTGTTATCAAAAGAACATGGTAAATACACAGCA

GACTTGGAAGATGGTGGATACACTATCAACATTAGATTTGCTGGA

2、代表序列B2-D-G1-B5-C-G1(SEQ ID NO：15)：

AGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATGCATTAAAGAAGGACAATGGAG

AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAAT

AACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTT

CATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCAC

CGAAAGAGCTCACTTACAAATTAATCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCT

ACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGAC

CTTTACAGTTACTGAAGAGCTCAAGAAAGTTGACGAAAAACCAGAAGAAAAAGAACAAGTAACAATTAAAGAAAATATAT

ATTTTGAAGATGGAACAGTACAAACTGCAACATTTAAAGGAACATTTGCAGAAGCGACAGCAGAAGCATACAGATATGCA

GATTTGTTATCAAAAGAACATGGTAAATACACAGCAGACTTGGAAGATGGTGGATACACTATCAACATTAGATTTGCTGG

AGAGCTCGCTGACAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAACTTAACTGAAG

AACAACGTAACGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTA

AACGATGCTCAAGCACCAAAAGAGCTCACTTACAAATTAATCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGA

AGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACG

ACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAA

3、代表序列B5-A-B2-G1-B1(SEQ ID NO：17)：

AAGAAAGTTGACGAAAAACCAGAAGAAAAAGAACAAGTAACAATTAAAGAAAATATATATTTTGAAGATGGAACAGTACA

AACTGCAACATTTAAAGGAACATTTGCAGAAGCGACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATTTGTTATCAAAAGAACATG

GTAAATACACAGCAGACTTGGAAGATGGTGGATACACTATCAACATTAGATTTGCTGGAGAGCTCGCTGACAACAATTTC

AACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAACATGCCTAACTTGAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCA

AAGCTTAAAAGATGACCCAAGTCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAG

AGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACA

CAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATGCATTAAAGAAGGACAA

TGGAGAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTACAAATTAA

TCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAA

TACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAAGAGCTCAA

AGAAGAAACACCAGAAACACCAGAAACTGATTCAGAAGAAGAAGTAACAATCAAAGCTAACCTAATCTTTGCAAATGGAA

GCACACAAACTGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAAAAGCAACATCAGAAGCTTATGCGTATGCAGATACTTTGAAGAAA

GACAATGGAGAATATACTGTAGATGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGA

4、代表序列B3-D-B3(SEQ ID NO：19)：

CGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGA

AAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAA

AGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGA

5、代表序列B3-D-B3-D-B3(SEQ ID NO：21)：

AGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATG

CGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAA

CGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGA

ATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCT

ATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGAC

TTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGA

6、代表序列B2-G2-A-B3-D-G1(SEQ ID NO：23)：

AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTACAAACTTGTTATT

AATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTAGACGCAGAAACTGCAGAAAAAGCCTTCAAACAATACGC

TAACGACAACGCTGTTGATGGTGTTTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGTAACTGAAGAGCTCGCTGACA

ACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAACATGCCTAACTTGAACGAAGAACAACGCAATGGT

TTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGTCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGC

ACCGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATG

GAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCA

AAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGA

TGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGC

AACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAAC

GAATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCACTTACAAATTAATCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGC

TGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACG

ATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAA

7、代表序列B1-G1-B3-G1(SEQ ID NO：25)：

AAAGAAGAAACACCAGAAACACCAGAAACTGATTCAGAAGAAGAAGTAACAATCAAAGCTAACCTAATCTTTGCAAATGG

AAGCACACAAACTGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAAAAGCAACATCAGAAGCTTATGCGTATGCAGATACTTTGAAGA

AAGACAATGGAGAATATACTGTAGATGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTAC

AAATTAATCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTT

CAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAAG

CAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAA

TGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTACAAATTAA

TACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAA

8、代表序列B2-D-B3-D-B1(SEQ ID NO：27)：

ATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCAAAGAAGAAACACCAGAAACACCAGAAACTGATTCAGAAGAAGAAGTAACAATCAAAG

CTAACCTAATCTTTGCAAATGGAAGCACACAAACTGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAAAAGCAACATCAGAAGCTTAT

GCGTATGCAGATACTTTGAAGAAAGACAATGGAGAATATACTGTAGATGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAA

ATTTGCTGGA

9、代表序列B2-C-B4-E-G1(SEQ ID NO：29)：

AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGACAACAAATTCAAC

AAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGCTTCATCCAAAG

CCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAAGAGC

TCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACTCAA

ACAGCAGAGTTCAAAGGAACATTTGCAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATACGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGG

TAAATATACAGCAGACTTAGAAGATGGTGGATACACTATTAATATTAGATTTGCAGGTGAGCTCGCTCAACAAAATGCTT

TTTATCAAGTCTTAAATATGCCTAACTTAAATGCTGATCAACGCAATGGTTTTATCCAAAGCCTTAAAGATGATCCAAGC

CAAAGTGCTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAGATTAAACGAATTTCAAGCACCGAAAGAGCTCACTTACAAATTAATCCT

TAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACG

CTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAA

10、代表序列B2-C-G2-B1-D-G1(SEQ ID NO：31)：

TCACTTACAAACTTGTTATTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTAGACGCAGAAACTGCAGAA

AAAGCCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGCTGTTGATGGTGTTTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGT

AACTGAAGAGCTCAAAGAAGAAACACCAGAAACACCAGAAACTGATTCAGAAGAAGAAGTAACAATCAAAGCTAACCTAA

TCTTTGCAAATGGAAGCACACAAACTGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAAAAGCAACATCAGAAGCTTATGCGTATGCA

GATACTTTGAAGAAAGACAATGGAGAATATACTGTAGATGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGG

AGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACT

TAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCT

AAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCACTTACAAATTAATCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAAC

AACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAAT

GGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAA

代表序列的氨基酸序列(氨基酸单字母表示)如下：

1、代表序列B3-G1-B2-G2-B5(SEQ ID NO：14)：

KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELTYKLIL

NGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAE

FKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYAND

NAVDGVWTYDDATKTFTVTEELKKVDEKPEEKEQVTIKENIYFEDGTVQTATFKGTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTA

DLEDGGYTINIRFAG

2、代表序列B2-D-G1-B5-C-G1(SEQ ID NO：16)：

KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQN

NFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAA

TAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEELKKVDEKPEEKEQVTIKENIYFEDGTVQTATFKGTFAEATAEAYRYA

DLLSKEHGKYTADLEDGGYTINIRFAGELADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKL

NDAQAPKELTYKL I LNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE

3、代表序列B5-A-B2-G1-B1(SEQ ID NO：18)：

KKVDEKPEEKEQVTIKENIYFEDGTVQTATFKGTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTADLEDGGYTINIRFAGELADNNF

NKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKT

QTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQ

YANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEELKEETPETPETDSEEEVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKK

DNGEYTVDVADKGYTLNIKFAG

4、代表序列B3-D-B3(SEQ ID NO：20)：

KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQN

NFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADG

KTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAG

5、代表序列B3-D-B3-D-B3(SEQ ID NO：22)：

KTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQ

RNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYAD

LLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAG

6、代表序列B2-G2-A-B3-D-G1(SEQ ID NO：24)：

KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDYADKGYTLNIKFAGELTYKLVI

NGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNAVDGVWTYDDATKTFTVTEELADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNG

FIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLA

KENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLN

ESQAPKELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE

7、代表序列B1-G1-B3-G1(SEQ ID NO：26)：

KEETPETPETDSEEEVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELTY

KLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKT

QTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQ

YANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE

8、代表序列B2-D-B3-D-B1(SEQ ID NO：28)：

RNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEETPETPETDSEEEVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAY

AYADTLKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAG

9、代表序列B2-C-B4-E-G1(SEQ ID NO：30)：

KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELADNKFN

KEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQ

TAEFKGTFAEATAEAYRYADLLAKENGKYTADLEDGGYTINIRFAGELAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPS

QSANVLGEAKRLNEFQAPKELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE

10、代表序列B2-C-G2-B1-D-G1(SEQ ID NO：32)：

KEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKELTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAE

KAFKQYANDNAVDGVWTYDDATKTFTVTEELKEETPETPETDSEEEVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYA

DTLKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEA

KKLNESQAPKELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE

实施例5、展示HAIBM的重组噬菌体的抗体结合活性测定

为了测定重组噬菌体所展示的HAIBM与抗体的结合能力，将阳性单克隆重组噬菌粒转化TG1，制成单克隆HAIBM重组噬菌体(噬菌体制备方法同前)，将各单克隆重组噬菌体和M13KO7辅助噬菌体用2×YT培养基调整至相同滴度(1.0×10¹²TU/ml)，分别取各单克隆噬菌体100μl加入人Ig抗体包板的反应孔中，37℃孵育3小时后洗涤50次。将反应后的样品分成两组，第一组在重组噬菌体和M13KO7与抗体结合后的样孔中每孔加入100μl大肠杆菌TG1(OD₆₀₀＝0.2)，37℃孵育1小时后，取1μl单克隆重组噬菌体感染菌液涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数，对照的M13KO7辅助噬菌体感染菌液涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数，用于检测被人Ig特异吸附的重组噬菌体的数量，检测结果见表3。第二组在重组噬菌体和M13KO7与抗体结合后的样孔中每孔加入噬菌体抗体HRP/Anti-M13 conjugate(Amersham pharmaciabiotech公司，工作浓度为1∶5000稀释)，37℃孵育45分钟后加入TMB显色，测OD₄₅₀nm值，用于检测被人IgG特异吸附的重组噬菌体的数量，检测结果见表3。

表3各HAIBM单克隆噬菌体的人IgG抗体结合试验

单克隆噬菌体中的分大肠杆菌TG1感染菌 HRP抗噬菌体OD450NM

子组成落数检

1 SPA 415 1.538

2 LB3-G1-LB2-G2-LB5 ＞500 2.251

3 LB1-A-LB3 328 1.247

4 LB1-A-LB4-B-G1 453 1.626

5 LB2-D-G1-LB5-C-G1 ＞500 2.119

6 LB3-B-LB3-A 272 1.372

7 LB5-A-LB2-G1-LB1 ＞500 1.931

8 LB3-D-LB3 ＞500 2.043

9 LB3-D-LB3-D-LB3 ＞500 2.251

10 LB2-G2-A-LB3-D-G1 ＞500 2.017

11 LB1-G1-LB3-G1 ＞500 1.943

12 LB4-G2-LB2 398 1.485

13 LB2-D-LB3-D-LB1 ＞500 2.196

14 LB2-C-LB4-E-G1 ＞500 2.005

15 LB2-C-G2-LB1-D-G1 ＞500 2.113

16 LB1-C-LB1 413 1.434

17 M13KO7 56 0.233

注：各噬菌体滴度均为1.0×10¹²TU/ml

从表3的大肠杆菌TG1感染菌落数测定结果可见，展示有单克隆HAIBM分子的噬菌体能被人IgG结合固定，并在投入噬菌体滴度在1.0×10¹²时存在高低不同的IgG结合活性。而对照野生型噬菌体M13KO7滴度在1.0×10¹²时检测不到与人IgG结合的噬菌体。酶联检测显色的检测结果与上述大肠杆菌TG1感染菌落数测定结果基本一致。该结果说明融合在PIII蛋白N端的HAIBM分子具有Ig结合活性，展示具有序列B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1阳性噬菌体与人Ig结合活性都高于展示葡萄球菌A蛋白(SPA)的噬菌体。

实施例6高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的功能

设计引物，上游引物引入NcoI位点，下游引物引入SalI位点，PCR扩增阳性克隆序列，酶切回收后将HAIBMs克隆于pET32a载体中的NcoI和SalI位点中，IPTG诱导表达HAIBMs蛋白，Ni-NTA柱纯化获得纯化蛋白HAIBMs，ELISA检测纯化蛋白HAIBMs的活性，用碳酸盐缓冲液包被各种纯化HAIBM蛋白(1∶100)包被于排条板上，设阳性对照SPA(1∶100)，阴性对照LT(1∶100)37℃2h后4℃过夜，加入不同稀释度的浓度为1mg/ml的辣根过氧化物酶(HRP)标记的人免疫球蛋白分子(HRP-人Ig)，37℃孵育45分钟，PBS洗液洗涤4次，OPD显色，酶联检测仪读取492nm处OD值。由表4的结果显示各种纯化HAIBM蛋白与人Ig有特异的结合活性，其中编码序列具有B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1连接方式的融合基因编码的分子结合活性高于SPA。

表4HAIBM纯化蛋白与人Ig结合活性检测

HRP-人Ig稀释度(1MG/ML)

纯化HAIBM 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1∶160 1∶320 1∶640 1∶128

0 0 0 00

阴性对照LT 0.289 0.146 0.076 0.056 0.027 0.029 0.010 0.001

阳性对照SPA 2.073 2.055 1.429 0.820 0.430 0.224 0.172 0.090

LB3-G1-LB2-G2-LB 0.515

2.255 2.117 1.956 1.862 1.342 0.955 0.323

5

LB1-A-LB3 1.873 1.704 1.331 0.680 0.318 0.180 0.092 0.072

LB1-A-LB4-B-G1 1.953 1.937 1.618 1.425 0.820 0.525 0.380 0.257

LB2-D-G1-LB5-C-G 0.316

2.110 1.998 1.730 1.632 0.926 0.530 0.240

1

LB3-B-LB3-A 1.924 1.757 1.424 0.756 0.320 0.224 0.136 0.009

LB5-A-LB2-G1-LB1 2.123 1.996 1.755 1.628 0.910 0.572 0.328 0.225

LB3-D-LB3 2.080 2.069 1.613 1.580 0.877 0.448 0.346 0.112

LB3-D-LB3-D-LB3 2.366 2.359 2.018 1.912 1.765 1.230 0.856 0.512

LB2-G2-A-LB3-D-G 0.530

2.271 2.150 1.978 1.794 1.216 0.874 0.251

1

LB1-G1-LB3-G1 2.045 1.923 1.767 1.673 1.065 0.654 0.320 0.203

0.214

LB4-G2-LB2 2.083 2.020 1.413 0.806 0.410 0.212 0.088

3

LB2-D-LB3-D-LB1 2.296 2.175 2.010 1.991 1.659 1.180 0.784 0.464

LB2-C-LB4-E-G1 2.225 2.151 1.910 1.712 1.218 0.717 0.528 0.336

LB2-C-G2-LB1-D-G 0.551

2.013 2.007 1.873 1.716 1.115 0.719

0.313

1

LB1-C-LB1 1.930 2.073 1.660 0.911 0.525 0.340 0.275 0.118

实施例7高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的应用

将HCV抗原包被于酶标排条板上，洗涤后，加入10μl丙肝病人的血清和90μl PBS，37℃1h作用后用洗液(PBS+0.05％Tween20)洗5遍，去除未结合的抗体，加入100μl滴度为1.0×1010TU/ml的各种HAIBM单克隆重组噬菌体37℃1h，设阴性对照LT/Phage，阳性对照PA/phage。再用洗液(PBS+0.05％Tween20)洗5遍，去除重组噬菌体。实验分成两组检测酶标排条板上所结合的重组噬菌体，第一组每孔加入100μl的大肠杆菌TG1，感染1h后，取单克隆重组噬菌体感染菌液100μl涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数；第二组每孔加100μl噬菌体抗体HRP/Anti-M13 conjugate，37℃反应1h后TMB显色，450nm处OD值检测。HCV抗原包被浓度为(2μg/ml)，结果见表5，表6。

表5应用HAIBM单克隆噬菌体检测抗-HCV试验(感染菌落数计数法)

大肠杆菌TG1感染菌落数

HCV阴性血清样

HCV阳性血清样品

单克隆HAIBM 品

1# 2# 3# 4# 1# 2# 3 4

# #

1 阴性对照LT 5 2 0 4 3 3 2 0

2 阳性对照SPA 79 86 53 92 5 3 3 0

3 LB3-G1-LB2-G2-LB5 126 113 111 127 2 0 5 1

4 LB1-A-LB3 39 78 50 64 11 8 5 0

5 LB1-A-LB4-B-G1 93 49 39 65 3 2 0 0

6 LB2-D-G1-LB5-C-G1 102 117 97 72 4 5 1 0

7 LB3-B-LB3-A 74 98 50 65 0 13 0 18

8 LB5-A-LB2-G1-LB1 93 76 134 128 9 6 14 3

9 LB3-D-LB3 97 94 114 98 3 2 0 1

10 LB3-D-LB3-D-LB3 171 144 128 167 1 2 3 0

11 LB2-G2-A-LB3-D-G1 123 128 160 141 1 0 3 0

12 LB1-G1-LB3-G1 111 131 125 96 12 4 10 9

13 LB4-G2-LB2 64 32 56 73 3 2 0 0

14 LB2-D-LB3-D-LB1 136 167 118 121 2 1 3 1

15 LB2-C-LB4-E-G1 118 142 131 116 17 8 0 7

16 LB2-C-G2-LB1-D-G1 117 124 119 158 3 0 5 1

17 LB1-C-LB1 76 110 63 94 2 0 6 0

注：各噬菌体滴度均为1.0×10¹⁰TU/ml

表6应用HAIBM单克隆噬菌体检测抗-HCV试验(酶联检测显色法)

HCV阳性血清样品(OD _450NM ) HCV阴性血清样品(OD _450NM )

单克隆HAIBM

1# 2# 3# 4# 1# 2# 3# 4#

1 阴性对照LT 0.069 0.046 0.076 0.056 0.037 0.044 0.010 0.053

2 阳性对照SPA 1.133 1.218 0.891 1.096 0.022 0.036 0.045 0.039

3 LB3-G1-LB2-G2-LB5 1.855 1.317 1.356 1.662 0.042 0.036 0.055 0.051

4 LB1-A-LB3 0.873 1.104 0.710 1.280 0.038 0.032 0.022 0.035

5 LB1-A-LB4-B-G1 1.223 0.837 1.018 1.125 0.023 0.025 0.040 0.011

6 LB2-D-G1-LB5-C-G1 1.710 1.698 1.430 1.230 0.031 0.043 0.036 0.031

7 LB3-B-LB3-A 0.924 0.457 0.524 0.756 0.024 0.022 0.036 0.019

8 LB5-A-LB2-G1-LB1 1.523 1.185 1.792 1.328 0.033 0.072 0.058 0.046

9 LB3-D-LB3 1.673 1.359 1.313 1.583 0.073 0.064 0.051 0.074

10 LB3-D-LB3-D-LB3 1.921 1.759 1.718 1.812 0.065 0.047 0.073 0.047

11 LB2-G2-A-LB3-D-G1 1.671 1.550 1.478 1.794 0.056 0.030 0.037 0.040

12 LB1-G1-LB3-G1 1.545 1.633 1.567 1.373 0.045 0.024 0.022 0.054

13 LB4-G2-LB2 1.083 0.420 0.913 1.006 0.015 0.022 0.043 0.038

14 LB2-D-LB3-D-LB1 1.796 1.615 1.578 1.761 0.059 0.014 0.065 0.074

15 LB2-C-LB4-E-G1 1.625 1.851 1.510 1.712 0.118 0.071 0.062 0.056

16 LB2-C-G2-LB1-D-G1 1.813 1.601 1.573 1.816 0.115 0.079 0.062 0.073

17 LB1-C-LB1 1.030 1.073 0.960 1.011 0.025 0.040 0.075 0.068

注：各噬菌体滴度均为1.0×10¹²TU/ml

由表5和表6可见，展示有单克隆HAIBM的噬菌体能与人抗-HCV阳性抗体反应，并在投入噬菌体滴度在1.0×10¹²时存在高低不同的抗体结合活性。而对照LT滴度在1.0×10¹²时基本无抗体结合活性。酶联检测显色的检测结果与上述大肠杆菌TG1感染菌落数测定结果基本一致。该结果证实了HAIBMs分子具有很好的人Ig结合功能，并具有可应用于酶联免疫吸附试验(ELISA法)、免疫层析检测、免疫组化等免疫学诊断及抗体的检测和纯化中的用途。

序列表

<110>上海润龙生物科技有限公司

<120>一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法

<130>040183

<160>32

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>228

<212>DNA

<213>Peptostreptococcus magnus

<400>1

aaagaagaaa caccagaaac accagaaact gattcagaag aagaagtaac aatcaaagct 60

aacctaatct ttgcaaatgg aagcacacaa actgcagaat tcaaaggaac atttgaaaaa 120

gcaacatcag aagcttatgc gtatgcagat actttgaaga aagacaatgg agaatatact 180

gtagatgttg cagataaagg ttatacttta aatattaaat ttgctgga 228

<210>2

<211>216

<212>DNA

<213>Peptostreptococcus magnus

<400>2

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120

gcatacagat atgcagatgc attaaagaag gacaatggag aatatacagt agacgttgca 180

gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctgga 216

<210>3

<211>216

<212>DNA

<213>Peptostreptococcus magnus

<400>3

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120

gcatacagat atgctgactt attagcaaaa gaaaatggta aatatacagt agacgttgca 180

gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctgga 216

<210>4

<211>216

<212>DNA

<213>Peptostreptococcus magnus

<400>4

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

gcagatggaa aaactcaaac agcagagttc aaaggaacat ttgcagaagc aacagcagaa 120

gcatacagat acgctgactt attagcaaaa gaaaatggta aatatacagc agacttagaa 180

gatggtggat acactattaa tattagattt gcaggt 216

<210>5

<211>219

<212>DNA

<213>Peptostreptococcus magnus

<400>5

aagaaagttg acgaaaaacc agaagaaaaa gaacaagtaa caattaaaga aaatatatat 60

tttgaagatg gaacagtaca aactgcaaca tttaaaggaa catttgcaga agcgacagca 120

gaagcataca gatatgcaga tttgttatca aaagaacatg gtaaatacac agcagacttg 180

gaagatggtg gatacactat caacattaga tttgctgga 219

<210>6

<211>174

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<400>6

gctgacaaca atttcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt gaacatgcct 60

aacttgaacg aagaacaacg caatggtttc atccaaagct taaaagatga cccaagtcaa 120

agtgctaacc tattgtcaga agctaaaaag ttaaatgaat ctcaagcacc gaaa 174

<210>7

<211>174

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<400>7

gcggataaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt acatttacct 60

aacttaaacg aagaacaacg caatggtttc atccaaagct taaaagatga cccaagcca 120

agcgctaacc ttttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg cacaagcacc aaaa 174

<210>8

<211>174

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<400>8

gctgacaaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatttt acatttacct 60

aacttaactg aagaacaacg taacggcttc atccaaagcc ttaaagacga tccttcagtg 120

agcaaagaaa ttttagcaga agctaaaaag ctaaacgatg ctcaagcacc aaaa 174

<210>9

<211>183

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<400>9

gctgatgcgc aacaaaataa cttcaacaaa gatcaacaaa gcgccttcta tgaaattttg 60

aacatgccta acttaaacga agcgcaacgc aatggtttca ttcaaagtct taaagacgat 120

ccaagccaaa gcactaacgt tttaggtgaa gctaaaaaat taaacgaatc tcaagcaccg 180

aaa 183

<210>10

<211>153

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<400>10

gctcaacaaa atgcttttta tcaagtctta aatatgccta acttaaatgc tgatcaacgc 60

aatggtttta tccaaagcct taaagatgat ccaagccaaa gtgctaacgt tttaggtgaa 120

gctaaaagat taaacgaatt tcaagcaccg aaa 153

<210>11

<211>165

<212>DNA

<213>Streptococcus sp.

<400>11

acttacaaat taatccttaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt 60

gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt 120

gaatggactt acgacgatgc gactaagacc tttacagtta ctgaa 165

<210>12

<211>165

<212>DNA

<213>Streptococcus sp.

<400>12

acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac taaagcagta 60

gacgcagaaa ctgcagaaaa agccttcaaa caatacgcta acgacaacgc tgttgatggt 120

gtttggactt atgatgatgc gactaagacc tttacggtaa ctgaa 165

<210>13

<211>1005

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>其编码蛋白能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因

<400>13

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120

gcatacagat atgctgactt attagcaaaa gaaaatggta aatatacagt agacgttgca 180

gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcacttacaa attaatcctt 240

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ttcaaaggaa catttgaaga agcaacagca gaagcataca gatatgcaga tgcattaaag 540

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tttgctggag agctcactta caaacttgtt attaatggta aaacattgaa aggcgaaaca 660

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atatattttg aagatggaac agtacaaact gcaacattta aaggaacatt tgcagaagcg 900

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<210>14

<211>335

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白

<400>14

Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala

1 5 10 15

Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly

20 25 30

Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu

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Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr

50 55 60

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65 70 75 80

Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala

85 90 95

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100 105 110

Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr

115 120 125

Glu Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr

130 135 140

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Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala

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Asp Ala Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp

180 185 190

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210 215 220

Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp

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Asn Ala Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe

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275 280 285

Gln Thr Ala Thr Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala

290 295 300

Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ser Lys Glu His Gly Lys Tyr Thr Ala

305 310 315 320

Asp Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala Gly

325 330 335

<210>15

<211>1152

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因

<400>15

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

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<210>16

<211>384

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白

<400>16

Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala

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Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp

165 170 175

Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

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210 215 220

Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala

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Asp Leu Leu Ser Lys Glu His Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp

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Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu

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Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala

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<211>1026

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因

<400>17

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tttgaagatg gaacagtaca aactgcaaca tttaaaggaa catttgcaga agcgacagca 120

gaagcataca gatatgcaga tttgttatca aaagaacatg gtaaatacac agcagacttg 180

gaagatggtg gatacactat caacattaga tttgctggag agctcgctga caacaatttc 240

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gctgga 1026

<210>18

<211>342

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白

<400>18

Lys Lys Val Asp Glu Lys Pro Glu Glu Lys Glu Gln Val Thr Ile Lys

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Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu

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Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu

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Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala

245 250 255

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260 265 270

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Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu

325 330 335

Asn Ile Lys Phe Ala Gly

340

<210>19

<211>627

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因

<400>19

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120

gcatacagat atgctgactt attagcaaaa gaaaatggta aatatacagt agacgttgea 180

gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcgctgatgc gcaacaaaat 240

aacttcaaca aagatcaaca aagcgccttc tatgaaattt tgaacatgcc taacttaaac 300

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<210>20

<211>209

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白

<400>20

Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala

1 5 10 15

Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly

20 25 30

Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu

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195 200 205

Gly

<210>21

<211>1038

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因

<400>21

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120

gcatacagat atgctgactt attagcaaaa gaaaatggta aatatacagt agacgttgca 180

gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcgctgatgc gcaacaaaat 240

aacttcaaca aagatcaaca aagcgccttc tatgaaattt tgaacatgcc taacttaaac 300

gaagcgcaac gcaatggttt cattcaaagt cttaaagacg atccaagcca aagcactaac 360

gttttaggtg aagctaaaaa attaaacgaa tctcaagcac cgaaagagct caaagaaaaa 420

acaccagaag aaccaaaaga agaagttact attaaagcaa acttaatcta tgcagatgga 480

aaaacacaaa cagcagaatt caaaggaaca tttgaagaag caacagcaga agcatacaga 540

tatgctgact tattagcaaa agaaaatggt aaatatacag tagacgttgc agataaaggt 600

tatactttaa atattaaatt tgctggagag ctcgctgatg cgcaacaaaa taacttcaac 660

aaagatcaac aaagcgcctt ctatgaaatt ttgaacatgc ctaacttaaa cgaagcgcaa 720

cgcaatggtt tcattcaaag tcttaaagac gatccaagcc aaagcactaa cgttttaggt 780

gaagctaaaa aattaaacga atctcaagca ccgaaagagc tcaaagaaaa aacaccagaa 840

gaaccaaaag aagaagttac tattaaagca aacttaatct atgcagatgg aaaaacacaa 900

acagcagaat tcaaaggaac atttgaagaa gcaacagcag aagcatacag atatgctgac 960

ttattagcaa aagaaaatgg taaatataca gtagacgttg cagataaagg ttatacttta 1020

aatattaaat ttgctgga 1038

<210>22

<211>346

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白

<400>22

Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala

1 5 10 15

Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly

20 25 30

Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu

35 40 45

Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr

50 55 60

Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn

65 70 75 80

Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met

85 90 95

Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys

100 105 110

Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu

115 120 125

Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu

130 135 140

Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly

145 150 155 160

Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala

165 170 175

Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr

180 185 190

Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala

195 200 205

Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln

210 215 220

Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln

225 230 235 240

Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr

245 250 255

Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

260 265 270

Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile

275 280 285

Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe

290 295 300

Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys

325 330 335

Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly

340 345

<210>23

<211>1149

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因

<400>23

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120

gcatacagat atgcagatgc attaaagaag gacaatggag aatatacagt agacgttgca 180

gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcacttacaa acttgttatt 240

aatggtaaaa cattgaaagg cgaaacaact actaaagcag tagacgcaga aactgcagaa 300

aaagccttca aacaatacgc taacgacaac gctgttgatg gtgtttggac ttatgatgat 360

gcgactaaga cctttacggt aactgaagag ctcgctgaca acaatttcaa caaagaacaa 420

caaaatgctt tctatgaaat cttgaacatg cctaacttga acgaagaaca acgcaatggt 480

ttcatccaaa gcttaaaaga tgacccaagt caaagtgcta acctattgtc agaagctaaa 540

aagttaaatg aatctcaagc accgaaagag ctcaaagaaa aaacaccaga agaaccaaaa 600

gaagaagtta ctattaaagc aaacttaatc tatgcagatg gaaaaacaca aacagcagaa 660

ttcaaaggaa catttgaaga agcaacagca gaagcataca gatatgctga cttattagca 720

aaagaaaatg gtaaatatac agtagacgtt gcagataaag gttatacttt aaatattaaa 780

tttgctggag agctcgctga tgcgcaacaa aataacttca acaaagatca acaaagcgcc 840

ttctatgaaa ttttgaacat gcctaactta aacgaagcgc aacgcaatgg tttcattcaa 900

agtcttaaag acgatccaag ccaaagcact aacgttttag gtgaagctaa aaaattaaac 960

gaatctcaag caccgaaaga gctcacttac aaattaatcc ttaatggtaa aacattgaaa 1020

ggcgaaacaa ctactgaagc tgttgatgct gctactgcag aaaaagtctt caaacaatac 1080

gctaacgaca acggtgttga cggtgaatgg acttacgacg atgcgactaa gacctttaca 1140

gttactgaa 1149

<210>24

<211>383

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白

<400>24

Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala

1 5 10 15

Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly

20 25 30

Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Ala Leu

35 40 45

Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr

50 55 60

Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Val Ile

65 70 75 80

Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala

85 90 95

Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Ala Val

100 105 110

Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr

115 120 125

Glu Glu Leu Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe

130 135 140

Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly

145 150 155 160

Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu

165 170 175

Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Glu Leu Lys

180 185 190

Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn

195 200 205

Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr

210 215 220

Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala

225 230 235 240

Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr

245 250 255

Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn

260 265 270

Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro

275 280 285

Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp

290 295 300

Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn

305 310 315 320

Glu Ser Gln Ala Pro Lys Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr

340 345 350

Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly

355 360 365

Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

370 375 380

<210>25

<211>792

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因

<400>25

aaagaagaaa caccagaaac accagaaact gattcagaag aagaagtaac aatcaaagct 60

aacctaatct ttgcaaatgg aagcacacaa actgcagaat tcaaaggaac atttgaaaaa 120

gcaacatcag aagcttatgc gtatgcagat actttgaaga aagacaatgg agaatatact 180

gtagatgttg cagataaagg ttatacttta aatattaaat ttgctggaga gctcacttac 240

aaattaatcc ttaatggtaa aacattgaaa ggcgaaacaa ctactgaagc tgttgatgct 300

gctactgcag aaaaagtctt caaacaatac gctaacgaca acggtgttga cggtgaatgg 360

acttacgacg atgcgactaa gacctttaca gttactgaag agctcaaaga aaaaacacca 420

gaagaaccaa aagaagaagt tactattaaa gcaaacttaa tctatgcaga tggaaaaaca 480

caaacagcag aattcaaagg aacatttgaa gaagcaacag cagaagcata cagatatgct 540

gacttattag caaaagaaaa tggtaaatat acagtagacg ttgcagataa aggttatact 600

ttaaatatta aatttgctgg agagctcact tacaaattaa tccttaatgg taaaacattg 660

aaaggcgaaa caactactga agctgttgat gctgctactg cagaaaaagt cttcaaacaa 720

tacgctaacg acaacggtgt tgacggtgaa tggacttacg acgatgcgac taagaccttt 780

acagttactg aa 792

<210>26

<211>264

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白

<400>26

Lys Glu Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Val

1 5 10 15

Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala

20 25 30

Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr

35 40 45

Ala Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala

50 55 60

Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Thr Tyr

65 70 75 80

Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu

85 90 95

Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn

100 105 110

Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr

115 120 125

Phe Thr Val Thr Glu Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys

130 135 140

Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr

145 150 155 160

Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala

165 170 175

Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val

180 185 190

Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu

195 200 205

Leu Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr

210 215 220

Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln

225 230 235 240

Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala

245 250 255

Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

260

<210>27

<211>1050

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因

<400>27

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120

gcatacagat atgcagatgc attaaagaag gacaatggag aatatacagt agacgttgca 180

gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcgctgatgc gcaacaaaat 240

aacttcaaca aagatcaaca aagcgccttc tatgaaattt tgaacatgcc taacttaaac 300

gaagcgcaac gcaatggttt cattcaaagt cttaaagacg atccaagcca aagcactaac 360

gttttaggtg aagctaaaaa attaaacgaa tctcaagcac cgaaagagct caaagaaaaa 420

acaccagaag aaccaaaaga agaagttact attaaagcaa acttaatcta tgcagatgga 480

aaaacacaaa cagcagaatt caaaggaaca tttgaagaag caacagcaga agcatacaga 540

tatgctgact tattagcaaa agaaaatggt aaatatacag tagacgttgc agataaaggt 600

tatactttaa atattaaatt tgctggagag ctcgctgatg cgcaacaaaa taacttcaac 660

aaagatcaac aaagcgcctt ctatgaaatt ttgaacatgc ctaacttaaa cgaagcgcaa 720

cgcaatggtt tcattcaaag tcttaaagac gatccaagcc aaagcactaa cgttttaggt 780

gaagctaaaa aattaaacga atctcaagca ccgaaagagc tcaaagaaga aacaccagaa 840

acaccagaaa ctgattcaga agaagaagta acaatcaaag ctaacctaat ctttgcaaat 900

ggaagcacac aaactgcaga attcaaagga acatttgaaa aagcaacatc agaagcttat 960

gcgtatgcag atactttgaa gaaagacaat ggagaatata ctgtagatgt tgcagataaa 1020

ggttatactt taaatattaa atttgctgga 1050

<210>28

<211>350

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白

<400>28

Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala

1 5 10 15

Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly

20 25 30

Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Ala Leu

35 40 45

Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr

50 55 60

Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn

65 70 75 80

Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met

85 90 95

Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys

100 105 110

Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu

115 120 125

Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu

130 135 140

Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly

145 150 155 160

Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala

165 170 175

Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr

180 185 190

Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala

195 200 205

Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln

210 215 220

Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln

225 230 235 240

Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr

245 250 255

Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

260 265 270

Glu Leu Lys Glu Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Thr Asp Ser Glu Glu

275 280 285

Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln

290 295 300

Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr

305 310 315 320

Ala Tyr Ala Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp

325 330 335

Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly

340 345 350

<210>29

<211>948

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因

<400>29

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120

gcatacagat atgcagatgc attaaagaag gacaatggag aatatacagt agacgttgca 180

gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcgctgacaa caaattcaac 240

aaagaacaac aaaatgcttt ctatgaaatt ttacatttac ctaacttaac tgaagaacaa 300

cgtaacggct tcatccaaag ccttaaagac gatccttcag tgagcaaaga aattttagca 360

gaagctaaaa agctaaacga tgctcaagca ccaaaagagc tcaaagaaaa aacaccagaa 420

gaaccaaaag aagaagttac tattaaagca aacttaatct atgcagatgg aaaaactcaa 480

acagcagagt tcaaaggaac atttgcagaa gcaacagcag aagcatacag atacgctgac 540

ttattagcaa aagaaaatgg taaatataca gcagacttag aagatggtgg atacactatt 600

aatattagat ttgcaggtga gctcgctcaa caaaatgctt tttatcaagt cttaaatatg 660

cctaacttaa atgctgatca acgcaatggt tttatccaaa gccttaaaga tgatccaagc 720

caaagtgcta acgttttagg tgaagctaaa agattaaacg aatttcaagc accgaaagag 780

ctcacttaca aattaatcct taatggtaaa acattgaaag gcgaaacaac tactgaagct 840

gttgatgctg ctactgcaga aaaagtcttc aaacaatacg ctaacgacaa cggtgttgac 900

ggtgaatgga cttacgacga tgcgactaag acctttacag ttactgaa 948

<210>30

<211>316

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白

<400>30

Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala

1 5 10 15

Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly

20 25 30

Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Ala Leu

35 40 45

Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr

50 55 60

Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Asn Lys Phe Asn

65 70 75 80

Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu

85 90 95

Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro

100 105 110

Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

115 120 125

Gln Ala Pro Lys Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu

130 135 140

Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln

145 150 155 160

Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr

165 170 175

Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Ala Asp

180 185 190

Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala Gly Glu Leu

195 200 205

Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn

210 215 220

Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser

225 230 235 240

Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Arg Leu Asn Glu Phe Gln

245 250 255

Ala Pro Lys Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu

260 265 270

Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys

275 280 285

Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr

290 295 300

Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

305 310 315

<210>31

<211>1161

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因

<400>31

aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60

gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120

gcatacagat atgcagatgc attaaagaag gacaatggag aatatacagt agacgttgca 180

gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcgctgacaa caaattcaac 240

aaagaacaac aaaatgcttt ctatgaaatt ttacatttac ctaacttaac tgaagaacaa 300

cgtaacggct tcatccaaag ccttaaagac gatccttcag tgagcaaaga aattttagca 360

gaagctaaaa agctaaacga tgctcaagca ccaaaagagc tcacttacaa acttgttatt 420

aatggtaaaa cattgaaagg cgaaacaact actaaagcag tagacgcaga aactgcagaa 480

aaagccttca aacaatacgc taacgacaac gctgttgatg gtgtttggac ttatgatgat 540

gcgactaaga cctttacggt aactgaagag ctcaaagaag aaacaccaga aacaccagaa 600

actgattcag aagaagaagt aacaatcaaa gctaacctaa tctttgcaaa tggaagcaca 660

caaactgcag aattcaaagg aacatttgaa aaagcaacat cagaagctta tgcgtatgca 720

gatactttga agaaagacaa tggagaatat actgtagatg ttgcagataa aggttatact 780

ttaaatatta aatttgctgg agagctcgct gatgcgcaac aaaataactt caacaaagat 840

caacaaagcg ccttctatga aattttgaac atgcctaact taaacgaagc gcaacgcaat 900

ggtttcattc aaagtcttaa agacgatcca agccaaagca ctaacgtttt aggtgaagct 960

aaaaaattaa acgaatctca agcaccgaaa gagctcactt acaaattaat ccttaatggt 1020

aaaacattga aaggcgaaac aactactgaa gctgttgatg ctgctactgc agaaaaagtc 1080

ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt gacggtgaat ggacttacga cgatgcgact 1140

aagaccttta cagttactga a 1161

<210>32

<211>387

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白

<400>32

Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala

1 5 10 15

Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly

20 25 30

Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Ala Leu

35 40 45

Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr

50 55 60

Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Asn Lys Phe Asn

65 70 75 80

Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu

85 90 95

Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro

100 105 110

Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

115 120 125

Gln Ala Pro Lys Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr

130 135 140

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu

145 150 155 160

Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Ala Val Asp Gly Val Trp

165 170 175

Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Glu Leu Lys

180 185 190

Glu Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Val Thr

195 200 205

Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala Glu

210 215 220

Phe Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr Ala

225 230 235 240

Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp

245 250 255

Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Ala

260 265 270

Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile

275 280 285

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

290 295 300

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala

305 310 315 320

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Glu Leu Thr Tyr Lys Leu

325 330 335

Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val

340 345 350

Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn

355 360 365

Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr

370 375 380

Val Thr Glu

385

Claims

1.一种重组Ig结合分子文库，其特征在于：以不同的Ig结合分子葡萄球菌A蛋白的A、B、C、D、E结构域，大消化链球菌L蛋白的B1、B2、B3、B4、B5结构域，G群或C群链球菌G蛋白的G1、G2结构域的单个抗体结合结构域为结构单元，随机地进行任意个结构单元的DNA重排形成Ig结合分子文库。

2.一种重组Ig结合分子文库的噬菌体展示方法，其特征在于将按权利要求1所述Ig结合分子文库克隆于噬菌粒载体pCANTAB5S中，以该载体进行3+3形式的噬菌体展示。

3.一种获得高亲和力Ig结合分子的方法，其特征在于：用Ig包板，利用权利要求2所述的噬菌体展示方法使所述重组Ig结合分子文库经3-4轮体外定向进化IgG亲和筛选获得高亲和力Ig结合分子。

4.一种高亲和力Ig结合分子，其特征在于：其序列特征是由葡萄球菌A蛋白的单个结构域、大消化链球菌protein L的单个结构域及G群或C群链球菌G蛋白的单个结构域间隔排列或重复排列连接而成。

5.一种根据权利要求4所述的高亲和力Ig结合分子，以ML、MA、MG分别代表大消化链球菌L蛋白的单个结构域、葡萄球菌A蛋白的单个结构域、G群或C群链球菌G蛋白的单个结构域，其特征在于：序列的连接方式为(ML-MA)n或(ML-MG)n或(ML-MA-MG)n或(ML-MG-MA)n或ML-(MA-ML)n或ML-(MG-ML)n，其中n为该序列的重复次数。

6.一种根据权利要求5所述的高亲和力Ig结合分子，其特征在于：序列的排列方式为B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1之任一种。

7.一种根据权利要求6所述的高亲和力Ig结合分子，其特征在于：具有SEQ ID NO：14、SEQID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32任一所示的序列。

8.一种高亲和力Ig结合分子的编码基因，其特征在于：它可以编码权利要求4～7任一所述的高亲和力Ig结合分子。

9.一种高亲和力Ig结合分子的编码基因，具有SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31任一所示的序列。

10.根据权利要求4～7任一所述的高亲和力Ig结合分子应用于免疫学诊断或抗体的检测和纯化。

11.根据权利要求10所述的高亲和力Ig结合分子应用于酶联免疫吸附试验或免疫层析检测或免疫组化。