CN1869069A - 重组肠道病毒71型中和抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗肠道病毒71型的抗体，其包含如SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的氨基酸序列或其活性同系物。本发明还提供了一种获得该抗体的方法，包括：(a)从酵母抗体文库中选择表达上述抗体的酵母细胞，(b)在上述抗体被表达的条件下培养该酵母细胞，和(c)从培养物中收集上述抗体。本发明还提供了一种制备该抗体的方法，该方法包括：(a)在该抗体被表达的条件下培养宿主细胞，(b)从培养物中收集该抗体，其中宿主细胞经过转化或转染用以表达抗肠道病毒71型的抗体。
Description
技术领域：
本发明涉及一具有生物活性，特别是用于针对肠道病毒所造成的疾病的一系列抗体。本发明也涉及抗病毒治疗方法，特别涉及重组抗人类EV71病毒单克隆抗体。本发明同时还涉及将该抗体用于诊断EV71感染的应用。
背景技术：
手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)通常是一轻微的疾病，且仅发生于婴儿与幼童身上。感染肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)是造成手足口病的第二大病因(CDC报告，1998年8月7日；CDC报告，1998年8月11日)。感染EV71常常并发严重的神经炎症，包括病毒性脑(脊)膜炎(viral(aseptic)meningitis)，脑炎(encephalitis)，以及类似小儿麻痹的瘫痪。
EV71首次在1969年被分离与描述(Schmidt et al.，1974，J.Infect.Dis.129：304)。关于EV71流行的报告从1998年开始出现，主要是发生于东南亚地区(Lam，1998，Emerg.Infect.Dis.4：145；WHO报告，1998年6月；WHO报告，1998年7月)。世界卫生组织曾发布香港、马来西亚和台湾是流行区域。最严重的流行爆发发生于台湾1998年4月到7月，造成了约320例严重并发症，并有73人死亡(Wu et al.，1999，Emerg.Infect.Dis，5：458；Wang et al.，1999，Clin.Infect.Dis.1：184；Komatsu et al.，1999，Pediatr.Neurol.20：17)。
从EV71感染到出现症状约为3至6天。第一个常见的症状为发烧。在发烧出现后的一到两天，病人口中常出现疮(sores)并常转变成溃疡。皮肤红疹出现于第1到2天，通常是在手掌或脚底出现。大部分病人会在1到2周内恢复(WHO报告，1998年6月；CDC报告，1998年8月7日)。有些病例，主要是小于3岁的儿童，会出现严重的并发症。他们出现短期(2-4天)的发烧病(febrile illness)，之后突然恶化，并在第12到24小时内死亡(CDC报告，1998年8月7日)。目前还不清楚为何某些受感染的儿童能恢复，而其它的却在感染后快速地产生并发症。
有报告指出猴子可在被EV71感染后14到20天内产生IgM抗体(Hashinmoto和Hagiwara，1982，Neuropathol.Appl.Neurobiol.8：149；Hashinmoto和Hagiwara，1983，Acta.Neuropathol 60：266)。报告指出病童的快速死亡，通常发生在第七天，是由于他们无法及时产生足够的中和抗体。目前尚无有效的试剂或治疗方法可治疗EV71感染。目前已有的手足口病治疗大多仅针对症状，包括减轻发烧、头痛和不适(malaise)。掌控并发症是目前临床治疗EV71感染最重要的着眼方向(CDC报告，1998年8月11日)。因此，一个能有效抑制病毒增生并清除病毒颗粒的治疗方法是有高度商业价值的。
利用杂交瘤制备单克隆抗体的技术于1975年首次出现(Cottona和Milstein，1973，Nature 244：42；Kohler和Milstein，1975，Nature256：495)。在过去的两个世纪，已产生了数种应用于临床的单克隆抗体。这些单克隆抗体能辨认特定疾病的重要分子或致病原，并能产生免疫反应来消灭它们。到2001年为止，已有11个老鼠的基因改造单克隆抗体在市场上销售(Glennie和Johnson，2000，Immunol.Today21：403：Ezzell，2001，Sci.Am.285：34)。
EV71是一正单链RNA病毒。病毒的RNA被包裹在4个结构蛋白质上：病毒蛋白1(viral protein 1，VP1)，VP2，VP3与VP4，都是由同一裸前体蛋白(naked precursor protein)经翻译后(post-translation)剪接而成。在这些病毒蛋白之中，VP1被认为是负责病毒与靶细胞结合的蛋白质(Graham et al.，1989，J.Gen.Virol.70：625)，因此它具有中和病毒主要的抗原决定簇(Pfaff et al.，1988，J.Virol.62：2033；Rueckert，1990，Virology/Lippin-cott-Raven，p.507)。许多以不同的病毒株进行的免疫学研究，分别指出数种单克隆抗体的主要表位应该在VP1上(Philip et al.，1986，J.Gen.Virol.67：1283；Tapani et al.，1993，J.Clin.Microbiol.31：1083；Timo et al.，1998，J.Gene.Virol.78：1)。
多个研究发现引发保护性的免疫反应需要EV71的一部分，并据此设计了寡肽(US 4,694,071，US 4,751,083，US 4,875,643)。怀孕的ICR鼠用VP1蛋白或EV71的DNA进行免疫，也发现其体内会产生足以保护新生鼠不受EV71感染的中和抗体(Wu，C.N.et al.，2002，Vaccine 20：895)。
虽然EV71是一基因上变异度大，且演化迅速的病毒，但研究者发现从6个以上的国家所分离出的VP1的三种基因型，包括野生型病毒株BrCr-CA-70，其彼此之间至少有94％的同一性(Brown et al.，2000，J.Viol.74：12003)。在EV71在台湾的流行期间，研究者取得并分离了许多病理样本，发现这些在台湾不同区域获得的VP1蛋白具有几乎相同的序列。将GenBank中VP1的氨基酸序列互相比对，亦发现不同的分离株序列有高度的相似性(＞96％)，且在同一基因型中有高于98.9％的相同序列(Wang et al.，2002，J.Clin.Microbiol.40：10；Shih et al.，2000，Virus Res.68：127)。这些资料显示VP1是一非常保守的区域，并且在被感染的个体中并未发生显著突变。因此VP1是EV71有潜力的中和决定簇与合适的靶抗原。
在过去15年中，制备抗体的技术因抗体工程和转基因技术的发展而快速进步。新一代的抗体一完全人类单克隆抗体(fully humanmonoclonal antibodies)在临床上应用。表达人类单克隆抗体最常见的方式是将人类单链VH-VL文库(单链Fv文库，单链scFv文库)在噬菌体表面表达，用转基因鼠制备抗体，采集人类重链的基因并用人类癌症细胞制备成杂交瘤生产抗体(Soderlind et al.，1993，Biotechnol.11：503；Vaughan et al.，1998，Nat.Biotechnol.16：535；Karpas et al.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1799)。实验数据显示这类单克隆抗体在人类疾病中引发较低的免疫原性，具有较长的半衰期以及较强的免疫反应。
最近有研究者在酵母菌中建立了一个高速制备/筛选人类抗体的系统(US 6406863)。相对于噬菌体表达系统，用酵母菌制备的抗体在表达之后可自然折叠，功能上应与人类抗体更相近。除此之外，在酵母菌中利用酵母双杂合系统可以轻易的筛选抗体-抗原的关连，因此相对于传统方式可省下许多时间与金钱。因此，酵母双杂合系统提供了一个有效且经济的方式来筛选人类抗体。
酵母菌抗体库的另一个好处是在酵母菌内发生的同源重组。VH与VL序列的重组更增加了scFv文库可能的复杂度，并可在成熟之后提高筛选后的scFv的结合亲和力。
发明内容：
抗体本发明提供了一种抗肠道病毒EV71型的VP1特异性抗体。
在此“抗体”包括完整抗体(即包含两个重链与两个轻链的抗体)，或具有能结合抗原的部分抗体片段，例如Fab，F(ab′)2，Fv或单链Fv(scFv)片段。本发明优选的实施例为scFv抗体。scFv由抗体的轻链可变区域(VL)与重链可变区域(VH)以一可弯曲的接头(linker)组合而成。scFv因此可以连接抗原并可在细菌中快速产生。
本发明提供了一种抗肠道病毒EV71型的抗体，其包含如SEQ IDNO.：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的氨基酸序列或其活性同系物(active homologues)。本发明的抗体优选其氨基酸序列为SEQ ID NO.26，该序列可进一步用来设计具有相似特异性的抗体。在本发明的具体实施例中的抗体是人类单克隆抗体。在更优选的实施例中，本发明的抗体为一单链Fv抗体(single chainFv，scFv)。
另外，本发明的抗体包含一双特异性抗体(bispecific antibody)，其包含两个可变区域，至少其中之一是本发明的抗体的可变区域。优选这两个可变区域都是本发明的抗体的可变区域。
本发明的抗体可连接到一抗病毒药物上或是可检测的标记上。这使得抗体可以将该药物或是可检测的标记置于靶病毒上，并造成对靶病毒的破坏/消灭。因此，本发明的抗体可用于治疗或手术，用作对人类或动物的治疗或手术(例如放射免疫导向手术，radioimmunoguided surgery)所需的抗体；或是用于对人类或动物进行诊断。本发明特别适用于针对肠道病毒(如EV71型)感染的手术或治疗，或是针对肠道病毒感染的诊断。
连接于抗体的抗病毒药物可以是任何能破坏或消灭与抗体相接的病毒，或与抗体相接的内含有病毒的细胞。例如，抗病毒药物可以是有毒制剂例如化疗制剂，放射性制剂或是放射性同位素，也可以是酶、前体药物或细胞因子。
适合的化疗药物已在文献中有详细记载，包括蒽环类(如道诺霉素或阿霉素)，氨甲蝶呤，春地辛(vindesine)，新制癌菌素，顺铂，苯丁酸氮芥，阿糖胞苷，5-氟尿苷，苯丙氨酸氮芥，篦麻毒蛋白与卡奇霉素(calicheamicin)。
可用于抗病毒制剂的合适的放射性同位素已在文献中已有详细记载。
连接于抗体的抗病毒药物也可以是能启动前体药物的酶，这样可以在被感染区域将前体药物启动至活化状态，这又被称为“抗体导向酶-前体药物疗法”(antibody-directed enzyme prodrug therapy，ADEPT)。在临床应用上，对病人施用抗体-酶接头，使其能集中在被感染区域并治疗感染部分。再对病人施用前体药物，使得前体药物在酶的催化下，能在被感染区域转化成有毒杀性的药物。
与抗体接连的可检测标记，可以是能成像的药物或是短半衰期的放射性同位素，例如111In，125I或99mTc。
本发明的抗体与可检测的标记连接，除可用于诊断外，也可用于放射免疫导向手术(radioimmunoguided surgery，RIGS)。放射免疫导向手术包括对病人施用一被标记的抗体，之后以手术方式去除被抗体标记的组织。因此，被标记的抗体能使手术医师有效地针对被感染的组织。
本发明的抗体，其中可检测的标记可用于检测或定量肠道病毒，检测方法包括：(a)将样本与抗体接触，(b)检测或定量标记的抗体，其中肠道病毒可为完整的病毒颗粒或是VP1亚单位。本发明包括体外定量VP1，例如，抗体可以用于酶联免疫测定法(enzyme-linkedimmunoassay，ELISA)，蛋白质印迹法(Western blotting)或是在组织样本中原位(in situ)检测肠道病毒的感染。因此，本发明包含将本发明的抗体用于在样本中定量VP1的方法，这个方法包括：(a)将样本与被标记的本发明的抗体接触，和(b)检测或定量任何与VP1结合的抗体。
应用本发明的标记抗体，采用ELISA定量样本中VP1的方法包括：(a)将一未标记的本发明的抗体固定在一固定支持物上；(b)将样本加入，使得样本中的肠道病毒能被攫取；(c)依照发明加入标记好的本发明的抗体；和(d)检测或定量任何结合到VP1上的标记抗体。
本发明的抗体也可用于组织的原位测定或EV71的定量，例如用于免疫萤光或免疫电子显微镜。要进行原位测定或定量，可先将组织从病人身上移出，并让一被标记的抗体能结合至样本中的VP1。通过这样的方法，不但可以知道是否有EV71的存在，也可标定其空间分布。
本发明的抗体也可用于纯化VP1。一般传统的纯化抗原的方法包括免疫沉淀与免疫亲和柱技术。在免疫亲和柱技术中，一般先将本发明中的抗体与柱中惰性(inert)的基质连接，再将含有靶VP1的样本通入柱，因此VP1会被留在柱中。研究者再用化学或生物方法析出VP1。在以上测定、量化和纯化方法中，含有VP1的样本可能是组织样本或是取自病人的细胞抽提物。样本也可能是用DNA重组技术制备的，例如提取物或是表达VP1的宿主细胞。
用于体外的标记抗体，其标记可以是放射性同位素(例如32p或35S)，生物素(可用与过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白测定)，地高辛，碱性磷酸酶或是萤光标记(例如荧光素或罗丹明)。
本发明所包含的抗体的氨基酸序列是由包含SEQ ID NO.：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示的多核苷酸所编码的。
本发明还提供了一种获得本发明抗体的方法，包括：(a)从酵母抗体文库中选择含有该抗体的酵母细胞，(b)将宿主细胞在能表达该抗体的条件下培养，和(c)从培养液中收集选择的抗体。在本发明的方法中，酵母表达文库是由以下步骤制备的：(a)从外周血液细胞用RT-PCR准备VH与VL的DNA区段，(b)将VH与VL的编码区段用接头(linker)连接起来，和(c)用含有连接好的VH与VL的载体转化酵母菌。酵母表达文库中，载体是用来复制和表达可用于制备上述抗体的脱氧核糖核酸(DNA)。此载体是选自于质粒、病毒或噬菌体载体，除具有复制起点外，其中启动子可能与上述DNA功能性地连接在一起。“功能性地连接”是意指启动子与编码抗体的序列的关系足以使编码序列的表达受启动子的控制。载体也可以包含启动子的调节基因。载体可能包括一个或多个标记基因，例如使用细菌载体时用的抗氨苄青霉素基因，或是使用哺乳动物细胞载体时用的抗新霉素基因。此载体可用于体外，例如利用DNA产生相对应的RNA，也可用于转化或者转染宿主细胞。
本发明另提供了一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括：(a)在能表达该抗体的条件下培养宿主细胞，和(b)从培养物中收集抗体，其中宿主细胞经过转化或转染从而可以表达本发明的抗体。宿主细胞一般选择与载体相容的，因此可以是细菌、酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞，在优选实施例中该宿主细胞为酵母菌。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含连接于抗病毒药物或可检测的标记上的本发明的抗体，以及药学上适用的载体或溶剂。在临床上，抗体将以非口服方式施用，例如以静脉注射或是腹膜注射方式施用，因此该药物组合物一般是适用于以非口服方式施用的。这样的组合物可以很容易地包含抗体，并以等张的盐水或碳酸氢盐为溶剂。抗体的最终用量仍须由医师决定，并应该考虑各种因素，例如治疗方式、诊断结果、病人体重、状况、年龄等。合适的抗体用量已记载在相关文献中。一个合适的人类用量可能介于0.01至100mg，优选0.1至10mg。本发明的抗体可用于已知的类似的肠道病毒。
附图说明：
图1用高速酵母双杂合系统筛选抗体的示意图。EV71vp1：EV71的衣壳蛋白(capsid protein)VP1。scFv：抗体的单链Fv区域。DNA-BD：DNA结合区域。AD：转录-启动区域。GAL1UAS：GAL1的上游启动子。(A)DNA-BD/EV71vp1蛋白与GAL1 UAS结合，但在缺少AD的情况下无法启动转录。(B)AD/scFv抗体库蛋白无法落在UAS，因此无法启动转录。(C)EV71的VP1如能与受检scFv抗体库的抗体相互作用，则AD/scFv会被带近UAS，并恢复GAL1的功能，导致报道基因的表达。
图2测量EV71VP1阳性克隆的抗原关连特异性(antigen-association specificity)。上：G338、G235和G234的亲本克隆；中：G333、G2334和G335的亲本克隆；下：G621、G622、G623、G624和G625的亲本克隆。
图3纯化有潜力的scFv。箭头标示纯化的scFv。
图4用Ni亲和纯化的EV71 VP1蛋白的SDS-PAGE图示。箭头标示析出的EV71 VP1-His6。
图5用ELISA检验scFvs的结合特异性。
图6用BIAcore 2000亲和力检验测量scFv与重组VP1的结合。
图7scFv的中和反应。(A)选择抗EV71-B型的scFv克隆。(B)选择抗EV71-C型的scFv克隆。
图8用空斑数降低测定法(plaque reduction assay)检验scFv对(A)EV71-B和(B)EV71-C的抗体中和反应。
图9建构完整的G625抗体重组杆状病毒。(A)G625重链构建pCEF/DB625-huCg1，(B)G625轻链构建pCEF/DB625-huCk，和(C)杆状病毒转移载体pAcDB3-G625Cg1Ck。
图10用空斑数降低测定法测量完整的G625抗体重组杆状病毒的中和反应。(A)G625抗EV71-B，和(B)G625抗EV71-C。
以下实施例是用于说明本发明，并不以任何形式对本发明的范围进行限制。
具体实施方式：
实施例1构建scFv文库，VP1融合蛋白。用酵母双杂合系统筛选可
能的抗体
人类抗体VH与VL的DNA片段是从外周血液细胞取得。收集的血液细胞以数组寡核苷酸引物用RT-PCR扩增人类VH与VL的cDNA片段(Orlandi et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3833)。这些引物的设计是参考不同Ig基因家族的共有序列(引物序列请参见US6406863)。这些扩增的片段再与间隔/接头序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4相连形成单链抗体(single-chain antibodies，scFv)。这些单链抗体的基因片段可插入载体成为单链抗体文库，并可进一步转化入酵母菌细胞。
为了高速筛选抗体，研究者将准备好的scFv文库作为酵母双杂合系统中的检验蛋白(US 6406863)。每一个检验蛋白都是一个scFv蛋白与活性结构域(active domain，AD)的融合蛋白。酵母菌细胞则被修饰为能表达一重组蛋白，其包含一转录活化子(transcriptionactivator)的DNA结合结构域(binding domain，BD)与靶抗原，EV71的VP1(序列37)。且酵母菌被改造为能表达一报导基因，其表达受一特定的DNA结合区域调控。当scFv与靶抗原相连时，AD就会被带近BD，造成与BD结合的DNA结合区域下游的报道基因(LacZ/HIS3)的转录活化(图1)。阳性克隆可用组氨酸缺乏的培养基筛选，而表达程度可以ONPG(对硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷)试验测量。
为制备靶抗原的基因片段，发明人首先将EV71-B(TW/1743)与EV71-C(TW/2086)分别从病人组织中分离出来，并在Vero与RD细胞中繁殖。扩增之后，将病毒颗粒以蔗糖梯度离心(sucrosegradient centrifugation)的方式纯化。蔗糖梯度离心的流程可参考Abraham和Colonno，1984，J.Virol.57：340；Smyth et al.，1993，J.Mol.Biol.230：667。病毒RNA是用RNA纯化试剂盒，遵照制造商的操作流程进行(Qiagen Co.，USA)。
发明人将从两种基因型取得的VP1基因片段用RT-PCR扩增，并克隆至转录活化子的BD的下游。病毒RNA则从被neu感染的细胞用一商业性试剂盒纯化(QIAamp viral RNA mini kit，Qiagen Inc.，SantaClara，CA)。第一条cDNA链是用反转录酶(Promega，USA)与和VP1的病毒基因3’端互补的引物(序列38：TCCTCCTGCGAAGCTGCTGACT)生成(Wu et al.，2002，Vaccine20：895)。发明人再用Pfu DNA聚合酶与一对引物(Envp1F：CACTCTTCCA TGGATATCCTACAGACAGGCA，Envp 1R：TCCTCTTCTAAGGAGAGTG GTRATTGCTGTGCGAC)，PCR扩增35次整个VP1蛋白的双链基因(94℃×1min，55℃×1min与72℃×2min)。
Envp1F与Envp1R是根据VP1基因已知的N端与C端序列设计的。发明人再将扩增后的VP1DNA用EcoR I切割后导入pcDNA3载体中(Invirtogen，USA)。发明人将构建好的scFv表达载体与EV71表达载体分别导入不同的单倍体(haploid)酵母菌细胞(US 6406863)。经两个单倍体酵母菌细胞交配后，将scFv表达载体导入酵母菌中。研究者将两种单倍体酵母菌细胞(如α与a型酵母菌)，分别携有scFv表达载体与VP1表达载体，交配后成为携有两种表达载体的二倍体酵母菌细胞。如图1所示，原本含有靶抗原表达载体的单倍体酵母菌细胞，在特定DNA结合位置的下游也有报道基因。因此两个单倍体酵母细胞交配之后，如果可能的scFv抗体能结合到靶VP1上，AD就会被带近BD，造成报道基因转录的活化。发明人根据对报道基因的表达程度与其它可选择的标记的观察，可以筛选出能有效与抗原VP1结合的scFv抗体，再克隆该选定的scFv抗体。然后分离并定性含有这些有潜力的scFv抗体的质粒。
发明人总共选择了10个亲本的(parental)克隆(序列14-23)。利用诱变PCR(mutagenic PCR)，发明人可将这些克隆的亲和力再次提高，并另外选择了13个成熟的克隆(DNA序列1-13，蛋白质序列24-36)。其中发明人利用酵母双杂合系统，比较了6个对照组(controlbaits)，和部分抗体与EV71 VP1阳性克隆的抗原结合特异性；分别以pGBK，laminC，IL-8，EGFR，p53，与TNF作为对照组，与启动区段(AD)形成重组蛋白，利用酵母双杂合系统检测与EV71 VP1是否会产生结合，在培养基上观察是否可形成菌落(图2)，结果显示，6个对照组都无法形成菌落，仅有筛选出来的scFv克隆产生菌落，这证明抗体与EV71 VP1的抗原结合特异性。
实施例2纯化候选scFv
为了在酵母双杂合系统确认所选择的scFv克隆的抗原特异性，将选定的scFv克隆的DNA片段导入E.coli的表达载体pET27b+中(Novagen Co.，Germany)，和BL21(pLys)型E.coli中。经过1mMIPTG在37℃的诱导表达4h后，将经过6组氨酸标记与HSV标记的scFv蛋白在内含体(inclusion body)中表达与沉淀。再将内含体溶于6M胍-HCl缓冲液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl)并在4℃下摇动过夜。离心(16000xg，20min)后，收集上清液并用0.45μm滤纸过滤，并通过2ml的Ni-NTA亲和柱。以10ml洗涤缓冲液I(6M胍-HCl缓冲液，5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl)与洗涤缓冲液II(6M胍-HCl缓冲液，20mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris-HCl)清洗柱。最后，用析出缓冲液(6M胍-HCl缓冲液，50mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl)析出scFv(图3)。将纯化出的scFv蛋白与复性缓冲液(renaturing buffer)透析2天来恢复蛋白质折叠，复性缓冲液包含0.5M L-精氨酸(100mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，1mM DTT，20％甘油，0.5％肌氨酰，0.5M L-精氨酸)(Lin et al.，2001，Anal.Biochem.294：44)。
实施例3纯化VP1
为了了解scFv的活性，发明人将在酵母菌表达载体中的VP1基因区段导入载体pETblue2 vector中(Novagen Co.，Germany)成为重组的VP1蛋白，并以(His)6标记修饰其C端。表达、纯化与重新折叠VP1蛋白的流程与scFv类似(图4)。
实施例4用ELISA检验scFv的结合特异性(binding specificity)
发明人用ELISA检验选定的克隆对重组VP1的结合特异性(图5)。将纯化的VP1在500ng/孔，0.1M NaCO3，pH＝9.6的条件下包被在96孔培养板中，并在4℃下培养过夜。再将包被过的培养板以300μl/孔，5％脱脂奶于PBS中，在37℃下封闭1小时。将培养板用含有0.05％Tween-20的PBS 400μl/孔清洗5次。
纯化的scFv抗体分别用含0.1％明胶的PBS稀释至0.5μg/ml，1.0μg/ml，1.5μg/ml与2.0μg/ml，在每一包被后的培养板中以100μl/孔加入。在37℃培养2小时。将所有板真空抽吸，并用含有0.05％Tween-20的PBS以400μl/孔清洗5次。将二抗鼠抗HSV(mouseanti-HSV)以20ng/孔加入，在37℃下反应1小时。将所有板真空抽吸，并用含有0.05％Tween-20的400μl/孔PBS清洗5次。用与抗鼠IgG的抗体(1∶5000稀释至1mg/ml，100μl/孔)缀合的辣根过氧化物酶检测已附着的抗体，在37℃下作用1小时。将所有板真空抽吸，并用含有0.05％Tween-20的400μl/孔PBS清洗5次。最后将所有板用100μl/孔TMB染色，并以650nm为标准记录450nm处的吸收值(图5)。
用BIAcore2000(Pharmacia Co.，USA)测量抗体与重组VP1的结合亲和力(图6)。首先将选定的scFv蛋白200μM接上Ni-NTA小片(Pharmacia Co.，USA)。再将不同浓度的VP1蛋白(50nM到1000nM)通过小片，并以BIAcore程序计算结合相关图。由此可以画出不同浓度的VP1的结合与分离曲线图，并可计算选定的scFv的亲和力。
实施例5计算scFv的中和反应
将纯化的scFv蛋白与病毒粒共同培养以计算其中和力价(Baxt etal.，1984，J.Virol.51：298；Wiley et al.，1990，Viral Immunol.3：137)。首先在进行中和检验的前一天，将2×104个细胞/孔的人类横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma，RD)植入96孔培养板中。隔天，用病毒m.o.i.(感染复数)＝10-3两倍稀释scFv蛋白(2-1～2-10)，在37℃下培养1小时后，涂抹在含2％的牛胎儿血清的DMEM培养液中的单层RD细胞上，再培养3天。用10％福尔马林固定培养细胞，并用1％结晶紫染色存活的细胞。
scFv的中和活性是用每孔在570nm的光学密度计算的。每个样本都有三次重复。scFv的IC50为能够阻止EV71 50％的感染性scFv浓度。发明人检验了其中两个scFv克隆，scFv-G334与scFv-G336，并用一个无关的克隆scFv-G74作为对照组。根据实验结果scFv-G334与scFv-G336对EV71的IC50分别为3μg/ml与5μg/ml(图7)。
实施例6用空斑数降低测定法(plaque reduction assay)测定scFv的中和活性
将EV71病毒颗粒(200个病毒颗粒)与稀释后的scFv蛋白或是对照组PBS混合，在37℃下反应1小时，再加到6孔平皿内的双倍或三倍单层RD细胞1小时，进行病毒吸收。将未附着的病毒颗粒洗掉后，用含0.3％琼脂糖的培养液收获细胞，在37℃，5％CO2的条件下培养4天。将细胞固定后，以结晶紫染色以计算空斑数。
发明人检测了8个scFv克隆，分别为scFv-G333～cFv-G336，scFv-G621～scFv-G625，对EV71-B(图8A)与EV71-C(图8B)的中和活性。每个待测抗体浓度为5μg/ml。实验发现来源于scFv的抗体，相对于PBS对照组，可降低空斑数10％～50％。
实例7以杆状病毒表达系统制造完全抗体
为制造完整的抗体，发明人以IgG重链信号肽，scFv-G625重链可变区域(VH)与IgGγ1恒定区域(pCEF/DB625-huCg1，图9A)组成IgG重链。另外以IgGκ轻链信号肽，scFv-G625轻链可变区域(VL)与IgGκ恒定区域(pCEF/DB625-huCk，图9B)组成IgG轻链。发明人用PCR方法扩增G625重链，扩增过程为使用ThermalAceDNA聚合酶(Invitrogen，USA)与一对引物H625F(5’-TGC TCT AGAGCC ACC ATG AAG CAT CTG TGG TTC)与H625R(5’-TCA TCATTT ACC CGG AGA CAC)，进行30次循环(94℃×30sec，60℃×30sec与72℃×2min)。将扩增后的重链片段在Xba I与Stu I酶切位点克隆入杆状病毒载体pAcDB3(Pharmigen，USA)，得到载体pAcDB3-G625Cr1(图9C)。
发明人以PCR扩增G625轻链，流程为使用ThermalAce DNA聚合酶(Invitrogen，USA)与一对引物SmaLK(5’-TCC CCC GGG GCCACC ATG AGG GTC CCC GCT CAG)与L625R(5’-GGA AGA TCTTCA ACA CTC TCC CCT GTT)，进行30次循环(94℃×30sec，60℃×30sec与72℃×2min)。将扩增后的轻链片段在Xma I与Bgl II酶切割位点克隆入杆状病毒载体pAcDB3-G625Cr1，得到载体pAcDB3-G625Cr1Ck(图9)。
发明人根据BaculoGold表达系统(Pharmigen，USA)准备重组杆状病毒。将Sf9细胞在无血清的培养液(Gibco)中悬浮培养，再以m.o.i.为10的重组杆状病毒感染细胞。将病毒与细胞在27℃下培养72小时。
以1000xg离心10min以收获细胞，用1xPBS洗涤细胞两次，再将细胞用含有1mM PMSF和1％Tween-20的PBS在冰上溶解20min。将上清液经离心20分钟20000xg后收集，再以蛋白A亲和柱纯化。
首先将含有1ml蛋白A树脂(HiTrapr ProteinA 1ml，Pharmacia，USA)柱用10ml的1xPBS平衡，再加入上清液，然后用10ml的0.1M甘油，pH4.5的溶液冲洗柱，并以pH3.0，0.1M甘氨酸析出蛋白质。将析出的部分合并用透析缓冲液(10mM HEPES，150mM KCl，1mMEDTA，50％甘油，pH8.0)透析。
发明人用如上述的空斑数降低实验检验完整的G625抗体的中和反应。首先让稀释的完整G625抗体(1，5与10μg/ml)、10μg/ml人类IgG(Sigma，USA)和透析缓冲液接受检验。实验发现与对照组相比较，完整G625抗体(5μg/ml)能减少75％的EV71-B空斑数(图10A)与50％的EV71-C空斑数(图10B)。人类IgG与透析缓冲液所减少的空斑数则与只有病毒的对照组无显著差异。该结果证实EV71对宿主细胞的感染与增殖可以被某些抗VP1的单克隆抗体所阻止。
序列表
<110>财团法人生物技术开发中心
<120>重组肠道病毒71型中和抗体及其用途
<130>无
<160>29
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>759
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V_region
<222>(1)..(759)
<223>scFv-G625
<400>1
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtggag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagcca gcaatactat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtgt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt 300
gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcaggcg gtggcggatc aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag cggcggtgga 420
ggcagtaatt ttacgccgac tcagccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaggacggtc 480
accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540
cagcagcttc caggatcagc ccccaatgtc ctcatctatg gtaacagcaa tcggccctca 600
ggggtccctg accgattctc tggccccaag tctggcaccc cagcctcccc ggccatcact 660
gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720
ggtgaggtct tcggcggggg cacccagctg accgtcctc 759
<210>2
<211>789
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V_region
<222>(1)..(789)
<223>scFv-G624
<400>2
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtggag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagcca gcaatactat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt 300
gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcaggcg gtggcggatc aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag cggcggtgga 420
ggcagtaatt ttacgctgac tcagccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaggacggtc 480
accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540
cagcagcttc caggatcagc ccccaaa9tc ctcacctatg gtaacagcaa tcggccctca 600
ggggtccctg accgattctc tggctccaag tctggcaccc cagcctcccc ggccatcact 660
gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720
ggtgaggtct tcggcggggg cacccagctg accgtcctcc cgaattcgag cacccagctg 780
accgtcctc 789
<210>3
<211>759
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-region
<222>(1)..(759)
<223>scFv-G623
<400>3
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtggag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagcca gcaatactat 180
gcggactctg tggagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt 300
gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcaggcg gtggcggatc aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag cggcggtgga 420
ggcagtaatt ttacgctgac tcagccccac tctgtgtcgg aggccccggg gaggacggtc 480
accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540
cagcagcctc caggatcagc ccccaaagtc ctcacctatg gtaacagcaa tcggccctca 600
ggggtccctg accggttctc tggctccaag tctggcacct cagcctcccc ggccatcact 660
gcattccagg ccgaggatga ggctgatcat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720
ggtgaggcct tcggcggggg cacccagctg accgtcctc 759
<210>4
<211>759
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-region
<222>(1)..(759)
<223>scFv-G622
<400>4
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtggag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagcca gcaatactat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt 300
gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcaggcg gtggcggatc aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag cggcggtgga 420
ggcagtaatt ttacgctgac tcagccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaggacggtc 480
accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540
cagcagcttc caggatcagc ccccaaagtc ctcatctatg gtaacagcaa tcggccctca 600
ggggtccctg accgattctc tggctccaag tctggcacct cagcctccct ggccatcact 660
gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720
ggtgaggtct tcggcggggg cacccagctg accgtcctc 759
<210>5
<211>759
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-region
<222>(1)..(759)
<223>scFv-G621
<400>5
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtggag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagtca gcaatactat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt 300
gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc cgggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcaggcg gtggtggacc aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag cggtggtgga 420
ggcagcgatt ttatgctgac tcagccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaagacggtc 480
accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540
cagcagcttc caggatcagc ccccaaagtc ctcatctatg gtaacagcaa tcggccctca 600
ggggtccctg accgattctc tggctccaag tctggcacct cagcctcccc ggccatcact 660
gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720
ggtgtggtct tcggcggagg cacccagctg accgtcctc 759
<210>6
<211>768
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-region
<222>(1)..(768)
<223>scFv-G338
<400>6
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggagg ccccctcagc gactatggct tcagctgggt gcgactggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg ggtgggaggg atcatcccta tgtttggaac accaaactac 180
gcacagaagt ttcagggcgg agtctcgatt accgcggacg agtccacgac cactgcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acgggcgtgt attattgtgc gggacgaagc 300
ccagacgatt attttggttc tcgtcgggac aactatcact acgggataga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggc agtggtggat caggcggcgg aggatctggc 420
ggaggtggca gcggtggtgg aggcagtgaa attgtgatga cgcagtctcc atcctcattg 480
tctgcatctg taggaggcag agtcaccatc acgtgtcggg cgagtcaggg cattggcaat 540
tatttagcct ggtttcagca gaaaccaggg aaagccccta agcccctgat ctttgctgca 600
tccaacttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagcggcg gtggatctgg gacagaattc 660
actctcacca tcaccggcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg ccaacagtat 720
aattattacc ctcccacttt cggcggaggg accaaggtgg aaatcaaa 768
<210>7
<211>759
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-region
<222>(1)..(759)
<223>scFv-G336
<400>7
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagtca gcaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt 300
gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcaggcg gtggtggatc aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag cggtggtgga 420
ggcagtaatt ttatgctgac tcagccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaagacggtc 480
accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540
cagcagcttc caggatcagc ccccaaagtc ctcatctatg gtaacaacaa tcggccctca 600
ggggtccctg accgattctc tgactccaag tctggcacct cagcctccct ggccatcact 660
gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720
ggtgtggtct tcggcggagg cacccagctg accgtcctc 759
<210>8
<211>759
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-region
<222>(1)..(759)
<223>scFv-G335
<400>8
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtggag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggcccag atggaagtca gcaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt 300
gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcaggcg gtggtggatc aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag cggtggtgga 420
ggcagtaatt ttatgctgac tcaaccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaagacggtc 480
accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540
cagcagcttc caggatcagc ccccaaagtc ctcatctatg gtaacaacaa tcggccctca 600
ggggtccctg accgattctc tggctccaag tctggcacct cagcctccct ggccatcact 660
gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720
ggtgtggtct tcggcggagg cacccagctg accgtcctc 759
<210>9
<211>759
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-region
<222>(1)..(759)
<223>scFv-G334
<400>9
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
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ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagtca gcaatactat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt 300
gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
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ggcagtaatt ttatgctgac tcagccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaagacggtc 480
accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540
cagcagcttc caggatcagc ccccaaagtc ctcatctatg gtaacaacaa tcggccctca 600
ggggtccctg accgattctc tggctccaag tctggcacct cagcctccct ggccatcact 660
gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720
ggtgtggtct tcggcggagg cacccagctg accgtcctc 759
<210>10
<211>768
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-reaion
<222>(1)..(768)
<223>scFv-G235
<400>10
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggagg ccccctcagc gactatggtt tcagctgggt gcgactggcc 120
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gcacagaagt ttcagggcag agtctcgatt accgcggacg agtccacgac cactgcctac 240
atggagctga gcagcccgag atctgaggac acgggcgtgt attattgtgc gggacgaagc 300
ccagacgatt attttggttc tcgtcgggac aactatcact acgggataga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggc ggtggtggat caggcggcgg aggatctggc 420
ggaggtggca gcggtggtgg aggcagtgaa attgtgatga cgcagtctcc atcctcattg 480
tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acgtgtcggg cgagtcaggg cattggcaat 540
tatttagcct ggtttcagca gaaaccaggg aaagccccta agcccctgat ctttgctgca 600
tccaacttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagcggcg gtggatctgg gacagaattc 660
actctcacca tcaccggcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg ccaacagtat 720
aattattacc ctcccacttt cggcggaggg accaaggtgg aaatcaaa 768
<210>11
<211>768
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-region
<222>(1)..(768)
<223>scFv-G234
<400>11
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gagaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggagg ccccctcagc gactatggtt tcagctgggt gcgactggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg ggtgggaggg atcatcccta tgtttggaac accaaactac 180
gcacagaagt ttcagggcag agtctcgatt accgcggacg agtccacgac cactgcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acgggcgtgt attattgtgc gggacgaagc 300
ccagacgatt attttggttc tcgtcgggac aactatcact acgggataga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggc ggtggtggat caggcggcgg aggatctggc 420
ggaggtggca gcggtggtgg aggcagtgaa attgtgatga cgcagtctcc atcctcattg 480
tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acgtgtcggg cgagtcaggg cattggcaat 540
tatttagcct ggtttcagca gaaaccaggg aaagccccta agcccctgat ctttgctgca 600
tccaacttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagcggcg gtggatctgg gacagaattc 660
actctcacca tcaccggcct gcagcctgag gattgtgcaa cttattactg ccaacagtat 720
aattattacc ctcccacttt cggcggaggg accaaggtgg aaatcaaa 768
<210>12
<211>756
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-region
<222>(1)..(756)
<223>scFv-G233
<400>12
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180
gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggatac 300
cgcggtagta gtggaaactg gtacttcgat ctctggggcc gtggcaccct ggtcaccgtc 360
tcctcaggcg gtggtggatc aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag ctggaggcag 420
tcagtctgct tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 480
tcctgcactg ggagcagccc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcaa 540
cttccaggaa ccgcccccga actcctcatc tatggtaacg acaaccggcc ctcaggggtc 600
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagtct ccctggccat cactgggctc 660
caggctgagg atgaggctga ttattactgt cagtcctatg acaacagcct gagtgccaat 720
gcggttttcg gcggagggac caagctcacc gtccta 756
<210>13
<211>756
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>V-region
<222>(1)..(756)
<223>scFv-G232
<400>13
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaggc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180
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cgcggtagta gtggaaactg gtacttcgat ctctggggcc gtggcaccct ggtcaccgtc 360
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Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Met Ile
50 55 60
Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu
65 70 75 80
Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro
85 90 95
Leu Lys Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp
100 105 110
Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr
115 120 125
Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly
130 135 140
Arg Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala
145 150 155 160
Pro Lys Pro Asp Ser Arg Asp Ser Leu Ala Trp Pro Thr Ala Thr Asn
165 170 175
Pro Ser Val Phe Val Lys Ser Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val
180 185 190
Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr
195 200 205
Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala
210 215 220
Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Ser
225 230 235 240
Ser Lys Ser Glu Tyr Ser Leu Val Ile Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys
245 250 255
His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu
260 265 270
Phe Lys Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asp Ser Ile Lys Pro Thr Gly
275 280 285
Thr Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu
290 295
<210>28
<211>891
<212>DNA
<213>Enterovirus 71 strain TW/1743/98
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(891)
<223>enterovirus 71 strain TW/1743/98 capsid protein VP1
<400>28
gga gat agg gtg gca gat gtg att gag agt tct ata ggg gac agc gtg 48
agc aga gcc ctc acc cga gct cta ccg gca cct acc ggc caa gac aca 96
cag gta agc agc cat cga tta gat act ggt aaa gtt cca gca ctc caa 144
gcc gct gaa att gga gca tca tca aat gct agt gat gag agt atg att 192
gag aca cgg tgt gtt ctt aat tca cat agc aca gct gag acc act ctt 240
gat agc ttc ttc agc aga gca gga tta gtt gga gag ata gac ctc cct 288
ctt gaa ggc aca acc aac ccg aat ggg tac gca aac tgg gac ata gac 336
ata aca ggt tac gcg caa atg cgt aga aag gtg gag ctg ttc acc tac 384
atg cgt ttt gac gca gag ttc acc ttt gtt gca tgc acc cct acc ggg 432
gaa gtt gtc ccg caa ttg ctc caa tat atg ttt gta cca ccc gga gcc 480
ccc aag cca gac tcc aga gaa tct ctc gca tgg caa act gcc act aat 528
ccc tcg gtt ttt gtg aag ctg tca gac ccc cca gca cag gtt tct gtt 576
cca ttc atg tca cct gcg agc gcc tat caa tgg ttt tat gac ggg tat 624
ccc aca ttc ggt gaa cac aaa cag gag aaa gac ctt gaa tac ggg gca 672
tgc cca aac aac atg atg ggt acg ttc tca gtg cgg act gta ggc acc 720
tcg aag tcc aag tac cca ttg gtg atc agg att tac atg agg atg aag 768
cac gtc agg gcg tgg ata cct cgc cca atg cgt aac cag aac tat cta 816
ttc aaa gcc aac cca aat tat gct ggt aat tct att aaa cca act ggt 864
gcc agt cgc aca gca atc acc act ctc 891
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>primer
<222>(1)..(22)
<223>Primer for VP1 cDNA
<400>29
tcctcctgcg aagctgctga ct 22
Claims (20)
1.一种抗肠道病毒EV71型的抗体，其包含如SEQ ID NO.：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的氨基酸序列或其活性同系物。
2.如权利要求1所述的抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.26。
3.如权利要求1所述的抗体，其氨基酸序列是由一包含SEQ IDNO.：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的多核苷酸所编码的。
4.如权利要求1所述的抗体，该抗体是人类单克隆抗体。
5.如权利要求1所述的抗体，该抗体为一单链Fv抗体。
6.如权利要求1所述的抗体，其氨基酸序列可用于制造双特异性抗体。
7.如权利要求6所述的抗体，其中的双特异性抗体包含两个可变区域且其中一个可变区域是权利要求1所述的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的抗体，其连接于一抗病毒药物或是可检测的标记上。
9.如权利要求8所述的抗体，其中抗病毒药物或可检测的标记选自由以下所组成的组：化疗制剂、放射性制剂、放射性同位素、酶、前体药物或细胞因子。
10.如权利要求8所述的抗体，其可用于治疗或手术。
11.如权利要求8所述的抗体，其中可检测的标记可应用于检测或定量肠道病毒。
12.如权利要求11所述的抗体，其中检测或定量的样本是在生物体外检测。
13.一种获得如权利要求5的抗体的方法，包括：
(a)酵母抗体文库中筛选含有该抗体的酵母细胞；
(b)将宿主细胞在能表达该抗体的条件下培养，以及
(c)从培养液中收获所筛选到的抗体。
14.如权利要求13所述的方法，其中酵母表达文库是根据以下步骤制备的：
(a)周血液细胞用RT-PCR制备VH与VL的DNA区段，
(b)VH与VL的编码区用接头连接起来，和
(c)含有连接好的VH与VL的载体转化酵母菌。
15.如权利要求14所述的方法，其中载体是用于复制和表达可产生权利要求1所述抗体的DNA。
16.如权利要求15所述的方法，其中载体选自质粒、病毒或噬菌体载体。
17.一种制备如权利要求1的抗体的方法，该方法包括：
(a)表达抗体的条件下培养宿主细胞，
(b)培养物中收获抗体；
其中宿主细胞经过转化或转染从而可以表达如权利要求1所述的抗体。
18.如同权利要求17所所述的方法，其中宿主细胞是细菌、酵母菌、哺乳类或昆虫细胞。
19.一种药物组合物，其包含权利要求1的抗体及药学上适用的载体或溶剂，其中的抗体连接到抗病毒药物或可检测的标记上。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其可用于治疗肠道病毒71型感染。
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2005
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2007
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