CN110508263B - 一种用于血液净化的吸附材料及其制备方法 - Google Patents

一种用于血液净化的吸附材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于血液净化的吸附材料及其制备方法，所述吸附材料以多孔纤维素布为基质，基质上固定有可结合内毒素的第一配体和具有抗菌作用的第二配体，基质具有孔径为5μm～600μm的多孔结构以及0.5cm2～12m2的活性表面。本发明通过二乙烯基砜活化法，基质用二乙烯基砜在碱性溶液中活化后产生一个活性乙烯磺酰基，此中间体可以直接与含氨基的配基反应，通过共价偶联配基，同时活化试剂等于自身引入了一个间隔臂；采用该方法制备的血液净化多孔纤维素布吸附材料，对内毒素具有很好的清除效果，同时对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有很好的杀菌抑菌效果，并且安全性高。

Description

一种用于血液净化的吸附材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学材料与血液净化技术领域，尤其是一种用于血液净化的吸附材料及其制备方法。
背景技术
脓毒症是多种微生物(细菌、真菌、病毒及寄生虫等)感染和全身炎症反应的复杂过程。基本上任何部位的感染都可以导致脓毒症，比如肺炎、肠炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿系统感染、蜂窝织炎、脑膜炎等。脓毒症，发病率高，病死率高，是重症监护病房(ICU)患者死亡的主要原因。2016年Fleischmann等报道近10年间全球发达国家脓毒症人群发病率为437/(10万·年)，病死率为17％，且以每年8％-13％的速度急剧增加；严重脓毒症发病率为270/(10万·年)，病死率为26％；符合Sepsis3.0脓毒症休克的患者病死率超过40％。北京协和医院杜斌教授等报道我国外科ICU及综合ICU的严重脓毒症患病率分别为8.7％和37.3％，与来自欧洲的数据相近。虽在危重病的支持治疗方面已取得很大进步，但脓毒症仍是全球重症病房患者死亡的主要原因。
革兰氏菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，内毒素可以诱发脓毒症；而大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。大规模流行病学资料显示，近年来革兰阳性菌引起的脓毒症和脓毒性休克明显增多，目前已达脓毒症发病率的50％以上。其中金黄色葡萄球菌感染的发病率位居首位，是烧伤创面感染、急性肝功能衰竭和血源性肾炎等疾病的主要病原菌。其致病的严重程度及致死率与革兰阴性菌相当，且通常与革兰阴性菌脓毒症同时发生、协同作用，使脓毒症的病理生理过程恶化，严重威胁着患者的生命。此外炎性因子的急剧增多也与革兰氏阳性菌感染的脓毒症等疾病关系紧密。脓毒症常见的并发症包括休克、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、深静脉血栓形成、应激性溃疡、代谢性酸中毒、弥漫性血管内凝血(DIC)甚至多器官功能不全。
很多疾病的发生与发展都是由于致病因子在机体内积累的结果。能特异、有效地通过净化血液的方法从机体内清除这些致病因子，而又不造成对机体的损害，是临床医学近一二十年来一直不断探索的问题。吸附治疗是临床应用较多的血液净化的一种重要方法，其原理是将某一配体牢固地结合在一个固定的载体上构建成吸附柱，通过体外循环的方法特异性地清除患者血液中的致病因子，净化血液，从而达到治疗疾病的目的。目前用于脓毒症的血液净化方法主要为单独吸附内毒素或单独吸附炎性因子，但对致病细菌和内毒素同时吸附的暂未发现。纤维素是自然界最丰富、可再生的天然高分子化合物，具有价廉、可降解、环境友好等优点。纤维素从结构上来看，是由D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键组成的大分子多糖，每个脱水葡萄糖单元上的羟基位于C-2，C-3和C-6位置，具有典型的伯醇和仲醇的反应性质，可以经过一系列的化学改性，制取不同用途的功能高分子材料。因此世界各国都十分重视对纤维素的研究与开发。纤维素的一个重要应用就是纤维素吸附剂，其研制和应用始于50年代初，目前国内外已有多种品牌和系列的纤维素商品出售。由于制备手段的局限，市售的纤维素吸附剂大多为粉状或微粒状，而且孔结构不太好，很大程度上制约了其使用范围。多孔纤维素布材料正好弥补了现有纤维素商品的缺点，可以控制孔度，具有比表面大、通透性能和力学性能好等优点。
目前，研究使用的偶联试剂一般采用溴化氰、三氯三嗪、羰基二咪唑、高碘酸钠和环氧氯丙烷等。由于溴化氰是剧毒物质，合成过程对人体和环境危害较大；并且用溴化氰方法偶联配体容易脱落进入人体，对病人产生较大的副作用，所以这一合成工艺不甚理想。袁直和贾凌云等人分别采用环氧氯丙烷(公开号：CN 1239210C)和羰基二咪唑(公开号：CN100493695C)作为偶联试剂活化载体偶联PMB，虽然这两种方法避免了使用剧毒物质溴化氰，其制备的材料使用也更安全，但其制备过程反应步骤较多，需要经过五步化学反应才能合成吸附材料，方法复杂，因此得到的吸附材料产品批间差异大，性能不稳定，且该吸附材料仅吸附内毒素。公开号为JPH04270965A的日本专利公开了一种内毒素吸附材料，其为表面带多粘菌素B的聚苯乙烯编织纤维，但其技术路线中用到容易导致强烈刺激性化学物质氯甲醚的残留，且氯甲醚为强烈致癌物，对患者的健康存在极大的安全隐患，且该吸附材料主要吸附内毒素。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可用于血液净化的吸附材料，其能结合并吸附内毒素，还具有抗菌效果，同时安全性高，副作用小。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种用于血液净化的吸附材料，所述吸附材料以多孔纤维素布为基质，所述基质上固定有可结合内毒素的第一配体和具有抗菌作用的第二配体，所述基质具有孔径为5μm～600μm的多孔结构以及0.5cm2～12m2的活性表面。
优选地，所述第一配体为硫酸多粘菌素B或聚乙烯亚胺。
优选地，所述第二配体为溶菌酶。
优选地，所述活性表面采用二乙烯基砜活化法进行表面修饰。需要说明的是，PMB(硫酸多粘菌素B)和PEI(聚乙烯亚胺)是两者常见的阳离子配基，能通过静电作用有效吸附内毒素。溶菌酶作为生物酶类抗菌剂，广泛地分布于自然界中，存在于人的组织及分泌物、动物组织、植物组织及微生物细胞中，其中以鸡蛋清中含量最多，应用最普遍。鸡蛋清溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰胞壁酸的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺中的4位碳原子间的β-1,4糖苷键；溶菌酶作为一种天然球状蛋白质，可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织，且本身无毒无害，是一种天然的、安全性能很好的杀菌剂。
优选地，所述第一配体和第二配体之间采用共价键偶联。
优选地，所述孔径为70μm～170μm。
作为本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于血液净化的吸附材料的制备方法，包括如下步骤：
1)对多孔纤维素布进行预处理，以除去布表面的杂质、油污及残留添加剂；
2)将步骤1)预处理过的多孔纤维素布用碳酸盐缓冲溶液浸泡，加入体积分数为5％～15％二乙烯基砜溶液，25～40℃浸泡反应1～4h；
3)将步骤2)的产物用10～50mg/mL硫酸多粘菌素B溶液或质量分数为5～35％的聚乙烯亚胺溶液浸泡，浸泡的时间为6～24h；
4)将步骤3)的产物用0.1～100mg/mL的溶菌酶水溶液浸泡，24～37℃反应6～24h，即得所述吸附材料。
优选地，步骤1)中所述预处理包括：将多孔纤维素布用0.2～1mol/L的盐酸溶液浸泡24h，之后用水清洗至无盐酸残留，以及去除所述多孔纤维素布表面的杂质、油污和残留添加剂，干燥后储存于干燥器中备用。
优选地，所述碳酸盐缓冲溶液的pH为9～11。
优选地，所述溶菌酶水溶液的pH为6～9。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明通过二乙烯基砜活化法，基质(多孔纤维素布)用二乙烯基砜在碱性溶液中活化后产生一个活性乙烯磺酰基，此中间体可以直接与含氨基的配基反应，通过共价偶联配基，同时活化试剂等于自身引入了一个间隔臂；
采用该方法制备的血液净化多孔纤维素布吸附材料，对内毒素具有很好的清除效果，同时对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有很好的杀菌抑菌效果，并且安全性高。
附图说明
图1为本发明的吸附材料表面照片；
图2为图1局部放大后的照片；
图3为本发明的吸附材料的合成路线图；
图4为本发明的吸附材料的更具体的合成路线图。
具体实施方式
在一些实施例中，本发明涉及一种从全血或血浆中选择性吸附内毒素且具有抗菌作用的血液净化用吸附材料及其制备方法，该制备方法主要包括由多孔纤维素布为基质，所述基质具有孔径为5μm～600μm的多孔结构以及0.5cm2～12m2的活性表面，如图1和2所示，通过二乙烯基砜活化法活化基质以及固载硫酸多粘菌素B或聚乙烯亚胺，并进一步固载溶菌酶的步骤。由于二乙烯基砜的反应活性较高，是比环氧化合物强的活化试剂，乙烯基团很容易与纤维素布上的羟基发生加成反应，使基质表面对外伸展出空间连接臂，通过一步反应引入活性基团且无需再连接间隔臂即可高效偶联配体，因此，本发明通过二乙烯基砜与多孔纤维素布基质上的羟基反应得到活性乙烯磺酰基中间体，活性中间体的另一个烯基与配体的氨基偶联得到多孔纤维素布血液净化吸附材料。本发明制备方法简单，所得的吸附材料具有良好的内毒素吸附性能、抗菌性、血液相容性以及安全性。
在一些实施例中，本发明提供一种从血液或血浆中选择性吸附内毒素且具有抗菌作用的血液净化用吸附材料，其包括：
将血液或血浆通过整合的分离基质，所述基质具有孔径为5μm～600μm的多孔结构以及0.5cm2～12m2的活性表面，通过在所述基质上固定第一配体结合内毒素，同时固定第二配体使其具有抗菌作用。
在一些实施例中，所述固定的第一配体为硫酸多粘菌素B(PMB)或聚乙烯亚胺(PEI)，所述第二配体为溶菌酶。
在一些实施例中，所述基质为多孔纤维素布。
在一些实施例中，所述表面采用二乙烯基砜(divinyl sulphone，简称DVS)活化法进行表面修饰。
在一些实施例中，在所述基质上偶联的不同配体间使用共价偶联。
在一些实施例中，所述基质孔径优选为70μm至170μm。
在一些实施例中，本发明提供一种用于血液净化的吸附材料的制备方法，合成路线如图3和4所示，包括以下步骤：
1)对多孔纤维素布进行预处理；
2)将预处理过的多孔纤维素布用pH 9～11的1mol/L碳酸盐缓冲溶液浸泡，加入体积分数为5％～15％二乙烯基砜溶液，25～40℃浸泡反应1～4h，震荡的转速为180rpm；
3)将步骤2)的产物用10～50mg/mL PMB溶液或5～35％聚乙烯亚胺溶液浸泡，浸泡的时间为6～24h，震荡的转速为180rpm；
4)将步骤3)的产物用0.1～100mg/mL的溶菌酶水溶液浸泡，控制pH在6～9范围内，24～37℃反应6～24h，震荡的转速为180rpm。由此制备出用于血液净化的多孔纤维素布吸附材料，具有良好的血液相容性，同时对内毒素具有很好的清除率，且有抗菌作用。
在一些实施例中，上述步骤1)所述的预处理为：将多孔纤维素布用0.2～1mol/L的盐酸溶液浸泡24h，去除后用水清洗至无盐酸残留，以及去除所述多孔纤维素布表面的杂质、油污和残留添加剂，干燥后储存于干燥器中备用。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。应理解的是，本发明的实施例用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质而进行的改进都属于本发明要求保护的范围。如无特别说明，本申请中试剂的浓度均为质量浓度。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。
实施例1
将多孔纤维素布裁剪成1cm*1cm形状，放置于0.5mol/L的盐酸溶液中浸泡24h，取出后用去离子水清洗数次至无盐酸残留，置于通风处自然干燥，以除去布样表面的杂质、油污及残留添加剂，储存于干燥器中备用。标记为M0。
将20g备用的M0放置于带有盖子的2000mL锥形瓶中，用pH 11的1mol/L碳酸盐缓冲溶液1000mL浸泡，加入100mL二乙烯基砜溶液，25℃浸泡反应2小时，震荡的转速为180rpm，得到含活性乙酰磺酰基的多孔纤维素布，标记为M1。
实施例2以PMB+溶菌酶为配基合成多孔纤维素布吸附材料
将5g实施例1制备的M1置于20mg/mL PMB(硫酸多粘菌素B)溶液(用pH7.4PBS溶解)中，25℃浸泡反应24小时，震荡的转速为180rpm，得到偶联了PMB配基的多孔纤维素布，标记为M2-1。
将5g M1置于50mg/mL PMB溶液(用pH7.4PBS溶解)中，25℃浸泡反应24小时，震荡的转速为180rpm，得到偶联了PMB配基的多孔纤维素布，标记为M2-2。
将2.5g M2-1置于pH＝6，溶菌酶浓度为0.1mg/mL的溶菌酶的0.2M磷酸盐缓冲溶液中，反应6h，得到多孔纤维素布吸附材料，标记为M3-1。
将2.5g M2-1置于pH＝6，溶菌酶浓度为20mg/mL的溶菌酶的0.2M磷酸盐缓冲溶液中，反应6h，得到多孔纤维素布吸附材料，标记为M3-2。
将2.5g M2-2置于pH＝6，溶菌酶浓度为0.1mg/mL的溶菌酶的0.2M磷酸盐缓冲溶液中，反应6h，得到多孔纤维素布吸附材料，标记为M3-3。
将2.5g M2-2置于pH＝6，溶菌酶浓度为20mg/mL的溶菌酶的0.2M磷酸盐缓冲溶液中，反应6h，得到多孔纤维素布吸附材料，标记为M3-4。
实施例3以PEI+溶菌酶为配基合成多孔纤维素布吸附材料
将5g M1置于5％的PEI(聚乙烯亚胺)溶液中，40℃浸泡反应2小时，震荡的转速为180rpm，得到偶联了PEI配基的多孔纤维素布，标记为M2-3。
将5g M1置于10％的PEI溶液中，40℃浸泡反应2小时，震荡的转速为180rpm，得到偶联了PEI配基的多孔纤维素布，标记为M2-4。
将2.5g M2-3置于pH＝6，溶菌酶浓度为0.1mg/mL的溶菌酶的0.2M磷酸盐缓冲溶液中，反应6h，得到多孔纤维素布吸附材料，标记为M3-5。
将2.5g M2-3置于pH＝6，溶菌酶浓度为20mg/mL的溶菌酶的0.2M磷酸盐缓冲溶液中，反应6h，得到多孔纤维素布吸附材料，标记为M3-6。
将2.5g M2-4置于pH＝6，溶菌酶浓度为0.1mg/mL的溶菌酶的0.2M磷酸盐缓冲溶液中，反应6h，得到多孔纤维素布吸附材料，标记为M3-7。
将2.5g M2-4置于pH＝6，溶菌酶浓度为20mg/mL的溶菌酶的0.2M磷酸盐缓冲溶液中，反应6h，得到多孔纤维素布吸附材料，标记为M3-8。
实施例4性能测试—血浆中内毒素的清除率
临床上，正常人血浆中内毒素的浓度低于0.053EU/mL，内毒素血症患者的血浆内毒素浓度通常分布在0.1至1.0EU/mL。将制备的血液净化吸附材料M3-1用大量水洗涤干净，抽干至恒重，然后称取0.1g血液净化材料，装入锥形瓶中，加入3ml 1EU/mL的牛血浆内毒素溶液，静态吸附2h，测试吸附前后牛血浆中的内毒素含量，计算出吸附材料的内毒素清除率。血液净化吸附材料M3-2、M3-3、M3-4、M3-5、M3-6、M3-7和M3-8吸附性能测试实施例同M3-1。具体数据参见表1。
表1 多孔纤维素布吸附材料对内毒素的吸附性能
Figure BDA0002176456920000081
缩写：PMB＝硫酸多粘菌素B；PEI＝聚乙烯亚胺；lysozyme＝溶菌酶。
由上表1的内毒素吸附结果可以看出，本发明实施例2和3制备的吸附材料均具有较好的内毒素清除率，能显著降低血浆中内毒素的浓度。例如，实施例2中的吸附材料M3-4的内毒素清除率甚至可以达到80％以上。
实施例5菌落计数法抗菌实验
分别将未改性的多孔纤维素布和改性后的多孔纤维素布M3-8置于液体培养基中，在培养箱中37±1℃培养24h后，取出0.1mL液体培养基加入0.9mL的无菌营养肉汤培养基做梯度稀释，然后取0.1mL的培养液置于营养琼脂培养基表面，将其均匀涂覆于营养琼脂培养基，于37±1℃培养24h后计算营养琼脂培养基上的菌落数，观察试样品的抗菌活性，并通过下述公式计算出抗菌率：
R(％)＝(logA-logB)/logA
上式中：A为未改性的多孔纤维素布培养后的CFU/mL，即菌落形成单位；B为改性后的多孔纤维素布培养后的CFU/mL。
根据培养液稀释的倍数和菌落数，可换算出试样品对细菌数量影响的情况。由于未改性的多孔纤维素布不具有抗菌作用，故空白对照中细菌的数量可被认为是细菌在液体培养基中正常生长的数量。实验数据见表2，由表2可得出，改性后的多孔纤维素布对金黄色葡萄球菌的抗菌率为96.43％，对大肠杆菌的抗菌率为46.49％，对白色念珠菌的抑菌率为64.04％。即改性后的多孔纤维素布对几种菌的抗菌效果大小为：金黄色葡萄球菌>白色念珠菌>大肠杆菌。其中金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为革兰氏阳性杆菌，大肠杆菌为革兰氏阴性杆菌。
表2 菌落计数法抗菌试验数据
Figure BDA0002176456920000091
实施例6溶血实验
根据《GB/T16886.4-2003医疗器械生物学评价第4部分与血液相互作用试验选择》、《GB/T16175-2008医用有机硅材料生物学评价试验方法》进行溶血实验。取样品组每管加入实施例2中制得的吸附材料1g，再加入氯化钠注射液10ml；阴性对照组每管加入氯化钠注射液10ml；阳性对照组每管加入蒸馏水10ml。每组平行操作3管。全部试管放入恒温水浴中(37±1)℃保温30min后，每支试管加入0.2ml稀释兔血，轻轻混匀，置(37±1)℃水浴中继续保温60min。倒出管内液体以800g离心5min。吸取上清液移入比色皿内，用分光光度计在545nm波长处测定吸光度。样品组合对照组吸光度均取3管的平均值。阴性对照管的吸光度应不大于0.03，阳性对照管的吸光度应为0.8±0.3，否则应重新试验。
溶血率＝(A-B)/(C-B)×100％，其中，
A——样品组吸光度；
B——阴性对照组吸光度；
C——阳性对照组吸光度。
结果显示实施例4中吸附材料的溶血率均小于1％，低于国家标准要求的低于5％。由此表明，实施例4中合成的吸附材料具有良好的血液相容性。
实施例7血液相容性实验
取实施例4中吸附材料各1g，经生理盐水浸泡10小时后装入柱子内，用注射器注入10mL经过肝素钠抗凝的兔子全血，以20mL/min的流速灌流2小时，同时加一支空柱子进行对照实验。经过Beckman LH750血细胞分析仪测定灌流前后血液各组分的变化。
结果表明，本发明实施例4中的吸附材料，灌流前后血液中各主要组分的变化不大，下降的百分数均在5％以内，由此表明本发明实施例4中的吸附材料具有良好的血液相容性，可应用于全血灌流。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种用于血液净化的吸附材料，其特征在于，所述吸附材料以多孔纤维素布为基质，所述基质上固定有可结合内毒素的第一配体和具有抗菌作用的第二配体，所述基质具有孔径为5 µm～600 µm的多孔结构以及0.5 cm2～12 m2的活性表面；
所述活性表面采用二乙烯基砜活化法进行表面修饰，所述二乙烯基砜活化法是将所述多孔纤维素布用二乙烯基砜在碱性溶液中活化后产生一个活性乙烯磺酰基。
2.根据权利要求1所述的吸附材料，其特征在于，所述第一配体为硫酸多粘菌素B或聚乙烯亚胺。
3.根据权利要求1所述的吸附材料，其特征在于，所述第二配体为溶菌酶。
4.根据权利要求1所述的吸附材料，其特征在于，所述第一配体和第二配体之间采用共价键偶联。
5.根据权利要求1所述的吸附材料，其特征在于，所述孔径为70 µm～170 µm。
6.一种用于血液净化的吸附材料的制备方法，包括如下步骤：
1）对多孔纤维素布进行预处理，以除去布表面的杂质、油污及残留添加剂；
2）将步骤1）预处理过的多孔纤维素布用碳酸盐缓冲溶液浸泡，加入体积分数为5%～15%二乙烯基砜溶液，25～40℃浸泡反应1～4h；
3）将步骤2）的产物用10～50 mg/mL硫酸多粘菌素B溶液或质量分数为5～35%的聚乙烯亚胺溶液浸泡，浸泡的时间为6～24h；
4）将步骤3）的产物用0.1～100 mg/mL的溶菌酶水溶液浸泡，24～37 ℃反应6～24 h，即得所述吸附材料。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述预处理包括：将多孔纤维素布用0.2～1 mol/L的盐酸溶液浸泡24h，之后用水清洗至无盐酸残留，以及去除所述多孔纤维素布表面的杂质、油污和残留添加剂，干燥后储存于干燥器中备用。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述碳酸盐缓冲溶液的pH为9～11。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述溶菌酶水溶液的pH为6～9。
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