KR20210148349A

KR20210148349A - 크로마토그래피 수지의 재생 방법

Info

Publication number: KR20210148349A
Application number: KR1020217037024A
Authority: KR
Inventors: 제임스 안젤로; 수안쿼 수
Original assignee: 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2020-04-16
Publication date: 2021-12-07
Also published as: JP2022530852A; EP3956046A1; CN113747960A; US20220220423A1; WO2020214792A1

Abstract

본 발명은 친화성 크로마토그래피 수지, 특히 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지를 재생 및 사용하는 개선된 방법을 제공한다.

Description

크로마토그래피 수지의 재생 방법

관련 출원에 대한 참조

본 출원은 2019년 4월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/835,049의 우선권 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

기술분야

본원에 개시된 대상은 일반적으로 크로마토그래피 및 크로마토그래피 수지의 세정에 관한 것이다.

크로마토그래피 수지는 샘플 용액 중 다른 불순물로부터 목적하는 단백질의 정제에 사용된다. 이러한 수지는 종종 친화성 크로마토그래피에 의한 생물제약, 예를 들어 모노클로날 항체 (Mab) 및 다른 Fc-함유 단백질의 정제에 사용된다. 친화성 크로마토그래피는 관심 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드, 예를 들어 항체의 Fc-영역에 결합할 수 있는 리간드 단백질 A를 수지에 커플링시키는 것에 의한 단백질-리간드 상호작용을 이용한다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피는 매우 효과적인 단백질 정제 방법이지만, 단백질 A 수지 관리의 비용은 MAb 제조에서 원료 수지 비용의 상당 부분을 포함하여 상당하다 (Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30, 121-128; Kelley, B., Biotechnol. Prog. 2007, 23:995-1008). 단백질 A 수지 비용의 문제는, 단지 몇회의 정제 사이클 후에 그의 전체 성능 및 결합 능력의 급속한 감소로 인한 수지의 전형적으로 짧은 수명에 의해 더욱 악화된다. 이는, 전형적으로, 대규모 단백질 정제 프로젝트에서 새로운 단백질 A를 상당히 자주 구입하고 사용할 필요가 있어, 단백질 정제의 전체 비용을 추가로 증가시키는 것을 의미한다. 수지 성능 및 결합 능력의 감소는 종종, 생산 및 가공 둘 다로부터의 수지 상의 불순물의 축적에 의한 수지의 오염으로 인한 것이다.

따라서, 크로마토그래피 수지의 전체 성능 및 결합 능력을 연장시킴으로써, 예를 들어 수지의 완전성을 유지하면서 크로마토그래피 수지를 재생 및/또는 세정함으로써 크로마토그래피 수지의 수명을 증가시키는 방법이 필요하다.

본 발명은 크로마토그래피 수지를 세정 및/또는 재생하는 방법을 제공한다. 크로마토그래피 수지는 동일한 생성물 또는 상이한 생성물과의 사용을 위해 세정 및/또는 재생될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 크로마토그래피 수지를 아세트산 및 벤질 알콜을 포함하는 제1 완충제 및 수산화나트륨, 시트르산나트륨 및 벤질 알콜을 포함하는 제2 완충제와 접촉시키는 것을 포함하는, 크로마토그래피 수지를 세정하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 제1 완충제는 인산을 함유하지 않는다. 한 실시양태에서, 제1 완충제는 약 150-200 mM 아세트산 및 약 1-3% (v/v) 벤질 알콜을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 완충제는 약 100-300 mM 수산화나트륨, 약 100-300 mM 시트르산나트륨, 및 약 0.5-1.5% (v/v) 벤질 알콜을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 완충제는 약 167 mM 아세트산을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 완충제는 약 2% (v/v) 벤질 알콜을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 완충제는 약 200 mM 수산화나트륨을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 완충제는 약 200 mM 시트르산나트륨을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 완충제는 약 1% (v/v) 벤질 알콜을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 완충제는 약 167 mM 아세트산 및 약 2% (v/v) 벤질 알콜을 포함하고, 제2 완충제는 약 200 mM 수산화나트륨, 약 200 mM 시트르산나트륨 및 약 1% (v/v) 벤질 알콜을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 완충제는 약 167 mM 아세트산 및 약 2% (v/v) 벤질 알콜을 포함하고, 제2 완충제는 약 100 mM 수산화나트륨, 약 200 mM 시트르산나트륨 및 약 1% (v/v) 벤질 알콜을 포함한다.

한 실시양태에서, 중화 완충제는 제1 완충제 후에 및 제2 완충제 전에 크로마토그래피 수지에 통과시킨다.

한 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 약 15분 이하 동안 제1 완충제 중에 유지된다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 약 15분 이하 동안 제2 완충제 중에 유지된다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 약 45분 이하 동안 제2 완충제 중에 유지된다. 한 실시양태에서, 재사용은 세정과 동일한 날에 수행된다.

한 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 크로마토그래피 칼럼에 존재한다.

한 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 친화성 수지이다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 지지체에 커플링된 친화성 리간드를 포함한다. 한 실시양태에서, 친화성 리간드는 스타필로코쿠스 단백질 A, 또는 그의 일부 또는 유도체이다. 한 실시양태에서, 친화성 리간드는 스타필로코쿠스 단백질 G, 또는 그의 일부 또는 유도체이다. 한 실시양태에서, 수지 또는 지지체는 폴리사카라이드, 아가로스, 폴리비닐에테르, 폴리비닐알콜, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카르보네이트, 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함한다.

본 발명은 또한 폴리펩티드를 크로마토그래피 수지에 적용하는 단계 및 본원에 기재된 방법을 사용하여 크로마토그래피 수지를 세정하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 세정된 크로마토그래피 수지의 결합 능력은 본원에 기재된 방법을 사용하여 크로마토그래피 수지를 세정한 후에 보존된다. 한 실시양태에서, 결합 능력은 50회 이상, 100회 이상, 150회 이상, 또는 200회 이상의 세정 후에 보존된다.

한 실시양태에서, 크로마토그래피 수지 압력은 본원에 기재된 방법을 사용하여 크로마토그래피 수지를 세정하는 과정 동안 증가하지 않는다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 수지 압력은 50회 이상, 100회 이상, 150회 이상, 또는 200회 이상의 세정 후에 증가하지 않는다.

한 실시양태에서, 폴리펩티드는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 이뮤노글로불린이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, 항체는 IgG 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, IgG 모노클로날 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 효소, 호르몬, 융합 단백질, 면역-접합체, 시토카인 또는 인터류킨이다.

본 발명은 또한, 크로마토그래피 수지를 1회 이상의 세정 사이클로 세정하는 것을 포함하는 크로마토그래피 수지를 함유하는 친화성 크로마토그래피 칼럼을 세정하는 방법을 제공하며, 여기서 각각의 세정 사이클은 크로마토그래피 수지를 아세트산 및 벤질 알콜을 포함하는 제1 용액과 약 15분 이하 동안, 및 수산화나트륨, 시트르산나트륨 및 벤질 알콜을 포함하는 제2 용액과 약 15분 이하 동안, 또는 약 45분 이하 동안 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 제1 용액은 인산을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 방법은 미생물 사멸을 증가시킨다. 한 실시양태에서, 방법은 숙주 세포 단백질 오염을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 방법은 수율 붕괴를 감소시킨다.

도 1은 세정 프로토콜 1 (-1-), 세정 프로토콜 2 (-2-), 세정 프로토콜 3 (-3-) 및 세정 프로토콜 6 (-4-)에 대한 정제 사이클 수 증가에 따른 단백질 A 단계 수율을 나타낸다.
도 2는 세정 프로토콜 9 (-1-), 세정 프로토콜 10 (-2-) 및 세정 프로토콜 11 (-3-)에 대한 정제 사이클 수 증가에 따른 단백질 A 단계 수율을 나타낸다.
도 3은 세정 프로토콜 2 (-1-), 세정 프로토콜 4 (-2-), 세정 프로토콜 5 (-3-) 및 세정 프로토콜 7 (-4-)에 대한 정제 사이클 수 증가에 따른 단백질 A 단계 수율을 나타낸다.
도 4는 세정 프로토콜 1 (-1-), 세정 프로토콜 7 (-2-), 및 세정 프로토콜 8 (-3-)에 대한 정제 사이클 수 증가에 따른 델타 칼럼 압력을 나타낸다.
도 5는 세정 프로토콜 10 (-1-) 및 세정 프로토콜 11 (-2-)에 대한 정제 사이클 수 증가에 따른 용리 분획 중 잔류 단백질 A (ppm)를 나타낸다.
도 6은 세정 프로토콜 9 및 세정 프로토콜 11에 대한 사이클 171에서의 세척 (세척 1, 세척 2 및 세척 3), 용리, CIP 및 중화 분획에서의 잔류 단백질 A (ng/mL)를 나타낸다.
도 7은 다양한 시간 동안 적용된 상이한 세정 용액의 미생물 사멸을 나타낸다.
도 8은 20분 CIP 2 접촉 시간 및 45분 CIP 2 접촉 시간을 갖는 세정 프로토콜 12에 대한 단백질 A 단계 수율을 나타낸다.
도 9는 100 사이클에 걸친 20분 CIP 2 접촉 시간 (좌측) 및 45분 CIP 2 접촉 시간 (우측) 동안의 세정 프로토콜 12에 대한 단백질 A DBC 곡선을 나타낸다.

크로마토그래피 수지를 세정 또는 재생하는 방법이 본원에 제공된다. 본 발명의 방법은 소규모 및 대규모 (예를 들어 제조-규모) 크로마토그래피 수지의 재생에 사용될 수 있다. 크로마토그래피 수지를 세정하기 위해 현재 허용되는 방법은 인산을 사용하는 산성 스트립 단계를 포함한다. 본 발명은 크로마토그래피 수지가 강력한 작용제, 예컨대 인산의 사용 없이 세정될 수 있다는 놀랍고도 예상치 못한 발견에 기초한다. 실리카- 또는 메타크릴레이트-기재 고정상 상의 오염물은 세정할 수 있으나 아가로스-기재 고정상 상의 오염물은 세정할 수 없는 인산의 사용은, 시스템 내 폐색에 의해 야기되는 압력 증가에 기여하며 이는 수율 붕괴를 유발할 수 있다.

정의

본원에 사용된 용어 "크로마토그래피"는 혼합물 중 다른 분자로부터 표적 분자, 예컨대 표적 단백질 (예를 들어, 이뮤노글로불린 또는 또 다른 Fc-함유 단백질)을 분리하고 이를 단리되도록 하는 동적 분리 기술을 지칭한다. 전형적으로, 크로마토그래피 방법에서, 액체 이동상은 관심 표적 분자를 함유하는 샘플을 고정상 (통상적으로 고체) 매질을 가로질러 또는 이를 통해 수송한다. 고정상에 대한 분배 또는 친화도의 차이는 선택된 분자가 고정상에 일시적으로 결합하게 하는 반면, 이동상은 상이한 시간들에 상이한 분자들을 운반한다.

본원에 사용된 용어 "친화성 크로마토그래피"는, 분리될 표적 분자, 예컨대 단백질 분자 (예를 들어, Fc-함유 단백질)와 크로마토그래피 수지 상에 고정된 분자 (예를 들어, 단백질 A 기반 리간드)의 "자물쇠-열쇠" 상호작용에 의해 단리되는 크로마토그래피 방식을 지칭한다. 이러한 특이적 상호작용은 표적 분자의 결합을 허용하는 반면 바람직하지 않은 분자는 통과되도록 한다. 이어서 이동상의 온도, pH 또는 이온 강도를 변화시켜 표적 분자를 고순도로 수득한다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 표적 분자 (예를 들어, 이뮤노글로불린 또는 또 다른 Fc-함유 단백질)를 함유하는 샘플을, 단백질 A의 C 도메인 (또는 일부 경우에 변형된 B 도메인)을 기재로 하는 리간드를 지지체 상에 보유하는 고체 지지체 (단백질 A 친화성 크로마토그래피 매질 또는 수지로 지칭됨)에 첨가하는 것을 포함한다. 친화성 크로마토그래프에 사용되는 다른 리간드는 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 결합하는 스트렙토코쿠스(Steptococci)로부터의 단백질 G를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단백질 A 친화성 크로마토그래피"는, Fc 영역에서 이뮤노글로불린에 결합할 수 있는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcous aureus)의 세포벽에서 발견되는 단백질인 단백질 A를 사용한 물질의 분리 또는 단리를 지칭한다. 단백질 A는 고체 지지체 상에 고정되고, 관심 단백질과 접촉한다.

용어 "고체 지지체"는 일반적으로 리간드가 부착되는 임의의 수지 (다공성 또는 비-다공성)를 지칭한다. 고체 지지체에 대한 리간드의 부착은 공유 결합을 통해, 예컨대 그라프팅의 경우에 (에테르, 티오에테르, 탄소-탄소 결합 또는 다른 연결을 통해), 또는 코팅, 접착, 흡착 및 유사한 메카니즘을 통해 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 방법에 사용되는 예시적인 고체 지지체는 폴리사카라이드, 아가로스, 폴리비닐에테르, 폴리비닐알콜, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카르보네이트를 포함한다.

관련 기술분야에 공지된 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 예는 제어된 세공 유리 백본 상에 고정된 단백질 A를 갖는 수지, 예를 들어 프로셉(PROSEP)^TM 매질/수지 (이엠디 밀리포어(EMD MILLIPORE)); 폴리스티렌 고체 상 상에 고정된 단백질 A를 갖는 수지, 예를 들어 포로스(POROS)^TM 맙캡쳐(MabCapture)^TM A 매질/수지 (어플라이드 바이오시스템즈. 인크.(APPLIED BIOSYSTEMS. INC.)); 및 아가로스 고체 지지체 상에 고정된 단백질 A를 갖는 수지, 예를 들어, r프로틴 A 세파로스 패스트 플로우(rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOW)^TM 또는 맙셀렉트(MABSELECT)^TM 매질 또는 수지 (지이 헬스케어(GE HEALTHCARE))를 포함한다.

본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "친화성 수지" 또는 "친화성 크로마토그래피 수지" 또는 "친화성 매질" 또는 "친화성 크로마토그래피 매질"은 고체 지지체, 예컨대 예를 들어 본원에 기재된 지지체 (예를 들어, 단백질 A 친화성 수지 또는 단백질 A 수지를 생성함)에 부착된 친화성 크로마토그래피 리간드 (예를 들어, 단백질 A를 기재로 함)를 의미한다. 일반적으로, 용어 "친화성 수지" 및 "친화성 매질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 친화성 크로마토그래피 수지의 다른 예는 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 결합할 수 있는 스트렙토코쿠스로부터의 단백질 G를 갖는 수지를 포함한다. 또한, 카파 경쇄를 통해 이뮤노글로불린에 결합하는 단백질 L을 갖는 친화성 수지가 포함된다. 이들 단백질은 이들 친화성 수지에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 또는 다른 단백질을 정제하기 위해 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 이러한 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한 상기 정의는, 예를 들어 1개 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 구체적으로 항체 및 Fc 도메인-함유 폴리펩티드 (예를 들어, 이뮤노어드헤신)를 포괄한다.

본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "표적 단백질" 또는 "관심 단백질"은 친화성 수지를 사용하여 정제될 수 있는 임의의 단백질, 예를 들어 단백질 A의 경우 Fc-함유 분자를 지칭한다. 다양한 실시양태에서, 표적 단백질은 Fc-함유 단백질, 예를 들어 이뮤노글로불린 또는 Fc-융합 단백질이다.

용어 "이뮤노글로불린", "Ig" 또는 "항체" (본원에서 상호교환가능하게 사용됨)는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (본원에서 CH로 약칭됨)으로 구성된다. 특정 항체, 예를 들어 자연 발생 IgG 항체에서, 중쇄 불변 영역은 힌지 및 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 특정 항체, 예를 들어 자연 발생 IgG 항체에서, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (CL로 약칭됨)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역 (FR)으로 명명되는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열되어 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은, 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 이뮤노글로불린이 결합하는 것을 매개할 수 있다. 중쇄는 C-말단 리신을 가질 수 있거나 또는 없다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, 가변 영역 내의 아미노산은 카바트(Kabat) 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링되고, 불변 영역 내의 아미노산은 EU 시스템을 사용하여 넘버링된다. "항체"는 예로서, 자연 발생 및 비-자연 발생 항체 둘 다; 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 및 비인간 항체 및 완전 합성 항체를 포함한다.

이뮤노글로불린 또는 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 단량체 또는 중합체 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어 IgM 항체는 오량체 형태로 존재할 수 있고/거나 IgA 항체는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재한다. "항체"와 함께 사용된 용어 "단편"은 무손상 또는 완전 항체 또는 항체 쇄보다 더 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 쇄의 일부 또는 부분을 지칭한다. 단편은 무손상 또는 완전 항체 또는 항체 쇄의 화학적 또는 효소적 처리를 통하여 수득될 수 있다. 단편은 재조합 수단에 의해 수득될 수도 있다. 예시적인 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 정제될 항체 또는 단편은 인간, 인간화 또는 키메라일 수 있다.

본원에 기재된 방법을 사용하여 정제되는 표적 단백질은 Fc 영역을 함유하는 것이고, 따라서 스트렙토코쿠스로부터의 단백질 A 또는 단백질 G에 의해 정제될 수 있는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 용어 "Fc 영역" 또는 "Fc"는 단백질 A와 상호작용하는 이뮤노글로불린 분자의 아미노산 잔기를 지칭한다. Fc 영역은 항체의 결정화가능한 테일 영역이고, Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체와 상호작용한다.

용어 "Fc-결합", "Fc 부분에 결합한다" 또는 "Fc 부분에 결합하는"은 항체의 불변 도메인 (Fc)에 결합하는 본원에 기재된 친화성 리간드의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 리간드는 항체 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4)의 Fc 부분에 대해 적어도 10^-7 M, 또는 적어도 10^-8 M, 또는 적어도 10^-9 M의 친화도로 결합한다.

본원에 사용된 용어 "단편(들)"은 또한 전장 Fc-함유 단백질, 예컨대 예를 들어 이뮤노글로불린의 부분을 지칭할 수 있다. 단편의 예는 Fab 단편, 단일쇄 항체 분자, 디아바디, 선형 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

본원에서 값 또는 파라미터에 대해 언급되는 "약"은 해당 값 또는 파라미터 자체와 관련된 변화를 포함 (및 기재)한다. "약 X"를 지칭하는 설명은 또한 "X"의 설명을 포함한다.

본원 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 단수 형태는 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 본원에 기재된 본 발명의 측면 및 변형은, 측면 및 변형을 "포함하는", 이들로 "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.

본 발명의 방법

크로마토그래피 수지의 세정

본 발명은 친화성 크로마토그래피 수지를 효율적으로 재생 또는 세정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하는 것은 보다 효율적인 세정 공정을 유발하고, 이는 다시 수지 물질의 수명을 증가시킨다. 본 발명의 보다 효율적인 세정 방법은 단백질 생성물의 대규모 생산에 사용하기 위한 친화성 수지의 연장된 성능을 허용한다.

본원에 사용된 용어 "세정"은, 수지의 성능을 보존하기 위해, 예를 들어 칼럼 (예를 들어, 단백질 A 칼럼)에서 친화성 크로마토그래피 수지 상에 남아있는 불순물 및 오염물을 제거하는 것을 수반하는, 표적 단백질 (예를 들어, 이뮤노글로불린 또는 또 다른 Fc-함유 단백질)을 정제하는 공정 동안의 단계를 지칭한다. 세정 단계는 수지로부터 불순물을 제거하지만, 이상적으로는 결합 능력 (수지가 정제할 수 있는 표적 단백질의 양) 및/또는 분해능 (바람직하지 않은 대상으로부터 표적 단백질을 분리하는 수지의 능력)을 사용하여 측정하였을 때 수지의 완전성에 영향을 최소한으로 주어야 한다. 종종, 예를 들어 스타필로코쿠스 단백질 A 또는 그의 유도체를 사용하는 상업적으로 입수가능한 친화성 크로마토그래피 수지는 인산을 함유하는 용액 또는 NaOH를 사용하는 알칼리성 용액을 사용하여 세정된다. 예를 들어, 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)^TM 단백질 A 칼럼은 희석된 NaOH로 세정된다. 한편, 프로셉^TM 단백질 A 칼럼은 일반적으로 인산을 사용하여 세정된다.

용어 "결합 능력"은 규정된 조건 하에 칼럼 실행에서 규정된 부피의 패킹된 수지 또는 매질에 결합할 분자의 양을 지칭한다. 결합 능력은 정적 결합 능력 또는 동적 결합 능력으로서 측정될 수 있다. 정적 결합 능력의 경우에, 분자 및 수지가 무한한 양의 시간 동안 접촉할 때 한정된 부피의 수지에 결합하는 분자의 양으로 결정된다. 정적 결합 능력은 수지가 결합할 수 있는 표적 분자의 최고량을 측정한다. 실제로, 상기 값은 종종 과량의 표적 분자를 최소의 유동으로 또는 유동 없이 4시간 이상 동안 수지와 접촉시킴으로써 수득된다. 다른 한편으로는, 동적 결합 능력은 설정된 유량에서 수지의 부피당 수지가 결합할 수 있는 표적 분자의 양이다. 임의의 수지에 대한 동적 결합 능력은 기저 조건에 크게 의존한다. 일반적으로, 유량이 낮을수록, 동적 결합 능력이 더 높다. 유량이 0에 접근함에 따라, 결합 능력은 최대 이용가능한 능력-정적 결합 능력에 접근한다. 적절한 세정 및 위생처리 없이, 친화성 수지의 결합 능력은 전형적으로 다수의 결합 및 용리 사이클 후에 초기 값 미만으로 떨어진다. 결합 능력이 크로마토그래피 방법/공정 개발 동안 설정된 특정 값보다 낮은 경우, 상당량의 표적 단백질이 "파과(breakthrough)"되거나, 또는 불순물을 함유하는 관류 분획과 함께 공-용리되어 생성물의 손실을 초래할 수 있다. 적합한 화학물질을 사용한 적절한 세정은 연장된 기간에 걸쳐 수지 결합 능력을 유지할 수 있다.

단백질 A 친화성 수지의 세정은 통상적으로, 수지가 수지의 수명 사이클 전반에 걸쳐 일관되게 정제를 수행할 것을 보장하기 위해 또는 다시 말해서 수지의 결합 능력을 보존하기 위해, 각각의 사이클 후에 실시된다. 세정은 하기 2가지 이유로 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 특히 중요하다: (1) 단백질 A 수지는 이온 교환 또는 소수성 상호작용 (HIC) 수지와 비교하여 높은 초기 비용을 갖는다; (2) 단백질 A 크로마토그래피 수지는 전형적으로 보다 높은 수준의 불순물을 함유하는 정화된 세포 배양물에 노출된다. 따라서, 일부 잔류 불순물이 단백질 A 수지에 결합할 수 있고, 이에 의해 수지의 재사용 시 결합 능력의 손실 또는 용리 풀(pool) 불순물의 증가를 유발한다. 이는 생산성의 감소 (결합 능력의 감소로 인함) 및 보다 불량한 생성물 순도로 이어지기 때문에 제조 환경에서 매우 바람직하지 않다. 따라서, 각각의 단백질 A 결합 및 용리 사이클 후의 일상적인 세정은 일관된 생성물 순도 및 공정 처리량으로 이어지는 일관된 수지 성능을 보장하는데 중요하다.

본원에 사용된 용어 "사이클" 또는 "친화성 사이클" 또는 "단백질 A 친화성 크로마토그래피 정제 사이클"은, 친화성 수지를 사용하는 크로마토그래피 칼럼의 중성 완충제로의 평형화로 시작하고; 이어서 정화된 세포 배양 공급물을 칼럼에 로딩하는 다단계 공정을 지칭하며, 여기서 정화된 세포 배양 공급물은 정제될 표적 단백질을 함유한다. 단백질 A 친화성 수지의 경우에, 표적 단백질은 정제된 Fc-함유 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)일 수 있으며; 이어서 표적 단백질이 리간드에 결합하는 것, 또는 예를 들어 Fc-함유 단백질이 단백질 A 수지에 결합하는 것을 방해하지 않는, 느슨하게 결합된 불순물을 제거하기 위한 1종 이상 (종종 3종)의 상이한 완충제로 칼럼을 세척하고; 이어서 용리 완충제 (예를 들어, 2.5-4.5의 pH를 갖는 완충제)를 사용하여 친화성 수지로부터 표적 단백질을, 예를 들어 단백질 A 수지로부터 Fc-함유 단백질을 용리한다. 평형화, 로딩, 세척 및 용리의 이러한 다단계 공정은 사이클 또는 결합 및 용리 사이클을 구성한다. 사이클 후에는 전형적으로 다음 사이클 전에 칼럼 상의 미량 수준의 불순물을 제거하기 위한 세정 단계가 이어진다.

본원에 기재된 일부 실시양태에서, 수지 세정은 아세트산 및 벤질 알콜을 포함하는 제1 세척 완충제 및 수산화나트륨, 시트르산나트륨 및 벤질 알콜을 포함하는 제2 세척 완충제를 사용하여 수행된다. 세정과 관련하여 본원에 사용된 용어 "세척 완충제"는 표적 단백질의 용리 후에 고체 지지체 (예를 들어, 고정된 단백질 A를 갖는 지지체) 상에 통과되는 완충제를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 각각의 사이클 후에 제1 완충제 및 제2 완충제 둘 다와 접촉된다. 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 제1 및 제2 완충제가 정제 캠페인을 통해 교대 방식으로 사용되도록 사이클 후에 제1 완충제 또는 제2 완충제와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 제2 완충제 및 이어서 제1 완충제와 접촉된다.

본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 완충제를 제공한다. 본 발명의 제1 완충제는 인산을 함유하지 않는다. 한 실시양태에서, 제1 완충제는 예를 들어 약 100-300 mM 아세트산, 또는 약 125-250 mM 아세트산, 또는 약 150-200 mM 아세트산, 또는 약 167 mM 아세트산을 포함할 수 있다. 제1 완충제는 또한 약 2-4% (v/v) 벤질 알콜, 또는 약 2.5-3.5% (v/v) 벤질 알콜, 또는 약 2-3% (v/v) 벤질 알콜, 또는 약 1.5-2.5% (v/v) 벤질 알콜, 또는 약 1-2% (v/v) 벤질 알콜, 또는 약 2% (v/v) 벤질 알콜을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 완충제는 167 mM 아세트산 및 약 2% (v/v) 벤질 알콜을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물 오염 부담을 감소시키고 임의로 저장을 위한 수지를 제조하는데 사용되는 제2 완충제를 제공한다. 본 발명의 제2 완충제는, 예를 들어 약 50-400 mM, 또는 약 100-350 mM, 또는 약 150-300 mM, 또는 약 100-300 mM, 또는 약 100-300 mM, 또는 약 200 mM의 수산화나트륨을 포함할 수 있다. 제2 완충제는 또한 약 50-400 mM, 또는 약 100-350 mM, 또는 약 150-300 mM, 또는 약 100-300 mM, 또는 약 100-300 mM, 또는 약 200 mM의 시트르산나트륨을 포함할 수 있다. 제2 완충제는 또한 약 0.5-3% (v/v), 또는 약 0.5-1.5% (v/v), 또는 약 1-2% (v/v), 또는 약 1.5-2.5% (v/v), 또는 약 1% (v/v)의 벤질 알콜을 포함할 수 있다. 제2 완충제의 비제한적 예는 약 200 mM 수산화나트륨, 200 mM 시트르산나트륨 및 1% (v/v) 벤질 알콜이다.

한 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 크로마토그래피 칼럼에 위치한다. 일부 실시양태에서, 칼럼은 적어도 2, 3, 4 또는 5배 칼럼 부피로 세척된다. 일부 실시양태에서, 불순물이 칼럼으로부터 추가로 용리되지 않거나 본질적으로 용리되지 않을 때까지 칼럼을 제1 완충제 및 제2 완충제로 세척한다.

본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 유량은 약 50 물질 부피/hr, 40 물질 부피/hr, 또는 30 물질 부피/hr 중 임의의 것 미만이다. 유량은 약 5 물질 부피/hr 내지 50 물질 부피/hr, 10 물질 부피/hr 내지 40 물질 부피/hr, 또는 18 물질 부피/hr 내지 36 물질 부피/hr 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유량은 약 9 물질 부피/hr, 18 물질 부피/hr, 25 물질 부피/hr, 30 물질 부피/hr, 36 물질 부피/hr, 또는 40 물질 부피/hr 중 임의의 것이다.

일부 실시양태에서, 유량은 약 90 칼럼 부피 (CV)/hr; 80 CV/hr; 70 CV/hr; 60 CV/hr; 50 CV/hr; 40 CV/hr, 또는 30 CV/hr 중 임의의 것 미만이다. 유량은 약 5 CV/hr 내지 50 CV/hr, 10 CV/hr 내지 40 CV/hr, 또는 18 CV/hr 내지 36 CV/hr 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유량은 약 9 CV/hr, 18 CV/hr, 25 CV/hr, 30 CV/hr, 36 CV/hr, 또는 40 CV/hr 중 임의의 것이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 유량은 약 100cm/hr, 75cm/hr, 또는 50cm/hr 중 임의의 것 미만이다. 유량은 약 25 cm/hr 내지 150 cm/hr, 25 cm/hr 내지 100 cm/hr, 50 cm/hr 내지 100 cm/hr, 또는 65 cm/hr 내지 85 cm/hr 중 임의의 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 칼럼 재생을 위한 시간을 절약한다. 일부 실시양태에서, 세정 완충제와의 접촉 시간은 전형적인 75분에서 30분으로, 또는 심지어 약 9분으로 감소되어, 동일한 수지를 사용하는 추가의 다수의 추가의 정제를 짧은 시간 내에 가능하게 한다.

오염물

본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 오염물은 임의의 1종 이상의 숙주 세포 물질, 침출된 단백질 A, 핵산, 목적하는 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체, 또 다른 폴리펩티드, 내독소, 바이러스 오염물, 세포 배양 배지 성분, 카르복시펩티다제 B, 겐타미신 등일 수 있다. 일부 예에서, 오염물은, 예를 들어 비제한적으로 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다.

침출된 단백질 A는 그것이 결합된 고체 상으로부터 침출되거나 세척된 단백질 A이다. 예를 들어, 침출된 단백질 A는 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 침출될 수 있다. 단백질 A의 양은, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 측정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 침출된 단백질 A의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 중 임의의 것 초과만큼 감소된다. 침출된 단백질 A의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99% 또는 85% 내지 99% 중 임의의 것만큼 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 침출된 단백질 A의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 침출된 단백질 A의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 침출된 단백질 A의 양과 비교하여 결정된다.

숙주 세포 단백질 (HCP)은 폴리펩티드가 생산되는 세포로부터의 단백질이다. HCP의 양은 ELISA 또는 메조 스케일 디스커버리 (Meso Scale Discovery: "MSO")에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 용리액 중 HCP의 양은 모의 용리에서 최소로 존재한다. 일부 실시양태에서, 모의 용리로부터의 용리액 중 숙주 세포 단백질의 수준은 세정 방법의 존재 또는 부재 또는 세정 방법 전 및 후에 비교된다.

DNA, 예컨대 숙주 세포 DNA를 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, DNA의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 중 임의의 것 초과만큼 감소된다. DNA의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 중 임의의 것만큼 감소될 수 있다. DNA의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 중 임의의 것만큼 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 DNA의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 DNA의 양과 비교하여 결정된다.

단편 폴리펩티드는 저분자량 (LMW) 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편화된 폴리펩티드는 관심 폴리펩티드의 단편이다. LMW 단백질의 예는 Fab (항원 결합 단편), Fc (결정화가능한 단편) 영역 또는 둘 다의 조합, 또는 관심 항체의 임의의 무작위적인 단편화된 부분을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 단편화된 단백질 (예를 들어, LMW 단백질)을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 실시예 섹션에 기재되어 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, LMW 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과만큼 감소된다. LMW 단백질의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99% 또는 85% 내지 99% 중 임의의 것만큼 감소될 수 있다. LMW 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것만큼 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 단편화된 단백질 (예를 들어, LMW 단백질)의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 단편화된 단백질 (예를 들어, LMW 단백질)의 양과 비교하여 결정된다.

응집된 폴리펩티드는 고분자량 (HMW) 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 응집된 폴리펩티드는 관심 폴리펩티드의 다량체이다. HMW 단백질은 이량체, 최대 8X 단량체, 또는 보다 큰 관심 폴리펩티드일 수 있다. 응집된 단백질 (예를 들어, HMW 단백질)을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 모의 용리에서 HMW의 수준은 최소; 예를 들어, 약 5 ppm 미만, 약 4 ppm 미만, 약 3 ppm 미만, 약 2 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 응집된 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과만큼 감소된다. 응집된 단백질의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99% 또는 85% 내지 99% 중 임의의 것만큼 감소될 수 있다. 응집된 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것만큼 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 응집된 단백질 (예를 들어, HMW 단백질)의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 응집된 단백질 (예를 들어, HMW 단백질)의 양과 비교하여 결정된다.

세포 배양 배지 성분은 세포 배양 배지에 존재하는 성분을 지칭한다. 세포 배양 배지는 세포를 수거하는 시점에서의 세포 배양 배지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지 성분은 겐타미신이다. 겐타미신의 양은 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 중 임의의 것 초과만큼 감소된다. 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99% 또는 85% 내지 99% 중 임의의 것만큼 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 98% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 세포 배양 배지 성분의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 세포 배양 배지 성분의 양과 비교하여 결정된다.

폴리펩티드

본 발명의 방법은 다수의 폴리펩티드 제제의 정제에 사용되는 크로마토그래피 물질을 세정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 대규모; 예를 들어, 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 그의 단편의 제조-규모 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 제1 폴리펩티드, 예컨대 제1 항체의 정제에 사용되고, 이어서 물질은 본 발명의 방법에 의해 세정되고, 이어서 크로마토그래피 물질은 제2 폴리펩티드, 예컨대 제2 항체를 정제하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세정은 제2 정제된 폴리펩티드를 포함하는 제제가 제1 폴리펩티드를 본질적으로 함유하지 않도록 하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 제2 정제된 폴리펩티드 (예를 들어 제2 항체)를 포함하는 제제는 1 ppm 미만의 제1 폴리펩티드 (예를 들어 제1 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 정제된 폴리펩티드는 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm 또는 100 ppm 중 어느 하나 미만의 제1 폴리펩티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 치료 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 크로마토그래피 물질을 재사용하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 길항제이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 효능제이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 에피토프 태그 부착된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 길항제이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 보체 의존성 세포독성을 개시한다. 일부 실시양태에서 폴리펩티드는 항체 또는 이뮤노어드헤신이다.

본원에 기재된 방법에 의해 세정된 재생된 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제된 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 생산된다. 재조합 단백질의 생산 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,534,615 및 4,816,567에 기재되어 있으며, 이들은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다.

폴리펩티드는 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 재조합적으로 생산될 수 있다. 단백질은 유전자 조작된 식물, 트랜스제닉 동물로부터 유래될 수 있거나, 또는 세포 배양물에서 성장하도록 적합화된 생산 세포에 의해 분비될 수 있다. 생산 세포는 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이, 스트렙토미세스 종, 및 바실루스(Bacillus) 종), 진균 (예를 들어, 아스페르길루스(Aspergillus)), 무척추동물-유래 (예를 들어, 곤충) 또는 포유동물일 수 있다. 산업에서 통상적으로 사용되는 포유동물 세포의 예는 CHO, VERO, BHK, HeLa, CV 1 (Cos 포함), MDCK, 293, 3T3, 골수종 세포주 (특히 뮤린), PC12 및 W138 세포이다. 특히 바람직한 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이고, 이는 여러 복합 재조합 단백질, 예를 들어 시토카인, 응고 인자, 및 항체의 생산에 널리 사용된다 (Brasel et al., 1996, Blood 88:2004-2012; Kaufman et al., 1988, J. Biol Chem 263: 6352-6362; McKinnon et al., 1991, J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al., 1990, J. Immunol 145:3011-3016). 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)-결핍 돌연변이체 세포주 (Urlaub et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220), DXB11 및 DG-44는, DHFR 선택가능하고 증폭가능한 효율적인 유전자 발현 시스템이 이들 세포에서 높은 수준의 재조합 단백질 발현을 허용하기 때문에 선택되는 CHO 숙주 세포주이다 (Kaufman R. J., 1990, Meth Enzymol 185:527-566). 또한, 이들 세포는 부착 또는 현탁 배양물로서 조작하기가 용이하고, 비교적 우수한 유전적 안정성을 나타낸다. CHO 세포 및 그에서 발현된 재조합 단백질은 광범위하게 특징화되었고, 규제 기관에 의해 임상 제조에 사용하기 위해 승인되었다.

본원에 기재된 방법에 의해 세정된 재생된 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제된 폴리펩티드는 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 순환, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴될 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 미립자 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]은 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비되는 폴리펩티드를 단리하는 절차를 기재하고 있다. 간략하게, 약 30분에 걸쳐 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 세포 페이스트를 해동시킨다. 세포 잔해는 원심분리로 제거할 수 있다. 폴리펩티드가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 우선 상업적으로 입수가능한 폴리펩티드 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.

본원에 기재된 방법에 의해 세정된 재사용가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제될 수 있는 폴리펩티드의 예는 이뮤노글로불린, 이뮤노어드헤신, 항체, 융합 단백질, Fe-함유 단백질 및 면역접합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

이어서 생성된 발현된 폴리펩티드를, 본 발명의 방법과 조합하여 공지된 공정을 사용하여 이러한 배양물 또는 성분으로부터 (예를 들어, 배양 배지 또는 세포 추출물 또는 체액으로부터) 정제 또는 부분적으로 정제할 수 있다. "부분적으로 정제된"은 일부 분획화 절차 또는 절차들이 수행되었지만, 목적하는 단백질보다 더 많은 폴리펩티드 종 (적어도 10%)이 존재함을 의미한다. "정제된"은 단백질이 본질적으로 균질함을, 즉 1% 미만의 오염 단백질이 존재함을 의미한다. 분획화 절차는 여과, 원심분리, 침전, 상 분리, 친화도 정제, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC; 페닐 에테르, 부틸 에테르 또는 프로필 에테르와 같은 수지를 사용함), HPLC 또는 상기의 일부 조합 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 임의의 상기 크로마토그래피 수지는 본 발명의 방법을 사용하여 세정 및 재생될 수 있다.

원하는 최종 순도의 정도는 폴리펩티드의 의도된 용도에 좌우된다. 예를 들어, 폴리펩티드를 생체내 투여하고자 하는 경우에는 비교적 높은 정도의 순도가 요구된다. 이러한 경우에, 폴리펩티드는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의한 분석 시 다른 폴리펩티드에 상응하는 폴리펩티드 밴드가 검출가능하지 않도록 정제된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 폴리펩티드에 상응하는 다중 밴드가 차등 글리코실화, 차등 번역후 프로세싱 등으로 인해 SDS-PAGE에 의해 시각화될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 SDS-PAGE에 의한 분석시에 단일 폴리펩티드 밴드에 의해 나타나는 바와 같이 실질적으로 균질하게 정제된다. 폴리펩티드 밴드는 은 염색, 쿠마시(Coomassie) 블루 염색에 의해, 또는 (폴리펩티드가 방사성표지되는 경우) 자가방사선촬영에 의해 시각화될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 본 발명을 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함된다.

실시예

수지 세정은 mAb 정제를 위한 단백질 A 칼럼의 적합하게 긴 수명을 유지하는데 중요한 요소이다. 단백질 A 수지가 하류 공정에 이용되는 가장 고가의 소모품 중 하나이기 때문에, 효율적인 수지 세정은 또한 물질의 지속가능한 비용을 유지하는데 중요하다.

오염의 영향은, 공간적 제한 및 전체 입자내 다공도의 감소를 통해 결합 능력을 감소시키고, 이러한 오염물 농도가 증가함에 따라 mAb의 흡착을 보다 어렵게 만들어 칼럼 수명에 영향을 미친다. 보다 높은 가성물질 농도는 오염물 축적을 제거하지만, 리간드 가수분해의 증가로 인해 능력을 희생시키는 것으로 입증되었다. 가성 용액 중의 첨가제, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 황산나트륨 및 시트르산나트륨은 리간드 가수분해 비율을 감소시키는데 미미하게 효과적인 것으로 입증되었다.

전체적으로 생산성 및 유효성을 증가시킬 새로운 세대의 가성 안정성 단백질 A 수지에 대한 세정 용액을 위한 새로운 제제가 추구된다.

물질 & 방법

표 1: 원료 리스트

수지 및 로드 물질

실험에 사용된 단백질 A 칼럼은 미니크롬(MiniChrom) 하드웨어 (레플리겐(Repligen), 매사추세츠주 월섬) 내의 0.8 cm i.d. x 5.0 cm 층 높이, 패킹된 맙셀렉트 슈어 LX 수지 (지이 헬스케어, 스웨덴 웁살라)였다. 세정 연구를 위한 실험을 악타 아반트 150 시스템 (AEKTA Avant 150 System) (지이 헬스케어) 상에서 로드 물질로서 4.1 내지 4.6 g/L 역가의 정화된 세포 배양 수거물을 사용하여 수행하였다. 추가의 실험을 1 cm i.d. x 10 cm 층 높이 옴니핏 (Omnifit) 유리 칼럼 (키네시스(Kinesis))에서 동일한 수지를 사용하여 수행하였으며, 또한 악타 아반트 150 시스템 (지이 헬스케어) 상에서 로드 물질로서 4.1 내지 4.6 g/L 역가의 정화된 세포 배양 수거물을 사용하여 또한 수행하였다.

분석

캡쳐 실행을 위한 생성물 농도를 드롭센스96(DropSense96) UV-Vis 분광광도계 (트리니안(Trinean), 벨기에 겐트브루게)를 사용하여 280 nm에서의 UV 흡광도를 사용하여 측정하였다. 잔류 CHO-HCP 및 rProA의 정량화를 위한 ELISA를 테칸 리퀴드 핸들링 시스템(Tecan Liquid Handling System) (노스캐롤라이나주 모리스빌)을 사용하여 고처리량 방식으로 수행하였다. HCP 수준을 CHO HCP 제3 세대 키트 (시그너스 테크놀로지스(Cygnus Technologies), 노스캐롤라이나주 사우스포트)를 사용하여 정량화하는 한편, rProA를 레플리겐 단백질-A ELISA 키트 (레플리겐 코포레이션, 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 정량화하였다. 샘플 중 잔류 CHO DNA (rDNA)를 실시간 정량적 PCR (RT-qPCR)을 사용하여 측정하였다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 워터스 액퀴티 H-클래스 바이오 UPLC(Waters' Acquity H-Class Bio UPLC)를 사용하여 수행하여 생성물 풀 중 단량체 및 응집체 함량을 측정하였다. 단량체, 저분자량 및 고분자량 종의 정량화를 엠파워 소프트웨어 (워터스 코포레이션(Waters Corp.))를 사용하여 수행하였다.

크로마토그래피 방법

맙셀렉트 슈어 LX 단백질 A 칼럼은 결합-및-용리 모드로 작동한다. 최종 기준이 충족될 때까지 각각의 세정 프로토콜에 대해 다수의 단백질 A 사이클을 수행하였다. 기준은 수율 (<80%) 및/또는 델타 칼럼 압력 (>3.00 MPa)이었다. 맙셀렉트 슈어 LX 단백질 A 크로마토그래피 작업을 위한 단계, 체류 시간 및 완충제 칼럼 부피 (CV) 요건의 요약을 표 2에 제시한다.

표 2: 단백질 A 크로마토그래피를 위한 작업 조건의 요약

단백질 A 칼럼을 3 CV의 20 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2 완충제로 평형화시켰다. 이어서 1 M 염화나트륨을 칼럼 내로 주입하고, 20 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2 완충제로의 평형화를 2 CV 동안 계속하였다. 평형화 후, 정화된 벌크를 로딩 표적 45 g/L 수지로 2℃ 내지 8℃에서 칼럼 상에 로딩하였다. 이어서 칼럼을 2 CV의 20 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2 완충제로 세척한 후, 5 CV의 50 mM 카르보네이트, 100 mM 염화나트륨, 0.5% 폴리소르베이트-80, pH 10.0으로 세척한 다음, 5 CV의 20 mM 시트레이트 포스페이트, pH 5.1로 세척하였다. 칼럼을 20 mM 시트레이트 포스페이트, pH 3.4 완충제로 용리시켰다. 용리액을 전체 5 CV에 대해 수집하고, 각각의 사이클로부터의 용리액을 개별 용기 내로 수집하였다. 용리 후, 단백질 A 칼럼을 3 CV의 CIP 1 완충제로 제자리에서 세정하고, 2 CV의 20 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2 완충제로 중화시킨 다음, 3 CV의 CIP 2 완충제로 위생처리하였다. 주어진 세정 프로토콜에서 CIP 1이 없는 경우에, CIP 1 및 중화 1을 해당 크로마토그래피 방법에 대해 수행하지 않았다. 유사하게, 주어진 세정 프로토콜에서 CIP 2가 없는 경우에, CIP 2 및 중화 2 둘 다를 해당 크로마토그래피 방법에 대해 생략하였다. 단백질 A 칼럼을 다시 순환시켜야 하기 때문에, 이를 3 CV의 20 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2 완충제로 2회 재평형화시킨 후, 로딩, 및 용리, 제자리 세정 및 위생처리로 이어지는 후속 단계를 수행하였다. 최종 사이클의 CIP 단계 후, 3 CV의 20 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2으로 평형화 단계를 수행한 후, 3 CV의 2% (v/v) 벤질 알콜로 칼럼을 저장하였다.

단백질 A 단계 수율을 계산하기 위한 방정식은 하기와 같다:

델타 칼럼 압력, 또는 칼럼 차압은 칼럼의 패킹된 층에 걸친 압력 강하, 즉 칼럼-전 압력 [MPa] - 칼럼-후 압력 [MPa]으로서 기재된다.

표 3: 세정 완충제

1 cm i.d. x 10 cm 층 높이 맙셀렉트 슈어 LX 칼럼을 사용한 추가의 사이클 연구를 표 3의 세정 프로토콜 12로 수행하였다. 이 세정 요법에서, 각각의 CIP 단계 (CIP 1 및 CIP 2)에 대한 체류 시간은, 동적 유동 조건 하에 각각의 CIP 용액의 15분 접촉 시간을 허용하는, 5분 (3분 대신)이었다. CIP 2 단계 후 5 또는 30분 정적 유지를 사용하여 2가지 사이클 연구를 병행하여 수행하였고, CIP 2 용액의 누적 접촉 시간은 각각 20 및 45분이 되었다.

결과 & 논의

이 연구로부터의 결과는 수율 및 델타 칼럼 압력이, 인산과 같은 비상용성 용액 성분과 조합하여, 오염물의 불충분한 제거에 의해 영향을 받으며, 이는 오염의 정도를 악화시키고 델타 칼럼 압력에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 이러한 상호작용의 메카니즘은 완전히 이해되지는 않는다. 도 1은 지시된 정제 사이클의 과정에 걸친 세정 프로토콜 1, 2, 3, 및 6에 대한 단계 수율을 나타낸다. 대조군 경우를 나타내는 것으로 의도되는 세정 프로토콜 1은 점진적인 수율 감소와 함께 대략 사이클 65에서 급격한 하향 전환을 갖는다. 이 경우는 CIP 1 단계에서 인산을 사용할 뿐만 아니라 CIP 2 단계에서 낮은 농도의 수산화나트륨을 사용하므로, 오염물의 제거가 불충분하고 칼럼 분해를 초래한다는 것을 추론할 수 있다. 이 경우는 거의 아마도 CIP 1 조건에서 제공된 낮은 pH 환경으로 인한 칼럼 과잉 가압으로 인해 종료되었다. CIP 2 단계의 제거 (세정 프로토콜 2)는, CIP 2 세정을 완전히 제외시키고 CIP 1의 인산/아세트산 조건 이외에는 칼럼 세정을 제공하지 않기 때문에 보다 불량한 공정 성능을 나타내며, 유사하게 사이클 60 근처에서 수율의 급격한 하향전환이 나타난다. 세정 프로토콜 3은 세정 프로토콜 1에 사용된 CIP 용액으로부터 벤질 알콜 함량을 제거하며, 이러한 제거로 수율이 사이클 120 근처에서 크게 감소할 때까지 훨씬 더 지속적인 공정 성능을 나타낸다. 이는 벤질 알콜이 또한 칼럼 세정 효율 및 전체 수율에 부정적인 영향을 미치는 잠재적 작용제일 수 있음을 시사한다. 유기 용액은 펩티드, 단백질 및 핵산과 침전 작용을 갖는 것으로 제시된 바 있으며, 따라서 불충분한 제거로 인한 잔류 단백질성 오염물 물질을 갖는 칼럼 상에서 이러한 작용이 존재할 수 있을 것으로 보인다. 세정 프로토콜 6은 수율의 점진적 감소를 나타내었으나, 수행된 170 사이클 동안 급격한 하향전환은 존재하지 않았다. 벤질 알콜이 여기에 사용된 CIP 용액에 남아 있을지라도, 인산의 제거 및 20 mM에서 200 mM로의 수산화나트륨 함량의 증가가 단계 수율에 훨씬 더 유익한 것으로 입증되었다. 보다 높은 농도의 히드록시드에 의해 제공되는 오염물 세정은 공정 성능을 유지하는데 있어서 중요하다.

CIP 1 단계에 대해 167 mM 아세트산, 2% (v/v) 벤질 알콜 및 CIP 2 단계에 대해 100 mM 수산화나트륨, 200 mM 시트르산나트륨, 1% (v/v) 벤질 알콜을 사용하는 대안적 세정 프로토콜 (표 3의 세정 프로토콜 12)을 또한 1 cm i.d. x 10 cm 층 높이 맙셀렉트 슈어 LX 칼럼을 사용하여 평가하였다. 이 제제에서, 고정상의 충분한 세정을 여전히 제공하면서, 리간드 분해의 효과를 줄이기 위해 중간 농도의 수산화나트륨 (100 mM)을 이용하였다. CIP 2 용액의 20분 및 45분 누적 접촉 시간을 사용한 사이클링 연구를 수행하여 이 세정 요법을 사용하는 수지 세정 및 리간드 분해의 정도를 평가하였다.

도 8은 91 단백질 A 사이클 동안 수행된 세정 프로토콜 12에 대한 수율 경향을 나타낸다. 전체적으로 경향은 20분 접촉 시간 및 45분 접촉 시간 경우 둘 다에서 거의 선형으로 감소하였다. 이들 경우 둘 다는, 그의 각각의 CIP 용액과의 단지 9분의 전체 접촉 시간 (즉, 3 칼럼 부피에 대해 3분 체류 시간 = 9분)을 갖는 세정 프로토콜 1 내지 11의 경우보다 CIP 2 용액과의 더 긴 전체 접촉 시간을 갖는다는 것에 주목해야 한다. 이러한 선형 감소는 강력한 세정 용액에 대한 노출로 인한 고정상 상의 리간드의 분해와 연관될 수 있다. 그러나, 100 mM 수산화나트륨 제제는 단백질성 오염물 물질의 적절한 세정 및 제거를 가능하게 한다.

도 9는 세정 프로토콜 12를 시험하기 위해 사용된 칼럼으로 개별적으로 수행된 동적 결합 능력 (DBC) 곡선을 나타낸다. 이들 곡선을 공정 중간체로부터 사전-정화된 mAb를 사용하여 캡쳐하고, 칼럼 상에 100 g/L 수지 초과의 로딩으로 로딩하였다. 이들 파과 곡선의 좌측으로의 일반적 이동은 결합 능력의 감소를 나타내며, 이는 리간드의 분해 및 그에 따른 mAb 생성물에 대한 친화도의 저하와 연관될 수 있다. 20분 접촉 시간 경우에 대한 이들 곡선의 특징적인 형상은 이 칼럼에서 보다 많은 오염물이 발생하지만, 관찰된 수율 영향은 20분 및 45분 접촉 시간 경우 둘 다에 대한 전체 단계 수율과 비교하여 무시할만하다는 것을 나타낸다.

세정 프로토콜 6은 9분의 접촉 시간을 갖는 잘 작동하는 시나리오를 제시하였지만, 세정 시약이 충분한 살박테리아 및 살진균 유효성을 갖는 것을 보장하기 위해 제조 설정에서 보다 긴 접촉 시간이 전형적으로 필요하다. 세정 프로토콜 12의 경우에 탐구된 보다 긴 접촉 시간은 이러한 의미에서 보다 현실적이며, 이는 가성 용액이 단백질 A 리간드를 분해하는데 미치는 효과를 줄이기 위해 100 mM의 중간 값 수산화나트륨을 선택하는 이유였다.

다양한 시간 (접촉 시간) 동안 적용된 상이한 용액의 미생물 사멸 (LRV)을 측정하였다 (도 7). 167 mM 아세트산, 2% (v/v) 벤질 알콜 (CIP 1 완충제) 및 200 mM 수산화나트륨, 200 mM 시트르산나트륨, 1% (v/v) 벤질 알콜 (CIP 2 완충제)이 15분의 바람직한 접촉 시간에서 시험된 용액 중에서 가장 효율적인 것으로 밝혀졌다.

결론

세정 프로토콜 6으로부터의 조건은 평가된 모든 세정 프로토콜 중에서 가장 강건한 것으로 확인되었다. 세정 프로토콜 6은 유의한 압력 증가 없이 높은 수율 (92.9%)을 여전히 유지하면서 170 사이클에 도달할 수 있었으며 (도 1), 이는 유의한 오염 또는 잔류 단백질 A 침출 없는 충분한 세정을 나타낸다. 세정 프로토콜 1은 유의한 문제가 발생하기 전에 단지 69 사이클을 수행할 수 있었다. 69 사이클에서, 수율은 84.1%로 떨어지고 (도 1), 델타 칼럼 압력은 0.3 MPa로 증가하였으며, 이는 불충분한 세정을 나타낸다 (도 4). 보다 높은 수산화나트륨 농도가 CIP 2에 존재하는 경우 (세정 프로토콜 8; 도 4)를 제외하고, 세정 조건 중 하나로서 인산을 사용한 다른 세정 프로토콜들은 모두 수율의 큰 감소 또는 델타 칼럼 압력의 유의한 증가를 나타냈다 (도 1 및 4). 또한, CIP 2 (가성) 조건 없는 실행은 CIP 2 조건을 갖는 실행보다 더 빠르게 오염되는 경향이 있는 것으로 관찰되었다 (도 3). 이들 실행 중 어느 것도 100 사이클에 도달할 수 없었던 반면, CIP 2 조건을 이용한 7가지의 실행 중 6가지는 100 사이클을 초과할 수 있었다 (도 1, 2 및 4). 세정 프로토콜 10 및 11을 용리 풀에 대해 10 사이클마다 리간드 가수분해에 대해 시험하였다 (도 5). 세정 프로토콜 9 및 11의 최종 사이클에 대해, 모든 회수 및 재생 단계를 리간드 가수분해에 대해 시험하였다 (도 6). 용리 풀 내의 잔류 단백질 A 수준은 두 실행 모두 정상 규격 내에 있었다 (도 5). 그러나, 잔류 단백질 A 수준은 두 실행의 최종 사이클에 대한 CIP 및 중화 단계에서 현저하게 더 높았다 (도 6). 수율에서의 주목할만한 감소와 함께 높은 잔류 단백질 A 수준은 CIP 2 조건에서의 보다 높은 농도의 수산화나트륨에 대하여 리간드 가수분해가 요인임을 나타낸다.

Claims

크로마토그래피 수지를 아세트산 및 벤질 알콜을 포함하는 제1 완충제 및 수산화나트륨, 시트르산나트륨 및 벤질 알콜을 포함하는 제2 완충제와 접촉시키는 것
을 포함하는, 크로마토그래피 수지를 세정하는 방법.
제1항에 있어서, 제1 완충제가 인산을 함유하지 않는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 완충제가 약 150-200 mM 아세트산 및 약 1-3% (v/v) 벤질 알콜을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 완충제가 약 100-300 mM 수산화나트륨, 약 100-300 mM 시트르산나트륨, 및 약 0.5-1.5% (v/v) 벤질 알콜을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 완충제가 약 167 mM 아세트산을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 완충제가 약 2% (v/v) 벤질 알콜을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 완충제가 약 200 mM 수산화나트륨을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 완충제가 약 200 mM 시트르산나트륨을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 완충제가 약 1% (v/v) 벤질 알콜을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 완충제가 약 167 mM 아세트산 및 약 2% (v/v) 벤질 알콜을 포함하고, 제2 완충제가 약 200 mM 수산화나트륨, 약 200 mM 시트르산나트륨 및 약 1% (v/v) 벤질 알콜을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 완충제가 약 167 mM 아세트산 및 약 2% (v/v) 벤질 알콜을 포함하고, 제2 완충제가 약 100 mM 수산화나트륨, 약 200 mM 시트르산나트륨 및 약 1% (v/v) 벤질 알콜을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 중화 완충제를 제1 완충제 후에 및 제2 완충제 전에 크로마토그래피 수지에 통과시키는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 수지가 약 15분 이하 동안 제1 완충제 중에 유지되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 수지가 약 15분 이하 동안 제2 완충제 중에 유지되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 수지가 약 45분 이하 동안 제2 완충제 중에 유지되는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 재사용이 세정과 동일한 날에 수행되는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 수지가 크로마토그래피 칼럼에 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 수지가 친화성 수지인 방법.
제18항에 있어서, 크로마토그래피 수지가 지지체에 커플링된 친화성 리간드를 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 친화성 리간드가 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 단백질 A, 또는 그의 일부 또는 유도체인 방법.
제19항에 있어서, 친화성 리간드가 스타필로코쿠스 단백질 G, 또는 그의 일부 또는 유도체인 방법.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 수지 또는 지지체가 폴리비닐에테르, 폴리비닐알콜, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는 것인 방법.
폴리펩티드를 크로마토그래피 수지에 적용하는 단계 및 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 크로마토그래피 수지를 세정하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 정제하는 방법.
제23항에 있어서, 크로마토그래피 수지의 결합 능력이, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 50회 이상, 100회 이상, 150회 이상 또는 200회 이상 크로마토그래피 수지를 세정한 후에 보존되는 것인 방법.
제23항에 있어서, 크로마토그래피 수지 압력이, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 50회 이상, 100회 이상, 150회 이상 또는 200회 이상 크로마토그래피 수지를 세정하는 과정 동안 증가하지 않는 것인 방법.
제23항에 있어서, 폴리펩티드가 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 이뮤노글로불린인 방법.
제26항에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
제27항에 있어서, 항체가 IgG 모노클로날 항체인 방법.
제28항에 있어서, IgG 모노클로날 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 방법.
제23항에 있어서, 폴리펩티드가 효소, 호르몬, 융합 단백질, 면역-접합체, 시토카인 또는 인터류킨인 방법.
크로마토그래피 수지를 1회 이상의 세정 사이클로 세정하는 것을 포함하는 크로마토그래피 수지를 함유하는 친화성 크로마토그래피 칼럼을 세정하는 방법이며, 여기서 각각의 세정 사이클은 크로마토그래피 수지를 아세트산 및 벤질 알콜을 포함하는 제1 용액과 약 15분 이하 동안, 및 수산화나트륨, 시트르산나트륨 및 벤질 알콜을 포함하는 제2 용액과 약 15분 이하 동안 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
크로마토그래피 수지를 1회 이상의 세정 사이클로 세정하는 것을 포함하는 크로마토그래피 수지를 함유하는 친화성 크로마토그래피 칼럼을 세정하는 방법이며, 여기서 각각의 세정 사이클은 크로마토그래피 수지를 아세트산 및 벤질 알콜을 포함하는 제1 용액과 약 15분 이하 동안, 및 수산화나트륨, 시트르산나트륨 및 벤질 알콜을 포함하는 제2 용액과 약 45분 이하 동안 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제32항에 있어서, 제1 용액이 인산을 포함하지 않는 것인 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 사멸을 증가시키는 것인 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 단백질 오염을 감소시키는 것인 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 수율 붕괴를 감소시키는 것인 방법.