JP4391830B2 - 変異免疫グロブリン結合タンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、変異タンパク質の分野、さらに具体的には、親分子に比べて安定性の向上した変異タンパク質並びに本発明の変異タンパク質の製造方法に関する。本発明はまた本発明の変異タンパク質をアフィニティーリガンドとして使用するアフィニティー分離マトリックスにも関する。
バイオテクノロジー及び医薬品産業における数多くの用途では、夾雑物を確実に除去することに包括的な注意を払う必要がある。かかる夾雑物としては、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌、ウィルスを始めとする望ましくない生体分子や微生物のように、クロマトグラフィー法での固定相やマトリックスに吸着された非溶出性の分子である。かかる夾雑物のマトリックスからの除去は、マトリックスを再生して使用するため、所望生成物の最初の溶出の後に行われるのが普通である。かかる除去では通常クリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）として知られる操作法を行い、固定相から夾雑物を溶出することのできる試薬が用いられる。かかる試薬として多用されるものに、固定相に流されるアルカリ性溶液がある。現時点で最も多用されている洗浄消毒剤はＮａＯＨであり、その濃度は汚染の程度及び性質に応じて０．１Ｍから例えば１Ｍの範囲である。ＮａＯＨは微生物、タンパク質、脂質及び核酸のような夾雑物の指数関数的減少を達成する効果的なＣＩＰ剤として知られている。ＮａＯＨのもう一つの利点は、特段の処理を施さずに容易に廃棄できる点である。しかし、この方法ではマトリックスが１３を超えるｐＨ域に暴露される。タンパク系アフィニティーリガンドを有する多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに対して、かかるアルカリ性環境は極めて過酷な条件であり、そのため高ｐＨ域でのリガンドの不安定性による容量低下を生じる。
そこで、アルカリ性ｐＨ域に対する耐性の向上した人工タンパク質リガンドの開発に集中して多大な研究が行われてきた。例えば、Ｇｕｌｉｃｈ他（Ｓｕｓａｎｎｅ Ｇｕｌｉｃｈ， Ｍａｒｔｉｎ Ｌｉｎｈｕｌｔ， Ｐｅｒ−Ａｋｅ Ｎｙｇｒｅｎ， Ｍａｔｈｉａｓ Ｕｈｌｅｎ， Ｓｏｐｈｉａ Ｈｏｂｅｒ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８０（２０００），１６９−１７８： Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｏｗａｒｄｓ ａｌｋａｌｉｎｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｃａｎ ｂｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄ）は、アルカリ環境でのストレプトコッカスのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の安定性を改善するためのタンパク質工学を示唆している。従前、アルカリ条件下でのアスパラギン及びグルタミン残基の脱アミド化及びペプチド骨格の切断のような構造的修飾がアルカリ性溶液処理時の活性損失の主な原因であり、上記２種類のうちアスパラギンが最も感受性が高いことが判明している（Ｇｅｉｇｅｒ，Ｔ．， ａｎｄ Ｓ．Ｃｌａｒｋｅ． １９８７． Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ， Ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｒａｃｅｍｉｚａｔｉｏｎ ａｔ Ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ａｎｄ Ａｓｐａｒｔｙｌ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：７８５−７９４）。さらに、脱アミド化速度が極めて特異的でコンホーメーション依存性であることも知られており（Ｋｏｓｋｙ，Ａ．Ａ．， Ｕ．Ｏ．Ｒａｚｚａｑ， Ｍ．Ｊ．Ｔｒｅｕｈｅｉｔ， ａｎｄ Ｄ．Ｎ．Ｂｒｅｍｓ． １９９９． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｘ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｓｎ ｒｅｓｉｄｕｅｓ： ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｖａｒｙｉｎｇ ｈｅｌｉｃｉｔｙ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ８：２５１９−２５２３； Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ，Ａ．Ａ． １９８８． Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｓ ａ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２４０：１９１−１９４；並びにＬｕｒａ，Ｒ．， ａｎｄ Ｖ．Ｓｃｈｉｒｃｈ． １９８８． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２７：７６７１−７６７７）、脱アミド化の最短の半減期は−アスパラギン−グリシン−及び−アスパラギン−セリンという配列に付随している。そこで、Ｇｕｌｉｃｈ他は天然ＡＢＤの４つのアスパラギン残基すべてをロイシン（１残基）、アスパラギン酸（２残基）及びリジン（１残基）に置換したＡＢＤの変異体を作成している。さらに、Ｇｕｌｉｃｈ他の報文では、これらの変異体は天然タンパク質と同様の目的タンパク結合挙動を示し、人工リガンドを有するアフィニティーカラムはアルカリ条件に繰返し曝露した後でも、非人工親リガンドを用いて調製したカラムよりも高い結合容量を示す。そこで、構造及び機能に有意の影響を与えることなく４つのアスパラギン残基をすべて置換できると結論される。
このように、Ｇｕｌｉｃｈ他の研究は、ストレプトコッカスアルブミン結合ドメインで行われている。しかし、例えば医薬品用途などでの、免疫グロブリンのような他の分子の精製プロトコルではアフィニティークロマトグラフィーも用いられている。アフィニティー試薬の中で特に興味深いものは抗体分子の不変部に特異的に結合できるタンパク質であり、かかる相互作用は抗体の抗原結合特異性とは無関係である。かかる試薬は例えば血清又は血漿製剤又は培養細胞由来の原料のような様々な試料からアフィニティークロマトグラフィーで免疫グロブリンを回収するのに広く使用できる。かかるタンパク質の具体例は様々な種のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ及びＦａｂ部分に結合できるドメインを含んだスタフィロコッカスのプロテインＡである。
スタフィロコッカスのプロテインＡ（ＳｐＡ）系試薬は、その高い親和性と選択性のため、バイオテクノロジー分野で（例えば抗体の捕獲及び精製並びに検出用のアフィニティークロマトグラフィーに）広く用いられている。現在、ＳｐＡ系アフィニティー媒体はおそらく培養細胞由来の工業原料を始めとする各種試料からのモノクローナル抗体及びそのフラグメントの単離に最も広く用いられているアフィニティー媒体と思われる。そこで、プロテインＡリガンドを有するマトリックスは各種市販されており、例えば天然プロテインＡの形態のもの（例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））、組換えプロテインＡからなるもの（例えばｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））などがある。さらに具体的には、上記の市販組換えプロテインＡ製品で行われている遺伝子操作は、担体への結合を促進することを目的としたものである。
Ｓｕｓａｎｎｅ Ｇｕｌｉｃｈ， Ｍａｒｔｉｎ Ｌｉｎｈｕｌｔ， Ｐｅｒ−Ａｋｅ Ｎｙｇｒｅｎ， Ｍａｔｈｉａｓ Ｕｈｌｅｎ， Ｓｏｐｈｉａ Ｈｏｂｅｒ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８０ （２０００）， １６９−１７８ Ｇｅｉｇｅｒ，Ｔ．， ａｎｄ Ｓ．Ｃｌａｒｋｅ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：７８５−７９４（１９８７） Ｋｏｓｋｙ，Ａ．Ａ．， Ｕ．Ｏ．Ｒａｚｚａｑ， Ｍ．Ｊ．Ｔｒｅｕｈｅｉｔ， ａｎｄ Ｄ．Ｎ．Ｂｒｅｍｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ８：２５１９−２５２３（１９９９） Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ，Ａ．Ａ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２４０：１９１−１９４（１９８８） Ｌｕｒａ，Ｒ．， ａｎｄ Ｖ．Ｓｃｈｉｒｃｈ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２７：７６７１−７６７７（１９８８）
従って、本分野では、免疫グロブリンに（特にそのＦｃフラグメントを介して）結合できるタンパク質リガンドであって、アルカリ試薬を用いた１回以上の洗浄作業に耐性を示すタンパク質リガンドを得ることが求められている。
本発明の目的の一つは、親分子に比べ、高ｐＨ域で向上した安定性を示し、アルカリ性条件下での洗浄に対して向上した耐性を示す変異免疫グロブリン結合タンパク質を提供することである。
本発明の別の目的は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンのＦｃフラグメントに特異的に結合するタンパク質リガンドを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、アルカリ性条件下で親分子よりも長時間親和性が保持されるタンパク質リガンドを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンに好ましくはそのＦｃフラグメントを介して結合できる変異タンパク質リガンドを含むアフィニティー分離マトリックスであって、該リガンドがアルカリ性条件下で親分子リガンドよりも洗浄に対して向上した耐性を示すアフィニティー分離マトリックスを提供することである。
上記の１以上の目的は、各請求項に記載の構成によって達成することができる。
定義
本明細書中では、「タンパク質」という用語はタンパク質だけでなく、そのフラグメントも意味する。そこで、３次元構造を示すアミノ酸の鎖は「タンパク質」という用語に包含され、タンパク質フラグメントも同様に包含される。
本明細書中では、タンパク質の「機能的変異体」という用語は、機能（本発明に関しては親和性及び安定性と定義される）が本質的に保持されている変異体タンパク質をいう。そこで、当該機能とは無関係の１以上のアミノ酸が置換されていてもよい。
本明細書中では、「親分子」という用語は、本発明の変異が導入される前の対応タンパク質をいう。
「構造的安定性」という用語は分子の３次元形態の健全性をいい、「化学的安定性」という用語は化学的分解に耐えることができることをいう。
「Ｆｃフラグメント結合」タンパク質という用語は、当該タンパク質が免疫グロブリンのＦｃフラグメントに結合することができることを意味する。ただし、Ｆｃフラグメント結合タンパク質が免疫グロブリンのＦａｂ領域のような他の領域にも結合できることを排除するものではない。
本明細書中では、アミノ酸について、その正式名称で記載しないときは、慣用の一文字略号で表す。
本明細書中では、変異は置換位置の番号の前に野生型又は非変異型アミノ酸を付し、その後に変異したアミノ酸を付して定義する。例えば、２３位のアスパラギンのスレオニンへの変異はＮ２３Ｔと記載する。
発明の詳細な説明
一つの態様では、本発明は、免疫グロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができる免疫グロブリン結合タンパク質であって、親免疫グロブリン結合タンパク質の１以上のアスパラギン残基がグルタミン以外のアミノ酸に変異しており、該変異によってアルカリ性ｐＨ域での化学的安定性が親分子に比べて向上しているタンパク質に関する。向上した安定性とは、以下で説明する通り、免疫グロブリンに対する変異タンパク質の当初の親和性が長期にわたって本質的に保持されることを意味する。
本発明で達成される目的タンパク質に対する親和性の保持は、一つには、変異タンパク質の空間的コンホーメーションが保持されていることに起因する。免疫グロブリンに対する変異タンパク質の親和性は、例えば、以下の実験の部で説明するように、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００標準セットアップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社（スウェーデン、ウプサラ））を用いたバイオセンサー法によって試験することができる。これに関して、「本質的に」保持という用語は、変異タンパク質の示す免疫グロブリンに対する親和性が親分子と同じオーダーであることをいう。従って、初期段階では、変異タンパク質の結合容量は親分子の結合容量に匹敵する。ただし、後述の変異タンパク質の化学的安定性（経時的に保持される）のため、アルカリ性環境下での結合容量の低下は親分子よりも遅い。上記環境はアルカリ性（上昇したｐＨ値を意味する。）と定義することができ、例えば約１０を上回るｐＨから約１３又は１４まで、例えば１０〜１３又は１０〜１４であり、アルカリ性条件と概括的に記載される。或いは、条件はＮａＯＨ濃度で定義することもでき、その濃度は約１．０Ｍ以下とすることができ、例えば０．７Ｍ、特に約０．５Ｍ、従って７〜１．０Ｍの範囲内である。
本発明の変異タンパク質の向上した化学的安定性は当業者が容易に確認することができ、例えば、以下の実験の部で説明するように、濃度０．５ＭのＮａＯＨでの通常の処理によって確認できる。これに関して、上記と同様、「向上した」安定性とは、初期安定性が親分子で達成されるものよりも長期間保持されることを意味する。同様の変異がストレプトコッカスのアルブミン結合ドメインに関して報告されているが（Ｇｕｌｉｃｈ他，上掲）、アルカリ性環境でのタンパク質の分解し易さに関与する脱アミド化の速度は配列及びコンホーメーションに高度に依存していることがよく知られている。ＡＢＤのアミノ酸配列はスタフィロコッカスのプロテインＡの個々のドメインのような免疫グロブリン結合タンパク質とアミノ酸配列の類似性が全くないので、Ｇｕｌｉｃｈ他の教示内容が免疫グロブリン結合タンパク質にも適当できるとは思えない。これに対して、免疫グロブリン結合タンパク質の１以上のアスパラギン残基の変異が向上した化学的安定性をもたらし、ｐＨ約１０超、例えば約１３又は１４以下の環境で分解速度が低減するという予想外の知見を示したのは本発明が最初である。
このように、本発明は、ヒトのような哺乳類の種に由来するＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＧのような免疫グロブリンの選択的吸着用のアフィニティークロマトグラフィーにおけるタンパク質リガンドとして有用な変異タンパク質を提供する。吸着の目的は、純粋な免疫グロブリン画分又は免疫グロブリンの除去された液体のような精製標品の製造であってもよいし、或いは試料中の免疫グロブリンの存在の検出であってもよい。本発明のリガンドは従来のアルカリ洗浄に長期間耐える十分な化学的安定性を示し、そのため当該リガンドはカラムの再生を要する費用効果的な大規模操作のための有力な候補となる。
従って、本発明のタンパク質においては、１以上のアルギニン（Ｎ）残基がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）又はプロリン（Ｐ）、或いは不都合な脱アミド化及び異性化を起こし難い修飾アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸に変異している。別法では、１以上のアルギニン（Ｎ）残基がグルタミン（Ｑ）に変異している。
免疫グロブリン結合タンパク質はスタフィロコッカスのプロテインＡ（ＳｐＡ）又はストレプトコッカスプロテインＧ（ＳｐＧ）のような天然免疫グロブリン結合容量を有するタンパク質であればどんなものでもよい。他のかかるタンパク質の総説については、例えばＫｒｏｎｖａｌｌ，Ｇ．， Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｋ． Ｒｅｃｅｐｔｉｎｓ： ａ ｎｏｖｅｌ ｔｅｒｍ ｆｏｒ ａｎ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔ． １９９９ Ｊａｎ−Ｆｅｂ； １２（１）：３８−４４を参照されたい。
一実施形態では、本発明は、免疫グロブリン結合タンパク質の少なくとも結合領域を含んでいて、アスパラギン変異の少なくとも１つが上記領域に存在する変異タンパク質である。従って、この実施形態では、本発明の変異タンパク質は、アスパラギン変異が２１位にないことを条件として、配列番号１又は２で規定される配列の約７５％以上、例えば約８０％以上、好ましくは約９５％以上を含む。
本明細書において、配列番号１はＳｐＡのＢドメインのアミノ酸配列を規定し、配列番号２はプロテインＺとして知られるタンパク質を定義する。プロテインＺは２９位のグリシンがアラニンに置換されたＳｐＡのＢドメイン由来の合成構築物であり、例えばＴｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（Ｍ．Ｃ．Ｆｌｅｃｋｉｎｇｅｒ及びＳ．Ｗ．Ｄｒｅｗ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）８−２２頁のＳｔａｈｌ他， １９９９： Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇなどの文献に開示されている。さらに、プロテインＺはアフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとしても使用されている。ただし、プロテインＺはＳｐＡのＢドメインに比べれるとＮａＯＨ以外の何種類かの化学物質に対して向上した化学的安定性を示すものの、高ｐＨ条件では、経済的な工業プラントで望まれる何回ものＣＩＰ再生工程に耐えれるほど安定ではない。
一実施形態では、上述の変異タンパク質は配列番号１又は２で規定されるアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。ここで、「機能的変異体」という用語には、免疫グロブリンに対する変異タンパク質の親和性や高ｐＨ環境でのその向上した化学的安定性に影響しないアミノ酸位置での１以上の変異をさらに含む類似の配列が含まれる。
好適な実施形態では、本発明の変異はＮ２３Ｔ、Ｎ２３ＴとＮ４３Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ６Ａ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ１１ＳとＮ２３Ｔ、及びＮ６ＡとＮ２３Ｔからなる群から選択され、親分子が配列番号２で規定される配列を含むものである。上述の通り、アルカリ性条件下で長期にわたって高い結合容量をもつリガンドとして有用な変異タンパク質を得るため、２１位のアスパラギン残基の変異は避ける。一実施形態では、３位のアスパラギン残基は変異しない。
最も好適な実施形態では、本発明のタンパク質において、ロイシン残基とグルタミン残基との間に位置するアスパラギン残基が例えばスレオニン残基に変異している。そこで、一実施形態では、配列番号２で規定される配列の２３位のアスパラギン残基が、例えばスレオニン残基に変異している。特定の実施形態では、配列番号２で規定される配列の４３位のアスパラギン残基も例えばグルタミン酸に変異している。アミノ酸番号４３が変異した実施形態では、当該変異をＮ２３Ｔのような別の１以上の変異と組み合わせるのが最も好適であると考えられる。
ＳｐＡのＢドメイン及びプロテインＺの様々なアスパラギン残基が変異タンパク質の親和性及び安定性に異なった寄与をしているとする本発明の知見は、特にＡＢＤのすべてのアスパラギン残基を何の内的区別もなく変異させることができると結論付けたＧｕｌｉｃｈ他の上述の教示内容に鑑みれば、全く予想外である。
そこで、本発明には上述の単量体型変異タンパク質が包含される。ただし、かかるタンパク質単量体を組み合わせて二量体、三量体、四量体、五量体のような多量体とすることもできる。従って、本発明の別の態様は、本発明の１以上の変異タンパク質を他の１以上の単位、好ましくは同じく本発明の変異タンパク質と共に含む多量体である。本発明は例えば２つの反復単位を含む二量体である。
一実施形態では、本発明の多量体は好ましくは０〜１５個（例えば５〜１０個）のアミノ酸で連結した複数の単量体単位を含む。かかる連結の性状は好ましくはタンパク質単位の空間的コンホーメーションを脱安定化しないものである。さらに、連結は好ましくはアルカリ環境下で変異タンパク質単位の特性を損なわないように十分安定であるべきである。
現時点での最良の実施形態においては、多量体は、Ｎ２３Ｔ変異を含むプロテインＺの四量体であり、連結単位の長さは５〜１０アミノ酸である。一実施形態では、本発明の多量体は、ＶＤＡＫＦＮ−Ｚ（Ｎ２３Ｔ）−ＱＡＰＫＶＤＡＫＦＮ−Ｚ（Ｎ２３Ｔ）ＱＡＰＫＣという配列を含む。別の実施形態では、多量体はＶＤＡＫＦＤ−Ｚ（Ｎ２３Ｔ）−ＱＡＰＫＶＤＡＫＦＤ−Ｚ（Ｎ２３Ｔ）−ＺＱＡＰＫＣという配列を含む。
特定の実施形態では、本発明の多量体はスタフィロコッカスのプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの１個以上も含む。この実施形態では、ループ領域に位置するアスパラギン残基を加水分解安定性の高いアミノ酸に変異させるのが好ましい。構造的安定性の点で好ましい実施形態では、配列番号１の２９位のグリシン残基も好ましくはアラニン残基に変異させる。また５２位のアスパラギン残基はプロテインＡ分子のαへリックス二次構造含量に寄与していることが判明したので、構造的安定性のため５２位のアスパラギン残基の変異は避けるのが好ましい。
別の態様では、本発明は上述の変異タンパク質又は多量体をコードする核酸に関する。従って、本発明には、既存のバイオテクノロジー的方法での組換え宿主内での発現による変異タンパク質の生産に使用できるＤＮＡ配列が包含される。そこで、本発明の別の態様は、上述の変異タンパク質の産生を可能にする発現系である。例えば以下の実験の部で説明するように、細菌宿主を好都合に使用できる。別の実施形態では、本発明は本発明に係る変異タンパク質を発現するように遺伝子操作された細胞系統である。このための方法に関しては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ他， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ）， ｖｏｌｓ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）を参照されたい。
当然、所望の配列が規定されていれば、本発明の変異タンパク質は合成法で製造することもできる。
従って、本発明には、本発明の変異タンパク質又は多量体を製造するバイオテクノロジー的方法又は合成法が包含される。
別の実施形態では、本発明は、アフィニティー分離用のマトリックスであって、１以上のアスパラギン残基がグルタミン以外のアミノ酸に変異した免疫グロブリン結合タンパク質を含む複数のリガンドが固体担体に結合したマトリックスに関する。本発明のマトリックスは、断続的アルカリ洗浄による２回以上の分離に際して、リガンドとして親分子を含むマトリックスに比べ、向上した結合容量を示す。変異タンパク質リガンドは好ましくはＦｃフラグメント結合タンパク質であり、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＧの選択的結合に使用できる。
本発明のマトリックスは、上述のいずれかの実施形態に係る変異タンパク質をリガンドとして含む。最も好ましい実施形態では、固体担体に存在するリガンドは上述の多量体を含む。
本発明のマトリックスの固体担体は、周知のもののうち適当であればどんな種類のものでもよい。従来のアフィニティー分離マトリックスは多くは有機質のものであり、用いる水性媒体に親水性表面が露出された高分子系のもの、つまりその外表面に（及び存在する場合には内表面にも）ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシアミド（−ＣＯＮＨ2、或いはＮ置換型）、アミノ（−ＮＨ2、或いは置換型）、オリゴ又はポリエチレンオキシ基が露出された高分子系のものである。一実施形態では、高分子は例えばデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロースのような多糖類系のものであり、安定な多孔性及び剛性を与えるため、好適には例えばビスエポキシド、エピハロヒドリン、１，２，３−トリハロ置換低級炭化水素で架橋したものである。最も好ましい実施形態では、固体担体は多孔性アガロースビーズである。本発明で用いられる担体は逆懸濁ゲル化（Ｓ．Ｈｊｅｒｔｅｎ： Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３−３９８（１９６４））のような常法で容易に製造できる。或いは、ベースマトリックスはセファロース（商標）ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））のような市販品である。大規模分離に特に好適な一実施形態では、担体はその剛性が増大し、もって高い流速に対するマトリックスの安定性が増すように改変される。
別法では、固体担体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドのような合成ポリマー系である。ジビニル及びモノビニル置換ベンゼン系マトリックスのように疎水性ポリマーの場合には、上述の親水性の基が周囲の水性液体に露出されるようにマトリックスの表面を親水化処理することが多い。かかるポリマーは常法に従って容易に製造され、例えば“Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ．Ａｒｓｈａｄｙ： Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ'Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９），
７０−７５ （１９８８））を参照されたい。或いは、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））のような市販品も使用される。
別の代替法では、本発明の固体担体は、例えばシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機担体を含む。
さらに別の実施形態では、固体担体は表面、チップ、キャピラリー又はフィルターのような別の形態をとる。
本発明のマトリックスの形状に関しては、一実施形態では、マトリックスは多孔性モノリスの形態である。別の実施形態では、マトリックスはビーズ又は粒子形態であり、多孔性でも非多孔性でもよい。ビーズ又は粒子形態のマトリックスは充填ベッドとして使用することもできるし、懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ）及び純然たる懸濁物として知られるものが包含され、粒子又はビーズが自由に運動できる。モノリス、充填床及び流動層の場合、分離手順は一般に濃度勾配による従来のクロマトグラフィー法に従う。純然たる懸濁物の場合は、回分法が用いられる。
リガンドは、例えばリガンドに存在するアミノ基及び／又はカルボキシ基を利用した従来のカップリング法で担体に結合してもよい。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などがよく知られたカップリング試薬である。担体とリガンドとの間にはスペーサーとして知られる分子を導入してもよく、これによってリガンドの利用性が向上し、担体へのリガンドの化学的カップリングが促進される。別法として、リガンドは物理的吸着又は生物特異的吸着のような非共有結合で担体に結合させることもできる。
好適な実施形態では、本発明のリガンドはチオエステル結合で担体に結合している。かかるカップリングの実施方法は当技術分野で周知であり、標準的な手法及び機器を用いて当業者が容易に実施できる。好適な実施形態では、まず、後のカップリングのための末端システイン残基をリガンドに設ける。適切な精製工程も当業者が容易に実施できる。
上述の通り、免疫グロブリンへの親和性、即ち、本発明のリガンドの結合特性、畢竟マトリックスの容量は、アルカリ性物質での処理による経時的変化は本質的にみられない。従来、アフィニティー分離マトリックスのクリーニング・イン・プレイス処理に使用されるアルカリ性物質はＮａＯＨであり、その濃度は０．７５Ｍ以下、例えば０．５Ｍである。
そこで、本発明のマトリックスは、上述の変異のため、０．５Ｍ ＮａＯＨで７．５時間処理した後の結合容量の低下が約７０％未満、好ましくは約５０％未満、さらに好ましくは約３０％未満（例えば約２８％）であると特徴付けることもできる。
別の態様では、本発明は、本発明に係る変異タンパク質、多量体又はマトリックスを使用してＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンを単離する方法である。そこで、本発明は上述の変異タンパク質又は多量体又はマトリックスへの吸着によって液体から１種以上の目的化合物を分離するクロマトグラフィー法を包含する。分離された化合物又は液体のいずれが所望の生成物であってもよい。そこで、本発明のこの態様は、広く用いられている周知の分離技術であるアフィニティークロマトグラフィーに関する。簡単に説明すると、最初の工程では、目的化合物（好ましくは上述の抗体）を含有する溶液を、分離マトリックス上に存在するリガンドに目的化合物が吸着するような条件下で、マトリックスに流す。かかる条件は、例えばｐＨ及び／又は塩濃度（即ち、溶液中のイオン強度）によって制御される。マトリックスの容量を超えないように注意すべきであり、換言すれば、流速は十分な吸着が起こるように十分遅くすべきである。この工程では、溶液の他の成分は原則としてスムーズに通過する。保持及び／又は緩く結合した物質を除去するため、適宜、マトリックスを水溶液で洗浄してもよい。本発明のマトリックスは最も好適には、上述の通りアルカリ性物質を用いた洗浄工程と共に使用される。次の工程では、溶出液といわれる第二の溶液を、目的化合物の脱着つまり遊離が起こる条件下で、マトリックスに流す。かかる条件は概して例えばｐＨ、塩濃度（即ちイオン強度）、疎水性などの変化でもたらされる。様々な溶出法が知られており、例えば勾配溶出及び段階的溶出が挙げられる。溶出は、マトリックス上の所望抗体に置き換わる競合物質を含む第二の溶液で達成することもできる。アフィニティークロマトグラフィーの原理に関する総説は、例えばＷｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．，Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．２０００に記載されている。アフィニティークロマトグラフィーに関する概説はＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７： １−６に記載されている。
別の実施形態では、本発明の変異タンパク質は、その３次元構造に類似した有機化合物をモデリングするプロセスのリード化合物として使用される。こうしてモデリングした化合物はミメティックとして知られる。ミメティック設計、合成及び試験は膨大な数の分子の無作為スクリーニングを避けるのに使用できる。簡単に説明すると、かかる方法では免疫グロブリン結合性のような特性に必須及び及び／又は重要なタンパク質部分を決定する。そうした部分が同定されたら、分光分析法、Ｘ線回折データ及びＮＭＲのような情報源から得られたデータを用いて、その物理的特性（例えば立体化学、結合、大きさ、電荷など）によってその構造をモデリングする。このプロセスではコンピューター分析、類似性マッピングその他の技術を使用できる。この種のプロセスで重要な点は、化合物の合成の容易さ、薬理学的妥当性、インビボ分解パターンなどである。
最後に、本発明は上述の変異タンパク質のその他の用途、例えば医療目的（診断など）の分析法、アレイなどでの使用も包含する。
図面の詳細な説明
図１は、ＳｐＡの５つの相同ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣ）のアミノ酸配列比較を示す。横線部はアミノ酸が同一であることを示す。３つのボックスはＴａｓｈｉｒｏと共同研究者（Ｔａｓｈｉｒｏ他，１９９７）が決定したＺwtのαへリックスを示す。Ｂドメインのアスパラギン残基と１箇所のグリシン残基で置換したものには図中下線を付した。さらに、ＺｗｔとＺ（Ｎ２３Ｔ）のアミノ酸配列比較も示す。
図２は、本発明の変異タンパク質のアルカリ処理（クリーニング・イン・プレイス）後に得られた結果を脱安定化プロテインＺと対比して示す。通常のアフィニティークロマトグラフィー法で繰返しＣＩＰ処理した後の容量の比較である。洗浄剤として０．５Ｍ ＮａＯＨを使用した。プロトコルは１６回実施し、アルカリ洗浄の時間は各回につき３０分であった。図２ａはＺ（Ｆ３０Ａ）及びその変異体の不活性化パターンを示し、図２ｂはＺｗｔ及びＺ（Ｎ２３Ｔ）の不活性化パターンを示す。
図３は、実施例４（ａ）に記載のベクターへの挿入後のＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）−Ｃｙｓをコードする遺伝子を示す。変異部位には＊を付した。
図４は、実施例４（ａ）に記載のＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）−Ｃｙｓをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＡＹ９１のプラスミド地図を示す。
図５は、実施例４（ｂ）に記載のベクターへの挿入後のＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）をコードする遺伝子を示す。変異部位には＊を付した。
図６は、実施例５に記載のＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）−Ｃｙｓの四量体を発現するプラスミドｐＡＹ１００のプラスミド地図の一例を示す。
図７は、実施例６のＳＰＡプロモーター及びシグナル配列を有するベクターへのＫｐｎＩ部位導入用アダプターを示す。
図８は、実施例６に記載の、ＫｐｎＩ部位を含むアダプターの導入に用いられるＳＰＡプロモーター及びシグナル配列を含むプラスミドｐＡＹ１０４を示す。
図９は、実施例６のアダプター挿入後に得られたプラスミドｐＡＹ１２８を示す。
図１０は、実施例６の構築クローニングカセットを示し、元のアダプターには下線を付した。
図１１は、実施例６に記載のＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）−Ｃｙｓ−四量体の挿入後のプラスミドｐＡＹ１１４を示す。
図１２は、実施例７の構築クローニングカセットを示し、元のアダプターには下線を付した。
図１３は、実施例７のアダプター挿入後に得られたプラスミドｐＡＹ１２９を示す。
図１４は、実施例７に記載のＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）四量体−Ｃｙｓの挿入後のプラスミドｐＡＹ１２５を示す。
図１５は、実施例８に記載の実験で得られたクロマトグラムであり、第１のピークはフロースルー物質に相当し、第２のピークは溶出ｈＩｇＧに相当する。
図１６は、実施例８のマトリックスの残存動的結合容量を示すグラフである。上から下に順次、Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）二量体−Ｃｙｓ、Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ）二量体−Ｃｙｓ、Ｚ（Ｎ２３Ｔ）二量体−Ｃｙｓ及びＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｋ４Ｇ）二量体−Ｃｙｓを示す。ソフトウエアの問題のため、Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ）二量体−Ｃｙｓの最後の２測定点が欠けている。
実験の部
以下、実施例によって本発明を説明するが、これらは例示のためのものであり、各請求項に規定される本発明の技術的範囲を限定するものではない。以下及び明細書のいずれかの項で引用した文献の開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。
この部では、Ｚはその本来の形態においてアルカリ処理に対して十分ではないがかなりの安定性を既に有しているため、変異による安定性の僅かな変化を実験室での試験で評価するのは困難であると思われた。そこで、サプレッサー変異法（Ｋｏｔｓｕｋａ，Ｔ．， Ｓ．Ａｋａｎｕｍａ， Ｍ．Ｔｏｍｕｒｏ， Ａ．Ｙａｍａｇｉｓｈｉ， ａｎｄ Ｔ．Ｏｓｈｉｍａ． １９９６． Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｒｅｍｅ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， ｂｙ ａ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８：７２３−７２７；並びにＳｉｅｂｅｒ，Ｖ．， Ａ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ａｎｄ Ｆ．Ｘ．Ｓｃｈｍｉｄｔ． １９９８． Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ａ ｐｈａｇｅ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． １６：９５５−９６０）を用いて、構造的安定性の低下したＺドメインの変異体を得た。この方法では、アルカリ安定性の検討に関して後で追加の変異を導入するための土台として、本明細書中ではＺ（Ｆ３０Ａ）と呼ぶ脱安定化プロテインＺの変異体（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ他，１９９３，上掲）を使用した。Ｆ３０はＦｃ結合に関与していないので、この変異体の結合特性は天然プロテインＺと同様である。
また、Ｚｗｔは野生型Ｚドメインをいい、Ｆ３０Ａ置換は含んでいない。
実験法
Ｚドメインのどのアスパラギンがアルカリ条件での不安定性の原因となるかを分析するため、変異分析を行った。Ｚドメインはアルカリ性条件に対して十分でないがかなりの安定性を既に有していることから、Ｚドメインのアルカリ安定性の向上を検出できるように、Ｚ（Ｆ３０Ａ）変異体を使用することにした。Ｚ（Ｆ３０Ａ）はＩｇＧに対して野生型と同様の親和性を有しているが、疎水性コアに本来関与するアミノ酸の変異のため、構造的安定性が大幅に低下していることが既に報告されている（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ他，１９９３，上掲； Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ，Ｌ．， Ｂ．Ｐｅｒｓｓｏｎ， Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｒ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｍ．Ｕｈｌｅｎ， ａｎｄ Ｂ．Ｎｉｌｓｓｏｎ． １９９５． Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｄｏｍａｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ Ｆｃ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． ８：２７０−２７８）。Ｚドメインは８個のアスパラギン残基（Ｎ３、Ｎ６、Ｎ１１、Ｎ２１、Ｎ２３、Ｎ２８、Ｎ４３及びＮ５２）を含む５８このアミノ酸からなる３つのへリックス束である（図１）（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．， Ｔ．Ｍｏｋｓ， Ｂ．Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｌ．Ａｂｒａｈｍｓｅｎ， Ａ．Ｅｌｍｂｌａｄ， Ｅ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ， Ｃ．Ｈｅｎｒｉｃｈｓｏｎ， Ｔ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ， ａｎｄ Ｍ．Ｕｈｌｅｎ． １９８７． Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １：１０７−１１３）。アルカリ条件での脱活性化に対する各アスパラギンの効果を評価するため、これらの残基の７個を他のアミノ酸で置換した。Ｎ３はドメインのフレキシブルなアミノ末端に位置しているので、これは検討から除外した。このアミノ酸の分解は単量体リガンドの活性には影響しないと推量され、保持活性を測定する本試験では検出可能とは考えられなかった。さらに、このアミノ酸はドメインの構造化部分の外に位置しているので、おそらくはプロテインＡ類似分子を得るためのドメインの多量体化の際に容易に置換できると思われる。タンパク質設計を容易にするため、プロテインＡの他のドメイン由来の相同配列との比較を行った（図１）（Ｇｕｌｉｃｈ他，２０００ａ）。比較から、アスパラギン１１をセリンで、アスパラギン２３をスレオニンで、最後にアスパラギン４３をグルタミン酸で置換することにした。アスパラギン６はアラニンで置換したが、その理由は、相同配列にみられるもう一方の置換がアスパラギン酸であり、同じくアルカリ性条件で感受性であることが報告されているからである。プロテインＡの５つのドメインはすべて他の位置（２１、２８、５２）にアスパラギンを有している。従って、これらはアラニンで置換した。
実施例１：変異プロテインＺの変異導入、発現及び精製
材料及び方法
部位特異的変異導入は二段階ＰＣＲ法を用いて行った（Ｈｉｇｕｃｈｉ他，１９８８）。プラスミドｐＤＨＺＦ３０Ａ（Ｃｅｄｅｒｇｒｅ他，１９９３）を鋳型として用いた。種々のアスパラギン置換及びＡ２９Ｇ置換をコードするオリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｒａｃｔｉｖａ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社（ドイツ、ウルム））で合成した。ベクターｐＤＨＺ（Ｊａｎｓｓｏｎ他，１９９６）へのクローニングには制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社（米国ニューヨーク州アムハースト）を使用し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１９８７）に従って実施した。ｐＴｒｐＺを作成するため、プラスミドｐＫＮ１（Ｎｏｒｄ他，１９９５）を鋳型として用いてＺドメインをＰＣＲ法で増幅した。フラグメントは制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで処理し、同じ制限酵素で処理したｐＴｒｐＡＢＤＴ１Ｔ２（Ｋｒａｕｌｉｓ他，１９９６）に連結した。ＭｅｇａＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシーケンシングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））を用いて挿入フラグメントの正確な配列を検証した。ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ他，１９７７）によるサイクル配列決定プロトコルには、ＭｅｇａＢＡＣＥターミネーター法（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））を供給元の推奨法に従って使用した。クローニング操作では、大腸菌ＲＲ１ΔＭ１５株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国マサチューセッツ州ロックビル））を用い、各種遺伝子産物の発現には０１７株（Ｏｌｓｓｏｎ，Ｍ．Ｏ．， ａｎｄ Ｌ．Ａ．Ｉｓａｋｓｓｏｎ． １９７９． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｐｓＤ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｉ： Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｖａｒｉｏｕｓ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ４． Ｍｏｌｅｃ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １６９：２５１−２５７）を用いた。
Ｚ（Ｆ３０Ａ）及びその種々の構築物の作成及び精製はＧｕｌｉｃｈ（Ｇｕｌｉｃｈ他，２０００ｂ、上掲）に記載のプロトコルに従って実施した。Ｚ及びｐＺ（Ｎ２３Ｔ）の作成はＫｒａｕｌｉｓ他（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｐ．Ｊ．， Ｐ．Ｊｏｎａｓｓｏｎ， Ｐ．−Ａ．Ｎｙｇｒｅｎ， Ｍ．Ｕｈｌｅｎ， Ｌ．Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ， Ｂ．Ｎｉｌｓｓｏｎ， ａｎｄ Ｊ．Ｋｏｒｄｅｌ． １９９６． Ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎＧ ｉｓ ａ ｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｅｌ： ａ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ＮＭＲ ｓｔｕｄｙ． ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ． ３７８：１９０−１９４）に記載の通り実施した。関連画分は凍結乾燥した。タンパク量は２８０ｎｍでの吸光度測定によって次の比吸光係数ａ（１ｇ−１ｃｍ−１）：Ｚについては０．１５６；Ｚ（Ｎ２３Ｔ）については０．１６９；Ｚ（Ｆ３０Ａ）、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ４３Ｅ）、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ２３Ｔ，Ｎ４３Ｅ）については０．１５７；Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ６Ａ）、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ１１Ｓ）、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ２１Ａ）、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ２３Ｔ）、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ２８Ａ）、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ５２Ａ）、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ６Ａ，Ｎ２３Ｔ）、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ１１Ｓ，Ｎ２３Ｔ）については０．１５８を用いて概算した。濃度はアミノ酸分析（ＢＭＣ社（スウェーデン、ウプサラ））で確認した。均質性はＰｈａｓｔシステムを用いてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ． １９７０． Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｄ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４． Ｎａｔｕｒｅ． ２２７：６８０−６８５）。凍結乾燥タンパク質を還元条件下で高密度ゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））にローディングし、供給元の推奨法に従ってクーマシーブリリアントブルーで染色した。均質性及び分子量は質量スペクトルでさらに確認した。
ＣＤ分光分析のため、タンパク質試料をリン酸塩緩衝液（８．１ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4，１．９ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．５）中で濃度１０μＭに調製した。スペクトルはＪ−７２０分光光度計（日本分光株式会社）を用いて光路長０．１ｃｍの石英セル中室温において２５０〜２００ｎｍの遠紫外領域でスキャン速度毎分１０ｎｍで記録した。各スペクトルは５回の累積スキャンの平均とし、最終スペクトルを平均残基楕円率（ＭＲＥ）（度ｃｍ2ｄｍｏｌ-1）に変換した。
結果（実施例１）
すべてのＺ変異体は３７℃で大腸菌菌体内でうまく産生され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで推定して約５０ｍｇ／ｌの同様の発現レベルを示した。タンパク質はすべてＩｇＧアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し（データ示さず）、凍結乾燥し、以降の分析用に保存した。プロテインＺとその各種変異体の分子量も質量スペクトルで分析した。そのデータからすべての変異体で正しいアミノ酸が含まれていることが確認された（データ示さず）。また、αへリックスタンパク質の構造変化の検出に適していることが従前明らかにされていることから（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｗ．，Ｊｒ． １９９０． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ７：２０５−２１４；並びにＮｏｒｄ，Ｋ．， Ｊ．Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｂ．Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｍ．Ｕｈｌｅｎ， ａｎｄ Ｐ．−Ａ．Ｎｙｇｒｅｎ． １９９５． Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ａｎ ａ−ｈｅｌｉｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ． Ｐｒｏｔ． ｅｎｇ． ８：６０１−６０８）、円二色性（ＣＤ）装置で構造分析を実施した。すべてのスペクトルが２０８ｎｍ及び２２２ｎｍに極小を示すとともに１９５ｎｍ付近に極大を示し、変異体と親分子が類似構造をもつことを示していた。ただし、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ５２Ａ）は野生型Ｚ及び他の変異体に比べてαへリックス性が幾分低値であった（データ示さず）。
実施例２：生物特異的相互作用分析
材料及び方法
親和性と会合及び解離状態の速度定数の差をＢｉａｃｏｒｅ（商標）２０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ社（スウェーデン、ウプサラ））で検出した。ヒトポリクローナルＩｇＧ及びＨＳＡ（陰性対照）を製造元の推奨法に従ってＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）のカルボキシル化デキストラン層にアミンカップリングによって固定化した。ＩｇＧの固定化で約２０００ＲＵとなった。Ｚ、ＺＦ３０Ａ及び各種変異体をＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３．４ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ ７．４）中で１０通りの濃度（１００〜５５０ｎＭ）に調製した。試料を一対ずつ順不同に３０μｌ／分の流速で表面にインジェクションした。表面の再生には１０ｍＭ ＨＣｌを用いた。データはＢＩＡ評価３．０．２ｂソフトウエア（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いて分析した。ＨＳＡを固定化した対照表面のシグナルをＩｇＧ表面のシグナルから差し引いた。１：１ラングミュアモデルと仮定して、見掛けの速度定数及び親和性定数を計算した。また、天然分子に対する自由結合エネルギーの変化（ΔΔＧ＝−ＲＴｌｎＫaff,mutant／Ｋaff,native）も算出した。
結果（実施例２）
ＩｇＧに対するＺ変異体の親和性の差を求めるため、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を行った。その目的は本発明の各種変異Ｚ変異体の親和性を親分子と比較することであった。上述の通り、親Ｚドメインのアルカリ安定性が高いことから、Ｆ３０Ａを含むＺの構造的脱安定化変異体（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｌ．， Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｂ．Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｍ．Ｕｈｌｅｎ， ａｎｄ Ｂ．Ｎｉｌｓｓｏｎ． １９９３． Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇ． ６：４４１−４４８）を使用することにした。そこで、変異にもかかわらず変異分子とＩｇＧとの親和性が保持されていることを最初に確認しておくことが重要であった。以下の表１から明らかな通り、Ｚ（Ｆ３０Ａ）の親和性はさほど影響されなかった。親和性のごく僅かな変化によって、Ｚ（Ｆ３０Ａ）とＩｇＧの複合体の安定性が親分子ＺとＩｇＧに比べて僅かに増している。この結果はＪｅｎｄｅｂｅｒｇ他（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ他，１９９３，上掲；Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ他，１９９５，上掲）が以前に報告した結果と一致している。Ｚ（Ｆ３０Ａ）を土台として構築したすべての変異体を分析し、親分子（Ｚ（Ｆ３０Ａ））と比較した。その結果、全体的な親和性は変異によってさほど変化せず、本発明のアスパラギン変異はいずれもＩｇＧとの結合にあまり重要ではないことを示していた（以下の表１参照）。Ｎ２１Ａ変異又はＮ４３Ｅ変異を含むすべてのＺ変異体で親和性定数がほんの僅かに低いことが観察された。Ｎ２３Ｔ変異を有する変異体では、意外にも、親和性はむしろ僅かに高くなった。また、Ｎ２８Ａ変異の場合は、親和性の低下は極めて小さく、この変異タンパク質を例えばタンパク質リガンドとして使用しても本質的な影響があるとは思われない。さらに、Ｎ２８Ａ変異を含むすべての構築物が大幅に増大した解離（オフ）速度を有している。Ｎ２３Ｔ変異を含む変異体については、幾分向上した親和性は僅かに増大した会合（オン）速度によるものと考えられる。また、Ｎ６Ａ変異は会合速度が高いが、変異後の解離速度も増大しているので、親和性定数には影響がない。
Figure 0004391830
Ｚwtは様々な測定で内標準として用いた。自由結合エネルギーの差はそれぞれＺｗｔ及びＺ（Ｆ３０Ａ）に対して計算した。
実施例３：アルカリ性条件に対する安定性
材料及び方法
アフィニティーリガンドとしてのＺドメインの変異体の挙動を標準的アフィニティーマトリックスに固定化して分析した。Ｚ、Ｚ（Ｆ３０Ａ）及び変異体を製造元の推奨法に従ってＮ−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてＨｉＴｒａｐ（商標）アフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））に共有結合させた。カラムはＴＳＴ及び０．２Ｍ ＨＡｃ，ｐＨ３．１でパルスした。ＴＳＴ中のヒトポリクローナルＩｇＧを調製し、過剰量でカラムに注入した。標準的アフィニティークロマトグラフィープロトコルに従って１６サイクルをＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））で行った。各サイクル間にＣＩＰ工程を組み込んだ。洗浄剤は０．５Ｍ ＮａＯＨであり、各パルスの接触時間を３０分とし、総曝露時間を７．５時間とした。溶出物は２８０ｎｍで検出した。
結果（実施例３）
Ｚ、Ｚ（Ｆ３０Ａ）及びその変異体をＮＨＳ法でＨｉＴｒａｐ（商標）カラムに共有結合させた。過剰量のＩｇＧをローディングし、各サイクル後に溶出ＩｇＧ量を測定してカラムの総容量を求めた。各サイクルの合間に、カラムを０．５Ｍ ＮａＯＨからなるＣＩＰ処理に付した。総曝露時間７．５時間となる１６パルス後に、Ｚ（Ｆ３０Ａ）マトリックスのカラムは７０％の容量低下を示す。図２ａの劣化データは、置換されたアルギニンの４つ（Ｎ６、Ｎ１１、Ｎ４３及びＮ５２）が本実験で変異体を暴露したアルカリ性条件に対する感受性が低いことを示している。対照的に、Ｎ２３はＺ（Ｆ３０Ａ）の安定性に極めて重要であると思われる。Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ２３Ｔ）は脱安定化Ｆ３０Ａ変異にもかかわらず容量の低下は僅か２８％にすぎなかった。従って、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ２３Ｔ）はＺｗｔとほぼ同じくらい安定であり、土台としてのＺ（Ｆ３０Ａ）で最も安定化された変異体である。また、２箇所の追加の変異を有するＺ（Ｆ３０Ａ）ドメインであるＺ（Ｆ３０Ａ，Ｎ２３Ｔ，Ｎ４３Ｔ）はＺ（Ｆ３０Ａ，Ｎ２３Ｔ）と同様の劣化パターンを示す。Ｎ２８のアラニンでの置換もアルカリ性条件に対するＺ（Ｆ３０Ａ）の安定性を改善する。意外なことに、Ｚ（Ｆ３０Ａ，Ｎ２１Ａ）をアフィニティーリガンドとしたカラムはＮａＯＨに曝露されると親分子に比べ容量の劇的な損失を示す。これらのデータはＺ（Ｎ２３Ｔ）がＩｇＧのアフィニティー精製の非常に有益なリガンドとして有望であることを示している。
安定性の僅かな変化を検出可能にするため分子の構造的脱安定化変異体を用いた手法の信頼性を最終的に検証するため、Ｎ２３Ｔ変異を親Ｚドメインに導入した。親Ｚドメイン及びＺ（Ｎ２３Ｔ）をＨｉＴｒａｐカラムにカップリングし、上述の変異体と同様にしてアルカリ性条件に曝露した。図２ｂから明らかな通り、Ｚ（Ｎ２３Ｔ）変異体は高ｐＨ曝露時にＺｗｔよりも高い安定性を示す。
実施例４：Ｃ末端システインを有する又は有さないＺ変異体の単量体の構築
Ｚ（Ｎ２３Ｔ）をコードする遺伝子に３種類の変異：Ｋ４Ｇ、Ｎ３Ａ及び二重変異Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄを導入した。
変異はまず、Ｃ末端にシステインを有するものとシステインを有さないものとの２種類のベクターに導入した。これは後で単一Ｃ末端システインを有する多量体の構築を容易にするために行った。
実施例４（ａ）：システイン含有単量体の構築
構築用の鋳型として、「ｐＧＥＭＺＮ２３Ｔ」と命名したプラスミドを使用した。これは既にＺ遺伝子内にＮ２３Ｔ変異を含んでいた。ＰＣＲ反応をこの鋳型プラスミドと以下の２種類のオリゴヌクレオチドを用いて実施した。
K4G変異には
AFFI-63: TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C
GRTO-40: GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

N3A変異には
AFFI-64: TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC AAC AAA GAA C
GRTO-40: GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

N3A/N6D変異には
AFFI-65: TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC GAC AAA GAA C
GRTO-40: GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG
ＰＣＲ反応試験管は、０．５μｌの鋳型ｐＧＥＭＺＮ２３Ｔ［５００ｎｇ／μｌ］、５ｐｍｏｌの各プライマー（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｂａｉｄ社（ドイツ、ウルム））、５μｌのｄＮＴＰミックス（［１０ｍＭ］、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州））、５μｌのＰＣＲ緩衝液１０×（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州））、０．１μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（［５Ｕ／μｌ］、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州））を含んでおり、滅菌水で最終体積を５０μｌとした。ＰＣＲプログラムは９４℃で２分の後、９６℃で１５秒、５０℃で１５秒、７２℃で１分のサイクルを３０回、最後に７２℃で１分とした。ＰＣＲ反応はＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州））で実施した。
ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで分析し、得られた産物のサイズが正しいことを確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社（ドイツ、ヒルデン））で精製した。
ＰＣＲ産物をＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他）に従って制限酵素ＡｃｃＩ及びＰｓｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社（ＮＥＢと略す，米国マサチューセッツ州））で切断した。切断産物をアガロースゲルで分析し、連結前にＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社（ドイツ、ヒルデン））でアガロースから精製した。フラグメントは、予め酵素ＡｃｃＩ及びＰｓｔＩで切断し精製しておいた「ｐＴｒｐ−ｐｒｏｔＡ−ｓｔａｂ−（ｍｕｌｔｉ９）」と名付けたベクターにＴ４ＤＮＡリガーゼ及びライゲーション緩衝液（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社（リトアニア））の添加によって連結した後、ＲＲＩΔＭ１５細胞（ＡＴＣＣ（米国マサチューセッツ州））に形質転換した。構築物はそれぞれｐＡＹ８７（Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｋ４Ｇ）−Ｃｙｓ）、ｐＡＹ８９（Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ）−Ｃｙｓ）及びｐＡＹ９１（Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）−Ｃｙｓ）と名付けた。
ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）１０００ＤＮＡシーケンシングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））を用いて挿入フラグメントの正確な配列を検証した。ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ他，１９７７）によるサイクル配列決定プロトコルには、ＭｅｇａＢＡＣＥターミネーター法（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））を供給元の推奨法に従って使用した。
実施例４（ｂ）：非システイン含有単量体の構築
構築用の鋳型として、「ｐＧＥＭＺＮ２３Ｔ」と命名したプラスミドを使用した。これは既にＺ遺伝子内にＮ２３Ｔ変異を含んでいた。ＰＣＲ反応をこの鋳型プラスミドと以下の２種類のオリゴヌクレオチドを用いて実施した。
構築用の鋳型として、「ｐＴｒｐ（−Ｎ）ＺＮ２３Ｔ−Ｃｙｓ」と命名したプラスミドを使用した。このプラスミドは遺伝子に既にＮ２３Ｔ変異を含んでいた。ＰＣＲ反応をこの鋳型プラスミドと以下の２種類のオリゴヌクレオチドを用いて実施した。
K4G変異には
AFFI-63: TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C
GRTO-41: GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

N3A変異には
AFFI-64: TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC AAC AAA GAA C
GRTO-41: GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

N3A/N6D変異には
AFFI-65: TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C
GRTO-41: GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG
ＰＣＲ反応試験管は、０．５μｌの鋳型ｐＴｒｐ（−Ｎ）ＺＮ２３Ｔ−Ｃｙｓ［５００ｎｇ／μｌ］、５ｐｍｏｌの各プライマー（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｂａｉｄ社（ドイツ、ウルム））、５μｌのｄＮＴＰミックス（［１０ｍＭ］、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州））、５μｌのＰＣＲ緩衝液１０×（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州））、０．１μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（［５Ｕ／μｌ］、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州））を含んでおり、滅菌水で最終体積を５０μｌとした。ＰＣＲプログラムは９４℃で２分間の後、９６℃で１５秒、５０℃で１５秒、７２℃で１分のサイクルを３０回、最後に１分７２℃とした。ＰＣＲ反応はＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州））で実施した。
ＰＣＲ産物はベクターｐＧＥＭに製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ社（米国ウィスコンシン州））の指示通り直接ＴＡクローニングし、その後ＲＲＩΔＭ１５細胞（ＡＴＣＣ（米国マサチューセッツ州））に形質転換した。構築物はｐＡＹ８６（Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｋ４Ｇ）、ｐＡＹ８８（Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ）及びｐＡＹ９０（Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）と名付けた。
ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）１０００ＤＮＡシーケンシングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））を用いて挿入フラグメントの正確な配列を検証した。ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ他，１９７７）によるサイクル配列決定プロトコルには、ＭｅｇａＢＡＣＥターミネーター法（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））を供給元の推奨法に従って使用した。
実施例５：ｐＴｒｐベクター内でのＣ末端システインを有する単量体及びオリゴマーをコードする遺伝子の構築
上記プラスミドｐＡＹ８６〜ｐＡＹ９１（合計６プラスミド）をすべて制限酵素ＡｃｃＩで切断した。この処理によって、ｐＡＹ８６、ｐＡＹ８８及びｐＡＹ９０ベクターからはＺ変異体が完全に放出され、ｐＡＹ８７、ｐＡＹ８９及びｐＡＹ９１ベクター内の遺伝子の３’末端で開環が起きた。切断ベクターを製造元の推奨法に従ってウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ、ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社（リトアニア））で処理した。この工程は５’末端を脱リン酸してベクターの自己連結を防止するために実施した。
放出されたＺ変異体フラグメントをアガロースゲルで分析し、次いでアガロースゲルから精製した後に、フラグメントを以下の通り開環ベクターに連結した。
ｐＡＹ８６のフラグメントをｐＡＹ８７に連結、
ｐＡＹ８８のフラグメントをｐＡＹ８９に連結、
ｐＡＹ９０のフラグメントをｐＡＹ９１に連結。
連結反応では、フラグメントとベクターとを様々な比率で混合して、予想通り二量体〜五量体の各種多量体を得た。
上記の各種多量体をＲＲＩΔＭ１５細胞（ＡＴＣＣ（米国マサチューセッツ州））に形質転換し、Ｒｏｙａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの配列決定装置で上述の通り分析して正確な配列を検証した。新たに構築したプラスミドを以下の表に示す。
Figure 0004391830
上記のプラスミドベクターは、ｐＡＹ８６、ｐＡＹ８８及びｐＡＹ９０を除いて、Ｔｒｐプロモーター、Ｔｒｐリーダー配列及びカナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子を有している。ｐＡＹ８６、ｐＡＹ８８及びｐＡＹ９０は代わりにアンピシリン耐性遺伝子を有している。
実施例６：ｐＫ４ベクター内でのＣ末端システインを有する単量体及びオリゴマーをコードする遺伝子の構築
表２に記載のタンパク質をコードする遺伝子をＳＰＡプロモーター及びシグナル配列を含むベクターに形質転換した。この操作を可能にするには、制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社（ＮＥＢと略す，米国マサチューセッツ州））の切断部位を含むアダプターを構築しなければならなかった。アダプターは２種類のオリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｂａｉｄ社（ドイツ、ウルム））で構築した。
プラスミドｐＡＹ１０４（ｐＫ４−ｃｙｓ−ＡＢＤｓｔａｂｄｉｍｅｒ）をＦｓｐＩ及びＰｓｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社（ＮＥＢと略す，米国マサチューセッツ州））で切断した。このベクターをアガロースゲルで精製し、遊離フラグメントを除去し、残存ベクターをＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社（ドイツ、ヒルデン））でアガロースから精製した。
２種類のオリゴマーＡＦＦＩ−８８及びＡＦＦＩ−８９をライゲーション緩衝液（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社（リトアニア））に混合し、５０℃に加熱し、混合物を室温に放冷した後、上記切断プラスミドベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社（リトアニア））と共に添加した。連結反応後、生成物をＲＰＩΔＭ１５細胞に形質転換し、正確な配列を上述の通り検証した。得られたプラスミドはｐＡＹ１２８と名付けた。
次にプラスミドｐＡＹ１２８を制限酵素ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで切断し、切断ベクターをアガロースゲルで分析し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社（ドイツ、ヒルデン））でアガロースから精製した。ｐＡＹ８６〜ｐＡＹ１０３からＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ）とＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ａ）の２種類の変異Ｚ遺伝子を発現するフラグメントをＫｐｎＩ及びＰｓｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社（ＮＥＢと略す，米国マサチューセッツ州））で切断し、分離し、アガロースゲル分離後に精製した。各種フラグメントをｐＡＹ１２８由来の切断ベクターに連結し、得られたプラスミドを、正確な配列を検証した後、表３に総括する通り、ｐＡＹ１０７〜ｐＡＹ１１６と名付けた。
Figure 0004391830
実施例７：ｐＫ４ベクター内でのＣ末端システインを有する単量体及びオリゴマーにＮ末端で結合したプロテインＡ由来Ｅ遺伝子（Ｅ’）の一部をコードする遺伝子の構築
表２に記載のタンパク質をコードする遺伝子を、ＳＰＡプロモーター及びシグナル配列及びプロテインＡのＥ領域をコードする遺伝子（Ｅ’）の一部を含むベクターに導入した。従前、成熟プロテインＡのＮ末端ＩｇＧ結合部分（領域Ｅ）又はその一部を加えると、正確なプロセシングが増し、周囲の培地への遺伝子産物の分泌も促進することが判明している（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ他，１９８５）。制限酵素ＫｐｎＩの切断部位及びプロテインＡの領域Ｅ（Ｅ’）の一部を含むアダプターを２種類のオリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｂａｉｄ社（ドイツ、ウルム））で構築した。
プラスミドｐＡＹ１０４（ｐＫ４−ｃｙｓ−ＡＢＤｓｔａｂｄｉｍｅｒ）をＦｓｐＩ及びＰｓｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社（ＮＥＢと略す，米国マサチューセッツ州））で切断した。ベクターをアガロースゲルで精製し、遊離フラグメントを除去し、残存ベクターをＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社（ドイツ、ヒルデン））でアガロースから精製した。２種類のオリゴヌクレオチドをライゲーション緩衝液に混合し、７５℃に加熱し、混合物を室温に放冷した後、上記切断プラスミドベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社（リトアニア））と共に添加した。連結反応後、生成物をＲＰＩΔＭ１５細胞に形質転換し、正確な配列を上述の通り検証した。得られたプラスミドはｐＡＹ１２９と名付けた。
次にプラスミドｐＡＹ１２９を制限酵素ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで切断し、切断ベクターをアガロースゲルで分析し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社（ドイツ、ヒルデン））でアガロースから精製した。ｐＡＹ８６〜ｐＡＹ１０３からＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ）とＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ａ）の２種類の変異Ｚ遺伝子を発現するフラグメントをＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで切断し、分離し、アガロースゲル分離後に精製した。各種フラグメントをｐＡＹ１２９由来の切断ベクターに連結し、得られたプラスミドを、正確な配列を検証した後、表４に総括する通り、ｐＡＹ１１８〜ｐＡＹ１２７と名付けた。
Figure 0004391830
実施例８：アルカリ性条件に対する安定性
アルカリ性条件に対する上記タンパク質の安定性を評価するため、４種類の異なるタンパク質を高ｐＨ環境で試験した。試験したタンパク質はＺ（Ｎ２３Ｔ）二量体−Ｃｙｓ、Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｋ４Ｇ）二量体−Ｃｙｓ、Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ）二量体ｒ−Ｃｙｓ及びＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）二量体−Ｃｙｓであった。
（Ｚ（Ｎ２３Ｔ）二量体−Ｃｙｓ）、（Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ）二量体−Ｃｙｓ）、（Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）二量体−Ｃｙｓ）及び（Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｋ４Ｇ）二量体−Ｃｙｓ）は発酵槽で培養した。回収した培地を精製し、常法によってＨＦアガロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））にカップリングした後、アルカリ試験に付した。ＨＦアガロースに結合したタンパク質は以下の通り名付けた。
・Ｚ（Ｎ２３Ｔ）二量体−Ｃｙｓ Ｕ６３１０４９
・Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｋ４Ｇ）二量体−Ｃｙｓ Ｕ６３１０７９
・Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ）二量体−Ｃｙｓ Ｕ６３１０６４
・Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）二量体−Ｃｙｓ Ｕ６３１０６３
マトリックスを最終体積が０．１〜０．３ｍｌとなるようにカラム（ＨＲ５／２、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））に充填した。使用した精製装置は光路長２ｍｍのＵＶ試料フローセル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））を装着したＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））であった。
緩衝液の組成は以下の通りである。
・ランニング緩衝液：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，５ｍＭ酢酸アンモニウム，ｐＨ ８，０
・溶出緩衝液：０．２Ｍ酢酸（ＨＡｃ），ｐＨ ３，１
・クリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）緩衝液：０．５Ｍ ＮａＯＨ
典型的なクロマトグラフィー試験サイクルは以下の通りである。
・ランニング緩衝液によるカラムの平衡化
・ポリクローナルヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）１０ｍｇの０．２ｍｌ／分での試料ローディング
・未結合タンパク質の十分な洗浄
・溶出緩衝液による１．０ｍｌ／分での溶出
・ランニング緩衝液による再平衡化
・カラムマトリックスと０．５Ｍ ＮａＯＨの接触時間１時間としたクリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）緩衝液によるクリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）
・ランニング緩衝液による再平衡化
各試験でのｈＩｇＧのローディング量は、すべての場合にカラムに試料をローディングした際の未結合のタンパク質のブレイクスルーが多大であったことから、カラムの総動的結合容量をはるかに超えていた。
上記の工程を含むサイクルを１回行った後、新しいサイクルを始めたが、このサイクルも０．５Ｍ水酸化ナトリウムへの１時間曝露を含んでいた。カラムの動的結合容量の低下を測定するため、溶出ピークのピーク面積を、マトリックスを水酸化ナトリウムに曝露する前の最初の溶出ピークのピーク面積と比較した。最初のピーク面積を結合容量１００％に設定してｈＩｇＧの結合容量の低下を観察した。ピーク面積は精製システムに付属するＵＮＩＣＯＲＮ（商標）ソフトウエアを用いて計算した。
各サイクルを２１回繰返し、各種マトリックスの各々についてマトリックスと水酸化ナトリウムの総曝露時間を２０時間とした。正規化したピーク面積を以下に示す通りグラフにした（図１６）。各変異につき全２１サイクル繰返した。
Ｚ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）二量体−Ｃｙｓ及びＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ）二量体−Ｃｙｓ共に、最初に生産したＺ（Ｎ２３Ｔ）二量体−Ｃｙｓに比較べアルカリ性条件に対する安定性が向上していた。
ＳｐＡの５つの相同ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣ）のアミノ酸配列比較である。 本発明の変異タンパク質のアルカリ処理（クリーニング・イン・プレイス）後に得られた結果を脱安定化プロテインＺと対比して示す。 本発明の変異タンパク質のアルカリ処理（クリーニング・イン・プレイス）後に得られた結果を脱安定化プロテインＺと対比して示す。 実施例４（ａ）記載のベクター挿入後のＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）−Ｃｙｓをコードする遺伝子を示す。 実施例４（ａ）に記載のプラスミドｐＡＹ９１のプラスミド地図を示す。 実施例４（ｂ）記載のベクター挿入後のＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）−Ｃｙｓをコードする遺伝子を示す。 実施例５に記載のプラスミドｐＡＹ１００のプラスミド地図の一例を示す。 実施例６のＳＰＡプロモーター及びシグナル配列を有するベクターへのＫｐｎＩ部位導入用アダプターを示す。 実施例６に記載の、ＫｐｎＩ部位含有アダプターの導入に用いられるＳＰＡプロモーター及びシグナル配列を含むプラスミドｐＡＹ１０４を示す。 実施例６のアダプター挿入後に得られたプラスミドｐＡＹ１２８を示す。 実施例６の構築クローニングカセットを示し、元のアダプターには下線を付した。 実施例６に記載のＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）−Ｃｙｓ四量体の挿入後のプラスミドｐＡＹ１１４を示す。 実施例７の構築クローニングカセットを示し、元のアダプターには下線を付した。 実施例７のアダプター挿入後に得られたプラスミドｐＡＹ１２９を示す。 実施例７に記載のＺ（Ｎ２３Ｔ／Ｎ３Ａ／Ｎ６Ｄ）四量体−Ｃｙｓの挿入後のプラスミドｐＡＹ１２５を示す。 実施例８に記載のヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）の分離で得られたクロマトグラムである。 実施例８のマトリックスの残存動的結合容量を示すグラフである。

Claims (19)

  1. 免疫グロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができる免疫グロブリン結合タンパク質であって、当該タンパク質が、配列番号１又は２で規定される２以上の反復単位を含んでおり、各単位における２３位のアミノ酸残基がスレオニンである、タンパク質。
  2. 当該タンパク質がＦｃフラグメント結合タンパク質である、請求項１記載のタンパク質。
  3. 前記単位が１５残基以下のアミノ酸からなる連結エレメントで連結している、請求項１又は請求項２記載のタンパク質。
  4. 前記連結エレメントがＶＤＡＫＦＤの配列を含む、請求項３記載のタンパク質。
  5. スタフィロコッカスのプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの１以上も含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のタンパク質。
  6. 四量体である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のタンパク質。
  7. 四量体であって、１以上の単位が配列番号４で規定される配列を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のタンパク質。
  8. 前記単位がＶＤＡＫＦＤの配列を含む連結エレメントで連結している、請求項７記載のタンパク質。
  9. 請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のタンパク質をコードする核酸。
  10. 請求項９記載の核酸を含む発現系。
  11. 請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の免疫グロブリン結合タンパク質を含む複数のリガンドが固体担体に結合したアフィニティークロマトグラフィー用マトリックス。
  12. 前記リガンドが１以上の四量体を含む、請求項１１記載のマトリックス。
  13. 前記リガンドがチオエーテル結合で担体に結合している、請求項１１又は請求項１２記載のマトリックス。
  14. 前記担体が多糖類である、請求項１１乃至請求項１３のいずれか１項記載のマトリックス。
  15. ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンの選択的結合をもたらす、請求項１１乃至請求項１４のいずれか１項記載のマトリックス。
  16. 請求項１１乃至請求項１５のいずれか１項記載のマトリックスを免疫グロブリンの単離に使用する方法であって、上記マトリックスに免疫グロブリンを吸着させる工程、免疫グロブリンを溶出させる工程、上記マトリックスをアルカリで洗浄する工程、洗浄したマトリックスに免疫グロブリンを吸着させる工程、及び免疫グロブリンを溶出させる工程を含む方法。
  17. 前記洗浄が１Ｍ以下の濃度のＮａＯＨを用いて行われる、請求項１６記載の方法。
  18. 請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のタンパク質又は請求項１１乃至請求項１５のいずれか１項記載のマトリックスへの吸着によって液体から１種以上の目的化合物を分離する、クロマトグラフィー方法。
  19. 前記目的化合物が免疫グロブリンである、請求項１８記載のクロマトグラフィー方法。
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