CN118291653A - 一种基于LAMP扩增和CRISPR/Cas检测相结合的大肠埃希氏菌检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于LAMP扩增和CRISPR/Cas检测相结合的大肠埃希氏菌检测试剂盒，包括：大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物、能够引导CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的sgRNA、DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶、荧光报告探针。并公开了特异性扩增引物和sgRNA的组合，以及利用所述试剂盒检测大肠埃希氏菌的方法。本发明利用ompF基因缺失的大肠杆菌表达纯化得到的DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶作为反应酶，并针对ompF基因序列设计特异性引物结合sgRNA加强特异性识别，提高了病毒特征序列核酸检测的准确性，排除假阳性。本发明检测时间快，特异性强，适用于活菌检测且操作简单，对温控要求低，对设备要求低，实现自动化操作。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种基于LAMP扩增和CRISPR/Cas检测相结合的大肠埃希氏菌检测试剂盒及应用方法。
技术背景
大肠埃希氏菌是一种常见的肠道细菌，正常情况下不会对身体健康造成危害。然而，如果大肠埃希氏菌超过了正常的数量，就会导致腹泻、呕吐、发热等症状，甚至会引起脱水、休克等严重后果。在食品生产和加工过程中，大肠埃希氏菌的污染可能会导致食品安全问题，因此对其进行快速、准确的检测对于保障公众健康至关重要。
迄今为止，基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的传统核酸检测技术仍是一种重要的分子检测手段，但大肠埃希氏菌的核酸检测通常会受到环境或反应体系中的残留大肠杆菌影响，且采用PCR扩增和检测方法存在一定的局限性。PCR方法需要进行多步操作，需要使用高精度仪器，难以在现场快速检测中应用。因此需要开发一种更加灵敏和特异的大肠埃希氏菌检测方法。
等温扩增技术(isothermal amplificationtechnology，ITA)是近年来发展起来的基于恒温扩增的新型核酸扩增技术，被许多学者认为是一种有可能与PCR媲美的检测方法。目前常见的等温核酸扩增技术：LAMP、NERA、NASBA、RCA、HDA、RPA和ERA。在这些扩增技术中LAMP扩增DNA的效率高，能够在1h内有效的扩增1-10拷贝的目的基因，扩增效率是普通PCR的10倍-100倍，反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。两者相比，等温核酸扩增不仅仅是缩短了核酸扩增的时间，更重要的是核酸扩增摆脱了对硬件的束缚，大大减低了价格成本，在基层的推广和现场检测中显示了其非常好的应用前景。但由于其敏感性强，特别容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果，而有效识别特定核酸靶标的存在及其序列改变，对于癌症、感染和遗传疾病的准确诊断和适当管理至关重要。
CRISPR/Cas系统的检测技术通过人工设计向导RNA(Single-guide RNA，sgRNA)，使其特异性识别靶序列后。当Cas蛋白与sgRNA、靶序列形成效应复合物时，其附属切割活性被激活，对已被标记的ssRNA或ssDNA报告基因进行切割，从而释放出信号达到检测效果。利用CRISPR/Cas系统特异的序列识别及切割活性，将其应用于与等温扩增相结合的核酸检测中，为提高检测灵敏度及特异性等性能指标提供了一种新思路。
发明内容
本发明基于DNA恒温扩增和CRISPR检测，提供了一种基于LAMP扩增和CRISPR/Cas检测相结合的大肠埃希氏菌检测试剂盒及应用。其优势在于结合LAMP扩增和CRISPR/Cas检测的单管反应检测技术以及选用ompF基因作为检测靶点，排除反应体系的自身污染。在LAMP扩增效率快且对设备的依赖性低的基础上结合CRISPR检测加强检测的特异性，全面实现有效保证对病毒特征序列核酸检测的正确度，做到高特异性、高灵敏度、简单操作程序的快速检测。
本发明的第一个目的是提供一种基于LAMP扩增和CRISPR/Cas检测相结合的大肠埃希氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括：大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物、能够引导CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的sgRNA、DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶、荧光报告探针。
所述DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶是通过构建包含DNA聚合酶、CRISPR/Cas蛋白酶的编码基因的表达载体，转化入敲除了ompF基因的基因工程菌，表达DNA聚合酶、CRISPR/Cas蛋白酶，然后纯化获得。
敲除了ompF基因的基因工程菌按以下方法获得：利用CRISPR/Cas9方法敲除大肠杆菌中的ompF基因，得到敲除了ompF基因的基因工程菌。
所述基因工程菌一般为BL21(DE3)大肠杆菌。
敲除ompF基因的基因工程菌不影响蛋白表达，而且可排除商品酶可能带有的目标基因残留。本发明通过敲除ompF基因的基因工程菌来表达DNA聚合酶、CRISPR/Cas蛋白酶，可排除反应体系内的自身基因污染问题，解决表达酶的工程菌残留问题。
所述的大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物是根据ompF基因进行设计，结合特异性的sgRNA序列能够准确识别扩增片段。
所述的荧光报告探针为一段单链DNA，其5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；
所述基团包括但不限于FAM、HEX、VIC、CY5、CY3、ROX、TAMRA；所述荧光淬灭基团包括但不限于BHQ1、BHQ2。
所述的单链DNA序列，可以是TTATTATT或TTTTT或TTTTTTTT或其他富含TA的单链DNA序列，该序列可以被CRISPR/Cas蛋白识别并切割。
优选荧光报告探针的序列为TTATTATT。
进一步，优选所述试剂盒包括反应缓冲液、酶混合液和大肠埃希氏菌检测液；
所述的反应缓冲液包含：Tris-HCl，dNTPs，Tween-20或Triton X-100，硫酸镁，硫酸铵，荧光报告探针；
所述的大肠埃希氏菌检测液包括大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物、能够引导CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的sgRNA；
所述酶缓冲液包括DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶。
进一步，优选所述的反应缓冲液包括：20-80mM Tris-HCl，1-5mM dNTPs，0.1％-0.4％Tween-20或X-100，10-40mM硫酸镁，10-40mM硫酸铵，200-800nM荧光报告探针。
优选所述的酶混合液包括：500-1500nM DNA聚合酶和10-100nM CRISPR/Cas蛋白酶，优选DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶的用量比为30～45：1。
所述的大肠埃希氏菌特异性扩增引物和sgRNA是根据ompF基因进行设计的。ompF基因编码的蛋白是一种外膜蛋白，外膜蛋白是小分子亲水物质出入细菌的通道，对生物被膜的形成有一定的影响。本试剂使用的酶都是通过ompF基因缺乏的宿主表达，可以有效排除反应体系影响。
大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物包括但不限于表格1中所列举的引物组1、引物组2。引物组1包括引物1～引物6，序列如SEQ ID NO 1～6所示，引物组2包括包括引物1～引物6，序列如SEQ ID NO 7～12所示。
sgRNA根据特异性扩增引物扩增区域进行设计，其序列包括但不限于表1中的sgRNA1～8中的一种。
表1大肠埃希氏菌特异性扩增引物和sgRNA序列
优选的，所述大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物为引物组1，sgRNA为sgRNA4；或者所述大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物为引物组2，且sgRNA为sgRNA5或6。
所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为含大肠埃希氏菌ompF基因序列的质粒和提取后的人源细胞核酸溶液；阴性质控品为提取后的人源细胞核酸溶液，ompF基因序列如SEQ ID NO 21所示。
所述提取后的人源细胞核酸是使用提取或纯化试剂对人源细胞进行提取，得到的核酸。
提取后的人源细胞核酸的浓度优选为1～10ng/μL；
更进一步，人源细胞可采用Jurkat细胞，采用杭州杰毅生物有限公司的核酸提取纯化试剂盒(货号：MD049T-P2)进行核酸提取，得到提取后的人源细胞核酸。
本发明还提供一种基于LAMP扩增和CRISPR/Cas检测相结合的检测大肠埃希氏菌的引物组合，所述引物组合包括大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物和sgRNA；
所述大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物为引物组1，sgRNA为sgRNA4；或者所述大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物为引物组2，sgRNA为sgRNA5或6。
本发明还提供一种大肠埃希氏菌的快速检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物、能够引导CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的sgRNA混合，得到大肠埃希氏菌检测液；
(2)将大肠埃希菌检测液、含有DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶的酶混合液、含有荧光报告探针的反应缓冲液、待测核酸样本混合，配成反应体系；
(3)反应体系在55-70℃下进行等温扩增反应5-30min，实时检测荧光信号，根据检测到的荧光信号值进行结果分析，判断样本中是否存在大肠埃希氏菌。
进一步，所述步骤(1)中，特异性扩增引物为引物组1，sgRNA为sgRNA4；或者特异性扩增引物为引物组2，sgRNA为sgRNA5或6，其中引物组1或引物组2中，引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6、sgRNA的浓度分别为0.5～2μM、0.5～2μM、2～10μM、2～10μM、1～4μM、1～4μM、0.1～0.5μM；更优选的引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6、sgRNA的浓度分别为1μM、1μM、8μM、8μM、2μM、2μM、0.2～4μM。
进一步，所述步骤(2)中，反应体系为50μL，包括反应缓冲液30μL，大肠埃希氏菌检测液10μL，酶混合液5μL，待测核酸样本、阳性质控品或阴性质控品为5μL。
进一步，所述步骤(3)中，所述结果分析方法为：荧光检测曲线呈上升趋势判定为阳性；荧光检测曲线呈水平状态判定为阴性；所述荧光检测曲线以荧光信号值为纵轴，以时间为横轴制得的曲线。荧光上升的拐点处所对应的时间为起峰时间Tt值。
Tt值的定义为：第一次荧光信号大于所设定的阈值时所经过的扩增时间。
在一个优选的实施例中，阈值是：第1-16次循环采集的荧光值的标准差的10倍的一个数值。
本发明提供的基于LAMP扩增和CRISPR/Cas检测相结合的大肠埃希氏菌检测试剂盒的主要优点在于：
(1)无需使用昂贵且精密的荧光定量PCR仪器；本发明的仪器只需恒温核酸扩增检测仪，设备小巧、便于转运和使用。
(2)使用普通的PCR管，一次性完成加样，全过程闭管反应，不易产生污染；
(3)灵敏度高：筛选合适的引物和sgRNA可实现高灵敏度的检测。
(4)特异性高：通过sgRNA靶向指导CRIPSR/Cas蛋白精准切割待测靶点，实验结果表明与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)，屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌均无交叉反应。
(5)避免体系内大肠杆菌污染，避免出现检测结果假阳性的情况。
(6)实现了扩增和检测一体化。
本发明利用ompF基因缺失的大肠杆菌表达纯化得到的DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶作为反应酶，并针对ompF基因序列设计特异性引物结合sgRNA加强特异性识别，减少体系内的大肠杆菌的污染，有效保证对病毒特征序列核酸检测的准确性，排除假阳性结果。本发明是结合了LAMP扩增和CRISPR检测的单管反应检测技术。在LAMP扩增效率快且对设备的依赖性低的基础上结合CRISPR检测加强检测的特异性。本发明提高了对病毒特征序列核酸检测的正确度，可在30min内确定样品中是否存在大肠埃希氏菌。本发明检测时间快，特异性强，灵敏度高、适用于活菌检测且操作简单，对温控要求低，可降低实验室设备要求，可实现自动化操作。
附图说明
图1为大肠埃希氏菌检测液筛选结果图。
图2为大肠埃希氏菌荧光定量PCR灵敏度检测结果图。
图3为大肠埃希氏菌检测试剂盒灵敏度测试结果图。
图4为大肠埃希氏菌检测试剂盒特异性测试结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图，对本发明提供的技术方法进行详细的阐述与说明，所述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，并不局限于本发明全部的实施例。以下实施例中所用到的试剂组分除特别说明外，均为本发明试剂盒中的组分。本领域的专业人员在本发明基础上的修改或者改动，这些等价修改的方式同样落在本发明权利要求书中所述的权利要求范围。
实施例1：
一种基于LAMP扩增和CRISPR/Cas检测的大肠埃希氏菌检测试剂盒，具体包括以下组份。
(1)反应缓冲液包括：33.33mM Tris-HCl，2.33mM dNTPs，0.16％Tween-20或
X-100，16.33mM硫酸镁，16.66mM硫酸铵，416nM荧光报告探针(序列TTATTATT，5’端标记有荧光基团6-FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1)。
(2)酶混合液包括：1240nM DNA聚合酶和33nM CRISPR/Cas蛋白酶。DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶的获取方式：首先获得含有目的基因的质粒(由南京金斯瑞生物公司合成)，导入ompF基因缺失的Ecoli工程菌中进行诱导表达，经亲和层析纯化得到DNA聚合酶、CRISPR/Cas蛋白酶。
OmpF基因缺失的Ecoli工程菌是使用CRISPR/Cas9基因敲除法得到。根据
CHOPCHOP网站(http://chopchop.cbu.uib.no/#)设计sgRNA，综合考虑基因组位置、GC含量、是否自互补、脱靶情况、编辑效率等因素，最终选择了(EcoDF敲除鉴定引物：ATCAGAAACAAAATTTCCG和GAACATTACCGCCGCTCCTG；sgRNA为GACATGACCTATGCCCGTCT)作为实验候选。琼脂平板获得的BL21(DE3)的单菌落再经过摇菌收集细菌，使用1mmGene Pulser皿(Bio-Rad)以1.8kV和1ng工具质粒对50μL感受态细胞进行电穿孔，诱导表达并PCR验证。将已编辑成功的菌落接种至2ml不含抗生素的LB中，37℃过夜培养4h，然后取2ul菌液在含有1％蔗糖的LB平板上划线，37℃培养。平板上长出来的菌落就是目标工程菌。
(3)大肠埃希氏菌检测液包括大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物以及sgRNA(一种能够引导所述的CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的单链RNA)。(4)质控品包括：阳性质控品为含大肠埃希氏菌基因ompF基因序列的质粒和提取后的人源细胞核酸溶液；阴性质控品为提取后的人源细胞核酸。
实施例2：大肠埃希氏菌检测液筛选结果
(1)实验材料
体外转录试剂盒使用的是HiScribeT7 Quick HighYieldRNA Synthesis kit(NewEnglandBiolabs)；RNA纯化试剂盒使用的是RNAClean&Concentrator-5kit(ZymoResearch)；
(2)引物设计
通过引物设计网站，直接粘贴ompF基因序列进行引物设计，合成引物。按比例(引物1:2:3:4:5:6＝1:1:8:8:2:2uM)预混成10x引物。本实施例中有2组引物，分别是引物组1和引物组2(见表1)
(3)sgRNA的设计和制备
合成带有Cas蛋白的FAM序列(TAATACGACTCACTATAGGGGAAGGTGGTTAGCTACAGGCTGACCAGTG CAGTTGTGTCATGTGCTACGGTGACCTAACACGTCACTCAGTCACAACGGC TATCTATATTTCCACTAACCAAAGTTAGTGGAAATGTAGATGGTTAGCAC)的质粒作为模板，取质粒中的一段作为上游引物(GAATTGTAATACGACTCACTATAGGGGAAGGTGGTTAGCTAC)。根据靶标引物的扩增区域中的PAM识别点(TTN)，得到扩增区域内能识别靶标的序列，按照表2中的序列，设计得到下游引物。
表2：
通过PCR反应，得到带靶标识别序列的crDNA。经体外转录试剂盒得到8种sgRNA产物，序列如表1中的SEQ ID NO 13～20所示，通过RNA纯化试剂盒进行纯化，Qubit检测浓度。用无核酸酶水稀释至100-250ng/μL左右备用。(4)大肠埃希氏菌检测液制备
取步骤(2)中10x引物组1、步骤(3)中稀释过的sgRNA1、2、3、4以及无核酸酶水按照体积比5:1:4分别预混成大肠埃希氏菌检测液，按照sgRNA1～4分别编号命名为检测液1-4。同样操作将步骤(2)中10x引物组2、步骤(3)中稀释过的sgRNA5、6、7、8按比例预混成大肠埃希氏菌检测液，按照sgRNA5～8分别编号命名为检测液5-8。
(5)标准品的制备
阴性质控品：提取的人源细胞核酸，浓度为0.1～10ng/μL；
阳性质控品：人工合成的含待检测大肠埃希氏菌ompF基因片段(序列如SEQ ID NO21所示：
GGGGAAACTCAAATCAATTCCGATCTGACCGGTTATGGTCAGTGGGAATAT
AACTTCCAGGGTAACAACTCTGAAGGCGCTGACGCTCAAACTGGTAACAA
AACGCGTCTGGCATTCGCGGGTCTTAAATACGCTGACGTTGGTTCTTTCGAT
TACGGCCGTAACTACGGTGTGGTTTATGATGCACTGGGTTACACCGATATGC
TGCCAGAATTTGGTGGTGATACTGCATACAGCGATGACTTCTTCGTTGGTCG
TGTTGGCGGCGTTGCTACCTATCGTAACTCCAACTTCTTTGGTCTGGTTGAT
GGCCTGAACTTCGCTGTTCAGTACCTGGGTAAAAACGAGCGTGACACTGC
ACGCCGTTCTAACGGCGACGGTGTTGGCGGTTCTATCAGCTACGAATACGA
AGGCTTTGGTATCGTTGGTGCTTATGGTGCAGCTGACCGTACCAACCTGCAAGAAGCTCAACCTCTTGGCAACGGTAAAAAAGCTGAACAGTG)的质粒核酸。用0.1～10ng/μL的人源细胞核酸稀释至1ng/μL，即阳性样本。
人源细胞核酸是将Jurkat细胞用杭州杰毅生物有限公司的核酸提取纯化试剂盒(货号：MD049T-P2)进行核酸提取得到。
(6)扩增与检测
a.按照使用说明，将试剂盒中的各组分置于室温解冻，并混匀备用。
b.参照下表2中各组分用量，配制在无核酸酶的离心管4份45μL反应预混液；
然后分别向反应管1和反应管2中加入5μL阴性质控品，向反应管3和反应管4中加入5μL阳性质控品；瞬时离心后将反应管放入恒温荧光检测仪进行检测，反应温度65℃，每30s读取一次荧光值，时间30min，观察荧光值变化和检测时间，制作荧光检测曲线。
表2
(7)结果判断
荧光检测曲线呈上升趋势判定为阳性；荧光检测曲线呈水平状态判定为阴性。
(8)结果分析
大肠埃希氏菌检测液筛选结果图如图1所示，由图1可知：大肠埃希氏菌检测液4、5、6能够明显区分开阴性质控和阳性质控品。
所以选择大肠埃希氏菌检测液4、5、6任何一个检测液均可以正确快速的区分待检测靶点和非检测靶点。
优选本发明的ompF基因的特异性扩增引和sgRNA的组合是：
引物组1和sgRNA4，引物组2和sgRNA5，引物组2和sgRNA6。
实施例3：大肠埃希氏菌检测试剂盒的灵敏度测试
(1)同实施例2中标准品的制备过程，继续用0.1～10ng/μL的人源细胞核酸依次稀释含待大肠埃希氏菌菌株核酸，分别获得1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL的待检测阳性样本。以人源细胞核酸为阴性对照。
(2)同实施例2中的扩增检测体系与条件，每个核酸样本设置2个重复进行扩增检测。使用大肠埃希氏菌检测液6(引物组2和sgRNA6)。
(3)同时对标荧光定量PCR(杭州杰毅生物有限公司的大肠埃希氏菌检测试剂盒(QPCR法)(货号：MD057))，其体系如下：
a.按照使用说明，将试剂盒中的各组分置于室温解冻，并混匀备用。
b.参照说明书中各组分用量，配制在无核酸酶的离心管17份23μL反应预混液；
然后分别向反应管中加入2μL稀释好的阳性质控品，阴性反应管中加入2μL阴性质控品；瞬时离心后将反应管至于荧光定量仪(如天隆TL988等荧光定量仪)。
(4)结果分析：
大肠埃希氏菌荧光定量PCR灵敏度检测结果图如图2和表3所示，大肠埃希氏菌的QPCR荧光定量的最低检测限为1pg/μL(CT值为31.6)。且阴性检测也存在CT值，能观察到明显荧光曲线。
表3大肠埃希氏菌荧光定量PCR的CT值
大肠埃希氏菌检测试剂盒灵敏度测试结果图如图3所示，本试剂盒的最低检测限为同为1pg/μL(对应QPCR的CT值为31.6)。阴性质控品无值，没有明显荧光曲线，能够明显区分两者。对比两种检测方式，本试剂盒的检测结果不会出现假阳性结果，检测结果更为准确，更加容易判断大肠埃希菌检测是否存在。
实施例4：大肠埃希氏菌检测试剂盒的特异性测试
(1)以人源细胞核酸作为阴性对照，含大肠埃希氏菌ompF靶点基因片段的质粒(10pg/μL)作为阳性对照，以肠杆菌科以及相似病原体质粒样本作为特异性干扰样本进行测试，这些病原体样本包括蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)，屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
(2)扩增检测体系与条件同实施例2，对以上核酸样本分别设置2个重复，进行扩增检测。使用大肠埃希氏菌检测液6(引物组2和sgRNA6)。
(3)结果分析：
大肠埃希氏菌检测试剂盒特异性测试结果图如图4所示，除阳性样本的检测荧光信号上升外，其余样本检测荧光均为无明显变化；由此可见，本试剂盒的特异性高，能够准确的区分待检基因和非检测基因，不会产生交叉信号。
Claims (10)
1.一种基于LAMP扩增和CRISPR/Cas检测相结合的大肠埃希氏菌检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物、能够引导CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的sgRNA、DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶、荧光报告探针；所述DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶是通过构建包含DNA聚合酶、CRISPR/Cas蛋白酶的编码基因的表达载体，转化入敲除了ompF基因的基因工程菌，表达DNA聚合酶、CRISPR/Cas蛋白酶，然后纯化获得。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物为引物组1，sgRNA为sgRNA4；或者所述大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物为引物组2，且sgRNA为sgRNA5或6；
引物组1的序列如下：
引物1：ATACGCTGACGTTGGTTCTT
引物2：CGCTCGTTTTTACCCAGGTA
引物3：TCACCACCAAATTCTGGCAGCACGATTACGGCCGTAACTACG
引物4：TTCTTCGTTGGTCGTGTTGGCGGCCATCAACCAGACCAAAGA
引物5：ACCCAGTGCATCATAAACCACAC
引物6：GCGTTGCTACCTATCGTAACTCC
sgRNA4的序列为：
GAAGGUGGUUAGCUACAGGCUGACCAGUGCAGUUGUGUCAUGUGCUACGGUG ACCUAACACGUCACUCAGUCACAACGGCUAUCUAUAUUUCCACUAACCAAAGUUAG UGGAAAUGUAGAUGGUUAGCACGAUACUGCAUACAGCGAUGA；
引物组2的序列如下：
引物1：AGCGATGACTTCTTCGTTGG
引物2：GCTGCACCATAAGCACCAA
引物3：AACAGCGAAGTTCAGGCCATCACGGCGTTGCTACCTATCG
引物4：CGTGACACTGCACGCCGTTC ACCAAAGCCTTCGTATTCGT
引物5：ACCAGACCAAAGAAGTTGGAGTT
引物6：CGGTGTTGGCGGTTCTATCA；
sgRNA5的序列为：
GAAGGUGGUUAGCUACAGGCUGACCAGUGCAGUUGUGUCAUGUGCUACGGUG ACCUAACACGUCACUCAGUCACAACGGCUAUCUAUAUUUCCACUAACCAAAGUUAG UGGAAAUGUAGAUGGUUAGCACCUACCUAUCGUAACUCCAAC；
sgRNA6的序列为：
GAAGGUGGUUAGCUACAGGCUGACCAGUGCAGUUGUGUCAUGUGCUACGGUGACCUAACACGUCACUCAGUCACAACGGCUAUCUAUAUUUCCACUAACCAAAGUUAGUGGAAAUGUAGAUGGUUAGCACGGUCUGGUUGAUGGCCUGAA。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述敲除了ompF基因的基因工程菌按以下方法获得：利用CRISPR/Cas9方法敲除大肠杆菌中的ompF基因，得到敲除了ompF基因的基因工程菌。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的荧光报告探针为一段单链DNA，其5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；
所述的单链DNA序列，可以被CRISPR/Cas蛋白识别并切割。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述荧光报告探针的核苷酸序列为TTATTATT、TTTTT或TTTTTTTT。
6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括反应缓冲液、酶混合液和大肠埃希氏菌检测液；
所述的反应缓冲液包含：Tris-HCl，dNTPs，Tween-20或Triton X-100，硫酸镁，硫酸铵，荧光报告探针；
所述的大肠埃希氏菌检测液包括大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物、能够引导CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的sgRNA；
所述酶缓冲液包括DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为含大肠埃希氏菌ompF基因序列的质粒和提取后的人源细胞核酸溶液；阴性质控品为提取后的人源细胞核酸溶液，ompF基因序列如SEQ ID NO 21所示。
8.一种基于LAMP扩增和CRISPR/Cas检测相结合的检测大肠埃希氏菌的引物组合，所述引物组合包括大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物和sgRNA；
所述大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物为引物组1，sgRNA为sgRNA4；或者所述大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物为引物组2，sgRNA为sgRNA5或6；
引物组1的序列如下：
引物1：ATACGCTGACGTTGGTTCTT
引物2：CGCTCGTTTTTACCCAGGTA
引物3：TCACCACCAAATTCTGGCAGCACGATTACGGCCGTAACTACG
引物4：TTCTTCGTTGGTCGTGTTGGCGGCCATCAACCAGACCAAAGA
引物5：ACCCAGTGCATCATAAACCACAC
引物6：GCGTTGCTACCTATCGTAACTCC
sgRNA4的序列为：
GAAGGUGGUUAGCUACAGGCUGACCAGUGCAGUUGUGUCAUGUGCUACGGUG ACCUAACACGUCACUCAGUCACAACGGCUAUCUAUAUUUCCACUAACCAAAGUUAG UGGAAAUGUAGAUGGUUAGCACGAUACUGCAUACAGCGAUGA；
引物组2的序列如下：
引物1：AGCGATGACTTCTTCGTTGG
引物2：GCTGCACCATAAGCACCAA
引物3：AACAGCGAAGTTCAGGCCATCACGGCGTTGCTACCTATCG
引物4：CGTGACACTGCACGCCGTTCACCAAAGCCTTCGTATTCGT
引物5：ACCAGACCAAAGAAGTTGGAGTT
引物6：CGGTGTTGGCGGTTCTATCA；
sgRNA5的序列为：
GAAGGUGGUUAGCUACAGGCUGACCAGUGCAGUUGUGUCAUGUGCUACGGUG ACCUAACACGUCACUCAGUCACAACGGCUAUCUAUAUUUCCACUAACCAAAGUUAG UGGAAAUGUAGAUGGUUAGCACCUACCUAUCGUAACUCCAAC；
sgRNA6的序列为：
GAAGGUGGUUAGCUACAGGCUGACCAGUGCAGUUGUGUCAUGUGCUACGGUGACCUAACACGUCACUCAGUCACAACGGCUAUCUAUAUUUCCACUAACCAAAGUUAGUGGAAAUGUAGAUGGUUAGCACGGUCUGGUUGAUGGCCUGAA。
9.一种大肠埃希氏菌的快速检测方法，所述方法利用如权利要求1～7之一所述的试剂盒，包括如下步骤：
(1)将大肠埃希氏菌ompF基因的特异性扩增引物、能够引导CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的sgRNA混合，得到大肠埃希氏菌检测液；
(2)将大肠埃希菌检测液、含有DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶的酶混合液、含有荧光报告探针的反应缓冲液、待测核酸样本混合，配成反应体系；
(3)反应体系在55-70℃下进行等温扩增反应5-30min，实时检测荧光信号，根据检测到的荧光信号值进行结果分析，判断样本中是否存在大肠埃希氏菌。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述结果分析方法为：荧光检测曲线呈上升趋势判定为阳性；荧光检测曲线呈水平状态判定为阴性。
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