CN114539375A - 葡萄溃疡病抗性相关蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了葡萄溃疡病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明公开的葡萄溃疡病抗性相关蛋白为A1)或A2)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白质具有相同功能的蛋白质。实验证明，本发明的葡萄溃疡病抗性相关蛋白的表达可以显著提高植物(如烟草或葡萄)对葡萄溃疡病的抗性。

Description

葡萄溃疡病抗性相关蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及葡萄溃疡病抗性相关蛋白VvRHIP1及其编码基因与应用。
背景技术
葡萄(Vitis vinifera L.)集鲜食与酿酒于一身，经济价值高。由葡萄座腔病菌引起的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback)是葡萄生产上最重要的枝干病害之一，在葡萄主产区分布广泛，严重影响葡萄的产量和品质，每年均造成巨大的经济损失。该类型病原真菌主可通过自然孔口或修剪伤口侵入寄主，引起枝干溃疡、果梗干枯、果实干缩或掉粒以及树势减弱等症状，更严重的会引起整株枯死。至今，在我国已分离获得6种葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaeriaceae)可引起葡萄溃疡病，其中优势种群是可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)和葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，而致病力最强的是可可毛色二孢菌。目前化学农药是防治该病害普遍应用的措施，但迄今为止，尚未获得低毒环保并能够高效防治该病害的农药。而长期农药的使用，不仅会加重农户的经济负担，还造成了环境污染。防控植物病害最有效的手段应该是从提高植物自身的抗病力出发，因此植物新型抗病基因的挖掘和利用，对植物的抗病遗传育种具有重要意义。
葡萄糖、果糖和蔗糖等糖类化合物可同时作为代谢物和信号分子调控植物的生长发育和免疫应答等代谢过程。在拟南芥中，葡萄糖主要通过(1)G蛋白信号转导调节因子1(AtRGS1)介导的质膜G蛋白偶联途径；(2)己糖激酶1(AtHXK1)途径；(3)糖酵解依赖的SNF相关激霉1/雷帕霉素靶点(SnRK1/TOR)三条途径来感应并向下游传递。D-葡萄糖和激发子鞭毛蛋白flg22处理拟南芥后，引起AtRGS1内吞，从而激活G蛋白介导的糖信号转导。并且，为AtRGS1和AtHXK1提供物理支架的AtRHIP1在葡萄糖信号通路中也起着关键作用。据报道，葡萄糖传感器在植物-病原体互作过程中通过糖信号通路调节植物免疫反应。而葡萄糖信号通路组分(VvRHIP1是葡萄中AtRHIP1的同源类似物)是否参与葡萄溃疡病菌的免疫调控未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡萄溃疡病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供的葡萄溃疡病抗性相关蛋白来源于葡萄(Vitis vinifera L.)，为如下A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白质具有相同功能的蛋白质。
序列表中序列2由246个氨基酸残基组成。
为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A1)或A2)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第1-732位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
优选的，所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)：
1)编码序列是序列表中序列1的第1-738位的cDNA分子或DNA分子；
2)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的cDNA分子或DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的cDNA分子或DNA分子。
上述葡萄溃疡病抗性相关蛋白在调控植物抗病性中的应用，也属于本发明的保护范围。
与所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用，也属于本发明的保护范围；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码葡萄溃疡病抗性相关蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)抑制所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白编码基因表达的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下1)或2)或3)或4)：
1)编码序列是序列表中序列1的第1-738位的cDNA分子或DNA分子；
2)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的cDNA分子或DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的cDNA分子或DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
B8)所述核酸分子具体可为与序列表中序列1的第1-738位核苷酸所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子。
所述微生物具体可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为农杆菌，如农杆菌EHA105。
所述转基因细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括植物的繁殖材料。
上述应用中，所述植物可为烟草或者葡萄。
所述抗病性可为葡萄溃疡病抗性。所述葡萄溃疡病可为葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaeriaceae)引发的葡萄溃疡病，如可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)或葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引发的病害。
本发明还提供了培育抗病性转基因植物的方法，所述方法包括：培育抗病性转基因植物的方法，所述权利要求1所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的编码基因的转入目的植物中，筛选得到超表达所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的转基因植物。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；如烟草或葡萄，所述抗病性为葡萄溃疡病抗性。
所述抗病性为葡萄溃疡病抗性抗性。所述葡萄溃疡病可为葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaeriaceae)引发的葡萄溃疡病，如可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)或葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引发的病害。
实验证明，VvRHIP1超表达烟草(OV-R3,OV-R16,OV-R25)三个超表达植株病斑长度比对照要小，发病情况要比野生型对照轻。本发明的葡萄溃疡病抗性相关蛋白的表达可以显著提高植物(如烟草或葡萄)对葡萄溃疡病的抗性。
本发明可以运用在果树育种抗病性改良和防治植物病害尤其是抗葡萄溃疡病方面具有重要的价值，达到增产减药的目的，在农业生产上具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为VvRHIP1基因受可可毛色二孢菌接种诱导表达。
图2为VvRHIP1基因超表达烟草材料的RNA水平表达检测。
图3为VvRHIP1基因超表达烟草材料的蛋白表达检测。
图4为VvRHIP1基因超表达烟草材料的病原接种。
图5为VvRHIP1基因超表达烟草材料接种后PR基因的表达情况。
图6为flg22处理VvRHIP1基因超表达烟草后基础防卫反应相关基因的表达。
具体实施方式
实施例1、葡萄溃疡病抗性相关基因VvRHIP1 cDNA的克隆
取正常光周期生长30天的葡萄‘无核白’组培苗叶片，液氮研磨后，采用多糖多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取样品总RNA，利用SuperscriptⅢ反转录试剂盒(Invitrogen公司)反转录合成cDNA。设计特异性引物：上游引物VvRHIP1-F:5’-ATGGCGGAGGCGACGCCGTCGTCAG-3’；下游引物VvRHIP1-R:5’-AACAGGAACCCCTAATTCAGAAATC-3’。反应体系(25uL)：10×PCR buffer 2.5uL；2.5mM dNTPs1.0uL；10uM上游和下游引物各0.5uL；LA聚合酶0.2uL；cDNA模版1.0uL；补水至25uL。以葡萄‘无核白’cDNA为模板，在MyCyclerTM thermal cycler(Bio-RAD)仪器上进行PCR扩增。扩增条件为：94℃预变性5分钟；进入94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒共32个循环，最后72℃延伸10分钟。回收PCR产物连接到pMD18-T载体上，构成的载体命名为T-VvRHIP1并送擎科生物科技有限公司进行测序。
测序结果为该PCR产物具有序列表中序列1的核苷酸序列，将该PCR产物的基因命名为VvRHIP1。VvRHIP1基因的cDNA全长共738bp，编码含有246个氨基酸的蛋白。该基因编码的蛋白命名为VvRHIP1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
实施例2、葡萄溃疡病抗性相关基因VvRHIP1基因受可可毛色二孢菌接种诱导表达
一年生葡萄‘夏黑’休眠枝条种植于温室，将生根枝条以25cm×25cm的间距移栽至50cm×50cm的花盆中培养2-3个月。将可可毛色二孢菌株CSS-01s转至PDA培养基上，于26℃培养2-3周产孢，调整孢子数目为1×106个/ml，以0.02％的silwet水溶液模拟接种作为对照。取半木质化新生葡萄枝条，70％乙醇表面消毒后，用打孔器在茎中间制造伤口，将孢子悬浮液置于伤口上并用封口膜固定，接种后的枝条置于26℃、12小时光照12小时黑暗、相对湿度为90％的接种室中培养。于接种0、12、24、36和48时，以伤口为中心截取上下5cm范围内全部韧皮组织，液氮中速冻，-80℃冰箱保存备用。组织经液氮研磨后，采用多糖多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取样品总RNA，利用SuperscriptⅢ反转录试剂盒(Invitrogen公司)反转录合成cDNA。设计特异性引物：上游引物VvRHIP1-qF:5’-CACTGGAAGTCAACTCAAG-3’；下游引物VvRHIP1-qR:5’-GATGTCATAGAAGCAACCTC-3’。内参基因VvEF1r引物序列为：VvEF1r-qF:5’-GCGGGCAAGAGATACCTCAA-3’；下游引物VvEF1r-qR:5’-TCAATCTGTCTAGGAAAGGAAG-3’。反应体系为：0.5μL反转录产物，引物3.5μL(0.5μM)，7μL 2×SYBR green，加水至总体积14μL。参照TaKaRa说明书，采用SYBR Green I染料法进行荧光定量PCR，反应在ABI7500 Real-timePCR检测系统上进行。反应程序为：95℃预变性3min，进入95℃30s，60℃30s，72℃30s共40个循环，设置3个生物学重复。根据实时荧光定量PCR得到的Ct值以及标准曲线，采用2-△△Ct法分析数据，计算可可毛色二孢菌不同侵染时间时，VvRHIP1基因的相对转录水平。
结果如图1所示，可可毛色二孢菌接种24h时显著诱导VvRHIP1基因的表达，达到峰值，表达量是0h的8倍；随后出现下降的趋势，在接种48h时，其表达量是0h的4倍左右。
实施例3、葡萄溃疡病抗性相关基因VvRHIP1的转基因功能验证
1.超表达VvRHIP1转基因烟草的获得
超表达载体构建：用引物VvRHIP1-GF：5’-CCAAGCTTATGGCGGAGGCGACGCCGTCGTCAG-3’和VvRHIP1-GR:5’-GGACTAGTAACAGGAACCCCTAATTCAGAAATC-3’进行配对，以T-VvRHIP1为模板，进行PCR扩增，回收小片段插入到
pCAMBIAsuper1300-GFP蛋白表达质粒(上海禾午生物科技有限公司；货号：P19574)的Hind II Ⅰ和Spe Ⅰ的酶切位点间，得到的重组载体命名为Super-VvRHIP1-GFP，即VvRHIP1基因的超表达载体。采用冻融法将载体转化农杆菌EHA105得到转Super-VvRHIP1-GFP农杆菌。
采用叶盘法转化方法，本生烟草种子用无菌水冲洗2遍，75％乙醇漂洗30秒后，随后用2.5％次氯酸钠浸泡5-10min，无菌水冲洗5次并用无菌滤纸吸干水分，置于1/2MS培养基培养4-5周。将无菌烟草叶片切成约0.5cm×0.5cm大小，置于转Super-VvRHIP1-GFP农杆菌的悬浮液中，浸泡8-10min，并不时晃动。取出后，用无菌滤纸吸去多余菌液，将叶片转到含BAP 1.0mg/L的MS固体培养基上于26℃培养3天。将共培养后的烟草叶盘用含特美丁250mg/L的MS液体培养基清洗后，置于含BAP 1.0mg/L、潮霉素30mg/L、特美丁250mg/L的MS固体筛选培养基上，26℃下培养。不定芽长到约1-2cm时，切下并转移到含潮霉素30mg/L、特美丁250mg/L的1/2MS生根培养基，生根培养3-4周，将小苗移至温室培养。2-3月后，收获该转基因苗收种为T1代种子，经潮霉素30mg/L筛选，获得纯和T2苗用于后续实验。
取转基因VvRHIP1-GFP的T2代烟草叶片，经液氮研磨后，采用多糖多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取样品总RNA，利用SuperscriptⅢ反转录试剂盒(Invitrogen公司)反转录合成cDNA。设计特异性引物：上游引物VvRHIP1-qF:5’-CACTGGAAGTCAACTCAAG-3’；下游引物VvRHIP1-qR:5’-GATGTCATAGAAGCAACCTC-3’。内参基因NbEF1a引物序列为：NbEF1a-qF:5’-AAGGTCCAGTATGCCTGGGTGCTTGAC-3’；下游引物NbEF1a-qR:5’-AAGAATTCACAGGGACAGTTCCAATACCA-3’。反应体系为：0.5μL反转录产物，引物3.5μL(0.5μM)，7μL 2×SYBR green，加水至总体积14μL。参照TaKaRa说明书，采用SYBRGreen I染料法进行荧光定量PCR，反应在ABI7500 Real-time PCR检测系统上进行。反应程序为：95℃预变性3min，进入95℃30s，60℃30s，72℃30s共40个循环，设置3个生物学重复。根据实时荧光定量PCR得到的Ct值以及标准曲线，采用2-△△Ct法分析数据，以野生型本生烟草做对照，计算VvRHIP1基因的相对转录水平。
结果如图2所示，VvRHIP1超表达烟草(OV-R3,OV-R16,OV-R25)株系中，VvRHIP1的表达量显著提高，是对照的150-200倍。
取转基因VvRHIP1-GFP的T2代烟草叶片，经液氮研磨后，用蛋白提取试剂盒将水稻叶片于液氮中充分研磨后，加入150L蛋白质抽提缓冲液[150mM NaCl，0.5％Triton X-100，50mM Tris-HCl(pH＝7.5)，蛋白酶抑制剂]，冰上放置30min后4℃12000g离心10min，吸取上清于新管中，液氮速冻-80℃保存。上样前加入5×SDS的上样缓冲液煮沸5min，以使蛋白充分变性。SDS-PAGE电泳后，采用电泳印迹法进行将蛋白转PVDF膜；5℅脱脂牛奶封闭过夜；Anti-GFP一抗孵育4-6小时，TBST缓冲液漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min；加入二抗孵育1小时后，用HRP显色化学发光检测参考康为世纪的说明书。
结果如图3所示，VvRHIP1超表达烟草(OV-R3,OV-R16,OV-R25)株系中，都检测到VvRHIP蛋白的表达。
2.超表达VvRHIP1转基因烟草对可可毛色二孢菌菌株CSS-01s的抗性分析
将可可毛色二孢菌株CSS-01s转至PDA培养基上，于26℃培养2-3周产孢，调整孢子数目为1×106个/ml，以0.02％的silwet水溶液模拟接种作为对照。取生长6周的转基因VvRHIP1-GFP的T2代烟草叶片，将孢子悬浮液滴加到烟草叶片上，接种后的枝条置于26℃、12小时光照12小时黑暗、相对湿度为90％的接种室中培养，4-5天统计病斑长度，并拍照。于接种0和12小时，取接种叶片，液氮中速冻，-80℃冰箱保存备用。叶片经液氮研磨后，采用多糖多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取样品总RNA，利用SuperscriptⅢ反转录试剂盒(Invitrogen公司)反转录合成cDNA。对防卫Marker基因(NbPR1和NbLOX)进行检测，设计特异性引物：上游引物NbPR1-qF:5’-CCGCCTTCCCTCAACTCAAC-3’，下游引物NbPR1-qR:5’-GCACAACCAAGACGTACTGAG-3’；上游引物NbLOX-qF:5’-AAAACCTATGCCTCAAGAAC-3’，下游引物NbLOX-qR:5’-ACTGCTGCATAGGCTTTGG-3’。内参基因VvEF1引物序列为：NbEF1a-qF:5’-AAGGTCCAGTATGCCTGGGTGCTTGAC-3’；下游引物NbEF1a-qR:5’-AAGAATTCACAGGGACAGTTCCAATACCA-3’。反应体系为：0.5μL反转录产物，引物3.5μL(0.5μM)，7μL 2×SYBR green，加水至总体积14μL。参照TaKaRa说明书，采用SYBRGreen I染料法进行荧光定量PCR，反应在ABI7500 Real-time PCR检测系统上进行。反应程序为：95℃预变性3min，进入95℃30s，60℃30s，72℃30s共40个循环，设置3个生物学重复。根据实时荧光定量PCR得到的Ct值以及标准曲线，采用2-△△Ct法分析数据，计算基因的相对转录水平。
可可毛色二孢菌株CSS-01s接种VvRHIP1基因超表达株系6天后，我们对发病结果进行了统计，结果如图4A和4B所示。从图中看出，数值经显著性分析证明，VvRHIP1超表达烟草(OV-R3,OV-R16,OV-R25)三个超表达植株病斑长度比对照要小，发病情况要比野生型对照轻。
此外，通过荧光定量PCR分析了接种前后超表达植株中防卫相关基因的表达情况，结果如图5A和5B所示。接菌12h后，野生型中，NbPR1和NbLOX基因的表达较0h都有了一定程度的诱导；而在VvRHIP1超表达烟草(OV-R3,OV-R16,OV-R25)三个超表达植株植株中的诱导倍数要比野生型要大，说明VvRHIP1基因的超表达也影响(提高)了防卫相关基因NbPR1和NbLOX的表达。
3.激发子处理超表达VvRHIP1转基因烟草
为了进一步明确VvRHIP1基因是否在植物的防卫反应中发挥作用，用激发子鞭毛蛋白flg22对生长10天的转基因幼苗进行处理，于处理0和12小时，取接种叶片，液氮中速冻，-80℃冰箱保存备用。叶片经液氮研磨后，采用多糖多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取样品总RNA，利用SuperscriptⅢ反转录试剂盒(Invitrogen公司)反转录合成cDNA。对防卫Marker基因(NbPR1和NbLOX)进行检测，设计特异性引物：上游引物NbAcre31-qF:5’-AATTCGGCCATCGTGATCTTGGTC-3’，下游引物NbAcre31-qR:5’-GAGAAACTGGGATTGCCTGAAGGA-3’；上游引物NbGras2-qF:5’-TACCTAGCACCAAGCAGATGCAGA-3’，下游引物NbGras2-qR:5’-TCATGAGGCGTTACTCGGAGCATT-3’；上游引物NbPti5-qF:5’-CCTCCAAGTTTGAGCTCGGATAGT-3’，下游引物NbGras2-qR:5’-CCAAGAAATTCTCCATGCACTCTGTC-3。内参基因VvEF1a引物序列为：NbEF1a-qF:5’-AAGGTCCAGTATGCCTGGGTGCTTGAC-3’；下游引物NbEF1a-qR:5’-AAGAATTCACAGGGACAGTTCCAATACCA-3’。反应体系为：0.5μL反转录产物，引物3.5μL(0.5μM)，7μL 2×SYBR green，加水至总体积14μL。参照TaKaRa说明书，采用SYBR Green I染料法进行荧光定量PCR，反应在ABI7500 Real-time PCR检测系统上进行。反应程序为：95℃预变性3min，进入95℃30s，60℃30s，72℃30s共40个循环，设置3个生物学重复。根据实时荧光定量PCR得到的Ct值以及标准曲线，采用2-△△Ct法分析数据，计算基因的相对转录水平。通过qRT-PCR分析该基因的表达特性。结果图6显示，flg22处理12h后，野生型中，NbAcre3、NbGras2和NbPti5基因的表达较0h都有了一定程度的诱导；而在VvRHIP1超表达烟草(OV-R3,OV-R16,OV-R25)三个超表达植株植株中的诱导倍数要比野生型要大，说明VvRHIP1基因的超表达也影响(提高)了防卫相关基因NbAcre3、NbGras2和NbPti5的表达。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 葡萄溃疡病抗性相关蛋白及其编码基因和应用
<130> WHOI220013
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 葡萄(Vitis vinifera L.)
<400> 1
atggcggagg cgacgccgtc gtcagctccg gcaccggcag atggagaatc gatatcgcag 60
cagcagcaga agccatggca catttcattt gcggaggatt tgcagcgtac ggtcagcgaa 120
tcggcagatt ccgccattcg ctcagctctg tctctccagc aaaactcgtc ctctcatctt 180
cgctccttgc aggaatttat acctcaaatg gaatcccagt atagaactta tgaagatgct 240
ttcttcaaga aagttaaaga tgagttgacg agtgcaaaag aacacccagt tgtggttggt 300
gcagttgctg ttacagctgg cctcatcttc ctgcgaggcc caagaaggtt tctgtttcat 360
catacattgg ggcgatttca gagtgaggag gcacagtttg taagagctga gaaaaatgta 420
aaagagttga atctttctgt tgacttaatg aagaatgaga gcagaaaact tcttgaaaga 480
gcagctcttg ctgaaaagga tatgaaatgt ggccatactg agctcatgaa cactggaagt 540
caactcaagc gccttgctaa aacagttttc aaagttgaag cccaagctgc agatttaatg 600
gatgggctgc gagaaactcc tggtagggag gctttaaaac taagatcaga ggttgcttct 660
atgacatcac ttttgaagca gcagaggata gctctggaca aaaggataat gaagatttct 720
gaattagggg ttcctgtt 738
<210> 2
<211> 246
<212> PRT
<213> 葡萄(Vitis vinifera L.)
<400> 2
Met Ala Glu Ala Thr Pro Ser Ser Ala Pro Ala Pro Ala Asp Gly Glu
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gln Gln Gln Gln Lys Pro Trp His Ile Ser Phe Ala Glu
20 25 30
Asp Leu Gln Arg Thr Val Ser Glu Ser Ala Asp Ser Ala Ile Arg Ser
35 40 45
Ala Leu Ser Leu Gln Gln Asn Ser Ser Ser His Leu Arg Ser Leu Gln
50 55 60
Glu Phe Ile Pro Gln Met Glu Ser Gln Tyr Arg Thr Tyr Glu Asp Ala
65 70 75 80
Phe Phe Lys Lys Val Lys Asp Glu Leu Thr Ser Ala Lys Glu His Pro
85 90 95
Val Val Val Gly Ala Val Ala Val Thr Ala Gly Leu Ile Phe Leu Arg
100 105 110
Gly Pro Arg Arg Phe Leu Phe His His Thr Leu Gly Arg Phe Gln Ser
115 120 125
Glu Glu Ala Gln Phe Val Arg Ala Glu Lys Asn Val Lys Glu Leu Asn
130 135 140
Leu Ser Val Asp Leu Met Lys Asn Glu Ser Arg Lys Leu Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ala Ala Leu Ala Glu Lys Asp Met Lys Cys Gly His Thr Glu Leu Met
165 170 175
Asn Thr Gly Ser Gln Leu Lys Arg Leu Ala Lys Thr Val Phe Lys Val
180 185 190
Glu Ala Gln Ala Ala Asp Leu Met Asp Gly Leu Arg Glu Thr Pro Gly
195 200 205
Arg Glu Ala Leu Lys Leu Arg Ser Glu Val Ala Ser Met Thr Ser Leu
210 215 220
Leu Lys Gln Gln Arg Ile Ala Leu Asp Lys Arg Ile Met Lys Ile Ser
225 230 235 240
Glu Leu Gly Val Pro Val
245

Claims (8)

1.葡萄溃疡病抗性相关蛋白，为如下A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白质具有相同功能的蛋白质。
2.权利要求1所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的编码基因；
优选的，所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)：
1)编码序列是序列表中序列1的第1-738位的cDNA分子或DNA分子；
2)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的cDNA分子或DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的cDNA分子或DNA分子。
3.权利要求1所述的葡萄溃疡病抗性相关蛋白在提高植物葡萄溃疡病抗病性中的应用。
4.与权利要求1中所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)抑制权利要求1中所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白编码基因表达的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)：
1)编码序列是序列表中序列1的第1-738位的cDNA分子或DNA分子；
2)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的cDNA分子或DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的cDNA分子或DNA分子。
6.培育抗病性转基因植物的方法，所述权利要求1所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的编码基因的转入目的植物中，筛选得到超表达所述葡萄溃疡病抗性相关蛋白的转基因植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述抗病性为葡萄溃疡病抗性。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述葡萄溃疡病为由葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaeriaceae)可引起的葡萄溃疡病。
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