CN106834356A - 葡萄溃疡病菌对葡萄致病力的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种葡萄溃疡病菌对葡萄致病力的评价方法。该方法是：将培养在PDA平板上的菌株，打取菌饼置于改良Fries液体培养基中静置培养14天，离心收集上清，用针孔过滤器过滤排除菌丝、孢子和细菌污染，即完成粗毒素原液的制备。选择一年生绿枝条的新生幼嫩叶片，表面消毒后，打取直径为10mm的叶盘，吸取10μL粗毒素原液在叶盘中央部位接种，3天后测定病斑面积，评价葡萄溃疡病菌粗毒素原液的致病力。本发明操作简单、成本低、重复性好，为真菌毒素在葡萄溃疡病菌致病过程中作用研究与抗葡萄溃疡病葡萄品种选育研究提供了技术支撑。

Description

葡萄溃疡病菌对葡萄致病力的评价方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，涉及葡萄溃疡病菌对葡萄致病力的评价方法，具体涉及4种葡萄溃疡病菌(葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodiatheobromae、小新壳梭孢Neofusicoccum parvum、Diplodia seriata)粗毒素原液的制备与致病力评价方法。
背景技术
由葡萄座腔菌科(Botryosphaeria spp.)真菌引起的葡萄溃疡病是一种重要的葡萄病害。葡萄溃疡病主要发生在枝干、叶片和果实上，具体表现为树势衰减、枝干出现溃疡斑、叶片皱缩、果实脱落等。至今已发现葡萄座腔菌科中有21个种能引起葡萄溃疡病，在美国、日本、法国、新西兰等20多个国家广泛发生(URbez-Torres J R,Peduto F,Striegler RK,et al.Characterization of fungal pathogens associated with grapevine trunkdiseases in Arkansas and Missouri.Fungal Diversity.2012:1-21.U Rbez-Torres JR,Gubler W D.Pathogenicity of Botryosphaeriaceae species isolated fromgrapevine cankers in California.Plant Disease.2009,93(6):584-592.)。
近年来，研究表明葡萄座腔菌科真菌可分泌多糖、蜜蜂曲霉素、对羟苯基乙醇等真菌毒素导致寄主植物发生病害(Martos S,Andolfi A,Luque J,et al.Production ofphytotoxic metabolites by five species of Botryosphaeriaceae causing declineon grapevines,with special interest in the species Neofusicoccum luteum andN.parvum.European Journal of Plant Pathology,2008,121(4):451-461.Djoukeng JD,Polli S,Larignon P,et al.Identification of phytotoxins from Botryosphaeriaobtusa,a pathogen of black dead arm disease of grapevine.European journal ofplant pathology,2009,124(2):303-308.Abou-Mansour E,Débieux J L,Ramírez-SueroM,et al.Phytotoxic metabolites from Neofusicoccum parvum,a pathogen ofBotryosphaeria dieback of grapevine.Phytochemistry,2015,115:207-215.)，表明毒素是葡萄溃疡病菌的重要致病因子之一。
目前，主要的葡萄溃疡病菌致病力评价方法，均需要接种活菌，实施需要大量的植物材料和病原菌，容易污染，耗时长等缺点。
发明内容
为了简便、直观的明确毒素在葡萄溃疡病菌在侵染葡萄过程中的作用，
本发明提供获得一种操作简单、成本低、结果可靠的我国4种葡萄溃疡病菌优势种(Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、Neofusicoccum parvum、Diplodia seriata)粗毒素原液的制备方法。
所述方法包括下述步骤：
1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL改良Fries的产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14d；
2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离心管中，常温下10000rpm(相当于11400g)离心8min；
3)将步骤2)中上清用0.25μm的针式过滤器过滤至新的无菌离心管中，即为粗毒素原液。
步骤1)中改良Fries的产毒液体培养基的配方为：每升中含蔗糖20g、酒石酸铵5g、硝酸铵1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、氯化钙0.13g、酵母浸膏1g，加超纯水至1L。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述粗毒素原液的进行葡萄溃疡病菌对葡萄致病力评价的方法，。
具体步骤如下：
1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL改良Fries的产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14d；
2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离心管中，常温下10000rpm离心8min；
3)将步骤2)中上清用0.25μm的针式过滤器过滤至新的无菌离心管中，即为粗毒素原液；
4)选取不同葡萄品种一年生绿枝条顶端起第1至第4片叶子，用1％(w/v)进行消毒处理1min后，用灭菌水冲洗3遍，超净工作台中晾干备用；
5)用直径为1cm的打孔器在经步骤4)处理的叶片上打取叶盘，并将其放入装有润湿灭菌滤纸的培养皿中；
6)用移液器吸取步骤3)中制备的10μL粗毒素原液，接种在步骤5)中所述的叶盘的中心位置，25℃保湿培养3d后根据病斑面积大小评价不同葡萄溃疡病菌粗毒素原液的致病力。
致病力的强弱是通过接种后叶盘上病斑面积大小来分级评价，病斑叶面积应用ImageJ软件进行测定，DPS数据处理系统进行显著性分析。葡萄溃疡病菌致病力评价标准：0级：无病斑；Ⅰ级：病斑面积范围在1-10mm2；Ⅱ级：病斑面积范围在10-20mm2；Ⅲ级：20-40mm2。
本发明建立了一种操作简单、经济、可靠的葡萄溃疡病菌粗毒素原液的制备方法及其致病力评价方法。本方法的建立在选育抗葡萄溃疡病的葡萄品种方面也具有重要意义。
附图说明
图1为夏黑’、‘寒香蜜’和‘巨玫瑰’葡萄品种叶盘法接种葡萄溃疡病菌Diplodiaseriata菌株SDZ-01 3d后的结果，其中a是对照，为‘夏黑’接种无菌水3d后的结果；b为‘夏黑’接种改良Fries培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果；c为‘夏黑’接种改良Czapeck培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果；d是对照，为‘寒香蜜’接种无菌水3d后的结果；e为‘寒香蜜’接种改良Fries培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果；f为‘寒香蜜’接种改良Czapeck培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果；g是对照，为‘巨玫瑰’接种无菌水3d后的结果；h为‘巨玫瑰’接种改良Fries培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果；i为‘巨玫瑰’接种改良Czapeck培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施实施例中所用葡萄溃疡病菌菌株(Lasiodiplodia theobromae)GX-5-5A、Sxg-01s-1、SDZ-01和AH-3-1-01S在文献“Jiye Yan,Yue Xie,Wei Zhang.,etal.Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback inChina.Fungal Diversity.2013,61:221-236.Jiye Yan,Yue Xie,Shengwei Yao,etal.Characterization of Botryosphaeria dothidea,the causal agent of grapevinecanker in China.Australasian Plant Pathology2012,41(4):351-357.”中公开，GXQZ-04s由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所按照常规方法分离、鉴定保存，公众可自行按照常规方法分类或者从北京市农林科学院获得。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、我国4种葡萄溃疡病菌优势种粗毒素原液的致病力评价
1、葡萄溃疡病菌粗毒素原液的制备
采用液体产毒培养基改良Fries和改良Czapeck培养4种葡萄溃疡病菌(葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、小新壳梭孢Neofusicoccumparvum、Diplodia seriata)。将各株葡萄溃疡病菌置于PDA培养基中28℃培养48小时后，在菌落边缘上用打孔器分别打取直径为5mm的菌饼，并将其分别放入50mL改良Fries和改良Czapeck的产毒液体培养基中，3个菌饼/50mL，静置培养14天。改良Fries培养基配方：蔗糖20g、酒石酸铵5g、硝酸铵1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、氯化钙0.13g、酵母浸膏1g，加超纯水至1L；改良Czapeck培养基配方：硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸铁0.01g、蔗糖30g、酵母提取物5g、麦芽糖提取物5g，超纯水定容至1L。PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml，煮沸半个小时，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装，高压蒸汽灭菌(121℃)灭菌20分钟。
14天后，将各菌株培养液倒入50mL的离心管中，10000rpm离心8min，取上清于新的50mL离心管。为避免上清液有杂质、菌丝和孢子的存在，将上清通过滤径为0.25μm针孔过滤器过滤于10mL的离心管中，即为粗毒素原液。滴一滴过滤后的粗毒素原液于PDA培养基上培养24h，排除细菌、菌丝和孢子的污染。粗毒素原液于4℃保存备用。
2、粗毒素原液接种
本发明选取‘夏黑’、‘寒香蜜’和‘巨玫瑰’3种葡萄品种一年生绿枝条顶端起第1至第4片叶子，经质量百分浓度为1％的次氯酸钠浸泡1min后，用灭菌的超纯水浸洗3次，再用吸水纸吸干叶片上多余的水分，使用直径为1cm的打孔器打出叶盘，并将其放入装有润湿滤纸的培养皿中。接着吸取滤液10μL于叶盘中央，并观察拍照。对照为改良Fries、改良Czapeck原液以及超纯水。观察结果表明：相同菌株在不同葡萄品种中表现出不同程度的病害，不同产毒培养基培养获得的滤液致病力存在差异，且不同菌株之间有着不同的致病力(图1)。综合实验结果，用于葡萄溃疡病菌粗毒素原液致病力分析的粗毒素制备的最佳条件为：采用改良Fries培养菌株，获取滤液后接种在葡萄生长枝顶端起第1片幼嫩新叶，接种后3d测量病斑面积。采用改良Czapeck的产毒液体培养基培养的葡萄溃疡病菌粗毒素原液没有在各个品种的葡萄叶面形成病斑，发明人在选择培养基的过程中，使用了其他多种培养基，均无法产生明显病斑。
3、评价葡萄溃疡病菌粗毒素原液致病力的方法
采用上述最佳条件对4种葡萄溃疡病菌(葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、小新壳梭孢Neofusicoccum parvum、Diplodia seriata)对不同葡萄品种进行致病力的评价，致病力的强弱是通过接种后叶盘上病斑面积大小来分级评价，病斑叶面积应用ImageJ软件进行测定，DPS数据处理系统进行显著性分析。葡萄溃疡病菌致病力评价标准：0级：无病斑；Ⅰ级：病斑面积范围在1-10mm2；Ⅱ级：病斑面积范围在10-20mm2；Ⅲ级：20-40mm2。
表1改良Frise培养基获得滤液接种3d后的病斑面积(mm2)
结果如表1所示，结果表明4种葡萄溃疡病菌供试菌株中Diplodia seriata菌株SDZ-01粗毒素原液的致病力最强，其对‘巨玫瑰’和‘夏黑’两个品种的致病力级别为Ⅲ级，对‘寒香蜜’的致病力为Ⅰ级，均高于Sxg-01s-1(Botryosphaeria dothidea)、GXQZ-04s/Gx-5-5A(Botryosphaeria rodina)和AH-3-1-01S(Neofusicoccum parvum)的致病力。
目前，常用的评价致病力方法是将上述4种葡萄溃疡病菌直接接种各品种的枝条，具体方法如下所示，
(1)将待测菌株活化，28℃培养5天，在菌落边缘处用4mm无菌打孔器打取菌饼。
(2)用4mm无菌打孔器刺伤葡萄枝条，造成伤口。
(3)将菌饼菌丝面朝下接种到伤口处，并用封口膜包扎保湿，每株葡萄苗为一个重复，共3个重复，并用接种空白PDA培养基作为对照。
(4)将接种好的葡萄苗置于25℃光照、18℃黑暗、12h光暗交替，50％相对湿度的温室中培养，7天后测量病斑长度。
并判断致病力，评价的结果(Jiye Yan,Yue Xie,Wei Zhang.,et al.Species ofBotryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China.FungalDiversity.2013,61:221-236.Jiye Yan,Yue Xie,Shengwei Yao,etal.Characterization of Botryosphaeria dothidea,the causal agent of grapevinecanker in China.)与本发明上述方法一致，但耗时长，接种方法繁琐。

Claims (8)

1.葡萄溃疡病菌粗毒素原液的制备方法，包括下述步骤：
1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14天；
2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离心管中，11400g离心8min；
3)将步骤2)中上清用滤径为0.25μm的针式过滤器过滤至新的无菌离心管中，即为粗毒素原液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄溃疡病菌为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、小新壳梭孢Neofusicoccumparvum或Diplodia seriata。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述产毒液体培养基为改良Fries产毒液体培养基，所述改良Fries产毒液体培养基的配方为：每升中含蔗糖20g、酒石酸铵5g、硝酸铵1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、氯化钙0.13g、酵母浸膏1g，加超纯水至1L。
4.一种利用权利要求1所述的粗毒素原液的进行葡萄溃疡病菌对葡萄致病力评价的方法，包括下述步骤：
1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14d；
2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离心管中，常温下10000rpm离心8min；
3)将步骤2)中上清用滤径为0.25μm的针式过滤器过滤至新的无菌离心管中，即为粗毒素原液；
4)选取不同葡萄品种一年生绿枝条顶端起第1至第4片叶子，用质量百分浓度为1％次氯酸钠溶液进行消毒处理1min后，用灭菌水冲洗3遍，超净工作台中晾干备用；
5)用直径为1cm的打孔器在经步骤4)处理的叶片上打取叶盘，并将其放入装有润湿灭菌滤纸的培养皿中；
6)用移液器吸取步骤3)中制备的10μm粗毒素原液，接种在步骤5)中所述的叶盘的中心位置，25℃保湿培养3d后根据病斑面积大小评价不同葡萄溃疡病菌粗毒素原液的致病力。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述葡萄溃疡病菌为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、小新壳梭孢Neofusicoccumparvum或Diplodia seriata。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述产毒液体培养基为改良Fries产毒液体培养基，所述改良Fries产毒液体培养基的配方为：每升中含蔗糖20g、酒石酸铵5g、硝酸铵1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、氯化钙0.13g、酵母浸膏1g，加超纯水至1L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述葡萄品种为‘夏黑’、‘寒香蜜’或‘巨玫瑰’葡萄品种。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，选取不同葡萄品种一年生绿枝条顶端起第1片叶子。
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