CN104498188B - 香青菜挥发油提取工艺及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及香青菜挥发油的提取工艺及其应用。步骤为取香青菜地上部分,洗净晾干,测含水量,烘干并粉碎后过筛;以石油醚为提取剂,利用超声波进行提取、抽滤,旋蒸浓缩,冷冻干燥,即得橘黄色透明香青菜挥发油。本发明通过单因素试验和响应面实验设计对超声波辅助提取挥发油的工艺进行优化,筛选出香青菜挥发油的最优提取工艺,并对所得的香青菜挥发油主要成分进行了鉴定,并对其抑菌作用进行了测定。本发明的方法操作方便,目的产物得率和纯度高,同时易于工业放大。香青菜挥发油具有浓郁的香味,并对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有较强的抑菌、杀菌活性,因而可在食品添加剂、化妆品、保健品、空气清新剂等行业得到广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于提取分离领域,涉及一种挥发油的提取工艺及其应用,特别是涉及一种香青菜中挥发油的提取方法,以及该挥发油的抗菌、抑菌用途。
背景技术
香青菜是苏州地方传统特色珍稀蔬菜品种,距今已有100多年的栽培历史。它是苏州市第一个申报农产品地理标志的蔬菜品种,主要分布在沿太湖及太湖西南岸的横扇、七都、震泽、桃源、松陵、平望、盛泽等镇的部分地区,其生长的太湖之畔的“小粉土夜潮泥”,再加上独特的气候条件,不仅在国内,即使在全球都无法复制。香青菜最大的特点是炒熟后有特殊的浓郁香味,并因此得名。除香味浓郁外,该菜糯性易烂,柔嫩,纤维较少,口感良好,营养丰富,为叶菜类中的上品;且其冬性强,抽薹开花晚,可在1-3月份上市大青菜,填补市场青菜供应的不足,是我国独有的青菜品种,深受广大消费者的青睐。
目前,有关香青菜研究主要集中在香青菜的特征特性、常规栽培技术与品种选育工作。 而有关香青菜香气来源的挥发油的研究尚未开展,从而导致香青菜的品质出现不稳定,种植风险增大,严重制约了香青菜产业的发展。因此,通过优化香青菜挥发油提取工艺,分析香青菜香味成分,并对其抗菌作用进行科学评价,对于进一步保护和利用好苏州香青菜这种优质种质资源已迫在眉睫。
发明内容
本发明提供一种香青菜挥发油提取工艺,以香青菜挥发油得率为评价指标,通过单因素试验和响应面试验设计对超声波辅助提取挥发油的工艺进行优化,并香青菜挥发油的主要成分及其抑菌作用进行研究。旨在得到香青菜挥发油的最优提取工艺条件和应用范围,为进一步扩大生产提供一定的科学依据。本发明所述的香青菜挥发油的提取工艺包括以下步骤:
步骤1,取香青菜地上部分,洗净晾干后,测定含水量,烘干并粉碎,过筛,备用;
步骤2,将步骤1所得香青菜粉末中加入与其液料比(mL/g)为10~30倍的石油醚,提取温度为40℃~80℃,超声波功率为100W~500W的条件下,超声萃取时间为10~50min,真空抽滤,旋蒸浓缩后冷冻干燥,得到香青菜挥发油。
优选的,所述的香青菜挥发油的提取工艺,所述的提取工艺中香青菜粉末中加入与其液料比20~30mL/g的石油醚;提取温度为50℃~70℃;超声波功率为200W~400W;超声萃取时间为30~50min。
进一步优选的,所述的香青菜挥发油的提取工艺,液料比为26.5mL/g。
进一步优选的,所述的香青菜挥发油的提取工艺,超声波功率为378W。
进一步优选的,所述的香青菜挥发油的提取工艺,超声提取时间为50min。
进一步优选的,所述的香青菜挥发油的提取工艺,提取温度为62℃。
其中,以上任一所述的香青菜挥发油的提取工艺,烘干温度为35℃,过筛时筛子目数为60目。
以上任一所述的香青菜挥发油的提取工艺制备得到的香青菜挥发油。
优选的,所述的香青菜挥发油的抑菌和杀菌用途,包括在食品、化妆品、日化产品、药品、保健品中的抑菌或杀菌用途。
本发明与现有技术相比,其显著优点在于:第一,本发明首次利用优化工艺分离提取得到香青菜挥发油。第二,本发明克服了以往挥发油提取工艺的提取时间长的缺点,提高了提取效率,节省了人力物力,降低了提取成本;第三,本发明采用单因素和响应面设计方法优化葎香青菜挥发油提取工艺,确保了提取工艺条件准确可靠,具有安全、经济等特点,适用于大规模生产。
附图说明
图1为香青菜挥发油提取工艺及分析的工艺流程图;
图2为超声波功率对香青菜挥发油得率的影响结果图;图3为超声提取时间对香青菜挥发油得率的影响结果图;图4为液料比对香青菜挥发油得率的影响结果图;图5为超声提取温度对香青菜挥发油得率的影响结果图;
图6为超声波功率与超声提取时间交互作用对香青菜挥发油得率影响的响应面和等值线图;图7为超声波功率与液料比交互作用对香青菜挥发油得率影响的响应面和等值线图;图8为超声波功率与提取温度交互作用对香青菜挥发油得率影响的响应面和等值线图;图9为超声提取时间与液料比交互作用对香青菜挥发油得率影响的响应面和等值线图;图10为超声提取时间与提取温度交互作用对香青菜挥发油得率影响的响应面和等值线图;图11为液料比与提取温度交互作用对香青菜挥发油得率影响的响应面和等值线。
具体实施方式
实施例1:香青菜挥发油的提取工艺优化及成分分析
步骤1,取12月下旬采集的香青菜,用蒸馏水洗净,在常温下晾干外表水,测定其平均含水量为91.8%,将其在35℃下烘干并粉碎,过60目筛后备用;
步骤2,将步骤1所得香青菜粉末中加入与其液料比分别为10 mL/g、15 mL/g、20mL/g、25 mL/g和30mL/g的石油醚,温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,超声波功率为100W、200W、300W、400W、500W的条件下,超声萃取10、20、30、40、50min,然后用真空抽滤机抽滤,旋蒸浓缩后进行冷冻干燥,得到香青菜挥发油。
步骤3,将步骤2初步优选出的各个挥发油提取的影响因素:以石油醚为提取剂,在液料比为20mL/g、25 mL/g、30mL/g,提取温度为50℃、60℃、70℃,超声波功率为200W、300W、400W的条件下,超声萃取30 min、40 min、50min;利用这些3水平的不同影响因子,采用响应面设计优化香青菜挥发油提取工艺。
步骤4,在单因素试验基础上,根据Box-Behnken 的中心组合设计原理,以超声波功率、超声提取时间、液料比和超声提取温度四个因素为自变量( 分别以X1,X2,X3 ,X4表示),以香青菜挥发油得率为响应值设计了四因素三水平共29个实验点的响应面分析实验,其中分为24个析因点和5个零点。
1.响应面试验
(1) 响应面试验具体包括如下几个方面实验:
X1:超声波功率(200W~400W)对香青菜挥发油得率的影响
X2:超声提取时间(30min~50min)对香青菜挥发油得率的影响
X3:液料比(20mL/g~30 mL/g)对香青菜挥发油得率的影响
X4:超声提取温度(50℃~70℃)对香青菜挥发油得率的影响
(2) 响应面试验设计表:
表1 三因素三水平响应面分析试验设计表
实验以随机次序进行,将实验所得的香青菜挥发油得率用Design-Expert 8.06程序进行分析,并得出回归拟合方程以及方差分析表及响应面分析图。响应面实验设计与结果见表2。
表2 响应面中心组合实验方案及结果
(3) 模型的建立与方差分析
根据Box-Behnken中心组合设计原理,利用Design-Expert.V8.0.6软件对表2中的实验数据进行多元回归拟合,可得超声波功率、超声提取时间、液料比和超声提取温度香青菜挥发油得率之间相互关系的二次多元回归方程:
Y= 2.33-6.167E-003* X1+0.14 * X2+0.042* X3-0.022*42* X4+0.095* X1 * X2+0.034* X1 * X3-0.043* X1 * X4-7.275E-003* X2 * X3+0.087* X2 * X4+0.043*X3*X4-0.058*X12-0.055*X22-0.12* X32-0.14* X42
式中X1、X2、X3和X4的各项系数的绝对值大小直接反映出各因素对香青菜挥发油得率的影响程度,系数的正负反映出香青菜挥发油得率增加或减小。对表2中的实验结果进行统计分析,分析结果如表3所示。
表3回归模型方差分析表
备注:表3中Prob>F 值小于0.01时表示有极显著影响,用**表示,Prob>F值 小于0.05时表示有显著影响,用*表示,而当Prob>F 值大于0.05时,则表示影响不显著。
由表3可知,模型中一次项中超声提取时间(X2)对方程影响最显著,说明超声提取时间直接关系到香青菜挥发油的得率;二次项中的超声提取温度(X4)和超声提取时间(X2)均对香青菜挥发油得率有显著影响,且其影响呈二次关系。由F值可知,各因素对香青菜挥发油得率的影响次序为:超声提取时间(X2)>液料比(X3)>超声提取温度(X4)>超声波功率(X1)。整体模型的Prob>F值小于0.01,表明该回归模型达到极显著水平;回归模型的相关系数R2= 0.9164(Radj 2=0.8328),且失拟项不显著(Prob>F值为0.2933,大于0.05),说明模型与数据之间拟合度较好,因此可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。同时做出中心组合设计试验所得的6组响应面曲面图,参见附图3。
(4) 香青菜挥发油最佳提取条件的预测与检验
响应面图形是特定的响应值Y对应的因素X1、X2、X3、X4构成的一个三维空间在二维平面上的等高图,可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。图中可看到拟合曲面有最大值,对拟合方程求偏导,可得出模型最大值,即为最优的试验方案。
在实验范围内,通过Design- Expert.V8.0.6软件对回归方程分析预测,得出香青菜挥发油的最优提取工艺条件为:超声波功率为378.4W,超声提取时间为50min,液料比为26.4 mL /g,超声提取温度为61.6℃,理论最高得率为2.46%。
为验证响应面分析法所得结果的可靠性,采用上述优化条件进行试验。考虑到实验的可操作性,将实验条件适度调整为:超声波功率为378W,超声提取时间为50min,液料比为26.5 mL/g,超声提取温度为62℃。在此工艺条件下,香青菜挥发油得率的平均值为2.43%,与预测得率的误差为1.2%。说明了回归方程的预测值与试验值之间具有较好的拟合度。因此,基于响应面法所得的优化工艺参数准确可靠,具有实用价值。
步骤5,香青菜挥发油化学成分分析
香青菜挥发油化学成分分析是在Bruker SCION SQ GC-MS(美国)仪器上测定的,其具体测定条件是:a.气相色谱条件:色谱柱,DB-wax(30m*0.25mm*0.25um)石英毛细管色谱柱;进样口温度:250℃;程序升温:起始温度40℃,保持3 min,以升温速率5℃/ min,升温到90℃,再以升温速率10℃/ min,升温到230℃,保持8分钟;载气:氦气,流速:0.8毫升/min;不分流。b.质谱条件:电离方式:EI,电子能量为70eV;离子源温度:200℃; 接口温度:250℃;质量扫描范围:33-400;检测器电压1000v。
分析鉴定结果表明,香青菜挥发油主要化学成分为脂肪族、芳香族和萜类3 大类化
合物以及它们的含氧衍生物如醇、醛、酮、酸、醚、酯、内酯等,鉴定了其中的48个成分,占全部精油的96% 以上。其中主要化合物为亚麻酸甲酯(14.31%)、3-苯基丙腈(12.18%)、邻苯二甲酸二丁酯(10.34%)、邻苯二甲酸二乙酯(9.74%)、棕榈酸(7.12%)、3-戊烯腈(4.18%)、二甲基三硫(3.97%)、亚麻酸甲酯(3.85%)、异硫氰酸-3-丁烯-1-基酯(3.15%)等。
香青菜挥发油成分检索结果见表4:
表4 香青菜挥发油化学成分检索结果
表4-1
表4-2
表4-3
实施例2:香青菜挥发油抑菌作用
步骤1:香青菜挥发油制备
取香青菜干燥粉末1000g,利用实施例1中所得的香青菜挥发油优化提取工艺(超声波功率为378W,超声提取时间为50min,液料比为26.5mL/g,超声提取温度为62℃)进行香青菜挥发油制备,挥发油冷冻干燥后得到24.25g橘黄色透明挥发油,香青菜挥发油的得率为2.425%。
步骤2:香青菜挥发油抑菌作用
(1)供试菌种:
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、酿酒酵母、灰绿青霉(以上菌种均由苏州科技学院微生物实验室提供)。
(2)培养基:
牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,琼脂1.5% -2.0% ( 液
体培养基不含琼脂),水1000mL,pH7.0-7.2( 使用1.0mol/L 的NaOH 溶液调节pH)。
马铃薯葡萄糖培养基:马铃薯 200克 葡萄糖 20克琼脂 15~20克,自来水 1000毫升,自然pH。
(3)菌悬液的配制:
从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应的液体培养基中,放入恒温振
荡培养箱培养至对数生长期。分别吸取以上培养时间的供试菌液0.5mL,加入无菌水倍比稀
释到105-106mL-1,备用。
(4)供试药物:
对照药:头孢拉定; 样品:实施例1所得的香青菜挥发油
(5)抑菌活性的测定:
采用滤纸片法测定抑菌活性。使用打孔器,将定性滤纸制成小圆纸片(D=6mm),高
压灭菌后备用。无菌条件下,在已灭菌的培养皿中倾入相应菌种的培养基25.00mL,冷却凝
固后制成固体平板。将上述接种活化好的各种菌分别取适量初试菌悬液用生理盐水将其稀释成含菌量为106~107CFU/mL 的菌悬液备用(其中真菌采用显微镜血球计数板计数,用接种环挑取真菌于无菌生理盐水中,调整稀释均匀后吸取一部分置于血球计数板(16×25规格)中,使得其在显微镜下观测视野中每个中方格中孢子数为14~18个,成为106~107个/ml的孢子菌悬液)。
将灭完菌的干燥的滤纸片用镊子夹到配制好的溶液(用DMSO稀释配制)中浸泡30min,用无菌镊子在试管壁上弄去多余溶液,放到上述的各个含菌培养皿上,每个培养皿上放置三片滤纸片,细菌于37℃倒置培养24h,真菌于28℃倒置培养48h后观察结果。培养时间到后取出培养皿观察透明抑菌圈,采用十字交叉法用测微尺测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径大小,取其平均值( mm) 为测定结果,每项抑菌实验均平行重复3 次。以抑菌圈直径的大小来进行抑菌活性强弱的判定,抑菌圈表现得越大,则表明其抗菌活性也就越强。
(6)实验结果
抑菌活性测定结果如表5所示。
表5 香青菜挥发油对各种微生物作用的抑菌圈大小(mm)
表5 香青菜挥发油对各种微生物作用的抑菌圈大小(mm)
由表5可知,实施例1所得的香青菜挥发油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、灰绿青霉均具有较强的抑菌活性,且对大肠杆菌的抑菌活性最强。
步骤3:香青菜挥发油最低抑菌浓度(MIC)测定
(1)香青菜挥发油不同浓度溶液配制:取香青菜挥发油用1/2体积对半稀释的方法将它们分别配置成浓度为100mg/mL;50mg/mL;25 mg/mL;12.5 mg/mL;6.25mg/mL;3.12 mg/mL;1.56mg/mL;0.78 mg/mL,0mg/mL的溶液备用。
(2)灭菌:将实验所需要的培养皿、培养基、试管、枪头、蒸馏水、生理盐水经牛皮纸包装好后在121℃湿热灭菌20min,灭完菌将其放置超净工作台紫外灭菌30min。
(3)接种:在超净工作台上,分别将1mL上述配制的提取物加入装有9mL固体培养基的试管中混合均匀后倒入培养皿中,配制成终浓度为10mg/mL;5 mg/mL;2.5 mg/mL;1.25mg/mL;0.625 mg/mL ;0.312 mg/mL;0.156 mg/mL;0.078 mg/mL,0mg/mL的药物平板。取配制好的菌悬液,吸取2μL滴加到不同浓度提取物的平板培养基中,细菌于37℃恒温箱中倒置培养24h,真菌于28℃恒温箱中倒置培养48h后观测结果。
(4)MIC确定:24h后观察细菌培养基中各浓度药物平板上菌生长的情况,几个浓度梯度中第一次没有出现菌生长的药物平板浓度就是所测的最低抑菌浓度。48h后观察测量真菌培养基中各浓度药物平板真菌生长情况,首次没有出现真菌生长的药物平板浓度即为最低抑菌浓度。
(5)实验结果
抑菌活性测定结果如表6所示。
表6 香青菜挥发油对各种微生物作用的MIC大小(mg/mL)
菌种 | MIC |
大肠杆菌 | 0.625 |
金黄色葡萄球菌 | 0.156 |
枯草芽孢杆菌 | 0.156 |
通过以上实例可以发现,香青菜挥发油具有浓郁的香味,同时也具有较好的抗菌、杀菌活性,对于香青菜的研究开发具有重要的实践意义和应用前景。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何人员在本发明披露的技术范围内得到的技术方案的简单变化或等效替换均在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.香青菜挥发油的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺包括以下步骤:
步骤1,取香青菜地上部分,洗净晾干后,测定含水量,烘干并粉碎,过筛,备用;
步骤2,在步骤1所得香青菜粉末中按10~30 mL/g的比例加入石油醚,提取温度为40℃~80℃,超声波功率为100W~500W的条件下,超声萃取时间为10~50min,真空抽滤,旋蒸浓缩后冷冻干燥,得到香青菜挥发油。
2.根据权利要求1所述的香青菜挥发油的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中香青菜粉末中加入与其液料比为20~30 mL/g的石油醚;提取温度为50℃~70℃;超声波功率为200W~400W;超声萃取时间为30~50min。
3.根据权利要求1所述的香青菜挥发油的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中液料比为26.5mL/g。
4.根据权利要求1所述的香青菜挥发油的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中超声波功率为378W。
5.根据权利要求1所述的香青菜挥发油的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中超声提取时间为50min。
6.根据权利要求1所述的香青菜挥发油的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中提取温度为62℃。
7.根据权利要求1至6任一所述的香青菜挥发油的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中烘干温度为35℃,过筛时筛子目数为60目。
8.根据权利要求1至6任一所述的香青菜挥发油的提取工艺制备得到的香青菜挥发油。
9.根据权利要求8所述的香青菜挥发油的抑菌或杀菌用途。
10.根据权利要求9所述的香青菜挥发油的抑菌、杀菌用途,其特征在于所述的香青菜挥发油在食品、化妆品、日化产品、保健品行业中的抑菌、杀菌用途。
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