CN107667939A - 使用克氏原螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法 - Google Patents
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Abstract
使用克氏原螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法，具体步骤如下：步骤一，选取植物提取液所对应的实验材料：步骤二，确定实验菌种：步骤三，选取克氏原螯虾为实验动物：步骤四，进行植物提取液的提取，并制成提取物与萃取物，测定实验菌种的抑菌圈直径，再进行饲料制备投喂实验动物，再测定血清总蛋白含量，确定实验动物死亡率：步骤五，进行实验结果判定。本发明提供使用克氏原螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法，通过采用相应的植物提取液方法提取对应的植物提取液，再根据特定的方法将其加入到克氏原螯虾，根据其死亡率判断对应植物提取液对对应菌种的抗药性。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取液验证方法领域，特别是涉及使用克氏原螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法。
背景技术
近年来养殖业在抗生素使用过程中对其用量、用药次数、停药期的忽视导致农副产品中药物残留等问题日益突出。而人类因直接使用抗生素或摄入食物中残留的抗生素，导致抗生素在其体内富集引起毒理效应、导致病源菌产生耐药性使药效降低等问题也日趋严重。为了解决抗生素带来的这些问题，寻找新的、天然的、能够替代抗生素控制传染性疾病的药物成为当务之急。在水产养殖过程中克氏原螯虾会出现各种各样的细菌性疾病和病害，例如烂尾病，黑鳍病，还有克氏原螯虾的机械损伤，体内寄生虫入侵。而植物提取物用于抑制克氏原螯虾的细菌性疾病引起有着极为重要的作用。植物提取液往往具有较佳的抑菌活性，为了对其进行验证可以考虑，将其添加至克氏原螯虾(Procambarus clarkii)饲料中，观察萃取物对克氏原螯虾存活率及非特异性免疫力的影响，为开发有效控制细菌性疾病的植物药物以及天然的植物饲料添加剂提供资料。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明提供使用克氏原螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法，通过采用相应的植物提取液方法提取对应的植物提取液，再根据特定的方法将其加入到克氏原螯虾，根据其死亡率判断对应植物提取液对对应菌种的抗药性，为达此目的，本发明提供使用克氏原螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法，具体步骤如下：
步骤一，选取植物提取液所对应的实验材料：
步骤二，确定实验菌种：
步骤三，选取克氏原螯虾为实验动物：
步骤四，进行植物提取液的提取，并制成提取物与萃取物，测定实验菌种的抑菌圈直径，再进行饲料制备，再测定血清总蛋白含量，再进行喂养确定实验动物死亡率：
1)将采集的实验材料研磨，称取20g粉末，按照1:20的比例分别用水、乙醇浸泡2小时后抽滤，收集滤液，抽滤后的粉末继续浸泡24小时后再抽滤，收集滤液，如此反复3-4次，合并滤液；利用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，即得实验材料提取物；
2)别取植物提取的提取物30g，各按1:10的比例用蒸馏水溶解，然后按照极性由小到大分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种有机溶剂分步进行萃取，每种溶剂萃取3-4次后合并同种萃取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，即得各种萃取物；
3)在已分离纯化培养的待测菌平板上挑取3-5个相同的单菌落，接种到5mL液体培养基上，28℃、150rpm摇床培养18-22小时，再用麦氏比浊法测出液体培养基的浓度，将浓度稀释至106cfu/mL；
取每种提取物，用二甲基亚砜溶解配成1g/mL的溶液，然后再用二甲基亚砜依次稀释，使其浓度成为200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL和12.5mg/mL的药液，同时，以氯霉素作为抗生素，换算其浓度与提取物的浓度相一致；
4)采用滤纸片法测定不同提取物的不同浓度对实验菌种的抑菌圈直径；
5)饲料的制备，将提取物和萃取物分别按基础饲料质量的1.00％添加至克氏原螯虾的普通饲料中，然后重新制成含有提取物、萃取物的颗粒饲料，用于饲喂克氏原螯虾；同时，将抗生素氯霉素按基础饲料的1.00％添加至预先粉碎的上述配合饲料中，然后重新制成含有氯霉素的颗粒饲料，用于饲喂克氏原螯虾；
6)测定血清总蛋白含量，饲喂动物15天后，在每组实验动物中各取6雌、6雄克氏原螯虾，用1ml无菌注射器从其头胸甲后插入心脏取血，血样在4℃冰箱静置12小时后，4℃10000r/min离心30min分离制备血清；
标准曲线绘制：取六个10ml离心管，每管加入5mL的考马斯亮蓝染液，然后在各管依次加入1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5mL的pH6.4 0.1M的磷酸钾盐缓冲液，然后各管再对应的加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的0.1mg/mL的蛋白标准液，混匀后静置2min，测定595nm处的吸光值，即得吸光值，并制作蛋白含量的标准曲线；
蛋白含量测定：在10mL离心管中依次加入5mL考马斯亮蓝染液及1mL待测样液，同时制作空白管，以缓冲液替代待测样品液，静置2min后测定595nm处吸光值，根据标准曲线计算蛋白含量；
7)将上述实验的个体，在饲喂不同组饲料15天后，对每个个体从第2-3腹节间肌肉注射浓度为108cfu/mL的嗜水气单胞菌0.1mL，分别于攻毒后的2、4、6、8、10、12、24、36和48小时统计动物的死亡率；
步骤五，进行实验结果判定：
1)植物提取物对菌种的抑菌圈直径大小；
2)植物提取物乙酸乙酯萃取物对菌种抑菌圈直径影响；
3)植物提取物萃取物对克氏原螯虾血清蛋白的影响；
4)判定植物提取物对克氏原螯虾存活率的影响。
本发明的进一步改进，所述实验菌种选用嗜水气单胞菌或温和气单胞菌或副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌或大肠杆菌或铜绿假单胞菌或鼠伤寒沙门氏菌。
本发明的进一步改进，步骤四中采用滤纸片法测定不同提取物的不同浓度对实验菌种的抑菌圈直径，具体方式如下，选用定性滤纸，用打孔器制作直径为6mm的圆形纸片，121℃高压灭菌20min，60℃烘干，用无菌镊子分别夹取到不同提取物、不同浓度的药液中浸泡24小时；用移液枪吸取15μL菌悬液涂布于平板上，制成含菌平板；再将晾干的带药滤纸片均匀贴于含菌平板上，29℃培养18-22小时后，用十字交叉法测量抑菌圈直径，每个抑菌圈测量4次，取其平均值作为最后的抑菌圈直径。
本发明提供使用克氏源螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法，通过特定方式收集对应植物提取液，然后对提取液采用不同的溶剂萃取分离，选出抑菌能力最强的萃取物，将其添加至克氏原螯虾饲料中，观察萃取物对克氏原螯虾存活率及非特异性免疫力的影响，再根据相应死亡率得出对应结论，为开发有效控制细菌性疾病的植物药物以及天然的植物饲料添加剂提供资料。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
本发明提供使用克氏源螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法，通过采用相应的植物提取液方法提取对应的植物提取液，再根据特定的方法将其加入到克氏原螯虾，根据其死亡率判断对应植物提取液对对应菌种的抗药性。
作为本发明一种具体实施例，由于野菱作为湿地植物由于其生活环境的特殊性，在抵抗病原微生物等方面可能具有独特的作用，本发明采用菱壳提取物，采用乙醇提取法提取有效成分，确定它们对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas aeruginosa)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)7种细菌的抑菌活性，进一步采用不同的溶剂萃取分离，选出抑菌能力最强的萃取物，将其添加至克氏原螯虾(Procambarus clarkii)饲料中，观察萃取物对克氏原螯虾存活率及非特异性免疫力的影响，具体步骤如下：
实验材料选用湿地植物野菱：
实验菌种选用嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、温和气单胞菌(A.sobria)、副溶血弧菌(V.Parahemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；
实验动物选用克氏原螯虾：
实验方法如下：
1.将采集的阴干野菱研磨，称取20g粉末，按照1:20的比例分别用水、乙醇浸泡2小时后抽滤，收集滤液，抽滤后的粉末继续浸泡24小时后再抽滤，收集滤液，如此反复3-4次，合并滤液；利用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，即得野菱提取物。
2.别取植物提取的提取物30g，各按1:10的比例用蒸馏水溶解，然后按照极性由小到大分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种有机溶剂分步进行萃取，每种溶剂萃取3-4次后合并同种萃取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，即得各种萃取物。
3.在已分离纯化培养的待测菌平板上挑取3-5个相同的单菌落，接种到5mL液体培养基上，28℃、150rpm摇床培养18-22小时，再用麦氏比浊法测出液体培养基的浓度，将浓度稀释至106cfu/mL。
取每种提取物，用二甲基亚砜溶解配成1g/mL的溶液，然后再用二甲基亚砜依次稀释，使其浓度成为200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL和12.5mg/mL的药液。同时，以氯霉素作为抗生素，换算其浓度与提取物的浓度相一致。
4.采用滤纸片法测定不同提取物的不同浓度对7种菌的抑菌圈直径。选用定性滤纸，用打孔器制作直径为6mm的圆形纸片，121℃高压灭菌20min，60℃烘干，用无菌镊子分别夹取到不同提取物、不同浓度的药液中浸泡24小时；用移液枪吸取15μL菌悬液涂布于平板上，制成含菌平板；再将晾干的带药滤纸片均匀贴于含菌平板上，29℃培养18-22小时后，用十字交叉法测量抑菌圈直径，每个抑菌圈测量4次，取其平均值作为最后的抑菌圈直径。
5.饲料的制备将提取物和萃取物分别按基础饲料质量的1.00％添加至克氏原螯虾的普通饲料中，然后重新制成含有提取物、萃取物的颗粒饲料，用于饲喂克氏原螯虾；同时，将抗生素氯霉素按基础饲料的1.00％添加至预先粉碎的上述配合饲料中，然后重新制成含有氯霉素的颗粒饲料，用于饲喂克氏原螯虾。
6.测定血清总蛋白含量饲喂动物15天后，在每组实验动物中各取6雌、6雄克氏原螯虾，用1ml无菌注射器从其头胸甲后插入心脏取血。血样在4℃冰箱静置12小时后，4℃10000r/min离心30min分离制备血清。
标准曲线绘制：取六个10ml离心管，每管加入5mL的考马斯亮蓝染液，然后在各管依次加入1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5mL的pH6.4 0.1M的磷酸钾盐缓冲液，然后各管再对应的加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的0.1mg/mL的蛋白标准液，混匀后静置2min，测定595nm处的吸光值，即得吸光值，并制作蛋白含量的标准曲线。
蛋白含量测定：在10mL离心管中依次加入5mL考马斯亮蓝染液及1mL待测样液，同时制作空白管，以缓冲液替代待测样品液，静置2min后测定595nm处吸光值，根据标准曲线计算蛋白含量。
7.将上述实验的个体，在饲喂不同组饲料15天后，对每个个体从第2-3腹节间肌肉注射浓度为108cfu/mL的嗜水气单胞菌0.1mL，分别于攻毒后的2、4、6、8、10、12、24、36和48小时统计动物的死亡率。
实验结果如下：
1.菱乙醇提取物对菌种的抑菌圈直径大小(mm)：
| 菌种 | 抑菌圈大小 |
| 嗜水气单胞菌 | 16.75mm |
| 温和气单胞菌 | 17.75mm |
| 副溶血弧菌 | 15.88mm |
| 金黄色葡萄球菌 | 17.00mm |
| 大肠杆菌 | 15.38mm |
| 铜绿假单胞菌 | 15.63mm |
| 沙门氏菌 | 11.75mm |
2.菱乙醇提取物乙酸乙酯萃取物对菌种抑菌圈直径影响：
| 菌种 | 抑菌圈大小 |
| 嗜水气单胞菌 | 25.50mm |
| 温和气单胞菌 | 24.13mm |
| 副溶血弧菌 | 27.00mm |
| 金黄色葡萄球菌 | 26.38mm |
| 大肠杆菌 | 18.75mm |
| 铜绿假单胞菌 | 17.63mm |
3.菱乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物对克氏原螯虾血清蛋白的影响：
4.野菱提取物对克氏原螯虾存活率的影响：
结论：本方法采用乙醇提取法对野菱的活性物质进行提取，测定了野菱提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、副溶血弧菌7种供试菌株的抑菌活性，发现野菱乙醇提取物队7种菌有很好的抑制作用。饲料中添加菱乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物可显著提高克氏原螯虾的免疫力和存活率。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作任何其他形式的限制，而依据本发明的技术实质所作的任何修改或等同变化，仍属于本发明所要求保护的范围。
Claims (3)
1.使用克氏原螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法，具体步骤如下，其特征在于：
步骤一，选取植物提取液所对应的实验材料：
步骤二，确定实验菌种：
步骤三，选取克氏原螯虾为实验动物：
步骤四，进行植物提取液的提取，并制成提取物与萃取物，测定实验菌种的抑菌圈直径，再进行饲料制备投喂实验动物，再测定血清总蛋白含量，确定实验动物死亡率：
1）将采集的实验材料研磨，称取20 g粉末，按照1:20的比例分别用水、乙醇浸泡2小时后抽滤，收集滤液，抽滤后的粉末继续浸泡24小时后再抽滤，收集滤液，如此反复3-4次，合并滤液；利用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，即得实验材料提取物；
2）别取植物提取的提取物30 g，各按1:10的比例用蒸馏水溶解，然后按照极性由小到大分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种有机溶剂分步进行萃取，每种溶剂萃取3-4次后合并同种萃取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，即得各种萃取物；
3）在已分离纯化培养的待测菌平板上挑取3-5个相同的单菌落，接种到5 mL液体培养基上，28℃、150 rpm摇床培养18-22小时，再用麦氏比浊法测出液体培养基的浓度，将浓度稀释至106 cfu/mL；
取每种提取物，用二甲基亚砜溶解配成1 g/mL的溶液，然后再用二甲基亚砜依次稀释，使其浓度成为200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL和12.5 mg/mL的药液，同时，以氯霉素作为抗生素，换算其浓度与提取物的浓度相一致；
4）采用滤纸片法测定不同提取物的不同浓度对实验菌种的抑菌圈直径；
5）饲料的制备，将提取物和萃取物分别按基础饲料质量的1.00%添加至克氏原螯虾的普通饲料中，然后重新制成含有提取物、萃取物的颗粒饲料，用于饲喂克氏原螯虾；同时，将抗生素氯霉素按基础饲料的1.00%添加至预先粉碎的上述配合饲料中，然后重新制成含有氯霉素的颗粒饲料，用于饲喂克氏原螯虾；
6）测定血清总蛋白含量，饲喂动物15天后，在每组实验动物中各取6雌、6雄克氏原螯虾，用1 ml无菌注射器从其头胸甲后插入心脏取血，血样在4℃冰箱静置12小时后，4℃10000 r/min离心30 min分离制备血清；
标准曲线绘制：取六个10 ml离心管，每管加入5 mL的考马斯亮蓝染液，然后在各管依次加入1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL的pH6.4 0.1 M的磷酸钾盐缓冲液，然后各管再对应的加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的0.1 mg/mL的蛋白标准液，混匀后静置2 min，测定595nm处的吸光值，即得吸光值，并制作蛋白含量的标准曲线；
蛋白含量测定：在10mL离心管中依次加入5 mL考马斯亮蓝染液及1 mL待测样液，同时制作空白管，以缓冲液替代待测样品液，静置2 min后测定595 nm处吸光值，根据标准曲线计算蛋白含量；
7）将上述实验的个体，在饲喂不同组饲料15天后，对每个个体从第2-3腹节间肌肉注射浓度为108cfu/mL的嗜水气单胞菌0.1 mL，分别于攻毒后的2、4、6、8、10、12、24、36和48小时统计动物的死亡率；
步骤五，进行实验结果判定：
1）植物提取物对菌种的抑菌圈直径大小；
2）植物提取物乙酸乙酯萃取物对菌种抑菌圈直径影响；
3）植物提取物萃取物对克氏原螯虾血清蛋白的影响；
4）判定植物提取物对克氏原螯虾存活率的影响。
2.根据权利要求1所述的使用克氏源螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法，其特征在于：所述实验菌种选用嗜水气单胞菌或温和气单胞菌或副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌或大肠杆菌或铜绿假单胞菌或鼠伤寒沙门氏菌。
3.根据权利要求1所述的使用克氏原螯虾验证植物提取液细菌的抑菌活性的方法，其特征在于：步骤四中采用滤纸片法测定不同提取物的不同浓度对实验菌种的抑菌圈直径，具体方式如下，选用定性滤纸，用打孔器制作直径为6 mm的圆形纸片，121 ℃高压灭菌20min，60 ℃烘干，用无菌镊子分别夹取到不同提取物、不同浓度的药液中浸泡24小时；用移液枪吸取 15 μL 菌悬液涂布于平板上，制成含菌平板；再将晾干的带药滤纸片均匀贴于含菌平板上，29℃培养 18-22小时后，用十字交叉法测量抑菌圈直径，每个抑菌圈测量4次，取其平均值作为最后的抑菌圈直径。
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