CN107412354A - 一种兽用枫蓼颗粒剂及其在鸡坏死性肠炎中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种兽用枫蓼颗粒剂及其在鸡坏死性肠炎中的应用。所述枫蓼颗粒剂包括牛耳枫、辣蓼和辅料;其中牛耳枫和辣蓼在枫蓼颗粒剂中的有效成分为枫蓼醇提液经过减压浓缩和真空干燥得到的枫蓼提取物;辅料为糊精与蔗糖的混合物。本发明优化了枫蓼的醇提工艺,最佳工艺条件下,可获得33.01±0.30mg/g的总黄酮,271.31±0.37μg/g的槲皮素,以及23.16±0.47%的干膏率。通过研究显示,本发明的兽用枫蓼颗粒剂对中枢神经镇痛作用稍弱于外周神经的镇痛作用;能有效降低早期炎性组织液的渗出,且呈现量效关系,即剂量越高,抑制率越大;与抗生素联合,可以有效的防治鸡的坏死性肠炎。
Description
技术领域
本发明属于兽医学领域,具体涉及一种兽用枫蓼颗粒剂及其在鸡坏死性肠炎中的应用。
背景技术
急、慢性胃肠炎是常见病、多发病,临床上以腹部不适,腹痛、恶心呕吐,腹胀腹泻,嗳腐泛酸,食欲不振为主要临床表现,该病病因常有暴饮暴食及不洁饮食史所致。临床用药发现,由牛耳枫、辣蓼组成的枫蓼制剂具有理气健胃、除湿化滞的功能,用于中运不健、气滞湿困而致的急性胃肠炎及其所引起的腹胀、腹痛和腹泻等消化不良症,在临床上取得了良好的效果。枫蓼制剂包括颗粒或片剂等各种形式。
枫蓼肠胃康颗粒,为棕色颗粒,味甜。执行标准为国家药品标准(新药转正标准)第六册WS3-194-(Z-62)-94(Z)。
枫蓼肠胃康片,为糖衣片,除去糖衣后显黑褐色;味涩。枫蓼肠胃康片标准收载于中华人民共和国部颁标准《中药成方制剂》第17册,标准号为WS3-B-3242-98,是由牛耳枫、辣蓼等两味药组成,具有理气健胃、除湿化滞的功能,用于中运不健、气滞湿困而致的急性胃肠炎及其所引起的腹胀、腹痛和腹泻等消化不良症。收载的制备方法为“以上二味,加水煎煮二次,第一次1.5小时,第二次1小时,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至稠膏状,在80℃以下干燥,粉碎成细粉,加入适量淀粉,混匀,制成颗粒,压制成1000片,包糖衣,即得”。在该份文献中公开了处方及制法。
专利检索得到,申请号分别为200410098464.7、200510020619.X、200510020620.2、200510102981.1的四项专利公布的是合剂、滴丸、软胶囊不同剂型,在其专利文献中均公布了牛耳枫和辣蓼的处方量比例为2∶1,提取浸膏粉的方法与标准类似,具体加水量的参数不同,成型工艺有所不同。
现有技术中,国内各大药厂出品的枫蓼制剂中的牛耳枫、辣蓼均为水提物,提取温度高,时间长,对有效成分特别是黄酮类破坏严重。
此外,目前枫蓼制剂多用于人的急、慢性胃肠炎等相关病症,而目前市面上并无兽用产品可专门用于鸡坏死性肠炎。
兽药是专门为防治动物的疾病而生产的,它适合于动物的生理机能、代谢特点和一些特有的动物疾病。兽药的许多剂型、规定的用药剂量、投药的途径与方法,都是根据动物本身的特点而制定的。例如许多药物都是大剂量规格,是专门为某些大型动物生产的;而某些药物适合于混在水或饲料内,只适合于小动物使用。
人与种属不同的各种动物,对药物的反应差异有时很大。药品在人体和动物体内代谢存在差异。比如反刍动物对某些麻醉药比较敏感;牛对汞剂耐受性很低;禽类对呋喃类药物易发生中毒;抗生素对草食动物易引起消化机能失常等等。所以人用药与兽药在使用上有严格的界限。
鸡坏死性肠炎是Parish(1961)首次发现的,是产气荚膜梭菌引起的一种急性消化道疾病,它是鸡普遍存在的一种疾病。给全世界的养禽业造成了每年超过20亿美元的损失。近年来,欧盟禁止在饲料中添加抗生素生长促进剂,导致了坏死性肠炎在欧洲国家的养鸡业中大量暴发。
坏死性肠炎通常发生在4周龄以后,在全世界的家禽养殖区均有发生(Long J R,1973)。临床症状表现为急性临床症状和亚临床症状。
坏死性肠炎急性临床症状:急性临床症状经典的特征就是鸡群死亡率突然增加,没有先兆,有时候会出现垫料潮湿的早期症状。发病非常快,在1h~2h内死亡,有时候死亡率会增加到50%(Riddell et al 1992)。
亚临床症状:过去的几年里,亚临床症状更普遍,这种形式的坏死性肠炎,没有明显的临床症状且死亡率也不会增加。但是,肠粘膜的慢性损伤,会导致消化吸收不良,增重率下降,饲料转化率增加,造成巨大的生产损失(Elwinger et al 1992)。在亚临床感染情况下,肠道的损伤导致细菌到达胆管及门静脉,大量的产气荚膜梭菌寄生于肝脏,导致了胆管炎和肝炎,肝脏上出现淡红色或白色病灶(Onderka et al 1990)。
其中,肠道病变包括:肉眼可见病变通常出现在小肠,但是其他的器官也会发生病变,如肝和肾。通过病理解剖可以发现,十二指肠、空肠和回肠肠壁变薄,且充满气体。坏死性肠炎的临床症状是小肠黏膜出现大面积坏死,表面覆盖着黄棕色伪膜。典型的亚临床症状是,肠粘膜表面有凹凸状的溃疡,黏膜变黄,表面有纤维素样物质附着。坏死性肠炎早期表现出强烈的炎症反应,固有层充血,大量的炎性细胞浸润,主要是嗜中性粒细胞。坏死性肠炎后期,肠粘膜出现弥散性坏死,占到肠道黏膜的三分之一到一半。坏死部位和其他组织之间由于嗜中性粒细胞的积累而出现一条清晰地界线。
目前暂时没有鸡坏死性肠炎的相关研究,也没有专门针对鸡坏死性肠炎研发的兽药。
有业内人士称,人药没有进行针对动物的实验,包括剂量和安全性测试,如果采用人药兽用,剂量把握不准,则存在极大的安全隐患。另外,动物体内积存的人药抗生素,会以原形或代谢物形式经由粪便排到环境中,对水体和土壤造成污染,因此引起水体和土壤中“耐药菌”的威胁,进而危害人体。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种兽用枫蓼颗粒剂及其在鸡坏死性肠炎中的应用。
本发明所采取的技术方案是:
一种枫蓼的提取工艺,将牛耳枫和辣蓼按照2:1的质量比进行混合;然后加入体积百分比浓度为50%-80%的乙醇溶液进行回流提取,得到枫蓼醇提液;对枫蓼醇提液进行减压浓缩和真空干燥得到枫蓼提取物;其中回流提取时加入的乙醇溶液的重量为牛耳枫和辣蓼混合物的6-15倍。
优选的,所用乙醇溶液的体积百分比浓度为55%-75%。
优选的,回流提取的时间为50-130min,回流提取的次数为1-5次。
优选的,回流提取的时间为60-120min,回流提取的次数为1-3次。
优选的,回流提取时加入的乙醇溶液的重量为牛耳枫和辣蓼混合物的8-12倍。
优选的,枫蓼醇提液进行减压浓缩前先离心去除沉淀,然后在0.08mpa下、温度为50℃-70℃的条件下进行减压浓缩至相对密度为1.15~1.25,得到枫蓼浸膏。
优选的,将枫蓼浸膏在温度为60℃~90℃的条件下进行真空干燥得到枫蓼提取物。
一种枫蓼颗粒剂,包括下列组分:牛耳枫、辣蓼和辅料;其中牛耳枫和辣蓼在枫蓼颗粒剂中的有效成分为枫蓼醇提液经过减压浓缩和真空干燥得到的枫蓼提取物(枫蓼粉末),是利用上述任一项所述的提取工艺制备得到;辅料为糊精与蔗糖的混合物。
优选的,枫蓼颗粒剂中还包括适量润湿剂,该润湿剂为体积百分比浓度为75%-95%的乙醇溶液。
优选的,辅料中糊精与蔗糖的质量比为(3-5):(2-4)。
优选的,枫蓼提取物与辅料的质量比为1:1.0~2.0。
一种枫蓼颗粒剂的制备工艺,按照上述任一项所述称取各组分,将牛耳枫和辣蓼制备得到的枫蓼提取物与辅料进行混合,加入适量的润湿剂,湿法造粒,过筛,55℃-80℃干燥,制备得到枫蓼颗粒剂。
上述任一项所述的枫蓼颗粒剂在制备治疗鸡坏死性肠炎或鸡泄泻药物中的应用。
泄泻是中医对于肠炎类疾病的说法。泄泻是指因感受外邪,或被饮食所伤,或情志失调,或脾胃虚弱,或脾肾阳虚等原因引起的以排便次数增多,粪便稀溏,甚至泄如水样为主证的病证。一般根据病因病机运用淡渗,升提,清凉,疏利,甘缓,酸收,燥脾,温肾,固涩的方法治疗。泄泻的定义范围比西医对于肠炎的定义范围更广。
在目前的养殖业中,为了减少抗生素的利用,本行业技术人员也倾向用中药去替代或部分替代抗生素去治疗动物的相关疾病。因此,本发明的枫蓼颗粒剂可用于鸡坏死性肠炎或鸡泄泻的治疗。
上述任一项所述的枫蓼颗粒剂和抗生素的联合应用在制备治疗鸡坏死性肠炎或鸡泄泻药物中的应用。
本发明的有益效果是:
本发明优化了枫蓼的提取工艺。通过研究对比发现,枫蓼的水提液中基本不含槲皮素,而且总黄酮也低于枫蓼的醇提液,因此,枫蓼醇提工艺优于水提工艺。
本发明进一步优化了枫蓼的醇提工艺,最佳工艺条件下,可获得33.01±0.30mg/g的总黄酮,271.31±0.37μg/g的槲皮素,以及23.16±0.47%的干膏率。
本发明进一步通过药效学研究实验得到:枫蓼醇提液和水提液两者毒性极低,临床给药安全可靠。通过热板法、醋酸扭体试验法比较了枫蓼提取液的镇痛作用,与生理盐水作比较,热板法结果显示,15min时醇高剂量组能够显著延长小鼠的痛阈值(P<0.05),醋酸扭体法结果显示醇高、中剂量能够显著降低小鼠的扭体次数(P<0.05),其原因可能是醇提液能够阻断前列腺素及中枢神经的传导发挥镇痛作用。通过二甲苯致小鼠耳肿胀法及醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性法考察枫蓼提取液的抗炎效果,与生理盐水作比较,耳肿胀法结果显示醇高剂量组显著抑制耳肿胀度(P<0.05)。毛细血管通透法结果显示,醇高、中剂量均能显著降低腹腔积液的吸光度(P<0.05),具有抑制毛细血管通透性的功能,发挥抗炎药理作用,其机制可能是提取液能抑制四烯酸代谢途径环氧合酶的合成。综上,枫蓼醇提液镇痛作用优于枫蓼水提液。通过研究发现,药物与药效还存在一定的量效关系,即随着药物浓度的增加,药效逐渐加强的过程。
本发明在枫蓼治疗急性肠炎动物试验中,通过前期预试验中已知氨苄青霉素最小抑菌浓度为32ug/ml,动物实验中,氨苄青霉素组的各因素水平与模型组无明显差异,由此可知,氨苄青霉素具有抑菌不抗炎的作用,与本发明的枫蓼颗粒混合给药的目的是起到杀菌的作用。
通过研究显示,本发明的兽用枫蓼颗粒剂对中枢神经镇痛作用稍弱于外周神经的镇痛作用;能有效降低早期炎性组织液的渗出,且呈现量效关系,即剂量越高,抑制率越大;与抗生素联合,可以有效的防治鸡的坏死性肠炎以及鸡泄泻。
附图说明
图1为大鼠肝脏、肾脏组织切片;
图2为大鼠回肠、胃组织切片;
图3为大鼠子宫、睾丸组织切片;
图4为鸡空肠、回肠、十二指肠病理组织切片;
图5为鸡空肠、回肠、十二指肠病理组织切片;
图6为鸡空肠、回肠、十二指肠病理组织切片。
具体实施方式
实施例中产物所涉及的检测方法:
1、吸湿率
在玻璃干燥器底部盛放氯化钠过饱和溶液,并将其放入恒温培养箱内保持25℃恒温放置24h,以达到恒定的相对湿度75%。在干燥至恒重的称量瓶底部放入颗粒2g,精密称定,置于干燥器内(瓶盖已打开),恒温恒湿放置48h后称重。按下述公式计算吸湿率。
吸湿率=(吸湿后颗粒重量—吸湿前颗粒重量)/吸湿前颗粒剂重量×100%。
2、粒度合格率
按照2010版本《中国药典》一部附录XIB双筛分法,取颗粒50g于一号筛中,下面放置五号筛。水平往返轻叩3min,取合格颗粒称重并按下述公式计算粒度合格率。
粒度合格率(%)=合格的颗粒重量/过筛前重量×100%。
3、外观溶化性
外观根据颗粒硬度、均匀度及色泽进行判断;溶化性按照2010版本《中国药典》一部附录ⅠC项下溶化性检查法进行考察。
4、总黄酮含量测定方法
4.1 线性关系考察精密称量0.0051g芦丁对照品于25ml容量瓶中,加甲醇适量,微热水浴使溶解,放冷至室温,加甲醇至刻度,摇匀,制得芦丁对照品溶液(每1ml含芦丁0.204mg)。分别精密移取1、2、3、4、5、6ml芦丁对照品于25ml容量瓶中,各加30%乙醇至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀放置6min后,再加10%硝酸钠溶液1ml,摇匀放置6min后,再加4.3%氢氧化钠溶液10ml,再加30%乙醇至刻度,摇匀,放置15min后,以相应试剂为空白,在波长510nm处测定吸光度值,以吸光度(A)为纵坐标,以试剂浓度(mg/ml)为横坐标,做线性回归,得回归方程为y=12.57x-0.0047,R2=0.9997,结果表明芦丁在8~48μg/mL浓度范围内,线性关系良好。
4.2 按芦丁处理方法处理测定各提取液的总黄酮含量。
5、槲皮素含量测定方法
5.1 色谱条件色谱柱:Waters Symmetry shield RP18色谱柱(4.6mm x 250mm,5.0μm);流动相:A为乙腈,B为0.4%磷酸水溶液;梯度洗脱:0~13min,A为20%~45%;13~15min,A为45%~60%;15~20min,A为70%~20%。流速:1mL/min;检测波长:368nm;柱温:30℃;进样量10μL。
5.2 线性关系考察精密称量10mg槲皮素对照品于10ml容量瓶中,加甲醇适量,超声溶解,放冷至室温,加甲醇至刻度,摇匀,制得槲皮素对照品溶液(每1ml含槲皮素1mg)。分别精密移取槲皮素对照品于容量瓶中,各加甲醇至刻度,摇匀。精密吸取上述各浓度标准品10μL,注入高效液相色谱仪中进行分析,以浓度(x)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,做线性回归,得回归方程为y=43215x-146476,R2=0.9995,结果表明槲皮素在10~50μg/mL浓度范围内,线性关系良好。
5.3 精密吸取各提取液10μL,注入高效液相色谱仪中测定槲皮素含量。
6、出膏率测定方法:精密移取定容后药液50ml,置于已干燥至恒定重量的蒸发皿中,水浴蒸干,105℃干燥3小时,置于干燥器中冷却0.5h,迅速称重,计算出膏率。
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明,但不限于此。
实施例1 一种枫蓼的提取工艺
称取枫蓼粉末(牛耳枫:辣蓼=2:1)20g,置于500ml圆底烧瓶中,用体积百分比浓度为55%-75%的乙醇作为提取溶剂,乙醇溶液的添加量为牛耳枫和辣蓼混合物的8-12倍,浸泡1h,进行回流提取,提取时间为60-120min,提取次数为1-3次。根据不同的乙醇浓度、乙醇溶液的添加量、提取次数、回流时间设置7个处理组,具体见表1,提取液滤过,合并,得到枫蓼醇提液。
表1 枫蓼的乙醇提取工艺
对照用水做提取溶剂。称取枫蓼粉末(牛耳枫:辣蓼=2:1)20g,置于500ml圆底烧瓶中,用水做提取溶剂,水的添加量为牛耳枫和辣蓼混合物的8-12倍,进行回流提取,提取时间为60-120min,提取次数为1-3次。根据加水量、提取时间、提取次数设置4个对比组,见表2,得到枫蓼水提液。
表2 对照用枫蓼的水提取工艺
将醇提液和水提液都减压浓缩至一定体积进行比较,以总黄酮、槲皮素含量及出膏率为考察指标,进行综合评分,结果见表3。
表3 水提取与乙醇提取工艺的结果比较
总黄酮(mg/g) | 槲皮素(μg/g) | 干膏率(%) | 综合评分 | |
处理组1 | 29.53 | 223.25 | 20.42 | 85.80 |
处理组2 | 25.87 | 265.22 | 19.31 | 86.58 |
处理组3 | 33.69 | 259.65 | 17.62 | 93.54 |
处理组4 | 25.37 | 274.47 | 20.48 | 88.37 |
处理组5 | 31.33 | 232.28 | 22.44 | 91.05 |
处理组6 | 30.10 | 260.55 | 14.74 | 86.85 |
处理组7 | 33.01±0.30 | 271.31±0.37 | 23.16±0.47 | 94.42 |
对比组1 | 21.6 | 未测出 | 15.21 | 37.19 |
对比组2 | 17.8 | 未测出 | 17.73 | 34.33 |
对比组3 | 18.0 | 未测出 | 15.32 | 32.87 |
对比组4 | 29.65±0.47 | 未测出 | 23.83±0.23 | 45.21 |
由表3可知,处理组7和对比组4分别为醇提和水提工艺的最佳工艺,两者出膏率差异不明显,但从总黄酮和槲皮素提取量来看,枫蓼水提液中基本不含槲皮素,而枫蓼水提液中含有丰富的槲皮素和总黄酮,所以醇提工艺优于水提工艺。
将处理组7和对比组4得到的枫蓼醇提液以及枫蓼水提液进行适当减压浓缩,并考虑了损失率后,换算为相应用药量进行下列药效学动物研究实验。
1.试验材料
1.1 实验动物:KM小鼠,SPF级别,体重18-22g,♀♂兼用;SD大鼠,体重180-220g,♀♂兼用。均采购于南方医科大学的试验动物中心(合格证号:SCXK(粤)2011-0015;)。
2.试验方法
2.1 毒性试验方法
2.1.1 LD50的测定
取18~20g SPF级健康昆明小鼠,雌雄各半,随机分组,每组4只。受试前,隔夜禁食不禁水,分别以高(20g/kg)、中(10g/kg)、低(5g/kg)剂量按0.2mL/10g体重灌胃枫蓼醇提液和水提液,并以等量生理盐水作为空白对照,试找出0/4和4/4估计致死剂量;给药后0.5、1、3、5、7、10、13、16、19、24、36、48h依据小鼠健康体征外观评判标准对小鼠精神状态、中毒以及死亡情况进行观察,以后的每天也进行2次同样的观察,连续观察记录7d,若给药4d后继续有死亡的,则需观察记录14d;若实验动物死亡率为0/4,则将实验动物每组增至10只(雌、雄各半),重复两次试验。小鼠健康体征外观评判标准见表4。
表4 小鼠健康体征外观评判标准
一般健康表现 | 等级 |
反应灵敏皮毛整齐,双目有神,对周围感兴趣 | Ⅰ |
皮毛微乱,无光泽,小鼠仍然机敏好动 | Ⅱ |
被毛明显微乱,部分成簇,小鼠不再机敏好动,对周围缺少兴趣 | Ⅲ |
触摸时出现呼吸困难,蜷缩,困倦,对周围毫无兴趣,被毛凌乱成簇 | Ⅳ |
小鼠对刺激无反应,被毛杂乱,无法站立,蜷缩,倦怠,贪睡,反应迟钝 | Ⅴ |
2.1.2 大鼠30d喂养试验
分别将枫蓼醇提液和水提液高、中、低剂量(300g/kg、150g/kg、10g/kg)与饲料按1:1.8均匀混合,搅拌,制条并60℃烘干24h,即得饲料中受试药物浓度为3kg/kg,1.5kg/kg,0.1kg/kg。将140只健康的SPF级SD大鼠随机平均分为7组,每组雌雄各半,分开饲养。按照体重10%给含药的饲料30d,第31d时,每组随机抽取10只雌雄SD大鼠,处死,并对高剂量组大鼠及对照组大鼠的主要脏器进行组织病理学检查。剩余大鼠停药观察7d。试验期间,每天观察记录动物的一般行为表现,中毒及死亡情况;并同时记录大鼠饮水投入量和饮水剩余量;按周时间段测量记录试验大鼠体重,投入饲料量及剩余量。
饲料利用率(%)=体重增加量(g)/采食量(g)×100%。
2.2 药效试验方法
2.2.1 热板法:温度调节在55±0.5℃,筛选痛阈值为5~30s之间、体重18~22g的雌性昆明种SPF级小鼠80只,随机分为罗通定对照组、生理盐水对照组、枫蓼水提液和醇提液高中低三个剂量组,各组小鼠用苦味酸标记,ig连续灌胃3d,末次灌胃后的15、30、60、90min时间点测定痛阈值,并进行组间比较。
2.2.2 醋酸扭体法:取18~22g SPF级健康昆明小鼠80只,雌雄各半,随机分为阿司匹林对照组、生理盐水对照组、枫蓼水提液和醇提液高中低三个剂量组。ig连续灌胃3d,末次灌胃后60min,对每只小鼠进行0.6%的醋酸溶液腹腔注射(0.2mL/只),组间比较各组小鼠20min内的扭体次数,并计算镇痛率。
阵痛率=(对照组—给药组)/对照组×100%。
2.2.3 二甲苯诱发小鼠耳廓肿胀法:取18~22g SPF级健康昆明小鼠80只,雌雄各半,随机分为阿司匹林对照组、生理盐水对照组、枫蓼水提液和醇提液高中低三个剂量组。ig连续灌胃3d,末次灌胃60min后各组小鼠右耳前后两面均涂抹0.02mL二甲苯,左耳不做处理。120min后处死小鼠,用打孔器在左耳和右耳相同部位打下的直径为8mm的圆耳片,分析天平称重,计算各组小鼠的耳肿胀度,并组间比较耳肿胀度。
耳肿胀度(mg)=右耳重量-左耳重量。
2.2.4 醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性影响:取18~22g SPF级健康昆明小鼠80只,雌雄各半,随机分为阿司匹林对照组、生理盐水对照组、枫蓼水提液和醇提液高中低三个剂量组。ig连续灌胃3d,末次灌胃1h后,各鼠按体重0.1mL/10g快速尾静脉注射5%伊文思蓝生理盐水溶液,随即每只腹腔注射0.6%HAc0.2mL。20min后,处死动物,一次性腹腔注射生理盐水6mL,轻揉腹部1min后,提起腹部皮肤沿耻前腹白线位置纵向小心剪一小切口,用装有灌胃器的10mL注射器吸取4-6mL冲洗液,于3000r/min离心15min,取上清液。生理盐水为空白对照,于590nm处测得吸光度A值,记录并进行组间比较,计算抑制率。镇痛率或抗炎抑制率公式如下:
炎症抑制率(%)=(生理盐水组—给药组)/生理盐水组×100%。
2.2.5 统计学分析采用SPASS 17.0统计软件,数据以表示,多组件比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,P<0.05具有统计学意义。
3.结果
3.1 LD50的测定
预试验中0只小鼠致死,根据《兽药研究技术指导原则汇编》一书中兽药急性毒性试验(LD50测定)指导原则:如果高剂量组已达到5 000mg/kg的剂量,试验动物死亡率为0/4,将动物数增至10只(雌雄各半),并重复两次试验,动物均未出现死亡,则可结束急性毒性实。本试验按无毒剂量,实际无毒剂量,低毒剂量进行两次LD50正式测定试验,两次LD50试验中,给药30min后,各组均出现不规则粪便,8h后开始好转,24h后正常。试验期间对小鼠进行观察,精神状态良好,毛皮光泽,采食饮水正常。试验结果见表5。
表5 枫蓼制剂急性毒性试验
由表5结果可知:两次LD50试验,小鼠均未出现死亡。根据《兽药研究技术指导原则汇编》一书中化学物急性毒性(LD50)剂量分级表描述,给药量在5 001mg/kg~15 000mg/kg的级别为实际无毒,大于15 000mg/kg的级别为无毒,所以判定枫蓼醇提液和水提液的LD50大于5000mg/kg,枫蓼水、醇提取液的毒性较低,临床给药安全可靠。
3.2 大鼠30d喂养试验
3.2.1 一般观察
枫蓼醇提和水提高、中、低三个剂量组大鼠与正常生理盐水对照组大鼠外观、行为、精神状态、活动均无明显异常,但给药的后期,水提液和醇提高剂量组反应稍显迟钝,后期体重增加缓慢,给药期及恢复期未出现动物死亡。
3.2.2 动物摄食量与体重:结果见表6。
表6 饮水、投食量及体重变化结果
由表6可知,给药期枫蓼水提液和枫蓼醇提液的高、中、低三个剂量组的大鼠总采食量、体重增重均大于对照组。水提取和醇提取低剂量组饲料利用率高于高、中剂量和正常对照组,醇提高剂量组饲料利用率均低于生理盐水组和水提组,可能由于药物浓度过大,乙醇对大鼠肠胃的刺激,导致饲料利用率下降。随着药物浓度的增加,大鼠饮水量也随之增加。
3.2.3 病理组织学检查
病理组织学检查病理切片各给药组的主要器官肠、胃、肝、肾、睾丸、卵巢与对照组比较未见炎性细胞浸润、细胞水肿、组织坏死、增生等典型的病理变化。结果见图1、图2、图3。
图1为大鼠肝脏(A、B、C)肾脏组织切片(D、E、F)(×100),其中A:枫蓼醇提高剂量,B:枫蓼水提高剂量,C:生理盐水,D:枫蓼醇提高剂量,E:枫蓼水提高剂量,F:生理盐水。
图2为大鼠回肠(A、B、C)、胃组织切片(D、E、F)(×100),其中A:枫蓼醇提高剂量,B:枫蓼水提高剂量,C:生理盐水,D:枫蓼醇提高剂量,E:枫蓼水提高剂量,F:生理盐水。
图3为大鼠子宫(A、B、C)、睾丸组织切片(D、E、F)(×100),其中A:枫蓼醇提高剂量,B:枫蓼水提高剂量,C:生理盐水,D:枫蓼醇提高剂量,E:枫蓼水提高剂量,F:生理盐水。
3.3 药效学实验结果
3.3.1 热板法:结果见表7。
表7 枫蓼制剂对小白鼠热板法痛阈值的影响
注:与给药前痛阈值作比较1)P<0.05;同一时间点,与生理盐水对照组比较2)P<0.05;同一时间点,与罗通定对照组作比较3)P<0.05。
表7结果显示:5min时,与生理盐水组比较,醇提高剂量组能够显著延长痛阈值(P<0.05),与罗通定组比较,差异不具有显著性(P>0.05)镇痛作用弱于罗通定;30min、60min及90min时,与生理盐水比较,水提取组和醇提取组镇痛效果不明显,差异无统计学意义(P>0.05);与给药前痛阈值作比较,醇高剂量组于15min时,能够显著延长小鼠痛阈值(P<0.05),水提及醇提其他各剂量组间差异均无统计学意义(P>0.05)。说明醇提物镇痛作用优于水提物。
3.3.2 醋酸扭体法:结果见表8。
表8 枫蓼制剂对小鼠扭体反应的影响
注:与生理盐水组作比较1)P<0.05;与阿司匹林作比较2)P<0.05;同剂量组间比较3)P<0.05。
表8结果显示:与生理盐水组作比较,各组扭体次数均有所下降,阿司匹林阳性对照组、枫蓼醇提高、中剂量组及水提高剂量组均能够显著降低小鼠扭体次数(P<0.05),醇提高中剂量平均镇痛率为22.87%,水提高剂量镇痛率均为21.16%;醇提高、中剂量组和水提高剂量组作用弱于阿司匹林组(P<0.05);两种提取物同剂量组间进行比较,醇提高中剂量组扭体次数分别显著低于水提组(P<0.05),具有统计学意义,说明醇提组镇痛作用优于水提组。
3.3.3 二甲苯致耳肿胀法:结果见表9。
表9 枫蓼制剂对小白鼠耳廓肿胀的影响
注:与生理盐水组作比较1)P<0.05;与阿司匹林作比较2)P<0.05
表9结果显示:与生理盐水组作比较,阿司匹林阳性对照组、醇提高剂量组、水提高剂量组能够显著降低小鼠的耳肿胀度(P<0.05),醇提高剂量组肿胀抑制率约为53.09%,水提高剂量组约为48.56%;与阿司匹林组作比较,水提和醇提高剂量组肿胀抑制率弱于阿司匹林组;从肿胀抑制率来看,醇高剂量组作用最明显,但同剂量间进行比较,差异不显著,不具有统计学意义。
3.3.4 HAC所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响:结果见表10。
表10 HAC所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
注:与生理盐水组作比较1)P<0.05;与阿司匹林作比较2)P<0.05
表10结果显示:与生理盐水组作比较,各给药组腹腔毛细血管渗透液吸光度均有所下降,阿司匹林阳性对照组、枫蓼醇提高、中剂量组及水提高剂量组对毛细血管通透性具有显著的抑制作用(P<0.05),醇提高中剂量平均炎症抑制率为36.29%,水提高剂量组炎症抑制率为32.26%;醇提高、中剂量组和水提高剂量组作用弱于阿司匹林组(P<0.05);从炎症抑制率来看,醇高剂量组作用最明显,但同剂量间进行比较,差异不显著,不具有统计学意义。
综上所述:枫蓼醇提液和水提液两者毒性极低,临床给药安全可靠。通过热板法、醋酸扭体试验法比较了枫蓼提取液的镇痛作用,与生理盐水作比较,热板法结果显示,15min时醇高剂量组能够显著延长小鼠的痛阈值(P<0.05),醋酸扭体法结果显示醇高、中剂量能够显著降低小鼠的扭体次数(P<0.05),其原因可能是醇提液能够阻断前列腺素及中枢神经的传导发挥镇痛作用。通过二甲苯致小鼠耳肿胀法及醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性法考察枫蓼提取液的抗炎效果,与生理盐水作比较,耳肿胀法结果显示醇高剂量组显著抑制耳肿胀度(P<0.05)。毛细血管通透法结果显示,醇高、中剂量均能显著降低腹腔积液的吸光度(P<0.05),具有抑制毛细血管通透性的功能,发挥抗炎药理作用,其机制可能是提取液能抑制四烯酸代谢途径环氧合酶的合成。综上,枫蓼醇提液镇痛作用优于枫蓼水提液。通过研究发现,药物与药效还存在一定的量效关系,即随着药物浓度的增加,药效逐渐加强的过程。
实施例2 一种枫蓼颗粒剂的制备工艺
将1160g牛耳枫和580g辣蓼进行混合,加入10倍重量的65%的乙醇回流提取2次,每次60min,合并提取液;将合并后的提取液6000r/min离心10min;取上清液在0.08mpa下以60℃减压浓缩至相对密度为1.15~1.25,得到辣蓼浸膏,出膏率为23%,浸膏中总黄酮平均含量30.28±0.45mg/g;80℃真空干燥成粉,得到枫蓼提取物400g,枫蓼提取物中的总黄酮含量18.67±0.58mg/g。
糊精与蔗糖按照3:2的重量比混合得到辅料,枫蓼提取物与辅料按照重量比1:1.5混合,利用85%乙醇作润湿剂进行湿法制粒,过14目筛,60℃干燥,干燥后取出放冷至室温,14目筛整粒,即得枫蓼颗粒剂。
对上述湿法制粒工艺进行重复性验证试验,结果见表11。
表11 工艺验证试验结果表
试验次数 | 吸湿性(%) | 粒度合格率(%) | 溶化性、外观 |
1 | 12.53 | 91.45 | 9.0 |
2 | 12.24 | 90.23 | 9.0 |
3 | 12.66 | 91.28 | 9.0 |
Average | 12.48 | 90.99 | 9.0 |
RSD(%) | 1.72 | 0.73 | 0 |
由表11可知,吸湿率RSD为1.72%,粒度合格率RSD为90.99%,溶化性、外观RSD为0%,制备工艺重复性好。
实施例3 一种枫蓼颗粒剂的制备工艺
将1160g牛耳枫和580g辣蓼进行混合,加入10倍量65%的乙醇回流提取2次,每次60min,合并提取液;将合并后的提取液6000r/min离心10min;取上清液在0.08mpa下以50℃-70℃减压浓缩至相对密度为1.15~1.25,得到辣蓼浸膏,并测定浸膏中总黄酮平均含量,实验结果见表12。将浸膏80℃真空干燥成粉,得到枫蓼提取物。
表12 浓缩试验结果表(n=3)
由表12可知:60℃时总黄酮含量最高,70℃时总黄酮含量最低,50℃和60℃含量差别不大,而70℃和60℃含量差别相对较大,因温度越高,浓缩时间越短,故浓缩温度为60℃时进行减压浓缩,效果最佳。
糊精与蔗糖按照3:2的重量比混合得到辅料,枫蓼提取物与辅料按照重量比1:1.5混合,利用85%乙醇作润湿剂进行湿法制粒,过14目筛,60℃干燥,干燥后取出放冷至室温,14目筛整粒,即得枫蓼颗粒剂。
实施例4 一种枫蓼颗粒剂的制备工艺
将1160g牛耳枫和580g辣蓼进行混合,加入10倍量65%的乙醇回流提取2次,每次60min,合并提取液;将合并后的提取液6000r/min离心10min;取上清液在0.08mpa下以60℃减压浓缩至相对密度为1.15~1.25,得到辣蓼浸膏。将辣蓼浸膏分成9份,每份100g,于60℃、70℃、80℃、90℃下真空干燥,得到枫蓼提取物。计算干燥后枫蓼提取物中总黄酮含量,试验结果见表13。
表13 减压干燥试验结果
由表13可知:60℃下进行减压干燥,总黄酮含量最高,80℃时次之,90℃最低,可能原因是90℃温度过高导致成分损失。相比之下,80℃干燥时间短,成分损失相对较少,故干燥温度为80℃时效果最佳。
糊精与蔗糖按照3:2的重量比混合得到辅料,枫蓼提取物与辅料按照重量比1:1.5混合,利用85%乙醇作润湿剂进行湿法制粒,过14目筛,60℃干燥,干燥后取出放冷至室温,14目筛整粒,即得枫蓼颗粒剂。
实施例5 一种枫蓼颗粒剂的制备工艺
将60g牛耳枫和30g辣蓼进行混合,加入10倍重量的65%的乙醇回流提取2次,每次60min,合并提取液;将合并后的提取液6000r/min离心10min;取上清液在0.08mpa下以60℃减压浓缩至相对密度为1.15~1.25,得到辣蓼浸膏;80℃真空干燥成粉,得到枫蓼提取物。
糊精与蔗糖按照(3-5):(2-4)的重量比混合得到辅料,枫蓼提取物与辅料按照重量比1:(1.0-2.0)混合,利用体积百分比浓度为75-95%乙醇作润湿剂进行湿法制粒,过14目筛,温度60-80℃干燥,干燥后取出放冷至室温,14目筛整粒,即得枫蓼颗粒剂。根据不同的枫蓼提取物与辅料质量比、糊精与蔗糖质量比、乙醇浓度、干燥温度设置多个处理组,制备得到枫蓼颗粒剂,并考察所得枫蓼颗粒剂的吸湿率、粒度合格率和溶化性外观等参数结果,具体见表14。
表14 枫蓼颗粒剂成型工艺
从表14可知,较佳的是处理组4、6、10的成型工艺。
实施例6 一种枫蓼颗粒剂的制备工艺
将60g牛耳枫和30g辣蓼进行混合,加入10倍重量的65%的乙醇回流提取2次,每次60min,合并提取液;将合并后的提取液6000r/min离心10min;取上清液在0.08mpa下以60℃减压浓缩至相对密度为1.15~1.25,得到辣蓼浸膏;80℃真空干燥成粉,得到枫蓼提取物。
糊精与蔗糖按照3:2的重量比混合得到辅料,枫蓼提取物与辅料按照重量比1:1.5混合,利用85%乙醇作润湿剂进行湿法制粒,过14目筛,干燥温度60℃,干燥后取出放冷至室温,14目筛整粒,即得枫蓼颗粒剂。
枫蓼为90g,出膏率按23%计算,得枫蓼提取物(干膏粉)20.7g,加入辅料比例为1:1.5,90g枫蓼制得颗粒30g,则每10公斤体重鸡每日需服6g颗粒,可制成每袋60g,100公斤体重鸡每日一次,每次一袋,拌料或饮水服用。
实施例7 枫蓼颗粒对鸡坏死性肠炎的防治
将实施例6制备得到的枫蓼颗粒剂用于鸡坏死性肠炎的防治实验中。
1 仪器与材料
1.1 主要仪器
J11101110生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司),LDZX-50FB立式压力灭菌器(上海申安医疗器械公司),SW-CJ1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),5804R低温离心机(上海艾本德生物技术有限公司),LRH-150F生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司),HH1恒温水浴锅(常州奥华仪器公司),DK-98-11电热炉(天津市泰斯特仪器有限公司)。
1.2 主要试剂
胰月示-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(广东环凯生物科技有限公司),蔗糖(广州化学试剂厂),糊精(南京化学试剂有限公司),细菌微量化鉴定管(青岛海博生物技术有限公司),DL2000Marker(康为世纪),无核酸酶水(康为世纪)。
1.3 材料
308商用鸡苗购自广东东莞正大康地有限公司
netBF:A型为产气荚膜梭菌,netB基因阳性。
2 试验方法
2.1 试验日粮
基础日粮购自广州市江丰实业有限公司。
试验日粮见表15。
表15 基础日粮组成及营养水平
原料组成 | 配比(%) | 营养指标 | 营养水平 |
豆粨 | 22.6 | 粗蛋白 | 20.8 |
麸皮 | 2 | 钙 | 1.08 |
小麦 | 68 | 可利用磷 | 0.48 |
鱼粉 | 1 | 赖氨酸 | 1.15 |
碳酸钙 | 1.4 | 蛋氨酸 | 0.5 |
碳酸氢钙 | 1.2 | 蛋+胱氨酸 | 0.87 |
油脂 | 2 | ||
预混料 | 1.8 | ||
共计 | 100 |
2.2 饲养管理
试验前1周,清理鸡舍,先用火焰消毒鸡笼、地面,再用甲醛熏蒸消毒,饲养全程定期消毒。笼养。相对湿度保持在64%~76%,保持鸡舍通风良好,自由采食、自由饮水。1~15日龄饲养基础日粮,16~24日龄在基础日粮中加入鱼粉。使鱼粉含量占总粮50%。
2.3 坏死性模型的建立
2.3.1 攻毒菌悬液准备
将试验组的产气荚膜梭菌复苏,划线接种到TSC平板上,40℃厌氧培养24h,取平板上黑色典型菌落接种到庖肉培养基中,40℃厌氧培养15h。然后将庖肉培养接种到400mL的FT培养基中,4℃厌氧培养15h。
2.3.2 疾病模型建立
将FT培养物加入到饲料中,拌匀,菌液与饲料比重为(mL:g)=1:1.5,每天两次,上午8:00,下午4:00,从22日龄开始,连续饲喂3d。
2.3.3 病变模型建立
25日龄脱颈处死,剖检观察十二指肠、空肠及回场病变,并分别计分。计分标准见表16。
表16 坏死性肠炎病变积分
2.4 枫蓼颗粒剂对鸡坏死性肠炎的防治
选用1日龄罗斯308商用鸡苗160只,随机分为8组,每组20只。G1为空白组;G2为模型组;G3为氨苄青霉素(1g/kg)+肠胃康(6g/kg);G4为氨苄青霉素1g/kg;G5为氨苄青霉素(1g/kg)+枫蓼颗粒剂(12g/kg);G6为氨苄青霉素(1g/kg)+枫蓼颗粒剂(6g/kg);G7为氨苄青霉素(1g/kg)+枫蓼颗粒剂(3g/kg);G8为效美素(0.1g/kg),照“2.2”项下喂养管理进行喂养。19日龄时按比例给药。22日除G1空白组不进行攻毒外,其余各组按照“2.3”项下进行攻毒试验,建立坏死性肠炎模型,连续攻毒3天。第25日龄脱颈处死,每组随机选取10只进行病变积分,计分标准见表16。每组随机选取3只取空肠、回肠及十二指肠进行组织病理学检查。每组随机取5只采集鸡血清,酶联法测定血清中IL-1β、α1-AGP及TNF-α的水平。
3 结果
3.1 病理组织学检查
病理组织学检查病理切片各给药组空肠、回肠、十二指肠病理组织切片见图4、图5、图6。
由图4、图5、图6可知,空白组G1的空肠、回肠及十二指肠形态均正常,未出现任何病变现象;模型组G2空肠绒毛呈现不规则状态,变性、坏死,回肠形态正常,呈现片状,十二指肠绒毛纹状缘消失,部分绒毛变性、坏死;G3给药组中空肠、回肠及十二指肠绒毛结构正常,未见病变;G4给药组中空肠、回肠绒毛形态正常,未见坏死,十二指肠肠绒毛尖部变、坏死;G5给药组中空肠、回肠形态均正常,十二指肠绒毛形态均正常,未见大面积坏死;G6给药组中空肠绒毛部分出现不规则状态,出现消失,回肠形态正常,十二指肠中绒毛形态不规则分布,部分细胞已坏死脱落;G7给药组中空肠、回肠形态均正常,十二指肠绒毛现不规则分布,绒毛细胞部分坏死。G8给药组中空肠绒毛不规则分布,部分坏死,回肠及十二指肠形态结构正常。
3.2 病变积分
小肠病变结果见表17。
表17 小肠病变结果表
注:与空白组作对比1)P<0.05;与模型组作对比2)P<0.05
表17结果显示:与空白组比较,模型组及其余各给药组病变积分均显著性增加(P<0.05),表明此次试验肠炎模型造模成功;与模型组比较,各给药组病变程度均显著降低,表明,各给药组均能有效修复产气荚膜梭菌对肠道的损伤,其中枫蓼中剂量组治疗效果最佳。各组作用强弱为效米素>枫蓼中剂量组>枫蓼低剂量组>枫蓼高剂量组>肠胃康对照组=氨苄青霉素,枫蓼颗粒组治疗效果优于肠胃康组,但无统计学差异(P>0.05)。
3.3 ELISA酶联法测定血清中α1-AGP、IL-1β及TNF-α水平结果测定
试验结果见表18。
表18 枫蓼制剂α1-AGP、IL-1β、TNF-α水平影响表
注:与空白组作比较1)P<0.05;与模型组作比较2)P<0.05
表18结果显示:
α1-AGP含量测定中:与空白组作比较,攻毒模型组浓度显著性上升(P<0.05),说明此次试验肠炎造模成功;与模型组作比较,就α1AGP含量来看,各给药组浓度均存在不同程度的下降,其中效美素浓度显著性下降差异(P<0.05),其余各组下降差异不显著(P>0.05)。
IL-β含量测定中:与空白组作比较,模型组浓度显著性上升(P<0.05),说明攻毒成功,肠炎模型建立;与模型组作比较,各给药组浓度均有所下降,其中氨苄青霉素与枫蓼颗粒高、中、低剂量组的组合及效美素浓度下降显著(P<0.05),说明,枫蓼颗粒剂与氨苄青霉素共同给药能够有效抑制鸡血清中IL-β因子的分泌。
TNF-α含量测定中:与空白组作比较,攻毒组浓度浓度上升显著(P<0.05),说明造模成功,与模型组比较,各给药组浓度均有所下降,效美素浓度显著下降(P<0.05),其余各给药组浓度下降,但无统计学意义P>0.05)
申请人通过前期预试验中已知氨苄青霉素最小抑菌浓度为32ug/ml,动物实验中,氨苄青霉素组的各因素水平与模型组无明显差异,由此可知,氨苄青霉素具有抑菌不抗炎的作用,与枫蓼颗粒混合给药的目的是起到杀菌的作用。
通过研究显示,本发明的兽用枫蓼颗粒剂对中枢神经镇痛作用稍弱于外周神经的镇痛作用;能有效降低早期炎性组织液的渗出,且呈现量效关系,即剂量越高,抑制率越大;与抗生素联合,可以有效的防治鸡的坏死性肠炎。
Claims (10)
1.一种枫蓼的提取工艺,其特征在于:将牛耳枫和辣蓼按照2:1的质量比进行混合;然后加入体积百分比浓度为50%-80%的乙醇溶液进行回流提取,得到枫蓼醇提液;对枫蓼醇提液进行减压浓缩和真空干燥得到枫蓼提取物;其中回流提取时加入的乙醇溶液的重量为牛耳枫和辣蓼混合物的6-15倍。
2.根据权利要求1所述的提取工艺,其特征在于:回流提取的时间为50-130min,回流提取的次数为1-5次。
3.根据权利要求1-2任一项所述的提取工艺,其特征在于:枫蓼醇提液进行减压浓缩前先离心去除沉淀,然后在0.08mpa下、温度为50℃-70℃的条件下进行减压浓缩至相对密度为1.15~1.25,得到枫蓼浸膏。
4.根据权利要求3所述的提取工艺,其特征在于:将枫蓼浸膏在温度为60℃~90℃的条件下进行真空干燥得到枫蓼提取物。
5.一种枫蓼颗粒剂,其特征在于,包括下列组分:牛耳枫、辣蓼和辅料;其中牛耳枫和辣蓼在枫蓼颗粒剂中的有效成分为枫蓼醇提液经过减压浓缩和真空干燥得到的枫蓼提取物,是利用权利要求1-4任一项所述的提取工艺制备得到;辅料为糊精与蔗糖的混合物。
6.根据权利要求5所述的枫蓼颗粒剂,其特征在于:枫蓼颗粒剂中还包括适量润湿剂,该润湿剂为体积百分比浓度为75%-95%的乙醇溶液。
7.根据权利要求5-6任一项所述的枫蓼颗粒剂,其特征在于:枫蓼提取物与辅料的质量比为1:1.0~2.0。
8.一种枫蓼颗粒剂的制备工艺,其特征在于:按照权利要求5-7任一项所述称取各组分,将牛耳枫和辣蓼制备得到的枫蓼提取物与辅料进行混合,加入适量的润湿剂,湿法造粒,过筛,55℃-80℃干燥,制备得到枫蓼颗粒剂。
9.权利要求5-7任一项所述的枫蓼颗粒剂在制备治疗鸡坏死性肠炎或鸡泄泻药物中的应用。
10.权利要求5-7任一项所述的枫蓼颗粒剂和抗生素的联合应用在制备治疗鸡坏死性肠炎或鸡泄泻药物中的应用。
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