CN105708926A - 一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药及其制备方法和应用，包括：五倍子、地榆和大黄，五倍子、地榆和大黄的剂量按重量配比为5:2:1。同时本发明公开了一种抑杀嗜水气单胞菌的中草药制备方法和应用。本发明合理地开发利用中草药资源，在水产动物养殖中，不仅对动物的营养和促生长以及提高防病抗病能力具有重大意义，同时也符合水产养殖可持续发展的要求；为了减少病害对水产养殖业造成的损失，找到有较强效果、毒副作用小的药物进行防治变得尤为重要，本发明以嗜水气单胞菌为研究对象，筛选出对其有较好抑菌作用的复方中草药，从而为水产动物病害学和嗜水气单胞菌引起的鱼类细菌性疾病防治实践提供参考依据。

Description

一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于淡水养殖技术领域，尤其涉及一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药及其制备方法和应用。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)属于弧菌科、气单胞菌属，是杆状、革兰氏阴性、有动力的气单胞菌群，在液体培养基中具有极生单鞭毛、兼性厌氧、无芽孢、无荚膜。生理生化特征为：V试验、氧化酶、硝酸盐还原、明胶液化、吲哚试验、精氨酸双水解、赖氨酸脱羧酶阳性，能发酵葡萄糖产酸和产气。生长pH值为5.5-9.0，最适生长温度28℃，在低温下有一定的生长能力，最低生长温度达-0.1℃。普遍存在于淡水、海水、河流、污水、淤泥、土壤和人类粪便中；也存在各种食品中，例如：蔬菜、鲜奶、鱼、海鲜、火腿、腊肠等各种畜禽肉中。嗜水气单胞菌(A.hydrophila)具有广泛的致病性，感染动物包括冷血动物(鱼类、两栖类、爬行类)和恒温动物(禽类及哺乳类)，尤其是水生动物最常见的致病菌，给全世界的淡水养殖业造成惨重的经济损失，具有感染动物种类多、流行范围广、流行季节长等特点，是一种典型人-兽-鱼共患的致病菌。近年来，人类因感染嗜水气单胞菌(A.hydrophila)而导致腹泻、食物中毒、继发感染引起蜂窝织炎、脑膜炎、腹膜炎、肠胃炎、败血症和伤口感染等病例也频繁发生，其致病作用已成为当今公共卫生关注的问题。目前在许多国家已将此菌纳入腹泻病原菌的常规检测范围，作为食品卫生检验的对象。随着水产养殖集约化程度的提高，特别是名、特、优养殖品种的迅速发展，水产动物疾病种类日益增多，给养殖业带来了严重的经济损失。以抗生素为主的药物防治长期使用不仅给水体环境造成了不良影响，而且耐药菌株的产生也将给人类健康带来一定的威胁。由此，疫苗和免疫增强剂(immuneopotentiator)成为水产动物病害防治的首选。免疫增强剂对提高养殖动物非特异性免疫(nonspecificcimmunit)能力有着其独特的功效，在提高养殖品种的抗病力起到了积极的作用，已成为水产养殖动物重要的饲料添加剂。特别是在甲壳类养殖品种中，通过免疫增强剂提高抗病力，已成为生产性防病的有效手段之一。中草药具有来源广泛、价格低廉、环境污染较低、不易产生耐药性等优点深受人们的普遍认可，中药源免疫增强剂已成为甲壳类免疫增强剂筛选的重要来源。在我国使用中草药防治疾病已有几千年历史，中草药为我国传统药物，在抑菌、抗菌和促生长等方面具有重要作用。目前，由于化学药物的滥用，导致了诸多的问题，如造成了不可逆环境污染、在动植物中蓄积、危害人类的健康和致癌等。然而中草药是天然有机物，毒副作用小，无蓄积、无残留，减少了对生物的危害，且其成分复杂，发挥作用时具有多靶点、多机制、多效性等特点，使病原微生物不易对中草药产生耐药性，提高了抗菌效力，因此，中草药越来越受到人们的关注。

近年来随着经济的快速发展，水产养殖业也得到了迅猛的发展，但同时由于集约化养殖导致了水质恶化，致使水体病原菌大量繁殖，水产养殖动物疾病频发，水产养殖业损失惨重，同时嗜水气单胞菌引起的病害也造成了大量的损失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药及其制备方法和应用，旨在解决近年来随着经济的快速发展，由于集约化养殖导致了水质恶化，致使水体病原菌大量繁殖，水产养殖动物疾病频发，水产养殖业损失惨重，同时嗜水气单胞菌引起的病害也造成了大量损失的问题。

本发明是这样实现的，一种抑杀嗜水气单胞菌的中草药的制备方法，所述抑杀嗜水气单胞菌的中草药的制备方法包括以下步骤：

将五倍子、地榆和大黄三味中草药置于恒温干燥箱65±5℃下干燥5h；

然后取每味中药各50g粉碎后放人洁净的烧杯中，按1：10重量比例加水浸泡30min后，煎煮30min，用纱布过滤药液，重复此过程3次；

然后合并所得药液，蒸馏浓缩至药液内含原药1g/mL；

最后用高压灭菌锅在121℃灭菌20min后，置冰箱4℃中保存备用。

本发明的另一目的在于提供一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药，所述抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药包括：五倍子、地榆和大黄，五倍子、地榆和大黄的剂量按重量配比为5:2:1。

本发明的另一目的在于提供一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药的应用，所述复方中草药的应用包括：

该抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药具有杀菌抑菌的功能，增强鱼类对嗜水气单胞菌的抵抗能力，降低患病的死亡率，在治疗嗜水气单胞菌引起鱼类的细菌性疾病中的应用。

我国拥有丰富的中草药资源，中草药以低残留、对人体健康无害、高效安全，符合目前倍受关注的健康养殖的要求。因此，合理地开发利用中草药资源，在水产动物养殖中，不仅对动物的营养和促生长以及提高防病抗病能力具有重大意义，同时也符合水产养殖可持续发展的要求；为了减少病害对水产养殖业造成的损失，找到有较强效果、毒副作用小的药物进行防治变得尤为重要。因此，本发明以嗜水气单胞菌为研究对象，筛选出对其有较好抑菌作用的复方中草药，从而为水产动物病害学和嗜水气单胞菌引起的鱼类细菌性疾病防治实践提供参考依据。

附图说明

图1是本发明实施例提供的抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明以嗜水气单胞菌为研究对象，通过琼脂扩散法，从30种中草药中，初步筛选出了五倍子、地榆、大黄、黄芩、黄连、甘草和槟榔等7种中草药；通过正交t值法得出了主要药物为五倍子；通过辅助药物之间的联合作用确定了辅助药物为地榆和大黄；通过剂量分析确定了五倍子、地榆和大黄的剂量配比为5:2:1。

以(136.33±15.94)g的异育银鲫为研究对象，采用养殖试验的方法，在60天试验期内，随着添加量的增大，增重率、SGR、丰满度、内脏比出现先升后缓慢降低的趋势，最大值均出现在1％组，分别为59.81％、0.77％、1.58和13.66％。以GOT、GPT、SOD、MDA、CAT、ACP、AKP、LDH和MDH活性为检测指标，在60天的试验期内，随着添加量的逐渐增大，肝脏、肌肉和鳃组织的GOT、GPT、SOD、MDA、CAT和LDH活性基本均出现上升的趋势，肝脏和肌肉的ACP和AKP活性基本保持不变，血液的则基本出现上升的趋势，肝脏MDH出现下降的趋势，肌肉和鳃组织则基本出现上升的趋势；基本呈现添加量越大，酶活性值越大的趋势；GOT和GPT活性大小顺序基本均为肝脏＞血液＞肌肉＞鳃；肝脏、肌肉和鳃组织的SOD活性大小相差不大，MDA活性大小顺序基本为血液＞鳃＞肝脏＞肌肉，CAT活性大小顺序基本为肝脏＞鳃＞血液＞肌肉；ACP和AKP活性大小顺序基本均为鳃＞肝脏＞肌肉；LDH活性大小顺序基本为肌肉＞肝脏＞鳃，MDH活性大小顺序基本为肝脏＞肌肉、鳃。

下面结合附图对本发明作详细描述。

一种抑杀嗜水气单胞菌的中草药的制备方法，所述抑杀嗜水气单胞菌的中草药的制备方法包括以下步骤：

S101：将五倍子、地榆和大黄三味中草药置于恒温干燥箱65±5℃下干燥5h；

S102:取每味中药各50g粉碎后放人洁净的烧杯中，按1：10重量比例加水浸泡30min后，煎煮30min，用纱布过滤药液，重复此过程3次；

S103:合并所得药液，蒸馏浓缩至药液内含原药1g/mL；

S104：用高压灭菌锅在121℃灭菌20min后，置冰箱4℃中保存备用。

本发明提供一种所述抑杀嗜水气单胞菌的中草药制备方法制备的抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药，所述抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药包括：五倍子、地榆和大黄，五倍子、地榆和大黄的剂量按重量配比为5:2:1。

本发明提供一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药的应用，所述抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药的应用包括：

该抑杀嗜水气单胞菌的中草药中的五倍子、地榆和大黄组合的组合物具有杀菌抑菌的功能，增强鱼类对嗜水气单胞菌的抵抗能力，降低患病的死亡率，其特征在于，在治疗嗜水气单胞菌引起鱼类的细菌性疾病中的应用。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1.单方中草药的筛选

1.1中草药提取液的制备

中草药提取采用煎煮的方法：将购置回来的30种中草药置于恒温干燥箱65(±5)℃下干燥5h(生姜和大蒜则先切碎，然后在此温度下干燥2d)，然后取每味中药各50g粉碎后放人洁净的烧杯中，按1：10比例加水浸泡30min后，煎煮30min，用纱布过滤药液，重复此过程3次，然后合并所得药液，蒸馏浓缩至药液内含原药1g/mL，最后用高压灭菌锅灭菌(121℃，20min)后，置冰箱4℃中保存备用。

1.2菌悬液的制备

将菌株活化，用接种针在固体培养基上划线，在28℃培养24h后，挑取单个菌落，接种到液体培养基上震荡培养12-16h。采用麦氏比浊法将菌液用液体培养基稀释到合适浓度，本试验中菌液浓度为1×108CFU/mL。

1.3琼脂扩散法

固体培养基平板直径约90.00mm，培养基厚度约3.60mm，平板上加100uL菌液(约1×107CFU/ml)，涂抹均匀。然后用打孔器(直径为5.00mm)在平板上打孔，每个平板上打5个孔，每种药物做5个重复，然后加入30ul(1g/ml)药液，最后放入28℃培养箱中培养24h，观察并测量抑菌圈直径，抑菌圈≥20mm，极敏；15-19mm，高敏；10-15mm，中敏；10mm以下，低敏。

1.4二倍稀释法

用LB液体培养基以二倍稀释法对提取物进行梯度稀释，稀释成7个2倍系列浓度，然后在盛有1.9mL肉汤培养基的试管中分别加入100ul稀释后的药液，最后一管加入100ul的蒸馏水作空白对照，最后加入细菌悬液，使细菌浓度达到106CFU/mL。37℃培养24h，625nm测定吸光值，无菌生长的试管中的药物浓度即为该药物的最小抑菌浓度(MIC)，试验重复3次。最后加入细菌悬液，使细菌终浓度达到106CFU/mL。在37℃下培养24h，625nm测定吸光值，无菌生长的试管中的最小提取物浓度即为该提取物的最小抑菌浓度(MinimumInhibitoryConcentration，MIC)。试验重复三次。

2.复方中草药的筛选和配比

通过琼脂扩散法和二倍稀释法共同初次筛选出抑菌效果较好的中草药，利用正交t值法和药物之间的交互作用，对初次筛选出的中草药进一步进行筛选和复方配比，步骤为，主要药物分析、辅助药物分析和剂量分析。

2.1主要药物分析

主要药物分析采用正交t值法(表1)，即将筛选出来的中草药每种作为一个因素，分别编制代号为ABCDE等，每种中草药均设两个水平，设水平1为添加，水平2为不添加。剂量水平均采用1:1:1:1:1。试验选用L12(211)正交t值表进行试验安排，各组通过二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，以其为试验指标，每组3个重复，数据越小，抑菌效果越好。

表1正交t值法L12(211)的组方原则

2.2辅助药物交互作用分析

利用琼脂扩散法，采用药物之间的交互作用进行辅助药物分析，以抑菌圈直径为试验指标。具体方法为用灭菌后的打孔器(直径为5.85mm)在每个平板上打4个孔，一孔以50uL灭菌生理盐水为阴性对照，另外3孔分别加入50uL两种单味中草药原液。设3个平行重复。将平板置于28℃培养箱中培养24h，观察结果。

2.3剂量配比分析

各因素确定后，即采用正交t值法进行剂量配比分析，每组3个重复，以抑菌圈直径为检测指标。

3.不同剂量复方中草药对异育银鲫生长的影响

3.1称取已确定好的3种中草药复方，按五倍子：地榆：大黄＝5:2:1的比例进行配置。配置好后，以5％的投饵率计算，称取合适的饲料，然后采用喷洒的方法将药液均匀的附在饲料上，然后置于干燥箱中，在65℃干燥24h以配用。饲料为成都天龙饲料公司生产的鲤鱼成鱼膨化饲料。

试验用鱼异育银鲫(Carassaisauratusgibebio)，体重为(136.33±15.94)g。经过预试验，设置1个对照组(0％复方)和4个试验组(复方中草药添加量为0.5％、1％、2％和4％)，每组3个重复，每个重复20尾，2天换水1次。养殖过程中，采用加热棒进行控温，控制水温在23±1.6℃，换水时，先放出1/3的水，然后将水注满，等待5min，再放掉1/2水，注满水后，等待5min，最后再放掉所用的水，再将水缸注满。试验期间，采用定时投喂，每天早晚各投喂1次饲料，投喂量为3％，早上9:00，下午16:00。在养殖过程中，每15天，抽取一定数量的鱼进行称重，逐渐增加投喂量。

3.2在60天的养殖试验结束后，进行体长、体重和去内脏重的测定。相关指标的计算方法：

增重率(％)＝[(试验末鱼体重-初始体重)/初始体重]*100％

特定生长率SGR(％)＝[(ln试验末鱼体重-ln初始体重)/试验天数]*100％

丰满度(％)＝[试验末鱼体重/试验末鱼体长3]*100％

内脏比(％)＝[试验末鱼体内脏重/试验末鱼体重]*100％

3.3攻毒试验

养殖试验结束后，剩余的试验鱼全部用于攻毒试验。试验方法采用xie(2008)、卢春霞(2011)等报道的方法。将两次活化的菌株用无菌生理盐水稀释，保持终浓度为108CFU/ml。注射量为0.2mL/尾，观察鱼死亡情况，观察1周，统计死亡率。

死亡率(％)＝死亡数/鱼总数*100％

免疫保护率(％)＝100％*(对照组死亡率-试验组死亡率)/对照组死亡率

4.不同剂量复方中草药对异育银鲫酶活性的影响

4.1称取已确定好的3种中草药复方，按五倍子：地榆：大黄＝5:2:1的比例进行配置。配置好后，以5％的投饵率计算，称取合适的饲料，然后采用喷洒的方法将药液均匀的附在饲料上，然后置于干燥箱中，在65℃干燥24h以配用。饲料为成都天龙饲料公司生产的鲤鱼成鱼膨化饲料。

经过预试验，设置1个对照组(0％复方)和4个试验组(添加量为0.5％、1％、2％和4％)，每组3个重复，每个重复20尾，2天换水1次。养殖过程中，采用加热棒进行控温，控制水温在23±1.6℃，换水时，先放出1/3的水，然后将水注满，等待5min，再放掉1/2水，注满水后，等待5min，最后再放掉所用的水，再将水缸注满。试验期间，采用定时投喂，每天早晚各投喂1次饲料，投喂量为3％，早上9:00，下午16:00。在养殖过程中，每15天，抽取一定数量的鱼进行称重，逐渐增加投喂量。

4.2在给药后的第60天进行采样，每个重复取鱼2尾，解剖时，取出鱼的鳃、肌肉和肝脏组织以后，滴加生理盐水保持样品的鲜活，称重时，先用生理盐水润洗，洗净后，用滤纸吸干再称重，使其重量为0.2-0.3g左右，然后放入4ml离心管中，将离心管放入冰浴中，加入1:10的生理盐水，利用匀浆器研磨，研磨到基本没有颗粒状或成块状物质为准，研磨时，使其浸没在冰浴中，以避免酶类失活。研磨完成后，放入冷冻离心机离心，完成后，放入4℃冰箱待用。血液的采集则采用注射器进行尾静脉采血，采完后，放入事先准备好的抗凝管中，编号，放入4℃冰箱保存待用。

4.3酶活性的测定

GOT、GPT、SOD、MDA、CAT、ACP、AKP、LDH和MDH活性的测定严格按照南京建成试剂盒说明书的操作方法进行测定，蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法。

5.结果

5.1从30种中草药中，初步筛选出了五倍子、地榆、大黄、黄芩、黄连、甘草和槟榔等7中中草药，五倍子和黄连对其为极敏药物，地榆、大黄、黄芩、甘草和槟榔等中草药为高敏药物；

通过正交t值法得出了主要药物为五倍子；

通过辅助药物之间的联合作用确定了辅助药物为地榆和大黄；

通过剂量分析确定了五倍子、地榆和大黄的剂量配比为5:2:1。

5.2在60天试验期内，随着添加量的增大，增重率、SGR、丰满度、内脏比出现先升后缓慢降低的趋势，最大值均出现在1％组，分别为59.81％、0.77％、1.58和13.66％。

5.3在60天的试验期内，随着添加量的逐渐增大，肝脏、肌肉和鳃组织的GOT、GPT、SOD、MDA、CAT和LDH活性基本均出现上升的趋势，肝脏和肌肉的ACP和AKP活性基本保持不变，血液的则基本出现上升的趋势，肝脏MDH出现下降的趋势，肌肉和鳃组织则基本出现上升的趋势；

随着添加量的逐渐增大，酶活性值也越大的趋势；

GOT和GPT活性大小顺序基本均为肝脏＞血液＞肌肉＞鳃；肝脏、肌肉和鳃组织的SOD活性大小相差不大，MDA活性大小顺序基本为血液＞鳃＞肝脏＞肌肉，CAT活性大小顺序基本为肝脏＞鳃＞血液＞肌肉；ACP和AKP活性大小顺序基本均为鳃＞肝脏＞肌肉；LDH活性大小顺序基本为肌肉＞肝脏＞鳃，MDH活性大小顺序基本为肝脏＞肌肉、鳃。

Claims (4)

1.一种抑杀嗜水气单胞菌的中草药制备方法，其特征在于，所述抑杀嗜水气单胞菌中草药制备方法包括以下步骤：

步骤一、将五倍子、地榆和大黄三味中草药置于恒温干燥箱65±5℃下干燥5h；

步骤二、然后取每味中药各50g粉碎后放人洁净的烧杯中，按1：10重量比例加水浸泡30min后，煎煮30min，用纱布过滤药液，重复此过程3次；

步骤三、然后合并所得药液，蒸馏浓缩至药液内含原药1g/mL；

步骤四、最后用高压灭菌锅在121℃灭菌20min后，置冰箱4℃中保存备用。

2.一种如权利要求1所述的抑杀嗜水气单胞菌中草药制备方法制备的抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药，其特征在于，所述抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药包括：五倍子、地榆和大黄三味中草药；所述五倍子、地榆和大黄的剂量按重量配比为5:2:1。

3.一种如权利要求2所述的抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药的应用，其特征在于，所述抑杀嗜水气单胞菌的中草药具有杀菌抑菌的功能，增强鱼类对嗜水气单胞菌的抵抗能力，降低患病的死亡率。

4.一种如权利要求3所述抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药的应用，其特征在于，在治疗嗜水气单胞菌引起鱼类的细菌性疾病中的应用。