CN109674778A - 脂类抗菌组合物、提取方法、检测方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂类抗菌组合物，所述的脂类抗菌组合物提取源自黑水虻幼虫，含有油酸甘油酯18.0％～22.0％、月桂酸7.7％～10.0％、肉豆蔻酸15.5％～18.0％，本发明属于生物领域，该组合物抗菌效果优异，至少能够对部分大肠杆菌、肠炎型沙门氏菌起到特异性的抗菌效果，同时，本发明还公开了该组合物的提取方法、检测方法和用途。

Description

脂类抗菌组合物、提取方法、检测方法和用途
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种脂类抗菌组合物、提取方法、检测方法和用途。
背景技术
《黑水虻研究进展》，养殖与饲料；2015年第12期；作者刘宏宇等公开了以下内容：通过对黑水虻幼虫肠道微生物的筛选，获得的菌株在生长代谢过程中能够合成某些脂肽类表面活性剂，如脂肽Iturin(依枯草菌素)和Surfaction(表面活性素)，并推测脂肽Iturin(依枯草菌素)和Surfaction(表面活性素)具有一定的抗菌效果，同时文中还记录了韩国科学家通过诱导的方式提取黑水虻体内的抗菌肽，表现出较好的抑菌效果，同时强调了该抗菌效果发生在免疫诱导后呈现。
《脂肽surfactin、iturin、fengycin性质鉴定的研究与展望》，中国食品添加剂，龚谷迪等著，其文献中记录了脂肽Iturin(依枯草菌素)和Surfaction(表面活性素)具有强效抗菌作用。
同时，《黑水虻肠道细菌抗菌筛选及其活性物质分子鉴定》，农业微生物，周定中等著，其研究对象是黑水忙的肠道微生物，并不是黑水忙的虫体本身，实验方法中提取了幼虫的肠道进行细菌分离，对所分离的细菌进行鉴定及抗菌谱检测。
综合所述可得到一些结论：
1、现有关黑水虻抗菌物质的研究，仅有少量文献报道了脂肽Iturin(依枯草菌素)和Surfaction(表面活性素)的功能作用。而脂肽Iturin(依枯草菌素)和Surfaction(表面活性素)是来源于黑水虻肠道微生物中芽孢杆菌的代谢产物，代谢产物呈现良好的抗菌效果，但其提取分离的技术工艺或手段跟本发明的技术工艺是不一样的。
2、国外有文献报告证实了合理的免疫诱导能够使黑水虻幼虫产生抗菌肽，表现抗菌效果，相应的，如果未经免疫诱导，则很难获得令人满意的抗菌效果。此外，抗菌肽和脂类抗菌物质的化学成分和作用机理是不同的。
本发明的主要目的是：基于黑水虻抗菌性能的研究，通过技术手段提取、分离获得不同于前人研究的一些有价值的抗菌物质，以期获得较好的抗菌效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂类抗菌组合物，该组合物抗菌效果优异，能够至少对部分大肠杆菌、肠炎型沙门氏菌起到特异性的抗菌效果，同时，本发明还公开了该组合物的提取方法、检测方法和用途。
本发明的具体方案如下：一种脂类抗菌组合物，所述的脂类抗菌组合物提取自黑水虻幼虫，含有油酸甘油酯18.0％～22.0％、月桂酸7.7％～10.0％、肉豆蔻酸15.5％～18.0％。
同时，本发明还公开了一种如上所述的脂类抗菌组合物的提取方法，包括如下步骤：
步骤1：清空黑水虻幼虫肠道内容物；
步骤2：清洗消毒黑水虻幼虫；
步骤3：匀浆与提取分离，将黑水虻幼虫匀浆后采用有机溶剂提取一段时间，过滤并离心滤液以除去滤液中的沉淀物，然后对滤液进行浓缩得到粗提物；
步骤4：将粗提物经过层析后洗脱纯化，去除洗脱液中的溶剂得到所述的脂类抗菌组合物。
在上述的脂类抗菌组合物的提取方法中，所述的步骤2和步骤3之间还包括去除幼虫肠道的步骤。
在上述的脂类抗菌组合物的提取方法中，所述的步骤1具体为：将3～5龄黑水虻幼虫置于养殖盒中，不饲喂过夜直至清空幼虫肠道内容物。
在上述的脂类抗菌组合物的提取方法中，所述的步骤2具体为：将空腹过夜的黑水虻幼虫置于三角锥瓶中，用蒸馏水清洗三次，滤干水份，再用70～75vol％乙醇消毒一次，滤干备用。
在上述的脂类抗菌组合物的提取方法中，所述的步骤3具体为：准确称取一定量的黑水虻幼虫虫体，采用高速组织捣碎机对幼虫虫体进行匀浆，分别用有机溶剂乙酸乙酯按1:5～1:3比例浸泡虫体组织匀浆液，低温提取72h，后将组织匀浆液用5层纱布过滤或于4℃下6000r/min离心10min，除去沉淀，分别获得虫体粗提液；采用旋转蒸发仪对粗提液进行浓缩，直至有机溶剂蒸发完毕，温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为4档，分别得到虫体粗提物。
在上述的脂类抗菌组合物的提取方法中，所述的步骤4具体为：虫体粗提物经300目硅胶柱层析，用有机溶剂无水乙醇进行洗脱，洗脱液再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，又以无水乙醇进行洗脱纯化，得到洗脱液，洗脱液进行旋转蒸发回收有机溶剂，温度设定为55℃，压力为0.1Mpa，转速为3档，获得脂类抗菌组合物。
此外，本发明还公开了一种脂类抗菌组合物的检测方法，所述的方法具体为：采用气—质谱联用(GC-MS)进行对如权利要求1所述的脂类抗菌组合物的有效组分的检测；检测参数：色谱柱HP-5MS，30m×0.25mm；载气高纯He流速为1.0mL/min；程序升温从70℃恒温1min开始，以5℃/min的速度升至280℃并恒温15min；进样口温度为250℃；分流模式为20：1；离子源EI70eV，温度为230℃；接口温度为250℃；采集质量范围：30-400amu。
此外，本发明还公开了一种如上所述的脂类抗菌组合物的用途，用于畜禽的体内或体外抗菌用途。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的脂类抗菌组合物至少能够对部分大肠杆菌和肠炎型沙门氏菌起到特异性的抗菌效果。
本发明的脂类抗菌组合物的提取方法提取效果好，提取率高，能够有效将其杂质的干扰。
本发明的脂类抗菌组合物在畜禽养殖领域中具有广泛的应用前景，但是本发明并不限定于在其他领域的用途。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围内。
1、提取和检测试验
实施例1：
3龄黑水虻幼虫脂类抗菌提取物的分离、制备步骤如下：
(1)清空黑水虻幼虫肠道内容物
将3龄黑水虻幼虫置于养殖盒中，不饲喂过夜直至清空幼虫肠道内容物。
(2)清洗消毒
将空腹过夜的黑水虻幼虫置于三角锥瓶中，用蒸馏水清洗三次，滤干水份，再用75％乙醇消毒一次，滤干备用。
(3)去除幼虫肠道
将滤干备用的幼虫，移置超净工作台(SW-CJ-IF)，无菌操作，用手术刀沿幼虫腹部中线小心切开，用无菌镊子取出幼虫肠道。虫体和肠道分别置于干净的容器中低温保存备用。
需要说明的是，在实际生产中，并不一定需要该步骤，本步骤的存在主要是为了排除幼虫肠道组织提取物对试验结果的影响以及对于本发明的结论的对比论证。下述实施例2-5均为该目的，不做重复阐述。
(4)匀浆与提取分离
分别准确称取100g的黑水虻幼虫虫体和肠道，采用高速组织捣碎机对幼虫虫体和肠道进行匀浆，分别用乙酸乙酯按1:5和1:3比例浸泡组织匀浆液，低温提取72h，后将组织匀浆液用5层纱布过滤，除去沉淀，得到虫体和肠道粗提液。采用旋转蒸发仪对粗提液进行浓缩，直至有机溶剂蒸发完毕，温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为4档，得到粗提物。经计算，虫体粗提物得率：16.07％；肠道粗提物得率：4.19％。
需要说明的是：肠道粗提物的制备是用于验证和排除肠道中的物质对于本发明的有效成分的影响，在实际生产中，无需单独提取。下述实施例2-5均为该目的，不做重复阐述。
(5)有效组分制备
虫体粗提物经300目硅胶柱层析，用无水乙醇进行洗脱，洗脱液再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，又以无水乙醇进行洗脱纯化，得到洗脱液，洗脱液进行旋转蒸发回收有机溶剂，温度设定为55℃，压力为0.1Mpa，转速为3档，获得脂类有效组分。经计算，有效组分得率：8.53％。GC-MS检测可知，有效组分中油酸甘油酯、月桂酸及肉豆蔻酸的含量分别为18.02％、7.71％及15.51％。
实施例2：
3.5龄黑水虻幼虫脂类抗菌提取物的分离、制备步骤如下：
(1)清空黑水虻幼虫肠道内容物
将3.5龄黑水虻幼虫置于养殖盒中，不饲喂过夜直至清空幼虫肠道内容物。
(2)清洗消毒
将空腹过夜的黑水虻幼虫置于三角锥瓶中，用蒸馏水清洗三次，滤干水份，再用75％乙醇消毒一次，滤干备用。
(3)去除幼虫肠道
将滤干备用的幼虫，移置超净工作台(SW-CJ-IF)，无菌操作，用手术刀沿幼虫腹部中线小心切开，用无菌镊子取出幼虫肠道。虫体和肠道分别置于干净的容器中低温保存备用。
(4)匀浆与提取分离
分别准确称取200g的黑水虻幼虫虫体和肠道，采用高速组织捣碎机对幼虫虫体和肠道进行匀浆，分别用乙酸乙酯按1:5和1:3比例浸泡组织匀浆液，低温提取72h，后将组织匀浆液用5层纱布过滤，除去沉淀，得到虫体和肠道粗提液。采用旋转蒸发仪对粗提液进行浓缩，直至有机溶剂蒸发完毕，温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为4档，得到粗提物。经计算，虫体粗提物得率：17.28％；肠道粗提物得率：4.22％。
(5)有效组分制备
虫体粗提物经300目硅胶柱层析，用无水乙醇进行洗脱，洗脱液再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，又以无水乙醇进行洗脱纯化，得到洗脱液，洗脱液进行旋转蒸发回收有机溶剂，温度设定为55℃，压力为0.1Mpa，转速为3档，获得脂类有效组分。经计算，有效组分得率：8.79％。GC-MS检测可知，有效组分中油酸甘油酯、月桂酸及肉豆蔻酸的含量分别为18.58％、8.33％及16.02％。
实施例3：
4龄黑水虻幼虫脂类抗菌提取物的分离、制备步骤如下：
(1)清空黑水虻幼虫肠道内容物
将4龄黑水虻幼虫置于养殖盒中，不饲喂过夜直至清空幼虫肠道内容物。
(2)清洗消毒
将空腹过夜的黑水虻幼虫置于三角锥瓶中，用蒸馏水清洗三次，滤干水份，再用75％乙醇消毒一次，滤干备用。
(3)去除幼虫肠道
将滤干备用的幼虫，移置超净工作台(SW-CJ-IF)，无菌操作，用手术刀沿幼虫腹部中线小心切开，用无菌镊子取出幼虫肠道。虫体和肠道分别置于干净的容器中低温保存备用。
(4)匀浆与提取分离
分别准确称取500g的黑水虻幼虫虫体和肠道，采用高速组织捣碎机对幼虫虫体和肠道进行匀浆，分别用乙酸乙酯按1:5和1:3比例浸泡组织匀浆液，低温提取72h，后将组织匀浆液用5层纱布过滤，除去沉淀，得到虫体和肠道粗提液。。采用旋转蒸发仪对粗提液进行浓缩，直至有机溶剂蒸发完毕，温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为4档，得到粗提物。经计算，虫体粗提物得率：18.24％；肠道粗提物得率：4.27％。
(5)有效组分制备
虫体粗提物经300目硅胶柱层析，用无水乙醇进行洗脱，洗脱液再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，又以无水乙醇进行洗脱纯化，得到洗脱液，洗脱液进行旋转蒸发回收有机溶剂，温度设定为55℃，压力为0.1Mpa，转速为3档，获得脂类有效组分。经计算，有效组分得率：9.42％。GC-MS检测可知，有效组分中油酸甘油酯、月桂酸及肉豆蔻酸的含量分别为20.05％、9.09％及16.84％。
实施例4：
4.5龄黑水虻幼虫脂类抗菌提取物的分离、制备步骤如下：
(1)清空黑水虻幼虫肠道内容物
将4.5龄黑水虻幼虫置于养殖盒中，不饲喂过夜直至清空幼虫肠道内容物。
(2)清洗消毒
将空腹过夜的黑水虻幼虫置于三角锥瓶中，用蒸馏水清洗三次，滤干水份，再用75％乙醇消毒一次，滤干备用。
(3)去除幼虫肠道
将滤干备用的幼虫，移置超净工作台(SW-CJ-IF)，无菌操作，用手术刀沿幼虫腹部中线小心切开，用无菌镊子取出幼虫肠道。虫体和肠道分别置于干净的容器中低温保存备用。
(4)匀浆与提取分离
分别准确称取1000g的黑水虻幼虫虫体和肠道，采用高速组织捣碎机对幼虫虫体和肠道进行匀浆，分别用乙酸乙酯按1:5和1:3比例浸泡组织匀浆液，低温提取72h，后将组织匀浆液用5层纱布过滤，除去沉淀，得到虫体和肠道粗提液。采用旋转蒸发仪对粗提液进行浓缩，直至有机溶剂蒸发完毕，温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为4档，得到粗提物。经计算，虫体粗提物得率：19.38％；肠道粗提物得率：4.38％。
(5)有效组分制备
虫体粗提物经300目硅胶柱层析，用无水乙醇进行洗脱，洗脱液再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，又以无水乙醇进行洗脱纯化，得到洗脱液，洗脱液进行旋转蒸发回收有机溶剂，温度设定为55℃，压力为0.1Mpa，转速为3档，获得脂类有效组分。经计算，有效组分得率：10.67％。GC-MS检测可知，有效组分中油酸甘油酯、月桂酸及肉豆蔻酸的含量分别为21.22％、9.63％及17.18％。
实施例5：
5龄黑水虻幼虫脂类抗菌提取物的分离、制备步骤如下：
(1)清空黑水虻幼虫肠道内容物
将5龄黑水虻幼虫置于养殖盒中，不饲喂过夜直至清空幼虫肠道内容物。
(2)清洗消毒
将空腹过夜的黑水虻幼虫置于三角锥瓶中，用蒸馏水清洗三次，滤干水份，再用75％乙醇消毒一次，滤干备用。
(3)去除幼虫肠道
将滤干备用的幼虫，移置超净工作台(SW-CJ-IF)，无菌操作，用手术刀沿幼虫腹部中线小心切开，用无菌镊子取出幼虫肠道。虫体和肠道分别置于干净的容器中低温保存备用。
(4)匀浆与提取分离
分别准确称取2000g的黑水虻幼虫虫体和肠道，采用高速组织捣碎机对幼虫虫体和肠道进行匀浆，分别用乙酸乙酯按1:5和1:3比例浸泡组织匀浆液，低温提取72h，后将组织匀浆液用5层纱布过滤，除去沉淀，得到虫体和肠道粗提液。采用旋转蒸发仪对粗提液进行浓缩，直至有机溶剂蒸发完毕，温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为4档，得到粗提物。经计算，粗提物得率：19.96％；肠道粗得物得率：4.41％。
(5)有效组分制备
虫体粗提物经300目硅胶柱层析，用无水乙醇进行洗脱，洗脱液再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，又以无水乙醇进行洗脱纯化，得到洗脱液，洗脱液进行旋转蒸发回收有机溶剂，温度设定为55℃，压力为0.1Mpa，转速为3档，获得脂类有效组分。经计算，有效组分得率：11.48％。GC-MS检测可知，有效组分中油酸甘油酯、月桂酸及肉豆蔻酸的含量分别为21.96％、9.91％及17.94％。
2、有效组分的体内、外效果检测
(1)体外抗菌活性检测
采用牛津杯法进行敏感性检测。参考依据：NCCLS药敏试验标准和抗生素微生物检定法。大肠杆菌O78、肠炎型沙门氏菌、大肠杆菌K88及大肠杆菌K99菌株来源：广东省农业科学院动物卫生研究所提供。具体步骤如下：
1)制备固体培养基底层。吸取M-H固体培养基20ml倒入培养皿(直径：9.0cm±0.1cm)，待凝固。
2)制备菌层。吸取一定量(比例：3-5滴/100ml)目标菌株(大肠杆菌O78、K88和K99)和质控菌株(大肠杆菌(ATCC 25922)菌悬液(菌浓：OD值2.0)，加到M-H培养基(50-60℃)中充分摇匀后，吸取10ml倒入已盛有培养基底层的平皿中，静置10min；
3)抑菌活性检测。用无菌镊子将牛津杯(内径6.0(±0.1)mm，外径7.8(±0.1)mm，高10.0(±0.1)mm)均匀放置制好的平板上。分别吸取粗提物(18.24％)和有效组分(8.62％)样品各240ul；设阳性对照：氨苄青霉素(AMP)和有机溶剂组(EA)。将平板置于(36.9±0.1)℃培养箱中培养18-24h观察结果、拍照及测量抑菌圈直径大小(mm)。结果见表1。
4)结果：由表1可知，黑水虻幼虫虫体粗提物和有效组分均有效抑制大肠杆菌O78、肠炎型沙门氏菌、产肠毒素型大肠杆菌K88和K99(P<0.01)，且有效组分的抑菌效果优于粗提物(P＞0.05)；而肠道粗提物对几种细菌均无抑制效果。
表1黑水虻幼虫粗提物和有效组分对几种细菌敏感性测定
注：抑菌圈直径＝Φ，数值均以平均值±标准差表示。质控菌株：大肠杆菌(ATCC25922)；EA：有机溶剂；AMP：氨苄青霉素；敏感性判定：Φ≥17.0mm为敏感。
(2)体内抑菌治疗效果试验
1)试验鸡饲养管理及分组
试验一：
试验在广东省农业科学院动物科学研究所试验基地完成。随机选择180只健康的的快大型黄羽肉鸡(1日龄)饲养至14日龄，随机分为6个组(健康对照组Ⅰ组、感染对照组Ⅱ-1组、抗生素对照组Ⅲ组、有效组分低剂量组Ⅳ组、中剂量组Ⅴ组、高剂量组Ⅵ组)，每组3个重复，每个重复10只鸡，各组鸡2周龄的初始体重无显著差异(P>0.05)。试验鸡均在封闭式肉鸡舍内地面平养，地面铺放木屑，光照时间24h，自由采食和饮水。试验选用玉米-豆粕型基础饲粮，参照NRC(1994)建议的鸡的营养需要量配制。试验采用常规免疫程序，鸡舍平均温度约22℃，相对湿度控制在60％～65％，试验期间采用常规消毒。试验设计与分组处理见表2。
试验二：
试验在广东省农业科学院动物科学研究所试验基地完成。随机选择180只健康的的快大型黄羽肉鸡(1日龄)饲养至14日龄，随机分为6个组(健康对照组Ⅰ组、感染对照组Ⅱ-2组、抗生素对照组Ⅲ组、有效组分低剂量组Ⅳ组、中剂量组Ⅴ组、高剂量组Ⅵ组)，每组3个重复，每个重复10只鸡，各组鸡2周龄的初始体重无显著差异(P>0.05)。饲养管理同试验一。试验设计与分组处理见表3。
2)人工感染试验
试验一：于14日龄进行人工感染试验，除健康对照组Ⅰ组外，其它各组中的每只鸡经肌肉注射大肠杆菌O78菌悬液0.5ml(半数致死量LD50约含5.0×108cfu)。
试验二：于14日龄进行人工感染试验，除健康对照组Ⅰ组外，其它各组中的每只鸡经肌肉注射肠炎型沙门氏菌悬液0.5ml(半数致死量LD50约含4.3×108cfu)。
3)给药方式
幼虫有效组分(实施例5)低中高剂量的配制：准确称取有效组分10.0g，按1:1比例加入无水乙醇，用纯化水分别稀释成0.1g/mL(低剂量)、0.25g/mL(中剂量)及0.5g/mL(高剂量)；盐酸环丙沙星(抗生素对照组)浓度配制：20μg/mL。攻毒后按表2和表3给药，连续用药5天。感染对照组与健康对照组不给药。观察期为10天。
4)粪便中大肠杆菌和沙门氏菌的含量检测
采用差异化培养基法检测鸡粪便中大肠杆菌和沙门氏菌的数量。准确取粪便10.0g，采用麦康凯培养基和沙门氏菌显色培养基按常规菌落计数法进行。菌落的数量单位为lg(CFU/g)。
5)药效评价指标
试验一：a.鸡只死亡率和治愈率；b.粪便中大肠杆菌总量
试验二：a.鸡只死亡率、治愈率及腹泻率；b.粪便中沙门氏菌总量
6)数据分析
试验数据均采用SPSS13.0进行统计分析，采用One-Way ANOVA方差分析和Duncan's进行多重比较，数据结果以平均数±标准误(M±SE)。死亡率、治愈率及腹泻率采用χ2检验分析。下同。
表2黑水虻幼虫有效组分灌服给药试验鸡分组与处理(试验一)
表3黑水虻幼虫有效组分灌服给药试验鸡分组与处理(试验二)
7)试验结果
各试验组的死亡率、治愈率、腹泻率、增重及细菌总量情况见表4和表5。
从表3可知，黑水虻幼虫脂类有效组分低、中、高剂量组能显著降低人工感染鸡大肠杆菌病的死亡率和提高治愈率(P<0.01)，低、中、高剂量组显著降低粪便中大肠杆菌的含量(P<0.05和P<0.01)，中、高剂量组防治效果优于低剂量组和抗生素对照组；从表4可知，黑水虻幼虫脂类有效组分低、中、高剂量组能显著降低人工感染鸡沙门氏菌病的死亡率和提高治愈率(P<0.01)及肠炎型沙门氏菌致鸡腹泻的发生率(P<0.01)，低、中、高剂量组显著降低粪便中沙门氏菌的含量(P<0.05和P<0.01)，中、高剂量组防治效果优于低剂量组和抗生素对照组。因此，黑水虻幼虫脂类有效组分均能有效防治鸡大肠杆菌病和肠炎型沙门氏菌病。
表3黑水虻幼虫有效组分灌服给药对人工诱发鸡大肠杆菌病的药效试验
注：同列数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。
表4 黑水虻幼虫有效组分灌服给药对人工诱发鸡肠炎型沙门氏菌病的药效试验
(3)人工感染K88致断奶仔猪腹泻的病理模型建立
1)试验仔猪饲养管理及分组
选取180头28d初始体重相近、健康三元杂(杜×长×大)断奶仔猪，按照性别和体重随机分为5个组(健康对照组、感染对照组、低剂量组(Ⅰ组)、中剂量组(Ⅱ组)及高剂量组(Ⅲ组)，每组3个重复，每个重复12头断奶仔猪(公母各半)。各组均饲喂玉米-豆粕型基础日粮，预试期为7d，试验期为7d。预试期间，发现有腹泻的仔猪剔除。基础日粮均按照NRC(2012)标准进行配制。试验仔猪均在封闭式断奶仔猪舍高架床平养，自然光照，自由采食和饮水。试验设计与分组处理见表5。
2)人工感染试验
预试期结束，感染对照组、Ⅰ组、Ⅱ组及Ⅲ组中的断奶仔猪攻毒前半小时灌服灭菌处理过的1.2％小苏打2ml/头，半小时后进行人工感染攻毒，灌服2ml大肠杆菌K88菌液/头(LD50：5×109CFU/mL)。
3)给药方式
幼虫有效组分(实施例5)低中高剂量的配制：准确称取有效组分20.0g，按2:1比例加入无水乙醇，用纯化水分别稀释成0.5g/mL(低剂量)、0.75g/mL(中剂量)及1.0g/mL(高剂量)；攻毒后按表5给药，连续用药5天。感染对照组与健康对照组不给药。观察期为7天，自由采食，记录仔猪腹泻情况。7d后仍未死亡的仔猪采取安乐死。
4)粪便中大肠杆菌数量检测
采用差异化培养基法检测粪便中大肠杆菌的数量。准确取粪便10.0g，采用麦康凯培养基按常规菌落计数法进行。菌落的数量单位为lg(CFU/g)。
5)药效评价指标
a.仔猪死亡率、治愈率及腹泻率；b.粪便中大肠杆菌总量
表5 黑水虻幼虫有效组分灌服给药试验断奶仔猪分组与处理
6)试验结果
从表6可知，脂类有效组分低、中、高剂量有利于改善人工感染K88致断奶仔猪腹泻后的生长性能(p＜0.05)，其中，中剂量组要好于低、高剂量组(p＞0.05)；从表7可知，脂类有效组分低、中及高剂量显著降低断奶仔猪死亡率、腹泻率及粪便中大肠杆菌的含量(p＜0.01)，其中，中、高剂量组明显好于低剂量组(p＜0.05)。综上所述，黑水虻幼虫脂类有效组分中和高剂量均有效防治人工感染K88致断奶仔猪腹泻病。
表6 不同处理组断奶仔发病前后体重变化(单位：kg)
注：同列数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
表7 不同处理组断奶仔猪腹泻记录情况
通过上述的实施例1-5以及相关的体内和体外抗菌试验证实以下结论：
1、可以排除黑水虻幼虫肠道组织提取物对于抗菌效果的贡献。
2、本脂类抗菌组合物抗菌效果优异，能够对部分大肠杆菌、肠炎型沙门氏菌起到特异性的抗菌效果。
3、本脂类抗菌组合物有作为抗菌新型兽药或功能性饲料添加的应用前景广泛。
4、本发明的提取效果好，检测方法科学。
本发明并不排斥该脂类抗菌组合物应用于人体类似的体内或体外的细菌的控制的可能性。

Claims (9)

1.一种脂类抗菌组合物，其特征在于，所述的脂类抗菌组合物提取自黑水虻幼虫，含有油酸甘油酯18.0％～22.0％、月桂酸7.7％～10.0％、肉豆蔻酸15.5％～18.0％。
2.一种如权利要求1所述的脂类抗菌组合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：清空黑水虻幼虫肠道内容物；
步骤2：清洗消毒黑水虻幼虫；
步骤3：匀浆与提取分离，将黑水虻幼虫匀浆后采用有机溶剂提取一段时间，过滤并离心滤液以除去滤液中的沉淀物，然后对滤液进行浓缩得到粗提物；
步骤4：将粗提物经过层析后洗脱纯化，去除洗脱液中的溶剂得到所述的脂类抗菌组合物。
3.根据权利要求2所述的脂类抗菌组合物的提取方法，其特征在于，所述的步骤2和步骤3间还包括去除幼虫肠道的步骤。
4.根据权利要求2所述的脂类抗菌组合物的提取方法，其特征在于，所述的步骤1具体为：将3～5龄黑水虻幼虫置于养殖盒中，不饲喂过夜直至清空幼虫肠道内容物。
5.根据权利要求2所述的脂类抗菌组合物的提取方法，其特征在于，所述的步骤2具体为：将空腹过夜的黑水虻幼虫置于三角锥瓶中，用蒸馏水清洗三次，滤干水分，再用70～75vol％乙醇消毒一次，滤干备用。
6.根据权利要求2所述的脂类抗菌组合物的提取方法，其特征在于，所述的步骤3具体为：准确称取一定量的黑水虻幼虫虫体，采用高速组织捣碎机对幼虫虫体进行匀浆，分别用有机溶剂乙酸乙酯按1:5～1:3比例浸泡虫体组织匀浆液，低温提取72h，后将组织匀浆液用5层纱布过滤或于4℃下6000r/min离心10min，除去沉淀，分别获得虫体粗提液；采用旋转蒸发仪对粗提液进行浓缩，直至有机溶剂蒸发完毕，温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为4档，分别得到虫体粗提物。
7.根据权利要求2所述的脂类抗菌组合物的提取方法，其特征在于，所述的步骤4具体为：虫体粗提物经300目硅胶柱层析，用有机溶剂无水乙醇进行洗脱，洗脱液再经SephadexLH-20凝胶柱层析，又以无水乙醇进行洗脱纯化，得到洗脱液，洗脱液进行旋转蒸发回收有机溶剂，温度设定为55℃，压力为0.1Mpa，转速为3档，获得脂类抗菌组合物。
8.一种脂类抗菌组合物的检测方法，其特征在于，所述的方法具体为：采用气—质谱联用(GC-MS)进行对如权利要求1所述的脂类抗菌组合物的有效组分的检测；检测参数：色谱柱HP-5MS，30m×0.25mm；载气高纯He流速为1.0mL/min；程序升温从70℃恒温1min开始，以5℃/min的速度升至280℃并恒温15min；进样口温度为250℃；分流模式为20：1；离子源EI70eV，温度为230℃；接口温度为250℃；采集质量范围：30-400amu。
9.一种如权利要求1所述的脂类抗菌组合物的用途，其特征在于，用于畜禽的体内或体外抗菌用途。
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