CN104480222A - 草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法 - Google Patents

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汤浩茹
邱静
王小蓉
张勇
陈清
孙勃
邓群仙
李雁翎
田钰
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Abstract

本发明公开了一种草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法，具体包括如下步骤：(1)田间草莓苗提取总RNA：(2)总RNA反转录为cDNA(3)设计四种病毒引物；(4)单一RT-PCR检测田间苗；(5)多重RT-PCR病毒检测体系：本发明在利用单一RT-PCR检测SVBV、SMYEV、SMoV和SCV的基础上，通过优化影响多重RT-PCR的因子，建立起多重RT-PCR检测SVBV、SMYEV、SMoV和SCV四种常见草莓病毒的技术体系。

Description

草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法
技术领域
本发明涉及一种植物的病原体检测方法，尤其涉及一种草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法。
背景技术
草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)宿根性多年生常绿草本植物。果实鲜嫩多汁、色泽艳丽、香气怡人、口感酸甜适中，是我国传统的优秀浆果果品之一。草莓果实富含维生素C、有机酸、糖、矿物质及果胶等多种营养成分。近年来研究发现草莓所含的鞣花单宁(Ellagitannins)、花青素(Anthocyanins)和原花青素(Proanthocyanidins)等生物活性物质能预防心脑血管和癌症的发生，因此草莓倍受消费者青睐。
草莓繁殖常采用传统的匍匐茎埋压或分株繁殖，这种无性繁殖方式提高了病毒侵染植株的几率，病毒侵染草莓植株后将破坏细胞的代谢，使其表现出生长缓慢、植株矮小、叶片失绿或变色等特征，从而严重影响果实品质和产量，严重减产可达30％～80％。目前，已发现约62种侵染草莓的病毒，其中以草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus，SCV)、草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus，SMoV)、草莓轻型黄边病毒(Strawberry mildyellow edge virus，SMYEV)和草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus，SVBV)四种病毒浸染造成的危害最为严重。在栽培过程中，这四种病毒往往同时存在，单独侵染时，除草莓皱缩病毒外其他三种病毒都不表现出明显症状，但会导致植株矮小、产量下降和品质变劣，造成严重的经济损失。
种苗是生产的起点，脱毒苗的病毒检测是脱毒苗进行田间生产的前提。由于草莓大多数受到多种病毒复合侵染，若利用多重RT-PCR病毒检测体系将有效解决单一PCR(聚合酶链式扩增反应)或者RT-PCR(逆转录聚合酶链式扩增反应)检测病毒，同一个样需要多次检测的问题，大大减轻了工作量。专利号201210403587.1发明了四快速检测四种病毒的多重RT-PCR方法。
发明内容
本发明就是针对上述问题，提出一种草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法，该方法利用单一RT-PCR检测SVBV、SMYEV、SMoV和SCV的基础上，通过优化影响多重RT-PCR的因子，建立起多重RT-PCR检测SVBV、SMYEV、SMoV和SCV四种常见病毒的技术体系。
为达到上述技术目的，本发明采用了一种草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法，具体包括如下步骤：
(1)田间苗提取总RNA：采用改良3％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取草莓叶片总RNA；
(2)总RNA反转录为cDNA(互补脱氧核糖核酸)：以提取的总RNA(DNA酶处理)逆转录产物(cDNA)为模板，内参引物对为295bp大小，进行常规PCR反应；
(3)设计四种病毒引物；
(4)单一RT-PCR检测田间苗：取逆转录产物cDNA 1μl进行单一PCR反应，检测试验材料草莓中是否含有四种常见草莓病毒。PCR体系中所加的引物为筛选的合适引物，浓度为0.2μmol·L-1(20μl体系中加1μl)，体系中还包括：TaqMix(DNA聚合酶混合物)10ml，用超纯水补充至20μl，整个操作必须在冰上进行。PCR反应程序为：94℃，3min；94℃，1min；退火温度(SCV1/SCV2为58℃，SMoV1/SMoV2为60℃，SMYEV1/SMYEV2为50℃，SVBV1/SVBV2为52℃、Actin1/Actin2为57℃)，40s；72℃，40s，35个循环；最后72℃延伸5min。用2.0％的琼脂糖凝胶电泳EB染色检测扩增产物；
(5)多重RT-PCR病毒检测体系：根据已筛选出的适合多重RT-PCR反应的引物，通过对PCR体系的不断优化，寻找出适合多重引物的最优PCR条件。多重PCR体系中，引物浓度为(0.1～0.5μmol·L-1)，20mmol·L-1MgCl2浓度为(1.6～2.4μl)，10×PCR Buffer(10倍PCR缓冲液)2μl，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)0.2μl，DNA聚合酶0.4μl，最后用超纯水补足至20μl。PCR反应的退火温度为(52℃～58℃)，退火时间为40s，延伸温度(68℃～72℃)和延伸时间(40s～2.0min)在多重PCR中被试验。用2.0％的琼脂糖凝胶电泳EB(溴化乙锭)染色检测扩增产物。
本发明能够建立起多重RT-PCR检测体系，可以同时检测四种草莓病毒，节约了时间，大大减轻了病毒检测的工作量。并且稳定性好，重复性高。
附图说明
图1所示的是本发明中提取的草莓叶片总RNA的电泳检测结果状态图；
图2所示的是本发明中Actin引物电泳结果状态图；
图3所示的是本发明中四种病毒单一RT-PCR电泳结果状态图；
图4所示的是本发明中草莓四种病毒SMYEV、SMV、SCV和SVBV的多重RT-PCR电泳检测结果状态图；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法，具体包括如下步骤：
(1)田间苗提取总RNA：采用改良3％CTAB法提取草莓叶片总RNA；1％琼脂糖凝胶电泳结果显示：28S、18S和5S清晰可见，且28S亮度是18S亮度的两倍(图1)，说明提取的RNA的完整性较好。通过EppendorfBiophtometer(蛋白核酸分析仪)测定260nm、280nm处的光吸收值(OD值)和RNA的浓度，OD260/OD280值在1.90～1.98之间，OD260/OD230值在2.05～2.30之间，浓度在500～700μg/ml之间，能够满足下一步进行反转录实验的要求(参见图1)；
(2)总RNA反转录为cDNA：以提取的总RNA(DNA酶处理)逆转录产物(cDNA)为模板，内参引物对为295bp大小，进行常规PCR反应；从结果来看：得到单一特异、清晰的目的片段扩增产物(295bp)。因此，逆转录产物是可以用于后续的多重RT-PCR试验(参见图2)。
(3)设计四种病毒引物；
(4)单一RT-PCR检测田间苗：取逆转录产物cDNA 1μl进行单一PCR反应，检测试验材料草莓中是否含有四种常见草莓病毒。PCR体系中所加的引物为筛选的合适引物，浓度为0.2μmol·L-1(20μl体系中加1μl)，体系中还包括：TaqMix 10ml，用超纯水补充至20μl，整个操作必须在冰上进行。PCR反应程序为：94℃，3min；94℃，1min；退火温度(SCV1/SCV2为58℃，SMoV1/SMoV2为60℃，SMYEV1/SMYEV2为50℃，SVBV1/SVBV2为52℃、Actin1/Actin2为57℃)，40s；72℃，40s，35个循环；最后72℃延伸5min。用2.0％的琼脂糖凝胶电泳EB染色检测扩增产物(参见图3)；
(5)多重RT-PCR病毒检测体系：根据已筛选出的适合多重RT-PCR反应的引物，通过对PCR体系的不断优化，寻找出适合多重引物的最优PCR条件。多重PCR体系中，引物浓度为(0.1～0.5μmol·L-1)，20mmol·L-1MgCl2浓度为(1.6～2.4μl)，10×PCR Buffer 2μl，dNTPs 0.2μl，Taq酶0.4μl，最后用超纯水补足至20μl。PCR反应的退火温度为(52℃～58℃)，退火时间为40s，延伸温度(68℃～72℃)和延伸时间(40s～2.0min)在多重PCR中被试验。用2.0％的琼脂糖凝胶电泳EB染色检测扩增产物(参见图4)。

Claims (1)

1.草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)田间苗提取总RNA：采用改良3％CTAB法提取草莓叶片总RNA；
(2)总RNA反转录为cDNA：以提取的总RNA逆转录产物为模板，内参引物对为295bp大小，进行常规PCR反应；
(3)设计四种病毒引物；
(4)单一RT-PCR检测田间苗：取逆转录产物cDNA 1μl进行单一PCR反应，检测试验材料草莓中是否含有四种常见草莓病毒，PCR体系中所加的引物为筛选的合适引物，浓度为0.2μmol·L-1，体系中还包括：TaqMix 10ml，用超纯水补充至20μl，整个操作必须在冰上进行；PCR反应程序为：94℃，3min；94℃，1min；退火温度，40s；72℃，40s，35个循环；最后72℃延伸5min，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳EB染色检测扩增产物；
(5)多重RT-PCR病毒检测体系：根据已筛选出的适合多重RT-PCR反应的引物，通过对PCR体系的不断优化，寻找出适合多重引物的最优PCR条件，多重PCR体系中，引物浓度为0.1～0.5μmol·L-1，20mmol·L-1MgCl2浓度为1.6～2.4μl，10×PCR Buffer 2μl，dNTPs 0.2μl，Taq酶0.4μl，最后用超纯水补足至20μl，PCR反应的退火温度为52℃～58℃，退火时间为40s，延伸温度68℃～72℃和延伸时间40s～2.0min在多重PCR中被试验，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳EB染色检测扩增产物。
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