CN103305541A - 一种激活标签Ac/Ds转座系统及其在植物突变体库构建中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种激活标签Ac/Ds转座系统，包括转座酶Ac表达载体、转座子Ds载体，其特征在于所述转座子Ds载体带有激活标签，所述激活标签为4个串联的35S增强子，4×35S增强子置于Ds3’端内侧。本发明的Ac／Ds转座系统可以在多种植物中高水平表达Ac转座酶基因，高水平地激活转座子插入位点临近基因的表达水平，以创造显性突变体，并高效鉴定和分离转座元件插入位点的侧翼序列，用于多倍体植物的突变体库创建。本发明是理想的植物功能基因组学研究工具，对作物特别是多倍体作物的突变体创建和功能基因组学研究具有重要意义。

Description

一种激活标签Ac/Ds转座系统及其在植物突变体库构建中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及该新型激活标签Ac/Ds转座系统的构建及其在植物突变体库创建中的应用。

背景技术

随着多种植物全基因组测序工作的陆续完成，以寻求基因功能为目标的植物后基因组学时代已经到来。面对这些基因组测序工作中产生的海量的数据和资源，如何发现新基因、认识基因功能并了解所有基因在植物生长发育过程中如何协调发挥作用成为功能基因组学研究最为紧迫的任务。要精确了解每个基因的功能及基因间的相互作用，必须分析单个基因和多个基因的突变表型，通过突变体表型来分析鉴定基因功能。而获得足够数量突变表型的最直接有效的方法即是构建饱和基因突变群体，因此突变体库的构建是功能基因组学研究的基础。

传统创建突变体库的方法有自发突变和理化诱变等方法。通过寻找自发突变体的方法来创建突变体库，已经无法满足大规模、高通量的全基因组序列研究的要求。而通过理化诱变获得突变体的方法，由于诱变过程不易控制，一个突变体经常包含多个突变位点，增加了功能基因鉴定的难度，极大地限制了其在功能基因组学中的广泛应用。随着农杆菌介导的植物转基因技术的不断完善，T-DNA插入方法已成为许多植物快速构建插入突变体库的主要方法，如水稻，拟南芥等。T-DNA在外源植物因组中的整合是随机的，它可以整合到植物的任何一条染色体上，T-DNA插入位置不同，引起植物表现不同表型，从而产生不同的突变体。但利用T-DNA插入技术构建饱和突变体库，需要成熟和高效的遗传转化技术，需要拿到成千上万的转基因植株。目前许多作物都不具备这些条件，且工作量巨大，需要投入大量人力物力，因而限制了这种突变体库创建方法的广泛应用。

转座子（transposon, 简称Tn），又称易位子，是指存在于染色体DNA上可以自主复制和位移的一段DNA顺序。研究者们利用转座子可以在植物基因组中不断跳跃产生突变的特点，来构建植物基因组的饱和突变体库。玉米Ac/Ds (activator/dissociation) 转座子系统是植物体内第一个被发现的可移动的遗传元件，是美国学者McClintock在研究玉米染色体重排和断裂时发现的，于1983年被克隆。1986年，Baker利用农杆菌介导的方法将Ac/Ds转座子系统引入烟草中，首次证明该转座子系统可以在转基因烟草中发挥作用，开启了Ac/Ds转座子系统在异源植物中的应用研究。研究者们利用Ds转座元件可以在植物基因组中不断跳跃产生突变的特点，来构建植物基因组的饱和突变体库，如水稻Ac/Ds突变体库的构建和拟南芥Ac/Ds突变体库的构建。利用Ac/Ds转座系统标签法构建的突变体库既具有T-DNA插入突变体库信息量大的优点，又可通过转座子自身在植物基因组中的移动不断获得新的转座事件。对于转化效率不高的植物，只要产生少量的转化株，就可以通过转座不断获得更多新的突变体株系，大大节省了进行人工转基因的工作量。转座子元件这些重要特点使转化效率不高的植物构建大规模的插入突变体库成为了可能。但是，Ac/Ds转座子系统导致的突变绝大多数为隐性突变，即无表型突变，又称功能失去型（loss-of-function）突变。这种适用于二倍体植物的突变体创建方法，在多倍体作物中受到了极大的限制，因为对多倍体植物如棉花、小麦、油菜等来说，通过隐性突变发现突变体的几率极低，这无疑增加了功能基因鉴定的难度，成为该系统广泛应用的一大障碍。而激活标签技术的出现和应用，为解决这一难题提供了有效手段。

激活标签技术是指将增强子或强启动子随机插入植物基因组，使得增强子或强启动子插入位点侧翼原先不表达或弱表达的基因得到过量表达，从而产生显性的功能获得性突变体。如前所述，以T-DNA为基础的激活标签技术需要大量繁重的组培转化工作，以得到数以万计的转基因植株，工作量非常巨大，对遗传转化技术不成熟及基因组比较庞大的作物而言更是困难重重。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转座系统，插入位点临近基因的突变率高，且特异性高。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种Ac/Ds转座系统，包括转座酶Ac载体、转座子Ds载体，其特征在于所述转座子Ds载体带有激活标签，所述激活标签为4个串联的35S增强子（4×35S），4×35S增强子置于Ds3’端内侧。

为了准确的识别、克隆突变基因，上述转座子Ds载体，还包括pBluescript II SK(+)质粒片段,pBluescript II SK(+)质粒片段位于4×35S增强子的下游。pBluescript II SK(+)质粒片段是pBluescript II SK(+)质粒切除多克隆位点后的剩余片段。

上述转座子Ds载体，还包括植物Basta抗性筛选标记基因。Basta抗性筛选标记基因位于转座子Ds5’端内侧，pBluescript II SK(+)质粒片段的下游。

上述转座子Ds载体，含有玉米不可以自主转座的Ds元件，所述Ds元件中整合有四个串联35S增强子、pBblueScript SK+质粒片段、以及植物Basta抗性筛选标记基因，4×35S增强子置于Ds3’端内侧，Basta抗性筛选标记基因置于转座子Ds5’端内侧，pBluescript II SK(+)质粒片段置于4×35S增强子与Basta抗性筛选标记基因之间。如图2所示。

上述转座子Ds载体，还包括潮霉素抗性标记基因（Hyg），位于Ds3’端的外侧，有效避免4×35S增强子在未发生转座前引起突变。

上述转座子Ds载体，具有如SEQ ID NO.2所述的序列。

上述转座酶Ac表达载体的启动子带有两个串联35S增强子，启动玉米转座酶Ac基因的表达。

上述转座酶Ac表达载体，具有如图1所示结构。

上述转座酶Ac表达载体，具有如SEQ ID NO.1所述的序列。

上述转座子Ds载体的制备方法，包括以下步骤：

（1） 带激活标签转座子元件（Ds）片段的构建，具体方法为：通过XhoI酶切从Ds Launch Pad T-DNA载体中获得含Basta抗性标记的玉米转座元件（Ds）片段，将该片段插入pBSK（即pBblueScript SK+)中得到中间载体pBSK-DS；从pBSK-DS载体中获得带有补平的HindIII末端和XhoI末端的转座子元件的5’片段，并插入经过修饰后含补平的KpnI末端和XhoI末端的pBSK载体；然后利用正向引物TGTAAAACGACGGCCAGT和反向引物AAAGAGCTCTGCATATAACCTGCAAATTAG从pBSK-DS中扩增得到转座子元件的3’片段，将该PCR产物经XhoI和SacI酶切后插入由同样经XhoI和SacI酶切处理的含转座子元件5’片段的pBSK载体，得到内部含有pBSK载体的转座子元件；然后，利用正向引物GCGGCCGCTCTAGAACTAGT和反向引物AAAACTAGTCAAACACTGATAGTTTCGGA通过PCR扩增从pSKI015载体获得四个串联35S增强子的核酸片段，用SpeI酶切该PCR产物后插入由EcoICRI酶切处理的内部含pBSK载体的转座子元件中，经过酶切及测序鉴定获得带激活标签并含有pBSK载体片段的Ds转座子元件；

（2）农杆菌复制结构片段的构建，具体方法为：利用SfoI和HindIII双酶切从pMDC32载体中获得其细菌复制结构的部分片段，并插入由EcoRV和HindIII酶切过的pBSK载体；然后，在该改造过的载体的PstI切点插入利用NsiI酶切从pMDC32载体中获得的其细菌复制结构的另一部分片段；将新获得的载体经过HindIII和SpeI酶切后获得一个不带大肠杆菌复制起始位点只带农杆菌复制结构的片段；

（3）带激活标签转座子（Ds）载体的获得，具体方法为：将由步骤1）获得的带激活标签的转座子元件（Ds）片段进行XhoI酶切处理并补平，同时将由步骤2）获得的只带农杆菌复制结构的片段进行补平，然后，经过连接即可获得带激活标签转座子(Ds)载体。

上述转座酶Ac表达载体的制备方法，包括以下步骤：

1）利用正向引物AAACCGCGGATGACGCCTCCGGTTGGAAAT和反向引物TCATGGAGAGGAGCCACTTGC，通过PCR扩增从sAc-Lc T-DNA载体中获得Ac转座酶基因片段；

2）将步骤1）获得的PCR产物用SacII酶切后，插入pENTR-D-TOPO载体的SacII切点和补平的AscI切点之间，然后通过同源重组将Ac转座酶导入pMDC32载体，获得Ac转座酶植物表达载体。

利用上述Ac/Ds转座系统构建植物突变体体库的方法，包括以下步骤：

（1）通过农杆菌介导的植物转基因方法，获得转座酶(Ac)载体的转基因烟草；对获得的转基因植株进行Northern杂交和Southern杂交鉴定，选取表达Ac转座酶基因且Ac转座酶基因表达载体在基因组中的插入拷贝数为单拷贝的植株；将这些单拷贝插入转基因植物进一步培养，获得转座酶(Ac)载体的纯合单拷贝插入转基因植株；

（2）通过农杆菌介导的植物转基因方法，获得带激活标签转座子(Ds)载体的转基因烟草；对获得的转基因植株进行Southern杂交鉴定，选取转座子载体在基因组中的插入拷贝数为单拷贝的植株；将这些单拷贝插入转基因植物进一步培养，获得带激活标签转座子(Ds)载体的纯合单拷贝插入转基因植株；

（3）将步骤（1）所获得的转座酶(Ac)载体的纯合单拷贝插入转基因植株和步骤2）所获得的带激活标签转座子(Ds)载体的纯合单拷贝插入转基因植株进行杂交，获得F1代杂交种；

（4）将由步骤（3）得到的F1代杂交种培育成F1代植株，通过自交获得由F2代杂交种组成的突变体库；

（5）选取部分突变体材料，克隆转座子新插入位点临近转座子元件3’端的烟草基因组片段，并利用该片段做探针，检测其在突变体及野生型烟草中的表达水平，以确定转座子是否能够激活新插入位点基因的表达。

有益效果

1. 本发明构建的的Ac／Ds转座系统可以在多种植物中高水平表达Ac转座酶基因。

2. 本发明构建的的Ac／Ds转座系统可以高水平地激活转座子插入位点临近基因的表达水平，以创造显性突变体。

3. 本发明构建的的Ac／Ds转座系统可以高效鉴定和分离转座元件插入位点的侧翼序列。

4. 本发明的不只可以用于二倍体植物的突变体库创建，更重要的是可以用于多倍体植物的突变体库创建。本发明以多倍体植物烟草为材料进行了突变体库创建的应用研究，证明该系统是一个高效的多倍体作物突变体库创建工具。该Ac／Ds转座系统将在多倍体作物的功能基因组学研究中具有重要的理论个应用价值。

5. 本发明避免了进行大量的人工转基因操作，又克服了Ac/Ds转座子系统只能产生隐性突变的缺点，是理想的植物功能基因组学研究工具，对作物特别是多倍体作物的突变体创建和功能基因组学研究具有重要意义。

附图说明

图1转座酶(Ac)表达载体的结构示意图。LB: T-DNA 左边界；RB: T-DNA 右边界；2×35S：带双35S增强子启动子；Ac: Ac转座酶；Hyg: 潮霉素标记基因；Kan:细菌抗性选择标记卡那霉素基因；Ori E. coli:大肠杆菌复制启始元件；pVS1:农杆菌复制启始元件pVS1。

图2 带激活标签转座子(Ds)载体的结构示意图。LB: T-DNA 左边界；RB: T-DNA 右边界；Ds5’:Ds转座子元件的5’端；Bar:抗除草剂Basta标记基因；Ori pBSK:位于pBSK质粒片刻中的大肠杆菌复制启始元件；4×35S En：四个串联35S增强子片段；Ds3’: Ds转座子元件的3’端；Hyg: 潮霉素标记基因；Kan:细菌抗性选择标记卡那霉素基因；pVS1:农杆菌复制启始元件pVS1。

图3 Southern杂交检测Ds转座子片段的转座情况。P_DS为转座子（Ds）的对照转基因烟草；F11，F34为由转座酶（Ac）和转座子(DS)转基因烟草杂交获得的F2代群体中的两个单株。杂交探针为转座子（DS）载体上的pBSK载体片段。

图4 Northern杂交检测转座子插入位点侧翼区段的转录情况。P_DS为转座子（Ds）的转基因烟草；F11为由转座酶（Ac）和转座子(DS)转基因烟草杂交获得的F2代群体中的单株。杂交探针为转座子插入位点Ds3’端的一段烟草DNA片段。

图5 sAc-Lc T-DNA载体结构示意图

图6 Ds Launch Pad T-DNA载体结构示意图。Ds转座子元件构建在ALS基因5’非翻译区的XhoI酶切位点内。

图7 pENTR-D-TOPO载体结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施实例对本发明做进一步阐述，以下内容设计的实验步骤和实验方法均为本领域的常规实验技术，所用试剂均为市售产品。

实施例1. Ac转座酶植物表达载体的构建

1、Ac转座酶基因的扩增引物序列为：

反向引物：TCATGGAGAGGAGCCACTTGC

正向引物：AAACCGCGGATGACGCCTCCGGTTGGAAAT

2、PCR扩增反应体系：总体积为50ml的反应体系中含10×buffer 5.0ml，10 mM dNTPs 1.0ml，10 mM 正反向引物各0.5ml，质粒模板1ml，Pfu DNA聚合酶2ml，无菌双蒸水40ml； 

3、PCR扩增反应条件: 94℃解链5 min；94℃ 40 s，58℃ 40s, 72℃ 5min共30个循环；72℃延伸5 min；

4、PCR产物的纯化：PCR扩增结束后，将产物直接用鼎国生物公司的DNA回收试剂盒，按照操作说明步骤进行纯化；

5、PCR产物的酶切：总体积为30ml的反应体系中含10×PCR buffer 3.0ml，纯化的PCR产物26ml，内切酶SacII 1.0ml；置于37℃酶切2小时；

6、酶切PCR产物的切胶回收：将酶切产物置于琼脂糖凝胶中进行电泳分析，电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后，在紫外灯下，从凝胶中切下目的片段，使用鼎国生物公司的DNA回收试剂盒，按照操作说明步骤回收目的片段，待用；

7、质粒载体的酶切：总体积为30ml的反应体系中含10×buffer 3.0ml，质粒载体pENTR-D-TOPO（Invitrogen公司）1mg，内切酶AscI 1.0ml，反应体积用无菌双蒸水补齐；置于37℃酶切4小时；

8、质粒酶切产物的补平：在上述30ml酶切产物中加入10×PCR buffer 5.0ml，10 mM dNTPs 1.0ml，Pfu DNA聚合酶1ml, 无菌双蒸水13ml；置于72℃反应30min；

9、质粒酶切补平产物纯化：同实施例1之4；

10、质粒酶切补平产物的SacII酶切：总体积为30ml的反应体系中含10×buffer 3.0ml，补平产物26ml，内切酶SacII 1.0ml；置于37℃酶切4小时；

11、质粒酶切产物的切胶回收：同实施例1之6；

12、载体连接反应：总体积为10ml的反应体系中含5×连接buffer 2.0ml，纯化载体酶切产物1ml，纯化目的片段（PCR产物）酶切产物6ml，连接酶1.0ml；置于16℃连接过夜；

13、连接产物的大肠杆菌转化：将100μl大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化，加入5μl连接产物，混匀后于冰上放置30 min，然后42℃水浴热激90S，冰上再放置1 min，加入1ml不含抗生素的液体LB培养基，于37℃振荡培养1 h，6000rpm离心收集菌体，涂布于含50μg/ml 卡那霉素（Kan）的LB琼脂平板上，于37℃倒置培养16-20 h；

14、大肠杆菌的菌落PCR鉴定：分别挑取单菌落于5ml含50μg/ml 卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16 h，各取1μl做模板，进行PCR扩增；扩增引物为实施例1之1所用Ac转座酶基因的扩增引物；PCR扩增反应体系为：总体积为50ml的反应体系中含10×buffer 5.0ml，10 mM dNTPs 1.0ml，10 mM 正反向引物各0.5ml，质粒模板1ml，Taq DNA聚合酶1ml，无菌双蒸水40ml；PCR扩增反应条件: 94℃解链5 min；94℃ 40s，58℃ 40s, 72℃ 1min共30个循环；72℃延伸5 min；扩增产物进行电泳检测，能够扩增出目的条带的菌株为阳性菌株；

、质粒DNA的提取：将阳性菌株的液体培养物使用鼎国生物公司的质粒DNA提取试剂盒，按照操作说明步骤进行提取；

16、质粒DNA的测序分析：将由阳性菌株提取的质粒送交测序公司进行测序，确定得到了正确的目的载体；

17、质粒的GateWay克隆重组反应：使用Invitrogen公司的Gateway                                                

LR Clonase^TM

将实施例1之14-16鉴定出的阳性质粒与双元载体pMDC32，按照试剂盒的说明书步骤进行重组反应，将Ac转座酶导入pMDC32载体；

18、重组产物的大肠杆菌转化：同实施例1之13；

19、大肠杆菌的菌落PCR鉴定：同实施例1之14；

20、质粒DNA的提取：同实施例1之15；

21、质粒DNA的测序分析：同实施例1之16。测序结果如SEQ ID NO.1所示。

实施例2.带激活标签转座子（Ds）载体的构建

1、构建内部含有pBSK载体的转座子元件：

本实施过程的（1）-（8）将转座子元件的5’端连接在了pBSK载体的一段，（9）-（18）将转座子元件的3’端连接在了pBSK载体的另一段，最后得到内部含有pBSK载体的转座子元件。

（1）转座子元件5’片段PCR扩增：正向引物为AGCTTGATATCGAATTCCTGC，反向引物为AAACTCGAGCGGCGGTACCCCGCGC，扩增模板为质粒载体Ds Launch Pad T-DNA载体，扩增体系同实施例1之2；扩增反应条件: 94℃解链5 min；94℃ 40 s，58℃ 40s, 72℃ 2min共30个循环；72℃延伸5 min；之后将PCR产物纯化回收，纯化方法同实施例1之4；最后将回收产物用XhoI酶切，酶切体系及过程同实施例1之7；

（2）酶切质粒载体pBSK：先将质粒载体pBSK由内切酶KpnI酶切，酶切体系及过程同实施例1之7；然后将酶切产物补平，补平体系及过程同实施例1之8；之后将补平产物纯化，纯化方法同实施例1之4；最后将回收产物用XhoI酶切，酶切体系及过程同实施例1之7；

（3）质粒酶切产物的切胶回收：同实施例1之6；从实施例2之1（1）的最终酶切产物中回收大小为2000bp的为目的片段；

（4）载体连接反应：纯化载体酶切产物为实施例2之1（2）载体的酶切纯化产物，纯化目的片段酶切产物为实施例2之1（1）最终酶切中得到的2000bp片段的纯化产物，连接体系及过程同实施例1之12

（5）连接产物的大肠杆菌转化：同实施例1之13，所用LB平板为含100μg/ml 氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板；

（6）质粒DNA的提取：同实施例1之15；共提取10个单菌落的质粒DNA；

（7）质粒DNA的酶切鉴定：质粒DNA为实施例2之1（6）提取的质粒DNA，内切酶为SmaI，酶切体系及过程同实施例1之7；酶切产物电泳可以看到2900bp和200bp两个片段的为阳性克隆；

（8）质粒DNA的测序分析：同实施例1之16；

（9）转座子元件3’片段PCR扩增：正向引物为AAACTCGAGCGGCTAGGGATGAAAAC，反向引物为AAAGAGCTCTGCATATAACCTGCAAATTAG，扩增模板为质粒载体为Ds Launch Pad T-DNA载体，扩增体系同实施例1之2；扩增反应条件: 94℃解链5 min；94℃ 40 s，58℃ 40s, 72℃ 2min共30个循环；72℃延伸5 min；

（10）PCR产物的纯化：同实施例1之4；

（11）PCR产物的酶切：内切酶为XhoI和SacI，酶切体系及过程同实施例1之5；

（12）质粒载体的酶切：质粒载体为实施例2之2（8）得到的阳性质粒，内切酶为XhoI和SacI，酶切体系及过程同实施例1之7；

（13）PCR产物和质粒载体酶切产物的切胶回收：同实施例1之6；

（14）载体连接反应：纯化载体酶切产物为实施例2之2（12）载体的酶切纯化产物，纯化目的片段酶切产物为实施例2之2（11）的PCR产物酶切的纯化产物，连接体系及过程同实施例1之12

（15）连接产物的大肠杆菌转化：同实施例1之13，所用LB平板为含100μg/ml 氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板；

（16）质粒DNA的提取：同实施例1之15；共提取10个单菌落的质粒DNA；

（17）质粒DNA的酶切鉴定：质粒DNA为实施例2之1（6）提取的质粒DNA，内切酶为XhoI和SacI，酶切体系及过程同实施例1之7；酶切产物电泳可以看到大小为7100bp和330bp两个片段的为阳性克隆；

（18）质粒DNA的测序分析：同实施例1之16；

2、在内部含有pBSK载体的转座子元件中插入四个串联35S增强子的核酸片段（所述35S的序列如SEQ ID NO.4所示）：

（1）四个串联35S增强子核酸片段的PCR扩增：正向引物为GCGGCCGCTCTAGAACTAGT，反向引物为AAAACTAGTCAAACACTGATAGTTTCGGA，扩增模板为pSKI015质粒载体，扩增体系同实施例1之2；扩增反应条件: 94℃解链5 min；94℃ 40 s，58℃ 40s, 72℃ 3min，共30个循环；72℃延伸5 min；

（2）PCR产物的纯化：同实施例1之4；

（3）PCR产物的酶切：内切酶为SpeI，酶切体系及过程同实施例1之5；

（4）质粒载体的酶切：质粒载体为实施例2之1得到的内部含有pBSK载体的转座子元件载体，内切酶为EcoICRI，酶切体系及过程同实施例1之7；酶切反应结束后在反应体系中加入1 ml虾碱性磷酸酶（SAP），于37℃进行1小时脱磷酸反应，并于65℃灭活20min；

（5）PCR产物和质粒载体酶切产物的切胶回收：同实施例1之6；

（6）载体连接反应：纯化载体酶切产物为实施例2之2（4）的载体酶切纯化产物，纯化目的片段为实施例2之2（3）PCR产物的酶切纯化产物，连接体系及过程同实施例1之12

（7）连接产物的大肠杆菌转化：同实施例1之13，所用LB平板为含100μg/ml 氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板；

（8）大肠杆菌的PCR鉴定：扩增引物为四个串联35S增强子核酸片段的PCR扩增引物，扩增和鉴定方法同实施例1之14；共鉴定10个单菌落；

（9）质粒DNA的提取：同实施例1之15；

（10）质粒DNA的测序分析：同实施例1之16；

3、农杆菌复制结构片段的构建：

(1) 酶切质粒载体pMDC32: 质粒载体为pMDC32，内切酶为SfoI和HindIII，酶切体系及过程同实施例1之7；

（2）酶切质粒载体pBSK: 质粒载体pBSK，内切酶为EcoRV和HindIII，酶切体系及过程同实施例1之7；

（3）质粒酶切产物的切胶回收：同实施例1之6；从质粒载体pMDC32的酶切产物中回收大小为4100bp的目的片段；

（4）载体连接反应：纯化载体酶切产物为实施例2之3（2）载体的酶切纯化产物，纯化目的片段酶切产物为实施例2之3（1）载体中得到的4100bp片段的纯化产物，连接体系及过程同实施例1之12

（5）连接产物的大肠杆菌转化：同实施例1之13，所用LB平板为含100μg/ml 氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板；

（6）质粒DNA的提取：同实施例1之15；共提取10个单菌落的质粒DNA；

（7）质粒DNA的酶切鉴定：质粒DNA为实施例2之3（6）提取的质粒DNA，内切酶为HindIII和SacI，酶切体系及过程同实施例1之7；酶切产物电泳4200bp和2900bp两个片段的为阳性克隆；

（8）质粒DNA的测序分析：同实施例1之16；

（9）质粒载体pMDC32的酶切：质粒载体为pMDC32，内切酶为NsiI，酶切体系及过程同实施例1之5；

（10）质粒载体的酶切：质粒载体为实施例2之3（8）得到的阳性质粒，内切酶为PstI，酶切体系及过程同实施例1之7；

（11）质粒载体酶切产物的切胶回收：同实施例1之6；从质粒载体pMDC32的酶切产物中回收大小3760bp的目的片段；

（12）载体连接反应：纯化载体酶切产物为实施例2之3（10）载体的酶切纯化产物，纯化目的片段酶切产物为实施例2之3（9）质粒载体酶切得到的3760bp片段的纯化产物，连接体系及过程同实施例1之12

（13）连接产物的大肠杆菌转化：同实施例1之13，所用LB平板为含100μg/ml 氨苄青霉素（Amp）和50μg/ml 卡那霉素（Kan）的LB琼脂平板；

（14）质粒DNA的提取：同实施例1之15；共提取10个单菌落的质粒DNA；

（15）质粒DNA的酶切鉴定：质粒DNA为实施例2之3（14）提取的质粒DNA，内切酶为SacI和HindIII，酶切体系及过程同实施例1之7；酶切产物电泳可以看到8000bp和2900bp两个片段的为阳性克隆；

4、带激活标签转座子（Ds）载体的获得：

（1） 带激活标签转座子元件质粒载体酶切: 质粒载体为实施例2之2得到的带激活标签转座子元件质粒载体，内切酶为XhoI，酶切体系及过程同实施例1之7；然后将酶切产物补平，补平体系及过程同实施例1之8；

（2）农杆菌复制结构片段的酶切: 质粒载体为实施例2之3得到的农杆菌复制结构片段质粒载体，内切酶为HindIII和SpeI，酶切体系及过程同实施例1之7；然后将酶切产物补平，补平体系及过程同实施例1之8；

（3）质粒酶切产物的切胶回收：同实施例1之6；从农杆菌复制结构片段的酶切产物中回收大小为8000bp的目的片段；

（4）载体连接反应：纯化载体酶切产物为实施例2之4（1）载体的酶切纯化产物，纯化目的片段酶切产物为实施例2之4（2）中得到的8000bp片段的纯化产物，连接体系及过程同实施例1之12

（5）连接产物的大肠杆菌转化：同实施例1之13，所用LB平板为含100μg/ml 氨苄青霉素（Amp）和50μg/ml 卡那霉素（Kan）的LB琼脂平板；

（6）质粒DNA的提取：同实施例1之15；共提取10个单菌落的质粒DNA；

（7）质粒DNA的酶切鉴定：质粒DNA为实施例2之4（6）提取的质粒DNA，内切酶为HindIII和SpeI，酶切体系及过程同实施例1之7，酶切产物电泳可以看到8800和7900两个片段的为阳性克隆；

（8）质粒DNA的测序分析：同实施例1之16；测序引物为GACCGGATCGTATCGGTTTTCG和CCTCGGGTTCGAAATCGATCG。测序结果如SEQ ID NO.2所示。

实施例3. 质粒DNA的农杆菌转化

1、材料和试剂：

农杆菌LBA4404；

YEB培养基（1升）：牛肉浸膏5g，酵母提取物1g，胰蛋白胨5g，MgSO4·7H₂O 0.5g，加800 ml 蒸馏水调pH至7.0，定容（固体培养基加1.5%琼脂粉），分装后高压灭菌。

、农杆菌感受态的制备：挑取LBA4404单菌落接种到5ml菌液中（含利福平浓度为50mg/ml），过夜培养；5ml菌液全部加入250mlYEB中（含利福平浓度为50mg/ml）；28℃，200rpm培养至OD600=0.6-0.8；冰浴20分钟，5000rpm，4℃，离心15分钟，收集菌体；等体积10%甘油悬浮；同上收集菌体，1/2体积10%甘油悬浮，重复一次；收集菌体，50ml超纯水配制的甘油悬浮；收集菌体，1ml 超纯水配制的10%甘油悬浮；100ml分装，保存于-70℃待用

3、电转化农杆菌：40ml电感受态细胞和1ml的质粒混合；冰浴30分钟；转入预冷的电击杯，电击；加入1ml的YEB培养基，28℃培养3小时；离心收集菌体并涂布于YEB固体培养基平板上（含利福平50mg/ml，卡那50mg/ml）；于28℃培养2天；

4、农杆菌的PCR鉴定：从每个转化平板中分别挑取3单菌落，接种于5ml YEB培养基（含利福平50mg/ml，卡那50mg/ml）；于28℃培养过夜；取1ml做模板，进行PCR检测；转带激活标记转座子（Ds）载体菌种的扩增引物为ACTAGTCAAACACTGATAGTTTCGGA和GAACAAAAGCTGGAGCTAGTGG；转Ac转座酶表达载体菌株的扩增引物为CATGTGTGTCACCATCCATTGG和ACAATCTCCGAACCAAGACG；扩增体系和方法同实施例1之14。

实施例4. 农杆菌介导的转基因烟草培育

1、转基因材料：烟草TN90（Nicotiana tabacum cv. TN90）。

2、培养基的配制：

YEB培养基（1升）：同实施例3之1； 

MS固体培养基（1升）：使用鼎国生物公司的MS培养基粉（货号：M519），加30g蔗糖配制，调pH值至5.8后，加8g琼脂粉，高压灭菌；

烟草分化培养基：MS固体培养基+6-BA（1mg/L）+卡那霉素（150 mg/L）+ 羧苄青霉素（250 mg/L）；

烟草诱导生根培养基：1/2 MS固体培养基+卡那霉素（150 mg/L）+羧苄青霉素（250 mg/L）；

农杆菌的制备：将实施例3之4得到的含目的质粒载体的农杆菌接种于5 ml YEB液体培养基（含利福平50mg/ml，卡那50mg/ml）中，200rpm,28℃，培养过夜；转移1ml菌液于50 ml YEB液体培养基（含利福平50mg/ml，卡那50mg/ml）, 200rpm,28℃，摇至对数生长期（OD600约为0.6-0.8）；5000 rpm，离心5分钟，收集菌体,用等体积YEB液体培养基悬浮菌体；

烟草转化：烟草种子用2.5%次氯酸钠处理8min，无菌水洗三次，播种于MS培养基上，于25℃，16小时光照/8小时黑暗条件培养5周；0.4*0.6cm²大小；将切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡5min；用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入表面铺一层滤纸的MS固体基本培养基，28°C暗培养；两天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基中进行培养（25℃，钨灯3000mmol.m^-2.s^-1，光照周期为16小时光照/8小时黑暗）；待抗性芽生长至2-3cm高时，切下转入生根培养基中诱导生根；将能够正常生根的转基因成苗移至土壤中培养。

实施例5. 转基因植物的鉴定

1、转基因植物的PCR鉴定：

（1）基因组DNA的提取：用CTAB法提取基因组DNA；

（2）转Ac转座酶表达载体植株的PCR鉴定：正向引物为CATGTGTGTCACCATCCATTGG,反向引物为ACAATCTCCGAACCAAGACG；PCR扩增反应体系为：总体积为50ml的反应体系中含10×buffer 5.0ml，10 mM dNTPs 1.0ml，10 mM 正反向引物各0.5ml，质粒模板1ml，Taq DNA聚合酶1ml，无菌双蒸水40ml；PCR扩增反应条件: 94℃解链5 min；94℃ 40s，58℃ 40s, 72℃ 1min共30个循环；72℃延伸5 min；电泳检测能扩增出目的条带的植株为阳性植株；

（3）转带激活标记转座子（Ds）载体植株的PCR鉴定：正向引物为ACTAGTCAAACACTGATAGTTTCGGA,反向引物为GAACAAAAGCTGGAGCTAGTGG；PCR扩增反应体系及条件同实施5之1（2）；电泳检测能扩增出目的条带的植株为阳性植株；

2、Ac转座酶表达载体转基因植物的Southern杂交鉴定：

（1）基因组DNA的提取：用CTAB法提取基因组DNA；

（2）基因组DNA酶切产物的电泳及转膜：使用分子克隆（第三版）中的方法完成；所用内切酶分别为SpeI、HindIII、SalI和SacI。

（3）Southern杂交探针的扩增及纯化：扩增模板为Ac转座酶表达载体的质粒DNA，正向引物为CATGTGTGTCACCATCCATTGG,反向引物为ACAATCTCCGAACCAAGACG；PCR扩增反应体系及条件同实施例5之1（2）；PCR产物的纯化同实施例1之4；

（4）Southern杂交：探针来自实施例5之2（3）所扩增的Ac转座酶片段，探针用Takara公司的DNA随机引物标记试剂盒进行放射性同位素[α-32P]dCTP标记；Southern杂交过程使用分子克隆（第三版）中的方法完成；选取Ac转座酶基因单拷贝插入的阳性植株。

3、带激活标记转座子（Ds）载体转基因植物的Southern杂交鉴定：杂交探针为pBSK载体质粒，其余检测过程同实施例5之2。

、Ac转座酶表达载体转基因植物的Northern杂交鉴定：

（1）总RNA的提取：取烟草叶片0.1 g，用液氮研磨成粉末状，移入加有1ml的Trizol的2ml离心管中，剧烈震荡摇匀；12000g离心10 min以除去不溶物，将上清液转入新的2ml离心管中；室温放置5 min，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置5 min后，12000g离心10 min；将上层水相转移到新的2ml离心管中，加0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置15 min； 4℃，12000g离心10 min，倒掉上清液；用75%的乙醇洗涤沉淀，然后4℃，7500g离心5 min，弃去乙醇；室温充分干燥沉淀，溶于30μl DEPC处理的蒸馏水中，于-80℃保存备用；

（2）烟草总RNA的电泳及转膜：使用分子克隆（第三版）中的方法完成；

（3）Northern杂交探针的扩增及纯化：扩增模板为Ac转座酶表达载体的质粒DNA，正向引物为CATGTGTGTCACCATCCATTGG,反向引物为ACAATCTCCGAACCAAGACG；PCR扩增反应体系及条件同实施例5之1（2）；PCR产物的纯化同实施例1之4；

（4）Northern杂交：探针来自实施例5之4（3）所扩增的Ac转座酶片段，探针用Takara公司的DNA随机引物标记试剂盒进行放射性同位素[α-³²P]dCTP标记；Northern杂交过程使用分子克隆（第三版）中的方法完成；能检测到条带的植株为Ac转座酶表达的阳性植株。

实施例6. 转基因植物杂交群体的培育及突变体的创建

1、转座酶(Ac)载体的纯合单拷贝插入转基因植株的获得：

根据实施例5对转基因植株进行的Southern杂交鉴定，选取表达Ac转座酶基因且Ac转座酶基因表达载体在基因组中的插入拷贝数为单拷贝的植株；将这些单拷贝插入转基因植物进一步培养，收获其自交繁殖种子；将种子播种于含20mg/L潮霉素的1/2MS平板上萌发，筛选抗性苗；选取5株抗性苗移栽于土壤，分别收获其自交繁殖种子；将每个株系的种子各1000粒，播种于含20mg/L潮霉素的1/2MS平板上萌发，不再出现非抗性苗的即为纯合植株；

2、带激活标签转座子(Ds)载体的纯合单拷贝插入转基因植株的获得：同实施例6之1；

3、将实施例6之1所获得的转座酶(Ac)载体的纯合单拷贝插入转基因植株和实施例6之2所获得的带激活标签转座子(Ds)载体的纯合单拷贝插入转基因植株进行杂交，收获其F1代杂交种；

4、将实施例6之3得到的F1代杂交种培育成F1代植株进行培养，通过自交繁殖，收获其F2代杂交种，这些种子即为突变体库材料；

5、转座子片段的转座情况的Southern杂交检测：检测材料为F2代突变体库群体中随机选取的植株和作为对照的带激活标签转座子(Ds)载体的纯合单拷贝插入转基因植株，检测过程同实施例5之3；实验证明在由转化了转座酶（Ac）和转座子(DS)烟草经过杂交培育的F2代群体中，转座子片段成功发生了转座（图3）。

实施例7. 转座子片段增强新插入位点下游基因表达水平的鉴定

随机选取了部分突变体材料进行了检测，本发明以F2代突变体单株F11为例做深入说明。

1、质粒拯救方法克隆转座子新插入位点靠近转座子元件Ds3’端的烟草基因组片段：

（1）用CTAB法提取基因组DNA；

（2）基因组DNA的酶切及纯化：在50μL反应体系中，含10× 酶切反应缓冲液5μL，基因组DNA 1μg，内切酶 SalI 3μL，37℃反应过夜；待酶切反应结束后，用酚/ 氯仿(体积比1︰1)进行抽提，后用2倍体积无水乙醇沉淀DNA，离心沉淀用70%乙醇洗涤，干燥后溶于20μL无菌双蒸水中；

（3）基因组DNA酶切纯化产物的连接：在30μL反应体系中，加入10×连接反应缓冲液3μL，T4 DNA连接酶3μL，基因组DNA酶切纯化产物20μL，16℃连接过夜；

（4）将连接产物用酚/ 氯仿(体积比1︰1)进行抽提，后用2倍体积无水乙醇沉淀DNA，离心沉淀用70%乙醇洗涤，干燥后溶于20μL无菌双蒸水中；

（5）连接产物的大肠杆菌转化：同实例1之13，转化后将收集的菌液涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板上筛选；

（6）质粒提取及酶切鉴定：质粒DNA提取同实例1之15；酶切鉴定质粒所用内切酶为PstI和BamHI ，反应体系及过程同实施例1之7。

（7）质粒的测序分析：测序引物为GACCGGATCGTATCGGTTTTCG,测序方法同实例1之16；

（8）测序结果得到的一段烟草基因组序列，如SEQ ID No.3所示；

2、烟草总RNA的提取：同实施例5之3（1）

3、烟草总RNA的电泳及转膜：使用分子克隆（第三版）中的方法完成；

4、Northern杂交探针的扩增及纯化：扩增模板为实施例7之1通过质粒拯救所筛选到的重组质粒，正向引物为ACATCCTGCACGAGTACCTG，反向引物为GGTGGAACCGCAGGTTGC；PCR扩增反应体系及条件同实施例5之1（2）；PCR产物的纯化同实施例1之4；

5、Northern杂交检测目的基因在突变体F11及转座子未跳跃前对照烟草中的表达水平：探针来自实施例7之2所扩增的烟草基因组片段，探针用Takara公司的DNA随机引物标记试剂盒进行放射性同位素[α-³²P]dCTP标记；Northern杂交过程使用分子克隆（第三版）中的方法完成；杂交结果如图4所示，显示突变体F11中目的片段的表达水平显著高于对照植株，该结果表明在突变体F11中，转座子片段能够增强新插入位点下游基因的表达水平。

本发明中的pBSK载体即为pBluescript II SK(+)，pBluescript II SK(+) 载体的NCBI登陆号为X52328.1。

pMDC32载体：NCBI登陆号为FJ172534.1。

pSKI015载体：NCBI登陆号为AF187951.1。

序列表

 

<110> 西南大学

<120>一种激活标签Ac/Ds转座系统及其在植物突变体库构建中的应用 <160>   <210> 1  <211> 13280 <212> DNA  <213> Artificial(人工序列)

 

<220>

<221>

<222> （3547）..（4373）

<223> 带有2×35S的启动子

<222> （296）..（3427）

<223> Ac转座酶基因

 

<222>（10878）..（10903）

<223> T-DNA左边界（LB），来源于pMDC32载体

<222>（4601）..（4626）

<223> T-DNA右边界（RB），来源于pMDC32载体

 

<400> 1

aattcagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt        60

tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa acccatctca       120

taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt       180

atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt tattgccaaa       240

tgtttgaacg atcggggaaa ttcgagctcc accgcggtgg gcggccgctc tagaactagt       300

taattaagga attatcgaac cactttgtac aagaaagctg ggtcggcgcg catggagagg       360

agccacttgc tacatcttca ttattcttag aaaattctat tgcgtcttca tcctgttaat       420

acacaaaaat aagtcagttt tggataaata aatacatata gaagaacatg aattgatatg       480

cagggagtat aaataaatac atataggaga acatgaatct gtgaactaac acggctggga       540

gctaggcagc tagcagctag cgcctaacag ctgggagcct aacagctagc agctagcagc       600

caatcaaaac aaggcgacaa ggcgcatgca gtgagatcaa aaatctgtta atgccagcca       660

tgcagggagt ataacacggc tgggcagcaa ggcgcatgca tcaaaacaag gcgacagcaa       720

acagcccatg catcaaaaca gtagtgaata atagcaaatt aatagcccat gcacgaagta       780

aataataatc tttaaatacc tcatccatat gattctcatg atttgttgca gcagcaataa       840

cagagtctag cacctcgaga tcaccaatca ttgttggaaa atatgtagca ccttgaatga       900

cacaaatatg catcaatata agtaaaataa ttgttgaata actataaatt ggaacttcat       960

tataacatat atgcattcac cttttctaga tgctgctacc caatcttttg tgcatatcaa      1020

agcttcaaca atctccgaac caagacgatt gcggtaagga tcaacaacac gaccaccagc      1080

actgaacgca gactcagaag caacagttga cacttgtatt gctagcacat cccttgcaat      1140

ttgggtgaga ataggatatt ctgcaaccct tcccctccac catgataaaa tatcaaactg      1200

accactatgc ttcaaaaggg gttcagacat atatttatcc aattcatttg actctacttg      1260

atcataatcc ttcaactcat gcaaatagtt ttgaaattca tcatcttcat tttccatcaa      1320

ggtatcatcc atactatcat tagtagttgt ctttgtcttt ggagctgaag gactacaact      1380

agaatagaat tgatacaatt ttctaatgac cctaacaaag tcatctacat gaactttgta      1440

tgaatcacca tgaaattttt tcatatagaa ctcaatcaat attttcttgt acctagggtc      1500

aaggaagcat gctacagcta gtgcaatatt agacactttc caatatttct caaacttttc      1560

actcattgca acggccattc tcctaatgac aaatttttca tgaacacacc attggtcaat      1620

caaatccttt atctcacaga aacctttgta aaataaattt gcagtggaat attgagtacc      1680

agataggagt tcagtgagat caaaaaactt cttcaaacac ttaaaaagag ttaatgccat      1740

cttccactcc tcggctttag gacaaattgc atcgtaccta caataattga catttgatta      1800

attgagaatt tataatgatg acatgtacaa caattgagac aaacatacct gcgaggatca      1860

cttgttttaa gccttattag tgcaggctta taatataagg catccctcaa catcaaatag      1920

gttgaattcc atctagttga gacatcatat gagatccctt tagatttatc caagtcacat      1980

tcactagcac acttcattag ttcttcccac tgcaaaggag aagattttac agcaagaaca      2040

atcgctttga ttttctcaat tgttcctgca attacagcca agccatcctt tgcaaccaag      2100

ttcagtatgt gacaagcaca cctcacatga aagaaagcac catcacaaac tagatttgaa      2160

tcagtgtcct gcaaatcctc aattatatcg tgcacagcta cttcatttgc actagcatta      2220

tccaaagaca aggcaaacaa ttttttctca atgttccact taaccatgat tgcagtgaag      2280

gtttgtgata acctttggcc agtgtggcgc ccttcaacat gaaaaaagcc aacaattctt      2340

ttttggagac accaatcatc atcaatccaa tggatggtga cacacatgta tgacttattt      2400

tgacaagatg tccacatatc catagttgta ctgaagcgag actgaacatc ttttagtttt      2460

ccatacaact tttctttttc ttccaaatac aaatccatga tatattttct agcagtgaca      2520

cgggacttta ttggaaagtg agggcgcaga gacttaacaa actcaacaaa gtactcatgt      2580

tctacaatat tgaaaggata ttcatgcatg attattgcca aatgaagctt ctttaggcta      2640

accacttcat cgtacttata aggctcaatg agatttatgt ctttgccatg atccttttca      2700

ctttttagac acaactgacc tttaactaaa ctatgtgatg ttctcaagtg atttcgaaat      2760

ccgcttgttc catgatgacc ctcagcccta tacttagcct tgcaattagg aaagttgcaa      2820

tgtccccata cctgaacgta tttctttcca tcgacctcca cttcaatttc cttcttggtg      2880

aaatgctgcc atacatccga tgtgcacttc tttgccctct tctgtggtgc ttcttcttcg      2940

ggttcaggtt gtggctgtgg ttgtggttct ggttgtggtt gtggttgtgg ttgtggttca      3000

tgaacaatag ccatatcatc ttgactcgga tctgtagctg taccatttgc attactactg      3060

cttacactct gaataaaatg cctctcggcc tcagctgttg atgatgatgg tgatgtgcgg      3120

ccacatccat gcccacgcgc acgtgcacgt acattctgaa tccgactaga agaggcttca      3180

gcttttcttt tcaaccctgt tataaacaga tttttcgtat tattctacag tcaatatgat      3240

gcttcccaat ctacaaccaa ttagtaatgc taatgctatt gctactgttt ttctaatata      3300

taccttgagc atatgcagag aatacggaat ttgttttgcg agtagaaggc gctcttgtgg      3360

tagacatcaa cttggccaat cttatggctg agcctgaggg aggattattt ccaaccggag      3420

gcgtcatccg cggagcctgc ttttttgtac aaacttgtcc taggcctatc gttcgtaaat      3480

ggtgaaaatt ttcagaaaat tgcttttgct ttaaaagaaa tgatttaaat tgctgcaata      3540

gaagtagaat gcttgattgc ttgagattcg tttgttttgt atatgttgtg ttgagaattc      3600

tcgaggtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat      3660

agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg      3720

aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt      3780

tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt tcctttatcg caatgatggc      3840

atttgtagga gccaccttcc ttttccacta tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc      3900

aatggaatcc gaggaggttt ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca attgcccttt      3960

ggtcttctga gactgtatct ttgatatttt tggagtagac aagtgtgtcg tgctccacca      4020

tgttatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga      4080

tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttcaacga      4140

tggcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggagcc accttccttt tccactatct      4200

tcacaataaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccg gatattaccc      4260

tttgttgaaa agtctcaatt gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atatttttgg      4320

agtagacaag tgtgtcgtgc tccaccatgt tgacctgcag gaattcgata tcaagcttgg      4380

cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc      4440

gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc      4500

gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc      4560

agattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt tgacaggata tattggcggg      4620

taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataacggata tttaaaaggg cgtgaaaagg      4680

tttatccgtt cgtccatttg tatgtgcatg ccaaccacag ggttcccctc gggatcaaag      4740

tactttgatc caacccctcc gctgctatag tgcagtcggc ttctgacgtt cagtgcagcc      4800

gtcttctgaa aacgacatgt cgcacaagtc ctaagttacg cgacaggctg ccgccctgcc      4860

cttttcctgg cgttttcttg tcgcgtgttt tagtcgcata aagtagaata cttgcgacta      4920

gaaccggaga cattacgcca tgaacaagag cgccgccgct ggcctgctgg gctatgcccg      4980

cgtcagcacc gacgaccagg acttgaccaa ccaacgggcc gaactgcacg cggccggctg      5040

caccaagctg ttttccgaga agatcaccgg caccaggcgc gaccgcccgg agctggccag      5100

gatgcttgac cacctacgcc ctggcgacgt tgtgacagtg accaggctag accgcctggc      5160

ccgcagcacc cgcgacctac tggacattgc cgagcgcatc caggaggccg gcgcgggcct      5220

gcgtagcctg gcagagccgt gggccgacac caccacgccg gccggccgca tggtgttgac      5280

cgtgttcgcc ggcattgccg agttcgagcg ttccctaatc atcgaccgca cccggagcgg      5340

gcgcgaggcc gccaaggccc gaggcgtgaa gtttggcccc cgccctaccc tcaccccggc      5400

acagatcgcg cacgcccgcg agctgatcga ccaggaaggc cgcaccgtga aagaggcggc      5460

tgcactgctt ggcgtgcatc gctcgaccct gtaccgcgca cttgagcgca gcgaggaagt      5520

gacgcccacc gaggccaggc ggcgcggtgc cttccgtgag gacgcattga ccgaggccga      5580

cgccctggcg gccgccgaga atgaacgcca agaggaacaa gcatgaaacc gcaccaggac      5640

ggccaggacg aaccgttttt cattaccgaa gagatcgagg cggagatgat cgcggccggg      5700

tacgtgttcg agccgcccgc gcacgtctca accgtgcggc tgcatgaaat cctggccggt      5760

ttgtctgatg ccaagctggc ggcctggccg gccagcttgg ccgctgaaga aaccgagcgc      5820

cgccgtctaa aaaggtgatg tgtatttgag taaaacagct tgcgtcatgc ggtcgctgcg      5880

tatatgatgc gatgagtaaa taaacaaata cgcaagggga acgcatgaag gttatcgctg      5940

tacttaacca gaaaggcggg tcaggcaaga cgaccatcgc aacccatcta gcccgcgccc      6000

tgcaactcgc cggggccgat gttctgttag tcgattccga tccccagggc agtgcccgcg      6060

attgggcggc cgtgcgggaa gatcaaccgc taaccgttgt cggcatcgac cgcccgacga      6120

ttgaccgcga cgtgaaggcc atcggccggc gcgacttcgt agtgatcgac ggagcgcccc      6180

aggcggcgga cttggctgtg tccgcgatca aggcagccga cttcgtgctg attccggtgc      6240

agccaagccc ttacgacata tgggccaccg ccgacctggt ggagctggtt aagcagcgca      6300

ttgaggtcac ggatggaagg ctacaagcgg cctttgtcgt gtcgcgggcg atcaaaggca      6360

cgcgcatcgg cggtgaggtt gccgaggcgc tggccgggta cgagctgccc attcttgagt      6420

cccgtatcac gcagcgcgtg agctacccag gcactgccgc cgccggcaca accgttcttg      6480

aatcagaacc cgagggcgac gctgcccgcg aggtccaggc gctggccgct gaaattaaat      6540

caaaactcat ttgagttaat gaggtaaaga gaaaatgagc aaaagcacaa acacgctaag      6600

tgccggccgt ccgagcgcac gcagcagcaa ggctgcaacg ttggccagcc tggcagacac      6660

gccagccatg aagcgggtca actttcagtt gccggcggag gatcacacca agctgaagat      6720

gtacgcggta cgccaaggca agaccattac cgagctgcta tctgaataca tcgcgcagct      6780

accagagtaa atgagcaaat gaataaatga gtagatgaat tttagcggct aaaggaggcg      6840

gcatggaaaa tcaagaacaa ccaggcaccg acgccgtgga atgccccatg tgtggaggaa      6900

cgggcggttg gccaggcgta agcggctggg ttgtctgccg gccctgcaat ggcactggaa      6960

cccccaagcc cgaggaatcg gcgtgacggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc      7020

gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa      7080

cgcatcgagg cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc      7140

aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc      7200

gacgagcaac cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc      7260

agcatcatgg acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg      7320

atccgctacg agcttccaga cgggcacgta gaggtttccg cagggccggc cggcatggcc      7380

agtgtgtggg attacgacct ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac      7440

cgataccggg aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac      7500

gtactcaagt tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc      7560

tgcattcggt taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc      7620

cgcctggtga cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc      7680

gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc      7740

acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt gatcgatccc      7800

ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga      7860

tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt      7920

ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag      7980

gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca      8040

tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa      8100

ggtcgaaaag gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt      8160

gggaaccgga acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg      8220

taagtgactg atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt      8280

attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa      8340

gagctgcaaa aagcgcctac ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt      8400

cggcctatcg cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg caatctacca      8460

gggcgcggac aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc gcccacatca aggcaccctg      8520

cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt      8580

cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg      8640

tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac      8700

tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa      8760

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc      8820

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg      8880

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc      8940

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc      9000

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga      9060

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc      9120

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat      9180

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg      9240

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc      9300

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga      9360

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact      9420

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt      9480

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag      9540

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg      9600

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgca ttctaggtac      9660

taaaacaatt catccagtaa aatataatat tttattttct cccaatcagg cttgatcccc      9720

agtaagtcaa aaaatagctc gacatactgt tcttccccga tatcctccct gatcgaccgg      9780

acgcagaagg caatgtcata ccacttgtcc gccctgccgc ttctcccaag atcaataaag      9840

ccacttactt tgccatcttt cacaaagatg ttgctgtctc ccaggtcgcc gtgggaaaag      9900

acaagttcct cttcgggctt ttccgtcttt aaaaaatcat acagctcgcg cggatcttta      9960

aatggagtgt cttcttccca gttttcgcaa tccacatcgg ccagatcgtt attcagtaag     10020

taatccaatt cggctaagcg gctgtctaag ctattcgtat agggacaatc cgatatgtcg     10080

atggagtgaa agagcctgat gcactccgca tacagctcga taatcttttc agggctttgt     10140

tcatcttcat actcttccga gcaaaggacg ccatcggcct cactcatgag cagattgctc     10200

cagccatcat gccgttcaaa gtgcaggacc tttggaacag gcagctttcc ttccagccat     10260

agcatcatgt ccttttcccg ttccacatca taggtggtcc ctttataccg gctgtccgtc     10320

atttttaaat ataggttttc attttctccc accagcttat ataccttagc aggagacatt     10380

ccttccgtat cttttacgca gcggtatttt tcgatcagtt ttttcaattc cggtgatatt     10440

ctcattttag ccatttatta tttccttcct cttttctaca gtatttaaag ataccccaag     10500

aagctaatta taacaagacg aactccaatt cactgttcct tgcattctaa aaccttaaat     10560

accagaaaac agctttttca aagttgtttt caaagttggc gtataacata gtatcgacgg     10620

agccgatttt gaaaccgcgg tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac     10680

atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc     10740

gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg ccgccttaca acggctctcc cgctgacgcc     10800

gtcccggact gatgggctgc ctgtatcgag tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg     10860

gagctgttgg ctggctggtg gcaggatata ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca     10920

acttaataac acattgcgga cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat taattcgggg     10980

gatctggatt ttagtactgg attttggttt taggaattag aaattttatt gatagaagta     11040

ttttacaaat acaaatacat actaagggtt tcttatatgc tcaacacatg agcgaaaccc     11100

tataggaacc ctaattccct tatctgggaa ctactcacac attattatgg agaaactcga     11160

gcttgtcgat cgacagatcc ggtcggcatc tactctattt ctttgccctc ggacgagtgc     11220

tggggcgtcg gtttccacta tcggcgagta cttctacaca gccatcggtc cagacggccg     11280

cgcttctgcg ggcgatttgt gtacgcccga cagtcccggc tccggatcgg acgattgcgt     11340

cgcatcgacc ctgcgcccaa gctgcatcat cgaaattgcc gtcaaccaag ctctgataga     11400

gttggtcaag accaatgcgg agcatatacg cccggagtcg tggcgatcct gcaagctccg     11460

gatgcctccg ctcgaagtag cgcgtctgct gctccataca agccaaccac ggcctccaga     11520

agaagatgtt ggcgacctcg tattgggaat ccccgaacat cgcctcgctc cagtcaatga     11580

ccgctgttat gcggccattg tccgtcagga cattgttgga gccgaaatcc gcgtgcacga     11640

ggtgccggac ttcggggcag tcctcggccc aaagcatcag ctcatcgaga gcctgcgcga     11700

cggacgcact gacggtgtcg tccatcacag tttgccagtg atacacatgg ggatcagcaa     11760

tcgcgcatat gaaatcacgc catgtagtgt attgaccgat tccttgcggt ccgaatgggc     11820

cgaacccgct cgtctggcta agatcggccg cagcgatcgc atccatagcc tccgcgaccg     11880

gttgtagaac agcgggcagt tcggtttcag gcaggtcttg caacgtgaca ccctgtgcac     11940

ggcgggagat gcaataggtc aggctctcgc taaactcccc aatgtcaagc acttccggaa     12000

tcgggagcgc ggccgatgca aagtgccgat aaacataacg atctttgtag aaaccatcgg     12060

cgcagctatt tacccgcagg acatatccac gccctcctac atcgaagctg aaagcacgag     12120

attcttcgcc ctccgagagc tgcatcaggt cggagacgct gtcgaacttt tcgatcagaa     12180

acttctcgac agacgtcgcg gtgagttcag gctttttcat atctcattgc cccccgggat     12240

ctgcgaaagc tcgagagaga tagatttgta gagagagact ggtgatttca gcgtgtcctc     12300

tccaaatgaa atgaacttcc ttatatagag gaaggtcttg cgaaggatag tgggattgtg     12360

cgtcatccct tacgtcagtg gagatatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg     12420

gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt     12480

cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc     12540

caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga     12600

ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga     12660

ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg ttatcacatc     12720

aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg     12780

gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt     12840

tatcgcaatg atggcatttg taggtgccac cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt     12900

gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag     12960

tctcaatagc cctttggtct tctgagactg tatctttgat attcttggag tagacgagag     13020

tgtcgtgctc caccatgttg gcaagctgct ctagccaata cgcaaaccgc ctctccccgc     13080

gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag     13140

tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt     13200

tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa     13260

cagctatgac catgattacg                                                          13280

 

<210> 2  <211> 16780 <212> DNA  <213> Artificial(人工序列)

 

<220>

<221>

<222> （8290）..（9645）

<223> 4×35S增强子

<222>（9650）..（12505）

<223> pBblueScript SK+质粒片段

<222>（13237）..（16341）

<223> 植物Basta抗性筛选标记基因

 

<222>（5686）..（6711）

<223>潮霉素抗性标记基因（Hyg）

<222>（16341）..（16773）

<223> Ds5’，来源于Ds Launch Pad T-DNA载体载体

<222>（7931）..（8246）

<223> Ds3’，来源于Ds Launch Pad T-DNA载体载体

<222>（5369）..（5394）

<223> T-DNA左边界（LB），来源于pMDC32载体

<222>（228）..（253）

<223> T-DNA右边界（RB），来源于pMDC32载体

 

<400> 2

agcttggcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa        60

cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc       120

accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc       180

ttggatcaga ttgtcgtttc ccgccttcag tttaaactat cagtgtttga caggatatat       240

tggcgggtaa acctaagaga aaagagcgtt tattagaata acggatattt aaaagggcgt       300

gaaaaggttt atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt tcccctcggg       360

atcaaagtac tttgatccaa cccctccgct gctatagtgc agtcggcttc tgacgttcag       420

tgcagccgtc ttctgaaaac gacatgtcgc acaagtccta agttacgcga caggctgccg       480

ccctgccctt ttcctggcgt tttcttgtcg cgtgttttag tcgcataaag tagaatactt       540

gcgactagaa ccggagacat tacgccatga acaagagcgc cgccgctggc ctgctgggct       600

atgcccgcgt cagcaccgac gaccaggact tgaccaacca acgggccgaa ctgcacgcgg       660

ccggctgcac caagctgttt tccgagaaga tcaccggcac caggcgcgac cgcccggagc       720

tggccaggat gcttgaccac ctacgccctg gcgacgttgt gacagtgacc aggctagacc       780

gcctggcccg cagcacccgc gacctactgg acattgccga gcgcatccag gaggccggcg       840

cgggcctgcg tagcctggca gagccgtggg ccgacaccac cacgccggcc ggccgcatgg       900

tgttgaccgt gttcgccggc attgccgagt tcgagcgttc cctaatcatc gaccgcaccc       960

ggagcgggcg cgaggccgcc aaggcccgag gcgtgaagtt tggcccccgc cctaccctca      1020

ccccggcaca gatcgcgcac gcccgcgagc tgatcgacca ggaaggccgc accgtgaaag      1080

aggcggctgc actgcttggc gtgcatcgct cgaccctgta ccgcgcactt gagcgcagcg      1140

aggaagtgac gcccaccgag gccaggcggc gcggtgcctt ccgtgaggac gcattgaccg      1200

aggccgacgc cctggcggcc gccgagaatg aacgccaaga ggaacaagca tgaaaccgca      1260

ccaggacggc caggacgaac cgtttttcat taccgaagag atcgaggcgg agatgatcgc      1320

ggccgggtac gtgttcgagc cgcccgcgca cgtctcaacc gtgcggctgc atgaaatcct      1380

ggccggtttg tctgatgcca agctggcggc ctggccggcc agcttggccg ctgaagaaac      1440

cgagcgccgc cgtctaaaaa ggtgatgtgt atttgagtaa aacagcttgc gtcatgcggt      1500

cgctgcgtat atgatgcgat gagtaaataa acaaatacgc aaggggaacg catgaaggtt      1560

atcgctgtac ttaaccagaa aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac ccatctagcc      1620

cgcgccctgc aactcgccgg ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc ccagggcagt      1680

gcccgcgatt gggcggccgt gcgggaagat caaccgctaa ccgttgtcgg catcgaccgc      1740

ccgacgattg accgcgacgt gaaggccatc ggccggcgcg acttcgtagt gatcgacgga      1800

gcgccccagg cggcggactt ggctgtgtcc gcgatcaagg cagccgactt cgtgctgatt      1860

ccggtgcagc caagccctta cgacatatgg gccaccgccg acctggtgga gctggttaag      1920

cagcgcattg aggtcacgga tggaaggcta caagcggcct ttgtcgtgtc gcgggcgatc      1980

aaaggcacgc gcatcggcgg tgaggttgcc gaggcgctgg ccgggtacga gctgcccatt      2040

cttgagtccc gtatcacgca gcgcgtgagc tacccaggca ctgccgccgc cggcacaacc      2100

gttcttgaat cagaacccga gggcgacgct gcccgcgagg tccaggcgct ggccgctgaa      2160

attaaatcaa aactcatttg agttaatgag gtaaagagaa aatgagcaaa agcacaaaca      2220

cgctaagtgc cggccgtccg agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg      2280

cagacacgcc agccatgaag cgggtcaact ttcagttgcc ggcggaggat cacaccaagc      2340

tgaagatgta cgcggtacgc caaggcaaga ccattaccga gctgctatct gaatacatcg      2400

cgcagctacc agagtaaatg agcaaatgaa taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa      2460

ggaggcggca tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt      2520

ggaggaacgg gcggttggcc aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc      2580

actggaaccc ccaagcccga ggaatcggcg tgacggtcgc aaaccatccg gcccggtaca      2640

aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca      2700

gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg      2760

aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc      2820

caagggcgac gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga      2880

tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg      2940

cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg      3000

catggccagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc      3060

catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt      3120

tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt      3180

agaaacctgc attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa      3240

gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt      3300

aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg      3360

cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat      3420

cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga      3480

agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa      3540

gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa      3600

ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg      3660

cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg      3720

ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc      3780

gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc      3840

acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt      3900

aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac      3960

agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc      4020

ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa      4080

tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcatc gaattcctgc      4140

attctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata ttttattttc tcccaatcag      4200

gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg atatcctccc      4260

tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa      4320

gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc      4380

cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc      4440

gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca atccacatcg gccagatcgt      4500

tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat      4560

ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc atacagctcg ataatctttt      4620

cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga      4680

gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc      4740

cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc ataggtggtc cctttatacc      4800

ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc caccagctta tataccttag      4860

caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt      4920

ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc tcttttctac agtatttaaa      4980

gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta      5040

aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat      5100

agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc tctgtcatcg      5160

ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg cagcttagtt      5220

gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac aacggctctc      5280

ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc      5340

tgccggtcgg ggagctgttg gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt aaacaaattg      5400

acgcttagac aacttaataa cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat taacgccgaa      5460

ttaattcggg ggatctggat tttagtactg gattttggtt ttaggaatta gaaattttat      5520

tgatagaagt attttacaaa tacaaataca tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat      5580

gagcgaaacc ctataggaac cctaattccc ttatctggga actactcaca cattattatg      5640

gagaaactcg agcttgtcga tcgacagatc cggtcggcat ctactctatt tctttgccct      5700

cggacgagtg ctggggcgtc ggtttccact atcggcgagt acttctacac agccatcggt      5760

ccagacggcc gcgcttctgc gggcgatttg tgtacgcccg acagtcccgg ctccggatcg      5820

gacgattgcg tcgcatcgac cctgcgccca agctgcatca tcgaaattgc cgtcaaccaa      5880

gctctgatag agttggtcaa gaccaatgcg gagcatatac gcccggagtc gtggcgatcc      5940

tgcaagctcc ggatgcctcc gctcgaagta gcgcgtctgc tgctccatac aagccaacca      6000

cggcctccag aagaagatgt tggcgacctc gtattgggaa tccccgaaca tcgcctcgct      6060

ccagtcaatg accgctgtta tgcggccatt gtccgtcagg acattgttgg agccgaaatc      6120

cgcgtgcacg aggtgccgga cttcggggca gtcctcggcc caaagcatca gctcatcgag      6180

agcctgcgcg acggacgcac tgacggtgtc gtccatcaca gtttgccagt gatacacatg      6240

gggatcagca atcgcgcata tgaaatcacg ccatgtagtg tattgaccga ttccttgcgg      6300

tccgaatggg ccgaacccgc tcgtctggct aagatcggcc gcagcgatcg catccatagc      6360

ctccgcgacc ggttgtagaa cagcgggcag ttcggtttca ggcaggtctt gcaacgtgac      6420

accctgtgca cggcgggaga tgcaataggt caggctctcg ctaaactccc caatgtcaag      6480

cacttccgga atcgggagcg cggccgatgc aaagtgccga taaacataac gatctttgta      6540

gaaaccatcg gcgcagctat ttacccgcag gacatatcca cgccctccta catcgaagct      6600

gaaagcacga gattcttcgc cctccgagag ctgcatcagg tcggagacgc tgtcgaactt      6660

ttcgatcaga aacttctcga cagacgtcgc ggtgagttca ggctttttca tatctcattg      6720

ccccccggga tctgcgaaag ctcgagagag atagatttgt agagagagac tggtgatttc      6780

agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaaggtctt gcgaaggata      6840

gtgggattgt gcgtcatccc ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga      6900

agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt      6960

gggaccactg tcggcagagg catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca      7020

tttgtaggtg ccaccttcct tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca      7080

atggaatccg aggaggtttc ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg      7140

gtcttctgag actgtatctt tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat      7200

gttatcacat caatccactt gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat      7260

gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat      7320

agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct      7380

tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct      7440

ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga      7500

gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg      7560

cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg      7620

aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag      7680

gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt      7740

cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcagta acatagatga caccgcgcgc      7800

gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat      7860

tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcagcc cgggggatcc      7920

actagtcgag cggctaggga tgaaaacggt cggtaacggt cggtaaaata cctctaccgt      7980

tttcattttc atatttaact tgcgggacgg aaacgaaaac gggatatacc ggtaacgaaa      8040

acgaacggga taaatacggt aatcgaaaac cgatacgatc cggtcgggtt aaagtcgaaa      8100

tcggacggga accggtattt ttgttcggta aaatcacaca tgaaaacata tattcagatc      8160

caagtccaca aggaaaattg attgtactct ttacttaaat ttacttatga atcctgctaa      8220

ttgaatgata caaatttact aatttgcagg ttatatgcag agctagtcaa acactgatag      8280

tttcggatct agatatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct      8340

ttttccacga tgttcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggtagaggca      8400

tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtagaagcc atcttccttt      8460

tctactgtcc tttcgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc      8520

gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctctggt cttctgagac tgtatctttg      8580

atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt tggggatcta gatatcacat      8640

caatccactt gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gttcctcgtg      8700

ggtgggggtc catctttggg accactgtcg gtagaggcat cttgaacgat agcctttcct      8760

ttatcgcaat gatggcattt gtagaagcca tcttcctttt ctactgtcct ttcgatgaag      8820

tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa      8880

gtctcaatag ccctctggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga      8940

gtgtcgtgct ccaccatgtt ggggatctag atatcacatc aatccacttg ctttgaagac      9000

gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ttcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga      9060

ccactgtcgg tagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg      9120

tagaagccat cttccttttc tactgtcctt tcgatgaagt gacagatagc tgggcaatgg      9180

aatccgagga ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc cctctggtct      9240

tctgagactg tatctttgat attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc caccatgttg      9300

gggatctaga tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt      9360

tccacgatgt tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggt agaggcatct      9420

tgaacgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt agaagccatc ttccttttct      9480

actgtccttt cgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat      9540

attacccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctctggtctt ctgagactgt atctttgata      9600

ttcttggagt agacgagagt gtcgtgctcc accatgttgg ggatccacta gctccagctt      9660

ttgttccctt tagtgagggt taatttcgag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc      9720

tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg      9780

taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc      9840

cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg      9900

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc      9960

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac     10020

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa     10080

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca     10140

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc     10200

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata     10260

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta     10320

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca     10380

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga     10440

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg     10500

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg     10560

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg     10620

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag     10680

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa     10740

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat     10800

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc     10860

tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc     10920

atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc     10980

tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc     11040

aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc     11100

catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt     11160

gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc     11220

ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa     11280

aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt     11340

atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg     11400

cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc     11460

gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa     11520

agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt     11580

gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt     11640

caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag     11700

ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta     11760

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat     11820

aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctaaa ttgtaagcgt taatattttg     11880

ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc     11940

ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt     12000

tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc     12060

tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg     12120

tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga     12180

aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg     12240

ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg     12300

ctacagggcg cgtcccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg     12360

cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt     12420

tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattgtaa     12480

tacgactcac tatagggcga attggagctt gcatgcctgc aggtcctgct gagcctcgac     12540

atgttgtcgc aaaattcgcc ctggacccgc ccaacgattt gtcgtcactg tcaaggtttg     12600

acctgcactt catttggggc ccacatacac caaaaaaatg ctgcataatt ctcggggcag     12660

caagtcggtt acccggccgc cgtgctggac cgggttgaat ggtgcccgta actttcggta     12720

gagcggacgg ccaatactca acttcaagga atctcaccca tgcgcgccgg cggggaaccg     12780

gagttccctt cagtgagcgt tattagttcg ccgctcggtg tgtcgtagat actagcccct     12840

ggggcacttt tgaaatttga ataagattta tgtaatcagt cttttaggtt tgaccggttc     12900

tgccgctttt tttaaaattg gatttgtaat aataaaacgc aattgtttgt tattgtggcg     12960

ctctatcata gatgtcgcta taaacctatt cagcacaata tattgttttc attttaatat     13020

tgtacatata agtagtaggg tacaatcagt aaattgaacg gagaatatta ttcataaaaa     13080

tacgatagta acgggtgata tattcattag aatgaaccga aaccggcggt aaggatctga     13140

gctacacatg ctcaggtttt ttacaacgtg cacaacagaa ttgaaagcaa atatcatgcg     13200

atcataggcg tctcgcatat ctcattaaag caggactcta ggatcccccg ggtcatcaga     13260

tctcggtgac gggcaggacc ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga     13320

aacccacgtc atgccagttc ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg     13380

catatccgag cgcctcgtgc atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga     13440

ccacgctctt gaagccctgt gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc     13500

ccagtcccgt ccgctggtgg cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt     13560

aggcgttgcg tgccttccag gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct     13620

cggcgacgag ccagggatag cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg     13680

gttcctgcgg ctcggtacgg aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg     13740

tgcagaccgc cggcatgtcc gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg     13800

ggctcatggt aattgtaaat agtaattgta atgttgtttg ttgtttgttg ttgttggtaa     13860

ttgttgtaaa aatgcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata gaggaagggt     13920

cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata tcacatcaat     13980

ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg     14040

ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag agagatcttc aacgatggcc tttcctttat     14100

cgcaatgatg gcatttgtag gagccacctt ccttttccac tatcttcaca ataaagtgac     14160

agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat taccctttgt tgaaaagtct     14220

caattgccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt tttggagtag acaagcgtgt     14280

cgtgctccac catgttgacg aagattttct tcttgtcatt gagtcgtaag agactctgta     14340

tgaactgttc gccagtcttt acggcgagtt ctgttaggtc ctctatttga atctttgact     14400

ccatgccctt tgattcagtg ggaactacct ttttagagac tccaatctct attacttgcc     14460

ttggtttgtg aagcaagcct tgaatcgtcc atactggaat agtacttctg atcttgagaa     14520

atatatcttt ctctgtgttc ttgatgcagt tagtcctgaa tcttttgact gcatctttaa     14580

ccttcttggg aaggtatttg atctcctgga gattattgct cgggtagatc gtcttgatga     14640

gacctgctgc gtaagcctct ctaaccatct gtgggttagc attctttctg aaattgaaaa     14700

ggctaatctt ctcattatca gtggtgaaca tggtatcgtc accttctccg tcgaacttcc     14760

tgactagatc gtagagatag aggaagtcgt ccattgtgat ctctggggca aaggagatct     14820

cttttggggc tggatcactg ctgggctttt tagttcctag catgagccag tgggcttttt     14880

gctttggtgg gcttgttaag gccttcgcaa agctcttggg cttgagttga gcttctcctt     14940

tggggatgaa gttcaaccta tctgtttgct gacttgttgt atacgcgtca gctgctgctc     15000

ttgcctctgt aatagtggca aacttcttat gcgcaactcc gggaacaccg tttgttgctg     15060

cctttgtaca accccagtca tcgtatatac cggcatgagg tccgttatac acgacgtagt     15120

agttggtatg agggtgttga atacccgatt cgtctctgag aggagcaact gaactgctag     15180

gttcaggttt tggtgggatt ggaattctca tgtttgacag cttatcatcg gatctagtaa     15240

catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt tgttttctat     15300

cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa acccatctca taaataacgt     15360

catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt atatgataat     15420

catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt tattgccaaa tgtttgaacg     15480

atctgcagcc gggcggccgc tttacttgta cagctcgtcc atgccgagag tgatcccggc     15540

ggcggtcacg aactccagca ggaccatgtg atcgcgcttc tcgttggggt ctttgctcag     15600

ggcggactgg gtgctcaggt agtggttgtc gggcagcagc acggggccgt cgccgatggg     15660

ggtgttctgc tggtagtggt cggcgagctg cacgctgccg tcctcgatgt tgtggcggat     15720

cttgaagttc accttgatgc cgttcttctg cttgtcggcc atgatataga cgttgtggct     15780

gttgtagttg tactccagct tgtgccccag gatgttgccg tcctccttga agtcgatgcc     15840

cttcagctcg atgcggttca ccagggtgtc gccctcgaac ttcacctcgg cgcgggtctt     15900

gtagttgccg tcgtccttga agaagatggt gcgctcctgg acgtagcctt cgggcatggc     15960

ggacttgaag aagtcgtgct gcttcatgtg gtcggggtag cgggcgaagc actgcaggcc     16020

gtagccgaag gtggtcacga gggtgggcca gggcacgggc agcttgccgg tggtgcagat     16080

gaacttcagg gtcagcttgc cgtaggtggc atcgccctcg ccctcgccgg acacgctgaa     16140

cttgtggccg tttacgtcgc cgtccagctc gaccaggatg ggcaccaccc cggtgaacag     16200

ctcctcgccc ttgctcacca tggacctgca tataacctgc atataacctg caaattagta     16260

aatttgtatc attcaattag caggattcat aagtaaattt aagtaaagag tacaatcaat     16320

tttccttgtg gacttggatc cggcgtgtga atgtgtgatg ctgttactcg tgtggtgcct     16380

ggccgcctgg gagagaggca gagcagcgtt cgctaggtat ttcttacatg ggctgggcct     16440

cagtggttat ggatgggagt tggagctggc catattgcag tcatcccgaa ttagaaaata     16500

cggtaacgaa acgggatcat cccgattaaa aacgggatcc cggtgaaacg gtcgggaaac     16560

tagctctacc gtttccgttt ccgtttaccg ttttgtatat cccgtttccg ttccgttttc     16620

gttttttacc tcgggttcga aatcgatcgg gataaaacta acaaaatcgg ttatacgata     16680

acggtcggta cgggattttc ccatcctact ttcatccctg ggtcacgcaa cgcgccccac     16740

gtacagcctc cccctccgcg cgcggggtac cgccgctcga                               16780

 

<210>3  <211> 348 <212> DNA  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 3

accggacggc gcacttcctc cgcccgaacc tgttcgtgaa caccccggac atcctgcacg        60

agtacctgca gcacggcggg gtgccggcct tcaagatcag agcggtgctc ggcgcgctcc       120

tggggccgac ctgggggatc tactcggggt tcgaactctg cgagaacacg ccactacgcc       180

cggggagcga ggagtacctt gatagtgaga aatatcagta caagccgcgc gactgggcgg       240

cggccgaacg ggagggccgc agcatcgccc ccttcatcac ccagctcaat ctcctgcggc       300

gggcgcaccc cgcgctccag gagctgcgca acctgcggtt ccaccacg                       348

 

<210>4  <211> 339 <212> DNA  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 4

tagatatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg        60

atgttcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggtagaggc atcttgaacg       120

atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtagaagc catcttcctt ttctactgtc       180

ctttcgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc       240

ctttgttgaa aagtctcaat agccctctgg tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg       300

gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg ttggggatc                                   339

Claims (9)

1.一种激活标签Ac/Ds转座系统，包括转座酶Ac表达载体、转座子Ds载体，其特征在于所述转座子Ds载体带有激活标签，所述激活标签为4个串联的35S增强子，4×35S增强子置于Ds3’端内侧。

2.如权利要求1所述的激活标签Ac/Ds转座系统，所述转座子Ds载体还包括pBluescript II SK(+)质粒片段,pBluescript II SK(+)质粒片段位于4×35S增强子的下游。

3.如权利要求1或2所述的激活标签Ac/Ds转座系统，所述转座子Ds载体还包括植物Basta抗性筛选标记基因，Basta抗性筛选标记基因位于转座子Ds5’端内侧，pBluescript II SK(+)质粒片段的下游。

4.如权利要求1所述的激活标签Ac/Ds转座系统，所述转座子Ds载体含有玉米不可以自主转座的Ds元件，所述Ds元件中整合有四个串联35S增强子、pBblueScript II SK+质粒片段、以及植物Basta抗性筛选标记基因，4×35S增强子置于Ds3’端内侧，Basta抗性筛选标记基因置于转座子Ds5’端内侧，pBluescript II SK(+)质粒片段置于4×35S增强子与Basta抗性筛选标记基因之间。

5.如权利要求1～4任一所述的激活标签Ac/Ds转座系统，所述转座子Ds载体还包括潮霉素抗性标记基因（Hyg），位于Ds3’端的外侧。

6.如权利要求1所述的激活标签Ac/Ds转座系统，所述转座子Ds载体具有如SEQ ID NO.2所述的序列。

7.如权利要求1～6所述的激活标签Ac/Ds转座系统，所述转座酶Ac表达载体的启动子包含以两个串联35S增强子。

8.如权利要求7所述的激活标签Ac/Ds转座系统，所述转座酶Ac表达载体具有如图1所示结构。

9.如权利要求7或8所述的激活标签Ac/Ds转座系统，所述转座酶Ac表达载体具有如SEQ ID NO.1所述的序列。

Images