CN101300358A

CN101300358A - 真核细胞中变胞藻黄素的生物合成

Info

Publication number: CN101300358A
Application number: CNA2006800413690A
Authority: CN
Inventors: J·施泰因布伦纳
Original assignee: PETER und TRAUDL ENGELHORN STI
Current assignee: PETER und TRAUDL ENGELHORN STI
Priority date: 2005-10-13
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2008-11-05
Also published as: DE102005049072A1; ZA200802906B; ATE478152T1; EP1934356A1; EP1934356B1; ES2351258T3; WO2007042304A1; US20100129845A1; DE502006007703D1; US7939320B2

Abstract

本发明涉及具有(a)编码在一个位点被赋予抗性的氨基酸置换改变的八氢番茄红素去饱和酶蛋白的DNA序列和(b)在其中能克隆入任何DNA序列的多克隆位点的DNA载体，涉及其用于真核细胞的转化的用途，涉及转化方法和涉及所制备的转基因植物细胞。

Description

真核细胞中变胞藻黄素的生物合成

本发明涉及DNA载体、其在真核细胞的转化中的用途、转化方法和由此制备的转基因植物，所述DNA载体具有(a)编码在一个位点上由赋予抗性的氨基酸置换改变的八氢番茄红素去饱和酶蛋白的DNA序列和(b)在其中能克隆入任何DNA序列的多克隆位点。

发明背景

类胡萝卜素是在所有光合成生物中发现的色素。它们作为光合反应中心的组分且在抗光氧化损害的保护作用中起着重要作用。

类胡萝卜素生物合成途径从双香叶基焦磷酸(GGDP)进行至变胞藻黄素。通过缩合两分子的香叶基-香叶基-焦磷酸(Geranyl-Gerany-Pyrophosphat)，八氢番茄红素合酶(PSY)形成了C40结构的八氢番茄红素。始于八氢番茄红素，八氢番茄红素去饱和酶(PDS)通过消除质子并构建入两个双键合成了ξ-胡萝卜素。该合成步骤的中间产物是六氢番茄红素。然后ξ-胡萝卜素再度在两步骤去饱和反应中转变成番茄红素，该反应通过中间产物链孢红素(Neurosporin)进行。为此负责的酶是ξ-胡萝卜素去饱和酶(ZDS)。番茄红素通过番茄红素环化酶(LCYB)转变成β-胡萝卜素。始于β-胡萝卜素，另外两种酶参与变胞藻黄素的形成。一方面，β-胡萝卜素酮酶(BKT)在4-和4′-位点各导入一个酮基。另一方面，通过类胡萝卜素羟化酶(CHY)在变胞藻黄素前体的离子环上的3-和3′-位点各附着一个羟基。

通过过度表达来自噬夏孢欧文氏菌(Eriwinia uredovora)的细菌八氢番茄红素合酶可能影响或刺激转基因番茄中的类胡萝卜素生物合成，从而使合成的类胡萝卜素的量增加2至4倍(Fraser，Romer等人2002)。

然而，在类胡萝卜素生物合成途径(图1)中起着中心关键作用的正是八氢番茄红素去饱和酶。已从蓝细菌(Chamovitz等人，1991；Martínez-Férez和Vioque，1992；Martínez-Férez等人，1994)和高等植物(Bartley等人，1991；Pecker等人，1992)克隆了编码八氢番茄红素去饱和酶的pds基因，并将所述基因在大肠杆菌(E.coli)中成功地过度表达。漂白除草剂(Bleichherbizid)氟草敏已知为八氢番茄红素去饱和酶的可逆的、非竞争性抑制剂。已描述了蓝细菌的聚球藻属(Synechococcus)的八氢番茄红素去饱和酶的突变形式；它们赋予了细菌对氟草敏的抗性。在各情况下，赋予抗性的突变基于单个氨基酸的置换。在聚球藻属中进行的突变研究的范围内，对于下列氨基酸置换发现产生抗性：Arg195Pro、Leu320Pro、Val403Gly、Leu437Arg(Linden等人，1990；Chamovitz等人，1993)。尽管长久以来使用氟草敏和其他此类漂白除草剂控制杂草，但至今仍未分离出天然发生的抗性植物。

在类胡萝卜素生物合成途径的中间产物和产物中，酮基类胡萝卜素变胞藻黄素尤其具有重要的商业价值。变胞藻黄素具有比类胡萝卜素生物合成途径中的其他中间产物更高的抗氧化剂活性。变胞藻黄素充当自由基和活性氧类的猝灭剂(Kobayashi和Sakamoto，1999)、充当免疫应答的增强剂(Jyonouchi等人，1995)和充当抗癌剂(Tanaka等人，1994，1995)。因为其作为有效的抗氧化剂的天然作用的缘故，变胞藻黄素也用作食品增补剂。其用作在鱼类养殖中具有着色剂作用的饲料添加剂。

一些绿藻例如巴德威杜氏藻(Dunaliella bardawil)和雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)在逆境条件下具有积累类胡萝卜素的独特能力。在此，尤其是雨生红球藻适合用于变胞藻黄素的天然产生。雨生红球藻能够以高达其干重的4％的量积累变胞藻黄素。这是雨生红球藻在变胞藻黄素的商业生产中起着重要作用的原因，因为对于商业用途的活性物质生产，用于变胞藻黄素生产的化学合成途径是其中最昂贵的。

针对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和小球藻(Chlorella)的一些种类已经多次描述了绿藻的基因转化(Kindle1990；Lumbreras等人，1998；Hawkins和Nakamura，1999；Kim等人，2002)。因为其代谢的缘故，这两类藻在类胡萝卜素的大规模天然产生方面对人的吸引力不足。

Teng等人(2003)已对雨生红球藻的基因转化进行了描述。通过微粒轰击已将在SV40启动子控制下的β-半乳糖苷酶报告基因lacZ整合入藻的基因组。借助于光学技术必须个别地检测和选择成功转化的藻细胞。用lacZ基因转化的藻细胞对有毒的或显性作用的选择剂不具有抗性。

尽管在过去10年中已对变胞藻黄素的生物合成进行了详细研究(Lu等人，1995；Fraser等人，1998)，但在生物技术工业规模上通过雨生红球藻生产变胞藻黄素仍然面临许多问题，因为，尤其是在变胞藻黄素生物合成过程中细胞分裂受到抑制(Boussiba和vonVonshak，1991)。

本发明的任务是提供DNA载体，所述DNA载体可用于将真核细胞特别是藻类如雨生红球藻的基因组以适当方式进行基因改变，以使能够影响或增加天然类胡萝卜素和类异戊二烯的体内合成和尤其变胞藻黄素的生物合成。本发明的另一个任务是提供载体，所述载体可用于作为真核细胞特别是藻类如雨生红球藻的转化的显性选择标记和使得能够以简单的方式选择成功转化的真核细胞特别是藻类如雨生红球藻的细胞。

本发明通过包含(a)编码在一个位点具有赋予抗性的氨基酸置换的八氢番茄红素去饱和酶蛋白的DNA序列和(b)可克隆入任何DNA序列的多克隆位点的载体来实现该任务。

在此本发明的载体包含可用作运载工具的任何DNA分子，借助于所述分子将外源DNA导入细胞。它们包括粘粒、噬菌体、病毒、YAC、BAC、线状DNA分子和尤其是环状质粒。

在本发明的范围内，已从基因组DNA文库分离了来自雨生红球藻的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的DNA序列并对该序列进行了测序(SEQ ID NO：1)。雨生红球藻八氢番茄红素去饱和酶的相应的蛋白质序列示于SEQ ID NO：2。本发明的主题包括考虑到编码蛋白质序列SEQ IDNO：2的遗传密码的简并性的所有核酸序列。

优选载体是其中(a)编码八氢番茄红素去饱和酶蛋白的DNA序列(pds基因)优选来源于雨生红球藻并且通过定向突变已导入赋予抗性的氨基酸置换的DNA载体。特别优选的载体是编码在其氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的位点504上具有从亮氨酸至精氨酸的氨基酸置换的雨生红球藻八氢番茄红素去饱和酶蛋白的载体。

根据本发明在雨生红球藻PDS蛋白的位点504上从亮氨酸至精氨酸的氨基酸置换相应于聚球藻PCC7942中的Leu437Arg置换(图2)。为此通过定向突变用Arg的密码子“CGC”取代Leu的密码子“CTG”。该突变赋予突变体对氟草敏的已知最高的抗性。已介导的抗性赋予本发明的突变体对氟草敏的抗性比野生型高多至70倍。根据本发明，将0.5-50μm的氟草敏浓度用作选择物质。

雨生红球藻的氨基酸序列中对于氨基酸置换优选的其他位点是精氨酸264、亮氨酸388、缬氨酸465(图3)。在聚球藻中，对于在同源位点上的氨基酸置换已知具有抗性赋予的效果。

介导转化子对除草剂尤其是漂白除草剂，特别优选氟草敏的抗性的载体是优选的。

在本发明的范围内，多克隆位点(MCS)，也称为多接头，理解为表示是指核酸序列中的这样的区域，即该区域具有许多不同的可利用的限制性内切酶的切割位点，同时当限制性水解发生时不对核酸序列的其他元件的功能产生不利影响。优选，DNA分子只在一个位点被在MCS中切割位点确定的限制性内切核酸酶水解。来自商购可获得的载体和质粒的常规MCS的实例对于本领域技术人员来说是熟知的。在本发明的意义内，MCS进一步理解为是指载体内的任何限制性切割位点，所述切割位点可用于以定向或非定向的方式将任意DNA序列克隆入载体序列而在该过程中没有对本发明的载体的其他功能元件产生不利影响。

本发明中优选的MCS的实施方案示于SEQ ID NO：4。在优选实施方案中，本发明的DNA载体具有序列SEQ ID NO：5(也参见图4)。

本发明优选涉及这样的DNA载体，其作为包含编码序列的在多克隆位点待克隆入的任意DNA序列。

编码序列理解为意指编码完整的活性蛋白或具有生物学活性的蛋白质片段的任意DNA序列。

植物来源的编码序列是特别优选的。此外包含至少一个启动子序列的编码序列是特别优选的。在此优选启动子是使在其控制之下的编码序列能够组成型转录或表达的启动子。优选启动子是β-微管蛋白启动子。选自雨生红球藻肌动蛋白基因(SEQ ID NO：6)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(SEQ ID NO：7)的启动子的启动子序列是特别优选的。

本发明还涉及其中除了至少一个启动子基因外还包含待表达的功能基因的编码序列的DNA载体。在此特别优选的是包含选自类胡萝卜素生物合成基因、变胞藻黄素生物合成基因和类异戊二烯生物合成基因的编码序列的DNA载体。β-胡萝卜素酮酶、类胡萝卜素羟化酶、ξ-胡萝卜素去饱和酶、八氢番茄红素合酶、Leucopin-环化酶、脱氧木酮糖合酶和1-脱氧木糖-5-磷酸还原异构酶的基因序列是特别优选的(Berthold等人，2002，Hallmann和Sumper，1996，Mahmoud和Croteau，2001)。

本发明还涉及本发明的载体用于转化真核细胞，特别是单细胞植物细胞的用途。特别优选使用本发明的载体进行藻类细胞特别是雨生红球藻细胞的转化。在本发明的范围内，转化理解为意指将外源DNA导入生物。

本发明的载体作为用于转化目的的选择标记的用途也是本发明的主题。在此特别优选的是用作显性选择标记的用途。

本发明的意义内的选择标记给经转化的生物赋予了便于将该生物与相同物种的未转化的生物区分的性质。显性选择标记理解为意指介导特性的标记，依靠所述特性，可在物种内施加选择压从而使在相同物种的经转化的和未转化的生物群体中只可获得经转化的生物。通过向生长培养基中加入氟草敏，可能例如从在这些条件下不能存活的未转化的细胞中选择已用本发明载体SEQ ID NO：4成功转化的雨生红球藻细胞。根据本发明使用0.5-50μm的氟草敏浓度进行转化体的选择。可在液体培养基中或通过向营养培养基板中加入除草剂进行选择。

通过使用突变的PDS作为用于真核生物特别是藻类如雨生红球藻的转化的第一显性选择标记，本发明为真核生物特别是藻类如雨生红球藻的生物技术学利用提供了重要的贡献。例如，可在将编码序列插入或不插入MCS的情况下使用本发明的载体以影响或改变类胡萝卜素在转化体中的生物合成。

本发明还涉及使用本发明的载体转化真核细胞的方法。此类转化方法对于本领域技术人员来说是熟知的。它们包括例如PEG、玻璃珠的使用、电穿孔和微粒轰击。根据本发明其中通过微粒轰击进行转化的方法是特别优选的。在此优选的实施方案是使用之前用本发明的载体DNA包被的大小为0.4至1.7μm的钨或金颗粒在500至2500psi的压力下和真空中进行的微粒轰击。在转化后，优选在黑暗中在振荡过夜的情况下在OHA液体培养基(2.42g Tris/醋酸盐pH 6.8)中再生细胞。然后在选择压下将细胞涂板在具有0.7％的OHA琼脂糖的OHA板上。在等长的光照(15-25μE^*m^-2*s^-1)和黑暗间隔(在各情况下6至12小时)的光照-黑暗-交替下在3至4周后可观察到转化体。转化效率是大约1*10^-4至10*10^-8个细胞/μg DNA，优选1*10^-6个细胞/μg DNA。

本发明另外地包括在用本发明的DNA载体转化后的转基因植物细胞和其后代，所述转基因植物细胞和其后代的特征在于其表征了导入的DNA进入细胞核基因组的整合。在此展示单个或多个导入的DNA进入细胞核基因组的整合的转基因植物细胞和其后代是优选的。特别优选的是其中导入的基因组成型表达的转基因植物细胞和其后代。

SEQ ID NO：1：编码雨生红球藻八氢番茄红素去饱和酶蛋白的pds基因的核酸序列

SEQ ID NO：2：雨生红球藻八氢番茄红素去饱和酶的蛋白质序列

SEQ ID NO：3：具有Leu504Arg氨基酸置换的八氢番茄红素去饱和酶的蛋白质序列

SEQ ID NO：4：本发明的载体Plat-pdsMod4.1的MCS的核酸序列

SEQ ID NO：5：优选DNA载体Plat-pdsMOD4.1的核酸序列

SEQ ID NO：6：包含肌动蛋白启动子(SmaI片段)的核酸序列。核酸序列包含具有内含子、外显子和标示(-)的启动子序列的编码区。

SEQ ID NO：7：包含rbsc启动子(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基)的核酸序列(PstI片段)。核酸序列包含具有外显子、内含子和标示的启动子序列的编码区。

图1：香叶基-香叶基焦磷酸至变胞藻黄素的类胡萝卜素生物合成途径。

图2：来自聚球藻和雨生红球藻的具有已知的突变和针对氟草敏的抗性因子(RF)的八氢番茄红素去饱和酶比较。

图3：来自雨生红球藻和聚球藻的PDS蛋白的氨基酸序列比对。标示了赋予针对氟草敏的抗性的氨基酸置换的优选位点。

图4：载体Plat-pdsMod4.1的质粒图谱；MCS(多克隆位点)、ori(复制起始区)。

图5：在用XbaI和XhoI降解后，然后用八氢番茄红素去饱和酶探针检测后，基因组DNA的Southern印迹。标记(M)以千碱基(kb)表示。

图6：(A)置于连续强光压迫(120μE*m^-2*s^-1)下的三个WT品系(WT0、18和36小时)和转化体P1-P13的Northern印迹分析。(B)使用抗八氢番茄红素去饱和酶蛋白的抗体进行的Western印迹。条带以经折算为55kDa的高度迁移。八氢番茄红素去饱和酶mRNA(pds)，类胡萝卜素羟化酶mRNA(hyd)，八氢番茄红素去饱和酶蛋白(PDS)。

图7：非光化学猝灭(NPQ)的说明。NPQ＝(F°_m-F′_m)/F′_m。F°_m是在饱和光脉冲后适应暗光的生物的最大荧光。F′_m是在以20秒的确定间隔的饱和光脉冲后的最大荧光。

图8：在不加入除草剂的情况下，在连续光照(175μEm^-2s^-1)下酮基类胡萝卜素、变胞藻黄素在WT雨生红球藻和两个转化体(P3，P13)中的积累的描述。干重(DW)，以小时(h)表示的时间。

图9：用于在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基(rbcS2)的启动子控制下的羟化酶基因(hyd)的组成型表达的转化载体。

实施例：

用于转化雨生红球藻的转化载体的制备

从雨生红球藻的基因组DNA文库分离大小为6.1千碱基的八氢番茄红素去饱和酶的部分，然后通过限制性切割位点XbaI和XhoI将其亚克隆入pBluescriptSK载体(Stratagene)的多克隆位点(MCS)。使用引物PDS-Qmut-plu2 CCA AGC AGA AGT ACC GCG CCT CCA TGG AGG G和PDS-Qmut-min2 CCC TCC ATG GAG GCG CGG TAC TTC TGC TTG G通过定向突变进行从CTG至CGC的核苷酸置换；质粒称为pPDS-Q2。该核苷酸置换导致密码子504中从亮氨酸至精氨酸的氨基酸置换(图2)，并赋予突变体对氟草敏的抗性。

始于质粒pPDS-Q2，用特定的引物通过PCR消除末端限制性切割位点XbaI和XhoI，并且导入两个新的EcoRV切割位点。通过这些限制性切割位点，将突变的八氢番茄红素去饱和酶基因亚克隆入pBluescriptSK载体的NaeI切割位点。从而使载体的多克隆位点(SEQID NO：4)对于其他克隆是自由的。所制备的转化平台称为Plat-pdsMod4.1(图4)。

使用转化载体Plat-pdsMod4.1对雨生红球藻进行的转化

将雨生红球藻细胞在标准条件(12小时光照(20μE*m^-2*s^-1)和12小时黑暗的光照-黑暗-交替)下在液体培养基中培养4天直至3.5*10⁵个细胞/ml的细胞密度(Kobayashi，Kakizono等人，1991)。在16℃和4000×g下对细胞离心5分钟，然后重悬浮，在各情况下将1*10⁸个细胞涂板在尼龙滤器上(Roche)。将滤器转移至OHM培养基板(Fabregas，Dominguez等人，2000)然后进行干燥直至进行转化。按照用Klein和其合作者的方案(Klein，Wolf等人，1987)用2μg Plat-pdsMod4.1载体DNA包被大小为0.4-1.7μm的钨颗粒。使用购自Bio-Rad公司的基因枪PDS-1000/He在1350psi的压力下和25mmHg的真空下进行转化。或者，保持标准设置。

转化后，在黑暗中轻轻振荡过夜的条件下在OHA液体培养基(2.42g Tris/醋酸盐PH 6.8)在尼龙滤器上再生细胞。此后，短暂离心细胞，然后将其与0.7％OHA顶层琼脂糖一起涂板在10至20块OHA板(5μM氟草敏)上。在12小时光照(20μE*m^-2*s^-1)和12小时黑暗的光照-黑暗交替下在3至4周的生长期后观察第一转化体。转化效率是大约1*10^-6个细胞/μg DNA。

用载体Plat-pdsMod4.1转化的细胞的分子分析

将阳性转化体重复接种在具有0.7μM的氟草敏浓度的OHA板上。在这些浓度上，WT细胞的生长受到极大抑制。为了使转化体经历通过Southern、Northern和Western印迹分析进行的分子分析，将转化体培养在具有3μM的氟草敏浓度的液体培养基中。

Southern印迹分析，转化质粒在雨生红球藻的基因组中的整合的验证

在液体培养基中在3μM的氟草敏浓度下在标准条件下培养4天后，通过离心分离细胞，然后从不同的转化体和几个WT对照分离基因组DNA。用限制性酶XbaI和XhoI降解获得的基因组DNA，然后在0.8％强度的琼脂糖凝胶进行分离。使用标准方法印迹DNA，然后用PDS的探针对其进行杂交(图5)。

Southern印迹在所有转化体和WT中清楚地显示大约5.9kb的内源八氢番茄红素去饱和酶。在所有情况下额外整合的突变的八氢番茄红素去饱和酶在内源八氢番茄红素去饱和酶的上方迁移。根据其他生物例如真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)已知载体通常以串联重复的形式整合入基因组(Cogoni和Macino 1997)。该现象解释了转化体P6、7、11和P13中的非常显著的条带。也用转化载体Plat-pdsMod4.1的抗氨苄西林盒的探针额外地对基因组DNA杂交。在这些条件下，在除了转化体P3外的所有情况下可见几条明显的条带。

转化体P1-P13的Northern和Western印迹分析

在液体培养基中在3μM的氟草敏浓度下在标准条件下培养4天后，通过离心分离细胞，然后从各种转化体和多个WT对照分离RNA。为了进一步分析转化体的转录模式，在1％的变性琼脂糖凝胶上分离RNA样品，将其印迹，然后用八氢番茄红素去饱和酶mRNA(pds)和类胡萝卜素羟化酶mRNA(hyd)的探针对其进行杂交(图6A)。将羟化酶用作内标准用于能够说明转化体的压力状态。在压力条件例如由光照或盐引起的压力下诱导羟化酶，否则其在检测极限之下(Steinbrenner和Linden 2001；Steinbrenner和Linden 2003)。

为获得蛋白质样品，同样在标准条件下培养4天后收获细胞，然后在12.5％的SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。使用特异性抗体检测八氢番茄红素去饱和酶蛋白(Grunewald，Eckert等人，2000)。

已置于连续强光条件(120μE*m^-2*s^-1)下的WT细胞显示对于八氢番茄红素去饱和酶(pds)在诱导时间点(第0小时)上的pds基因的基础表达。在18小时的过程中该信号增加。在这些诱导条件下类胡萝卜素羟化酶的行为是足够的，但转录有些延迟。

在标准条件下在第0小时，转化体P1、P2、P5和P6的八氢番茄红素去饱和酶mRNA的表达模式与WT的基础表达相当。转化体P8、P9和P10的表达水平比第0小时的WT的基础表达水平低一些。在两个进一步的独立的Northern印迹分析中，转化体P8、P9和P10的表达相应于第0小时的WT的基础表达。此处，转化体P3、P4、P7、P11、P12和P13在此显示与在第0和第18小时之间的连续强光对照相比提高的转录水平；在两个进一步的独立Northern印迹分析中同样观察到该现象。在该情况下，增加不能归因于压力产生的诱导，但可归因于转化载体Plat-pdsMod4.1在雨生红球藻的基因组中的多重整合。作为压力对照的类胡萝卜素羟化酶的表达在这些标准条件下未显示增加的转录水平。

在使用抗PDS的抗体的Western印迹中，蛋白质的量均匀地增加至第36-小时-值(图6B)。

所有转化体的蛋白质的量稍微高于WT对照的第0小时的值。转化体P3、P5、P7、P11和P13的蛋白质的量对比其他水平再度增加并且可与在连续强光条件下的WT的18-小时-值的蛋白质的量相当。也可在转化体P3、P7、P11和P13的蛋白质水平上观察到八氢番茄红素去饱和酶的更高的转录水平。

Plat-pdsMod4.1转化体的生理学研究

Plat-pdsMod4.1转化体的非光化学猝灭(NPQ)的确定

过去已对一些具有改变的类胡萝卜素生物合成的高等植物进行了较详细的研究。因此，已用来自噬夏孢欧文菌的八氢番茄红素去饱和酶基因crtl转化烟草(Misawa，Yamano等人，1993)。在所得的转化体中的一个转化体(称为ET4-208)中，确定到针对氟草敏的较高的抗性。稍后也检测到与未转化的对照相比，转基因crtl植物中的改变的类胡萝卜素组成(Misawa，Masamoto等人，1994)。

研究转基因植物中的类胡萝卜素组成的变化的可能性是测量叶绿素荧光。首先，这是筛选光合突变体的非常快速的方法；第二，叶黄素含量的改变反映在叶绿素荧光上(Niyogi，Bjorkman等人，1997)。

在标准条件下在不含氟草敏的OHA板上培养各种转化体3至4周。在测量之前，将板经历黑暗适应24小时。使用PAM荧光计(Walz，Germany)，测量所有转化体的叶绿素荧光，然后通过下式：NPQ＝(F°_m-F′_m)/F′_m计算NPQ。

F°_m是在饱和光脉冲后适应黑暗的生物的最大荧光。F′_m是在以确定的间隔饱和光脉冲后的最大荧光；在我们的情况下，间隔是20秒。Kate Maxwell和Giles N.Johnson撰写了关于该主题的优秀综述论文(Maxwell和Johnson 2000)。

所有被测量的转化体，除了P3和P13外，显示与野生型(WT)相似的荧光曲线和NPQ曲线。转化体P3和P13的NPQ在整个测量过程中比在WT的情况下高大约50％(图7)。

在不加除草剂的情况下WT雨生红球藻和三种转化体中的着色的类胡萝卜素的分布比较

在不加除草剂的液体培养基中在标准条件下培养转化体4天，然后通过离心分离细胞并将沉淀冷冻干燥。确定沉淀的干重，在加入甲醇情况下在研钵中捣碎细胞。使用光度计测量叶绿素，然后通过加入6％的KOH进行皂化。在石油醚/醚(沸点35℃-60℃)(9∶1v/v)中溶解类胡萝卜素，蒸发浓缩并在100％的丙酮中吸收。然后通过HPLC柱分离样品。

	雨生红球藻WT	转化体P1	转化体P3	转化体P13
	雨生红球藻WT	转化体P1	转化体P3	转化体P13	新黄质	9.6	9.6	12.9	8.9
堇菜黄质	8.6	8.3	11.7	11.23	新黄质	9.6	9.6	12.9	8.9
堇菜黄质	8.6	8.3	11.7	11.23	叶黄质	65.3	62.9	65.8	64
β-胡萝卜素	16.6	19	9.6	15.7	叶黄质	65.3	62.9	65.8	64

表1：雨生红球藻WT和八氢番茄红素去饱和酶转化体P1、P3和P13的总的色素提取物的HPLC分析。总类胡萝卜素的类胡萝卜素的百分数分布。

如可从表1容易地看到的，WT和转化体P1中的个体类胡萝卜素的百分数分布非常相似。在比较中，转化体P3和P13中类胡萝卜素的组成已发生显著的改变。在P3中，叶黄素类(Xanthophylle)增加大约6％而β-胡萝卜素含量与WT相比减少了相同的值。在转化体P13中，堇菜黄质含量增加大约3％。在标准条件下不能测量直接参与NPQ过程的玉米黄质。对此需要已经历强光压力的细胞的HPLC测量。然而，转化体P3和P13的大约3％的堇菜黄质含量的增加仍然允许与这些转化体的增加的NPQ直接偶联，因为在强光条件下堇菜黄质库转变成玉米黄质。

雨生红球藻转化体P3、P13和WT在弱光条件下的类胡萝卜素组成

已知烟草中来自噬夏孢欧文菌的pds基因的异源表达改变了叶中的类胡萝卜素组成(Misawa等人，(1994))。抗氟草敏的聚球藻突变体的分析证实了八氢番茄红素去饱和是蓝细菌中类胡萝卜素的生物合成的限速步骤(Chamovitz等人，(1993))。为证实这些结果，在弱光照条件下培养P3、P13和WT雨生红球藻转化体，然后萃取所有类胡萝卜素。与干重相比，没有一个研究的转化体显示改变的类胡萝卜素的量。随后的转化体P3、P13和WT中类胡萝卜素组成的HPLC分析显示，对于转化体P3，叶黄素堇菜黄质的量略有增加，然而叶黄质和新黄质(Luthein)的量略有减少。

在连续强光照下、在不加入除草剂的情况下WT雨生红球藻和转化体P3和P13中酮基类胡萝卜素变胞藻黄素的积累的比较

为进行强光实验，将雨生红球藻细胞在标准条件下培养4天。在该时期后，将光照强度从20μEm^-2s^-1增加至175μEm^-2s^-1，和将光照/黑暗节律增加至24小时的连续光照。在诱导后的某些时间点(第0、6、12、24、48、72小时)上，收集样品并离心。

依照Boussiba等人，(1992)描述的方法进行类胡萝卜素的萃取。通过该方式确定冷冻干燥的细胞的干重(TG)，再次将材料在加入海沙、30％甲醇和5％KOH的研钵中捣碎。在70℃下皂化叶绿素10分钟后，以4000转每分离心样品5分钟，然后弃去含有叶绿素的上清液。将沉淀在100％DMSO(二甲基亚砜)中吸收和在70℃下加热10分钟。重复该萃取步骤直至沉淀失去其淡红色。变胞藻黄素和其酯在492nm具有其主吸收的最大值。然而，放弃在该波长的测量，因为总类胡萝卜素(主要为β-胡萝卜素、叶黄质和堇菜黄质)也在该波长范围内显示吸收。借助于变胞藻黄素标准(Sigma，在100％DMSO中)确定了允许在其中不再显示总类胡萝卜素的波长范围(550nm)内确定变胞藻黄素含量的折算因子。因此，只在492nm(A₄₉₂)的波长处和随后在550nm(A₅₅₀)的波长处测量变胞藻黄素标准。然后将在550nm测量吸收值乘以系数A₄₉₂/A₅₅₀＝3.2，使用Davies(1976)的公式利用变胞藻黄素吸光系数(E1％/1cm＝2220)计算变胞藻黄素含量。

在改变光照条件6小时后，仍然未被检测到变胞藻黄素(图8)。在暴露于强光8小时后，转化体P3显示了可见的红色表型，而WT和其他转化体仍保持绿色。在12小时的诱导后，WT和转化体P13中形成的变胞藻黄素的量达到1.47mg/g TG和1.32mg/g TG；相反地，转化体P3已达到的值为2.37mg/g TG。在24小时后，测量的WT和转化体P13的变胞藻黄素的量分别是3.48mg/g TG和3.79mg/g TG。在该时间点上，转化体P3以6.22mg/g TG的变胞藻黄素的量相对于野生型显示大约40％的增加。在连续强光下48小时后，WT和P13转化体分别显示8.6±1.4mg/g TG和8.4±1.6mg/g TG的值。在48小时后对于转化体P3确定了与WT或P3相比增加26％的变胞藻黄素的积累(11.4±0.9mg/g TG)。在连续光照压力后72小时，WT和P13转化体分别显示10.5mg/g TG和10.1mg/g TG的量，在此转化体P3以12.1mg/gTG的值显示了高出14％的变胞藻黄素的积累。

因此，在连续强光下，转化体P3与转化体P13和WT相比在其变胞藻黄素的积累方面具有很大的差异。在连续光照实验中，与WT相比P3在24小时后显示变胞藻黄素的量增加大约40％。在48小时后该差异下降至26％，在72小时后达到14％的值。

结果证明雨生红球藻中的八氢番茄红素去饱和步骤在强光条件下是限速步骤，但在弱光照条件下不是限速步骤。

通过使用在组成型启动子的控制之下的胡萝卜素酮酶增加变胞藻黄素生物合成

载体的构建和转化

通过使用转化平台Plat-pdsMod4.1制备具有肌动蛋白基因或二磷酸核酮糖羧化酶的启动子、之后是各种限制性内切核酸酶的克隆位点的转化质粒；从基因组DNA文库分离这两种启动子。这些平台还包含各自基因的3′-非翻译区，该非翻译区也充当导入的cDNA的多腺苷酸化信号。通过PCR扩增类胡萝卜素羟化酶和β-胡萝卜素酮酶的cDNA并为其提供末端限制性切割位点。这使得可能将这些cDNA按读框导入转化平台。也为这两个类胡萝卜素生物合成基因的基因组DNA制备所述构建体。图9显示用于在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基启动子的控制之下的羟化酶基因的组成型表达的转化载体。

在肌动蛋白启动子的控制下以不同的翻译起始克隆cDNA和羟化酶基因组序列的三个构建体和在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子的控制下各克隆一个构建体，然后转化入雨生红球藻。通过将氟草敏浓度从5μM减少至3μM来降低选择压。经此还应获得一方面具有对氟草敏更低抗性，另一方面其生长机会因为代谢平衡向玉米黄质或角黄素推移而降低的转化体。该平衡的推移可能意味着，例如，减少的叶黄质的形成，所述叶黄质于类囊体膜中对天线复合物(Antennenkomplexen)的聚集起着重要作用。叶绿素的形成或生育酚的形成，也可能受到该推移的影响，因为这些物质同样从非常早期的类异戊二烯生物合成中离去。

转化体的选择

在转化后，将获得的集落转移至具有氟草敏的其他培养基板。此后，将各个构建体的15个转化体在非常低的选择压下转移入液体培养基。

在进一步的生长期后，该生长期中没有一个转移的转化体显示角黄素或玉米黄质的明显的类胡萝卜素积累，将细胞置于强光(120μE*m^-2*s^-1)下24小时。

在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(Plat-rbcS2gHyd)和第二肌动蛋白启动子(Plat-ActPII-gHyd)(第二翻译始于一个内含子)的控制下的基因组DNA的羟化酶构建体转化的转化体与其他羟化酶构建体的转化体相比没有显示赤褐色着色的细胞。

在酮酶构建体转化体的情况下，将在第二肌动蛋白启动子(Plat-ActPIIgBkt和Plat-ActPIIcBkt)(第二翻译始于内含子)控制下用cDNA和酮酶基因转化的转化体进行进一步的研究。

羟化酶构建体的Southern印迹和Northern印迹分析

在各情况下在15个筛选前的转化体中选择10个并进一步培养用于分子生物学研究。在已分离个体转化体的基因组DNA后，将它们经历限制性内切酶降解，然后在琼脂糖凝胶上分离，进行印迹和用针对羟化酶的探针杂交。在第二肌动蛋白启动子(Plat-ActPII-gHyd)的控制之下的10个转化体中，两个转化体明确地显示基因组中存在额外的羟化酶拷贝。在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(Plat-rbcS2gHyd)的控制之下的10个转化体中，6个在基因组中具有额外拷贝是阳性的。为了有利于处于不利生长的转化体而在选择板上减少氟草敏浓度明显地对选择具有负效应。

提取剩余转化体的RNA，然后在变性琼脂糖凝胶上进行分离，将其进行印迹和用针对羟化酶mRNA的探针进行杂交。转化体中的二个显示增加的羟化酶mRNA的转录水平。使用针对类胡萝卜素生物合成基因β-番茄红素环化酶和八氢番茄红素合酶的其他探针的对照实验在这两个转化体中也显示增加的转录水平。

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序列表

<110>Peter und Traudl Engelhorn-Stiftung zur Foerderung derBiotechnologie

<120>真核细胞中变胞藻黄素的生物合成

<130>34309P DE

<140>10 2005 049 072.7

<141>2005-10-13

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>6149

<212>DNA

<213>雨生红球藻

<220>

<223>pds-Gen

<400>1

atcggtgagg ggttcaagtg ccagctcagt caaacatcgt gcattcagga ggcacagtta 60

gaggcgtggt tgcagacgta ggtgagcagt tgggtgctgc tgctgctgtg atctgataca 120

tgttgaaaac tgagcggaat ggccatgtat tgttgtttga ttactcatgg ccatgcactg 180

agcatgcagc aagccatacc catccaggag ttgtcttcac ttcctttccc gcgcttgctt 240

gctttcatcc gctttctttc catatgctgt gttgtgatcc ctccctcccc tcctccctcc 300

ttaccctgcc ccacccctgg tggtgtgtgg ccaggtggct gtgacgcact gcctgctgag 360

cgctgacctg gtgagcatga gcgccaggct gggccgagct gcctgggtgg ccaccactcg 420

gctgtatgct gctcagcaag aggtggcagg ccaggcccat gtggcagcca tgcacctggt 480

ggcaatcggg gatagggctg cggcagaagc agtgtacagg tgggcgcggg caggagcagg 540

gacaggggct atagggtccc cggccaggtc taccctgact gctggggtta aggctagggc 600

tagggctagg gctagggcta gggctagggc tagggctagg gctagggcta gggctagggc 660

tagggctagg gctagggcta gggctagggc tagggctagg gctagggcta gggctaagga 720

caaggggtgg gggcgaaggg tgggggtttg cagcagccag ggtcagccct gggccaacag 780

tagctactgc acatccccac aatctcctac aggcagcaca ggctaacgtg cgcggactgc 840

atcaccgggt acacagttga tgacatctta tcgaagcatc tcaccacacg acacatcaca 900

attagttgca agggttcctg tcggtgttga ggtttgagtt ggtctgtatg caggggcctg 960

atggaaaaac tgtagtagct gagtgagatt acccacagcc aagcatgttg ttccatgttg 1020

aacaggtttt gtttggtctg atggaaaaac tgttgaaatg cttcctgtca tcgttccgct 1080

gtacgccatt gtacgccgtt gactgatgga ctgattgttt gactgatgga agaactgtgt 1140

agacctcagc cccctcagca cattagcata tctcgacaca tcagccatgc gcacaccgag 1200

ttcgccttgt catgcgcagc caccctgtag aatgaagtca cgtaagtagt ggctgccgcg 1260

aggtcgcctt ggtattgtct ctggcttgat atagcgctga ctgacgggtg gtgacggtgc 1320

tcgtgcgcta tagatgccac tagaggcccg cccacctcgc gcctgagccg caaaacccgg 1380

cggggtcgtc acgatgaggg catcttacct cgacgatgta ccgaccccgg gagctgtccc 1440

gctggactgg cggatcgcgg ctgcccaact tgggcactga gcgttggctg tggatcaaca 1500

tcattggcgc cgatgtcagc ctgggccagc aggtgcagcg gctgaccggc tatggaccgg 1560

ctatggaccg gctacgatag cggatgcagc gttcctccgc atgcagagat gcactggacc 1620

agtaccggag acggcgccag cgggatacac ggattagtgc gcctgaactg cggtgtgccc 1680

catgaatgac catgccagcc ccaaggggcg gcattgaagc ggccctagag agctagtggc 1740

aaggcagcac tagacaactt atgagctaag gtcagggagc tatgaggctg caagattagg 1800

ggcctgattt gagttgttca gtcgcacgtc ttcacgacgt tacggctgcc atcttaccca 1860

gtcggctaaa gcaggccacc accattggcg tcacgcgtga tcgtcttgaa atgacagcta 1920

gtccaaacac caggctcagc tcgtatggtt tggcgagggc gtttcgtcgg ttgaacgacg 1980

tgcctttaat gaaaattcgt ggccatacct tcatcgcttg agccaaccat ccagcatcaa 2040

ctctgacaat gcagacagca atgcgtggcc aagccagcgg ttcaggatgc acttccagca 2100

ggcaagctcg cggtcattgg tcaaggcgct ctgtgcgtga gcgaggtgct ctcagggtgg 2160

ttgccaagga ctaccccacg ccggatttcc aatcatcgga cacataccag gaggccctgt 2220

ccctgtcgac caagctgcga aatacacccc ggcccgccaa gcctttgcgc gttgtcattg 2280

ctggggccgg cctggcaggc ctctcggctg caaaatacct ggcagatgca gggcaccacc 2340

cagttgtgct ggagggccgc gacgtgctag gcggcaaggt aaggacttgc gagtgtcgaa 2400

tgccacgccg gcccgttcca aacgcccaca agctgtccgg ccacctcaca aactcattgg 2460

cgcacaggtg gccgcgtgga aggacgagga cggtgattgg tacgagactg gccttcacat 2520

tttctttggt gcttacccca acatccagaa cctgttcaaa gagttgggca tccaagacag 2580

gtaggaggtg cacccagtag tgtcaacgca ttgcctagca agcgcctcag tcaacaagac 2640

caccatgagc actgttcttg atgtgggcat gtgcctgcct tgcaggctgc agtggaagga 2700

gcattccatg atctttgcca tgccagacgc ccctggggag ttttctcgct ttgacttccc 2760

tgagctgcct gcgccctgga acggcatcat cgccatcttg cggaacaacc agatgctcag 2820

ctggcctgag aagatccggt ttgccatcgg cctgctgcct gctatcatct ttgggcagcg 2880

ctactgtgaa gagcaggacg agctgaccgt gacagagtgg atgcgcaagc agggtgtgcc 2940

agaccgagtc aatgaggaag tgttcatcgc catggccaag gccttgaact tcatcaaccc 3000

tgacgaccta tccatgacag tggtgctcac agcactgaac cgcttcctgc aggcaagtgt 3060

tgggcctagg cagtcagggg tcaggggcct gcagggccag cttgcatctg cccgaccttc 3120

agggccgccg cctccctcac aaagcatgca ccctccacaa cccgcctgtc tgtctgccca 3180

acaccagctt atggtccaaa tccaccacaa ccgcctctca ccctcctgcc cctgctttca 3240

gcctgagcac tgcagtcctg tcaccagcaa atgtgtggcg gctgcacttc ttgtccctgc 3300

cgccaatcgc tttcagtgtg gcctggccag cttgtgacag tggctagagc tccaagctct 3360

gcaaagactg agacaagctg tggtttgcat tgcctgggct gcaggagcag catggcagca 3420

agatggcttt cttggatggc gccccacctg agcgcctctg tcagccaatg gtggactact 3480

tcaaggcacg aggcggcgac ctcatgttca actcccgggt caagcagatt gtgttgaatg 3540

tgaggtccct ggctctcagc ctcgccgcct cctgcagacg ctgcatgcca tgtgcagtat 3600

caccatgcca cacacgtcgg catcagctgc aggcctagct ctcgcgccgc agtcacagtt 3660

gaacccaaca catgtgcaag tcatcaccct gtgcagcagg caggggcagg ctgggtgcct 3720

gggcctgtca tccactgcag ccacagtctt gagtggaggg tacagtcatt aactctgccc 3780

atgaggtgtc agagtctttc atgggtgcta tatggtcgct cttggcgtgc aggacgacaa 3840

gagtgtcaag cacctggccc tcaccaatgg tcagacagtt gagggcgacc tctacatctc 3900

agccatgcca ggtgtgtgcc tatggtgcag ctgggctgtg tgcccctaag cagccacaca 3960

agcactggat gccatcaccc attgctgcat gacataggca caaggatgat agccaacgac 4020

atggatgagg cacctgggca cagaggcaca cgttgtggcc tgcacagcct gagtcatgaa 4080

ttgagggggg agagccaggt aggctgtaat tgtggcactg acctccacaa aaccataaca 4140

caccagattg actgagtcca gttaggcttg ggggcttccc ttcagtttgt tcagaaccag 4200

gatgcttggc tnctccctac catgcgctga catgtgtgct tgcattgatg tggtctcgca 4260

gtggacatca tgaagatcct catgcctgac ccctgggcct ccatgcccta cttcaagcag 4320

ctgaacggcc tggagggggt gcctgtgatc aacatccaca tctggttcga tcgcaagctg 4380

actacggtgg accacctgtt gttcagtcgg tcaccgctgc tgtctgtgta cgctgacatg 4440

agcaccacgt gcaaggagta tgctgacgac aagaagagca tgcttgagct ggtgtttgcg 4500

ccggccaagg agtggattgg ccggcctgac gaggagatca tcgcagccac catgacagag 4560

ctggagcggc tgttcccgac agaggtcagg gctgaccagt ccatggccaa ggtaggcggg 4620

tcaggcacca gccagcactg ccaggcctgc aggttaagag gcttgtgagg ggtgcagctc 4680

tgggcagata gcagctacag ccagctaacg gtgccggggt tgtgagtgaa tggcgcccac 4740

tgcctgaagc accaccctgc tcagcttgct ctgctgtgcc agcattggct gcctgctgtc 4800

gaagtacttg tggtgatggg tgatggtggc atgatgtgca gatcttgaag tacaaggtgg 4860

tgaagactcc attgtctgtg tacaagtcca ctgctgggcg ggagaagttc aggtgagcct 4920

cgcgacagcc gacagtggaa tgcactgcag cccttgtggc tgcctgactg gctttcttgt 4980

cagccgctct ctcgtgacca taactgatgc tgccgtacct tatctgctgc tgctgctgtc 5040

atgctggtgc taatggtggt gccccggtgc tgctgctgct gtgctgcaga cccactcagc 5100

gctccccaat ctccaacttc taccttgcgg gtgattacac caagcagaag tacctgctcc 5160

atggagggtg cagtgttctc cggcaagctg gtcaccgaag ccattgtaga ggactggagc 5220

gctcggggtg tgaccagcag cgctgccagc cgccagcctg ccctggctgc agccggtgtg 5280

gtggcagggt cggctgcagt gattggggcg gcgttggttg cagccagtgg tgcaatagcc 5340

ggtgggatgt aagtgatgaa agaatggcac ctggtagatg aggcagcatt tatagaaatg 5400

gcagcaccct cgctgcctaa tgcttgtggt gtatactatt gacctcggga gttgaggccc 5460

gcagccattg tgtggctatc gcatggggtg gtgcatcgct gctcaatgcc gacaacattg 5520

ggatggccta gaacttattg ctaggtagtg tgacctggac aagagattgg gtatgggtct 5580

ggtgaggaag ggcaggcact atgggcgagc attctgagag gttgggcagg cgtgctgtag 5640

tcctgcgatg agttggagtg tctaaacggc agtaacggat atggggtcac acggtttaca 5700

cgaacattgc tgaaatcgag gatcatcacg aagcgtgcaa gaaacgtcat gcaacatgca 5760

aacaagccaa aattcaaacg atggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag 5820

gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg 5880

ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 5940

gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg 6000

ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 6060

cggccagtga attgtaatac gactcactat agggcgaatt gggtaccggg ccccccctcg 6120

aggtcgacgg tatcgataag cttgatatc 6149

<210>2

<211>570

<212>PRT

<213>雨生红球藻

<220>

<223>八氢番茄红素去饱和酶

<400>2

Met Gln Thr Thr Met Arg Gly Gln Ala Ser Gly Ser Gly Cys Thr Ser

1 5 10 15

Gly Arg Gln Ala Arg Gly His Trp Ser Arg Arg Ser Val Arg Glu Arg

20 25 30

Gly Ala Leu Arg Val Val Ala Lys Asp Tyr Pro Thr Pro Asp Phe Gln

35 40 45

Ser Ser Asp Thr Tyr Gln Glu Ala Leu Ser Leu Ser Thr Lys Leu Arg

50 55 60

Asn Ala Pro Arg Pro Ala Lys Pro Leu Arg Val Val Ile Ala Gly Ala

65 70 75 80

Gly Leu Ala Gly Leu Ser Ala Ala Lys Tyr Leu Ala Asp Ala Gly His

85 90 95

His Pro Val Val Leu Glu Gly Arg Asp Val Leu Gly Gly Lys Val Ala

100 105 110

Ala Trp Lys Asp Glu Asp Gly Asp Trp Tyr Glu Thr Gly Leu HisIle

115 120 125

Phe Phe Gly Ala Tyr Pro Asn Ile Gln Asn Leu Phe Lys Glu Leu Gly

130 135 140

Ile Gln Asp Arg Leu Gln Trp Lys Glu His Ser Met Ile Phe Ala Met

145 150 155 160

Pro Asp Ala Pro Gly Glu Phe Ser Arg Phe Asp Phe Pro Glu Leu Pro

165 170 175

Ala Pro Trp Asn Gly Ile Ile Ala Ile Leu Arg Asn Asn Gln Met Leu

180 185 190

Ser Trp Pro Glu Lys Ile Arg Phe Arg Ile Gly Leu Leu Pro Ala Ile

195 200 205

Ile Phe Gly Gln Arg Tyr Cys Glu Glu Gln Asp Glu Leu Thr Val Thr

210 215 220

Glu Trp Met Arg Lys Gln Gly Val Pro Asp Arg Val Asn Glu Glu Val

225 230 235 240

Phe Ile Ala Met Ala Lys Ala Leu Asn Phe Ile Asn Pro Asp Asp Leu

245 250 255

Ser Met Thr Val Val Leu Thr Ala Leu Asn Arg Phe Leu Gln Glu Gln

260 265 270

His Gly Ser Lys Met Ala Phe Leu Asp Gly Ala Pro Pro Glu Arg Leu

275 280 285

Cys Gln Pro Met Val Asp Tyr Phe Lys Ala Arg Gly Gly Asp Leu Met

290 295 300

Phe Asn Ser Arg Val Lys Gln Ile Val Leu Asn Asp Asp Lys Ser Val

305 310 315 320

Lys His Leu Ala Leu Thr Asn Gly Gln Thr Val Glu Gly Asp Leu Tyr

325 330 335

Ile Ser Ala Met Pro Val Asp Ile Met Lys Ile Leu Met Pro Asp Pro

340 345 350

Trp Ala Ser Met Pro Tyr Phe Lys Gln Leu Asn Gly Leu Glu Gly Val

355 360 365

Pro Val Ile Asn Ile His Ile Trp Phe Asp Arg Lys Leu Thr Thr Val

370 375 380

Asp His Leu Leu Phe Ser Arg Ser ProLeu Leu Ser Val Tyr Ala Asp

385 390 395 400

Met Ser Thr Thr Ser Lys Glu Tyr Arg Asp Asp Lys Lys Ser Met Leu

405 410 415

Glu Leu Val Phe Ala Pro Ala Lys Glu Trp Ile Gly Arg Pro Asp Glu

420 425 430

Glu Ile Ile Ala Ala Thr Met Thr Glu Leu Glu Arg Leu Phe Pro Thr

435 440 445

Glu Val Arg Ala Asp Gln Ser Met Ala Lys Ile Leu Lys Tyr Lys Val

450 455 460

Val Lys Thr Pro Leu Ser Val Tyr Lys Ser Thr Ala Gly Arg Glu Lys

465 470 475 480

Phe Arg Pro Thr Gln Arg Ser Pro Ile Ser Asn Phe Tyr Leu Ala Gly

485 490 495

Asp Tyr Thr Lys Gln Lys Tyr Leu Ala Ser Met Glu Gly Ala Val Phe

500 505 510

Ser Gly Lys Leu Val Thr Glu Ala Ile Val Glu Asp Trp Ser Ala Arg

515 520 525

Gly Val Thr Ser Ser Ala Ala Ser Arg Gln Pro Ala Leu Ala Ala Ala

530 535 540

Gly Val Val Gly Arg Val Gly Ser Ser Asp Trp Ala Arg Trp Leu Gln

545 550 555 560

Pro Val Gly Ala Ile Ala Gly Gly Cys Lys

565 570

<210>3

<211>569

<212>PRT

<213>雨生红球藻

<220>

<223>具有Leu504Arg置换的八氢番茄红素去饱和酶蛋白序列

<400>3

Met Gln Thr Thr Met Arg Gly Gln Ala Ser Gly Ser Gly Cys Thr Ser

1 5 10 15

Gly Arg Gln Ala Arg Gly His Trp Ser Arg Arg Ser Val Arg Glu Arg

20 25 30

Gly Ala Leu Arg Val Val Ala Lys Asp Tyr Pro Thr Pro Asp Phe Gln

35 40 45

Ser Ser Asp Thr Tyr Gln Glu Ala Leu Ser Leu Ser Thr Lys Leu Arg

50 55 60

Asn Ala Pro Arg Pro Ala Lys Pro Leu Arg Val Val Ile Ala Gly Ala

65 70 75 80

Gly Leu Ala Gly Leu Ser Ala Ala Lys Tyr Leu Ala Asp Ala Gly His

85 90 95

His Pro Val Val Leu Glu Gly Arg Asp Val Leu Gly Gly Lys Val Ala

100 105 110

Ala Trp Lys Asp Glu Asp Gly Asp Trp Tyr Glu Thr Gly Leu His Ile

115 120 125

Phe Phe Gly Ala Tyr Pro Asn Ile Gln Asn Leu Phe Lys Glu Leu Gly

130 135 140

Ile Gln Asp Arg Leu Gln Trp Lys Glu His Ser Met Ile Phe Ala Met

145 150 155 160

Pro Asp Ala Pro Gly Glu Phe Ser Arg Phe Asp Phe Pro Glu Leu Pro

165 170 175

Ala Pro Trp Asn Gly Ile Ile Ala Ile Leu Arg Asn Asn Gln Met Leu

180 185 190

Ser Trp Pro Glu Lys Ile Arg Phe Arg Ile Gly Leu Leu Pro Ala Ile

195 200 205

Ile Phe Gly Gln Arg Tyr Cys Glu Glu Gln Asp Glu Leu Thr Val Thr

210 215 220

Glu Trp Met Arg Lys Gln Gly Val Pro Asp Arg Val Asn Glu Glu Val

225 230 235 240

Phe Ile Ala Met Ala Lys Ala Leu Asn Phe Ile Asn Pro Asp Asp Leu

245 250 255

Ser Met Thr Val Val Leu Thr Ala Leu Asn Arg Phe Leu Gln Glu Gln

260 265 270

His Gly Ser Lys Met Ala Phe Leu Asp Gly Ala Pro Pro Glu Arg Leu

275 280 285

Cys Gln Pro Met Val Asp Tyr Phe Lys Ala Arg Gly Gly Asp Leu Met

290 295 300

Phe Asn Ser Arg Val Lys Gln Ile Val Leu Asn Asp Asp Lys Ser Val

305 310 315 320

Lys His Leu Ala Leu Thr Asn Gly Gln Thr Val Glu Gly Asp Leu Tyr

325 330 335

Ile Ser Ala Met Pro Val Asp Ile Met Lys Ile Leu Met Pro Asp Pro

340 345 350

Trp Ala Ser Met Pro Tyr Phe Lys Gln Leu Asn Gly Leu Glu Gly Val

355 360 365

Pro Val Ile Asn Ile His Ile Trp Phe Asp Arg Lys Leu Thr Thr Val

370 375 380

Asp His Leu Leu Phe Ser Arg Ser Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Asp

385 390 395 400

Met Ser Thr Thr Ser Lys Glu Tyr Arg Asp Asp Lys Lys Ser Met Leu

405 410 415

Glu Leu Val Phe Ala Pro Ala Lys Glu Trp Ile Gly Arg Pro Asp Glu

420 425 430

Glu Ile Ile Ala Ala Thr Met Thr Glu Leu Glu Arg Leu Phe Pro Thr

435 440 445

Glu Val Arg Ala Asp Gln Ser Met Ala Lys Ile Leu Lys Tyr Lys Val

450 455 460

Val Lys Thr Pro Leu Ser Val Tyr Lys Ser Thr Ala Gly Arg Glu Lys

465 470 475 480

Phe Arg Pro Thr Gln Arg Ser Pro Ile Ser Asn Phe Tyr Leu Ala Gly

485 490 495

Asp Tyr Thr Lys Gln Lys Tyr Arg Ala Ser Met Glu Gly Ala Val Phe

500 505 510

Ser Gly Lys Leu Val Thr Glu Ala Ile Val Glu Asp Trp Ser Ala Arg

515 520 525

Gly Val Thr Ser Ser Ala Ala Ser Arg Gln Pro Ala Leu Ala Ala Ala

530 535 540

Gly Val Val Gly Arg Val Gly Ser Ser Asp Trp Ala Arg Trp Leu Gln

545 550 555 560

Pro Val Gly Ala Ile Ala Gly Gly Cys

565

<210>4

<211>226

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Nukleins鋟resequenz der MCS des erfindungsgem溥en载体s Plat-pdsMOD4.1

<400>4

ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 60

gccccccctc gaggtcgacg gtatcgataa gcttgatatc gaattcctgc agcccggggg 120

atccactagt tctagagcgg ccgccaccgc ggtggagctc cagcttttgt tccctttagt 180

gagggttaat ttcgagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcc 226

<210>5

<211>8742

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA-载体Plat-pdsMOD4.1

<400>5

cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 60

ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120

cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 180

ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 240

accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 300

gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccatcggtg aggggttcaa gtgccagctc 360

agtcaaacat cgtgcattca ggaggcacag ttagaggcgt ggttgcagac gtaggtgagc 420

agttgggtgc tgctgctgct gtgatctgat acatgttgaa aactgagcgg aatggccatg 480

tattgttgtt tgattactca tggccatgca ctgagcatgc agcaagccat acccatccag 540

gagttgtctt cacttccttt cccgcgcttg cttgctttca tccgctttct ttccatatgc 600

tgtgttgtga tccctccctc ccctcctccc tccttaccct gccccacccc tggtggtgtg 660

tggccaggtg gctgtgacgc actgcctgct gagcgctgac ctggtgagca tgagcgccag 720

gctgggccga gctgcctggg tggccaccac tcggctgtat gctgctcagc aagaggtggc 780

aggccaggcc catgtggcag ccatgcacct ggtggcaatc ggggataggg ctgcggcaga 840

agcagtgtac aggtgggcgc gggcaggagc agggacaggg gctatagggt ccccggccag 900

gtctaccctg actgctgggg ttaaggctag ggctagggct agggctaggg ctagggctag 960

ggctagggct agggctaggg ctagggctag ggctagggct agggctaggg ctagggctag 1020

ggctagggct agggctaggg ctagggctaa ggacaagggg tgggggcgaa gggtgggggt 1080

ttgcagcagc cagggtcagc cctgggccaa cagtagctac tgcacatccc cacaatctcc 1140

tacaggcagc acaggctaac gtgcgcggac tgcatcaccg ggtacacagt tgatgacatc 1200

ttatcgaagc atctcaccac acgacacatc acaattagtt gcaagggttc ctgtcggtgt 1260

tgaggtttga gttggtctgt atgcaggggc ctgatggaaa aactgtagta gctgagtgag 1320

attacccaca gccaagcatg ttgttccatg ttgaacaggt tttgtttggt ctgatggaaa 1380

aactgttgaa atgcttcctg tcatcgttcc gctgtacgcc attgtacgcc gttgactgat 1440

ggactgattg tttgactgat ggaagaactg tgtagacctc agccccctca gcacattagc 1500

atatctcgac acatcagcca tgcgcacacc gagttcgcct tgtcatgcgc agccaccctg 1560

tagaatgaag tcacgtaagt agtggctgcc gcgaggtcgc cttggtattg tctctggctt 1620

gatatagcgc tgactgacgg gtggtgacgg tgctcgtgcg ctatagatgc cactagaggc 1680

ccgcccacct cgcgcctgag ccgcaaaacc cggcggggtc gtcacgatga gggcatctta 1740

cctcgacgat gtaccgaccc cgggagctgt cccgctggac tggcggatcg cggctgccca 1800

acttgggcac tgagcgttgg ctgtggatca acatcattgg cgccgatgtc agcctgggcc 1860

agcaggtgca gcggctgacc ggctatggac cggctatgga ccggctacga tagcggatgc 1920

agcgttcctc cgcatgcaga gatgcactgg accagtaccg gagacggcgc cagcgggata 1980

cacggattag tgcgcctgaa ctgcggtgtg ccccatgaat gaccatgcca gccccaaggg 2040

gcggcattga agcggcccta gagagctagt ggcaaggcag cactagacaa cttatgagct 2100

aaggtcaggg agctatgagg ctgcaagatt aggggcctga tttgagttgt tcagtcgcac 2160

gtcttcacga cgttacggct gccatcttac ccagtcggct aaagcaggcc accaccattg 2220

gcgtcacgcg tgatcgtctt gaaatgacag ctagtccaaa caccaggctc agctcgtatg 2280

gtttggcgag ggcgtttcgt cggttgaacg acgtgccttt aatgaaaatt cgtggccata 2340

ccttcatcgc ttgagccaac catccagcat caactctgac aatgcagaca gcaatgcgtg 2400

gccaagccag cggttcagga tgcacttcca gcaggcaagc tcgcggtcat tggtcaaggc 2460

gctctgtgcg tgagcgaggt gctctcaggg tggttgccaa ggactacccc acgccggatt 2520

tccaatcatc ggacacatac caggaggccc tgtccctgtc gaccaagctg cgaaatacac 2580

cccggcccgc caagcctttg cgcgttgtca ttgctggggc cggcctggca ggcctctcgg 2640

ctgcaaaata cctggcagat gcagggcacc acccagttgt gctggagggc cgcgacgtgc 2700

taggcggcaa ggtaaggact tgcgagtgtc gaatgccacg ccggcccgtt ccaaacgccc 2760

acaagctgtc cggccacctc acaaactcat tggcgcacag gtggccgcgt ggaaggacga 2820

ggacggtgat tggtacgaga ctggccttca cattttcttt ggtgcttacc ccaacatcca 2880

gaacctgttc aaagagttgg gcatccaaga caggtaggag gtgcacccag tagtgtcaac 2940

gcattgccta gcaagcgcct cagtcaacaa gaccaccatg agcactgttc ttgatgtggg 3000

catgtgcctg ccttgcaggc tgcagtggaa ggagcattcc atgatctttg ccatgccaga 3060

cgcccctggg gagttttctc gctttgactt ccctgagctg cctgcgccct ggaacggcat 3120

catcgccatc ttgcggaaca accagatgct cagctggcct gagaagatcc ggtttgccat 3180

cggcctgctg cctgctatca tctttgggca gcgctactgt gaagagcagg acgagctgac 3240

cgtgacagag tggatgcgca agcagggtgt gccagaccga gtcaatgagg aagtgttcat 3300

cgccatggcc aaggccttga acttcatcaa ccctgacgac ctatccatga cagtggtgct 3360

cacagcactg aaccgcttcc tgcaggcaag tgttgggcct aggcagtcag gggtcagggg 3420

cctgcagggc cagcttgcat ctgcccgacc ttcagggccg ccgcctccct cacaaagcat 3480

gcaccctcca caacccgcct gtctgtctgc ccaacaccag cttatggtcc aaatccacca 3540

caaccgcctc tcaccctcct gcccctgctt tcagcctgag cactgcagtc ctgtcaccag 3600

caaatgtgtg gcggctgcac ttcttgtccc tgccgccaat cgctttcagt gtggcctggc 3660

cagcttgtga cagtggctag agctccaagc tctgcaaaga ctgagacaag ctgtggtttg 3720

cattgcctgg gctgcaggag cagcatggca gcaagatggc tttcttggat ggcgccccac 3780

ctgagcgcct ctgtcagcca atggtggact acttcaaggc acgaggcggc gacctcatgt 3840

tcaactcccg ggtcaagcag attgtgttga atgtgaggtc cctggctctc agcctcgccg 3900

cctcctgcag acgctgcatg ccatgtgcag tatcaccatg ccacacacgt cggcatcagc 3960

tgcaggccta gctctcgcgc cgcagtcaca gttgaaccca acacatgtgc aagtcatcac 4020

cctgtgcagc aggcaggggc aggctgggtg cctgggcctg tcatccactg cagccacagt 4080

cttgagtgga gggtacagtc attaactctg cccatgaggt gtcagagtct ttcatgggtg 4140

ctatatggtc gctcttggcg tgcaggacga caagagtgtc aagcacctgg ccctcaccaa 4200

tggtcagaca gttgagggcg acctctacat ctcagccatg ccaggtgtgt gcctatggtg 4260

cagctgggct gtgtgcccct aagcagccac acaagcactg gatgccatca cccattgctg 4320

catgacatag gcacaaggat gatagccaac gacatggatg aggcacctgg gcacagaggc 4380

acacgttgtg gcctgcacag cctgagtcat gaattgaggg gggagagcca ggtaggctgt 4440

aattgtggca ctgacctcca caaaaccata acacaccaga ttgactgagt ccagttaggc 4500

ttgggggctt cccttcagtt tgttcagaac caggatgctt ggctnctccc taccatgcgc 4560

tgacatgtgt gcttgcattg atgtggtctc gcagtggaca tcatgaagat cctcatgcct 4620

gacccctggg cctccatgcc ctacttcaag cagctgaacg gcctggaggg ggtgcctgtg 4680

atcaacatcc acatctggtt cgatcgcaag ctgactacgg tggaccacct gttgttcagt 4740

cggtcaccgc tgctgtctgt gtacgctgac atgagcacca cgtgcaagga gtatgctgac 4800

gacaagaaga gcatgcttga gctggtgttt gcgccggcca aggagtggat tggccggcct 4860

gacgaggaga tcatcgcagc caccatgaca gagctggagc ggctgttccc gacagaggtc 4920

agggctgacc agtccatggc caaggtaggc gggtcaggca ccagccagca ctgccaggcc 4980

tgcaggttaa gaggcttgtg aggggtgcag ctctgggcag atagcagcta cagccagcta 5040

acggtgccgg ggttgtgagt gaatggcgcc cactgcctga agcaccaccc tgctcagctt 5100

gctctgctgt gccagcattg gctgcctgct gtcgaagtac ttgtggtgat gggtgatggt 5160

ggcatgatgt gcagatcttg aagtacaagg tggtgaagac tccattgtct gtgtacaagt 5220

ccactgctgg gcgggagaag ttcaggtgag cctcgcgaca gccgacagtg gaatgcactg 5280

cagcccttgt ggctgcctga ctggctttct tgtcagccgc tctctcgtga ccataactga 5340

tgctgccgta ccttatctgc tgctgctgct gtcatgctgg tgctaatggt ggtgccccgg 5400

tgctgctgct gctgtgctgc agacccactc agcgctcccc aatctccaac ttctaccttg 5460

cgggtgatta caccaagcag aagtaccgcg cctccatgga gggtgcagtg ttctccggca 5520

agctggtcac cgaagccatt gtagaggact ggagcgctcg gggtgtgacc agcagcgctg 5580

ccagccgcca gcctgccctg gctgcagccg gtgtggtggc agggtcggct gcagtgattg 5640

gggcggcgtt ggttgcagcc agtggtgcaa tagccggtgg gatgtaagtg atgaaagaat 5700

ggcacctggt agatgaggca gcatttatag aaatggcagc accctcgctg cctaatgctt 5760

gtggtgtata ctattgacct cgggagttga ggcccgcagc cattgtgtgg ctatcgcatg 5820

gggtggtgca tcgctgctca atgccgacaa cattgggatg gcctagaact tattgctagg 5880

tagtgtgacc tggacaagag attgggtatg ggtctggtga ggaagggcag gcactatggg 5940

cgagcattct gagaggttgg gcaggcgtgc tgtagtcctg cgatgagttg gagtgtctaa 6000

acggcagtaa cggatatggg gtcacacggt ttacacgaac attgctgaaa tcgaggatca 6060

tcacgaagcg tgcaagaaac gtcatgcaac atgcaaacaa gccaaaattc aaacgatggc 6120

gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag 6180

tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg 6240

cgcgtcccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc 6300

ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac 6360

gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattgt aatacgactc 6420

actatagggc gaattgggta ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga 6480

tatcgaattc ctgcagcccg ggggatccac tagttctaga gcggccgcca ccgcggtgga 6540

gctccagctt ttgttccctt tagtgagggt taatttcgag cttggcgtaa tcatggtcat 6600

agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 6660

gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 6720

gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 6780

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 6840

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 6900

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 6960

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 7020

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 7080

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 7140

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 7200

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 7260

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 7320

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 7380

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 7440

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 7500

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 7560

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 7620

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 7680

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 7740

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 7800

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 7860

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 7920

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 7980

tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 8040

ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 8100

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 8160

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 8220

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 8280

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 8340

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 8400

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 8460

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 8520

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 8580

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 8640

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 8700

ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gc 8742

<210>6

<211>2187

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>肌动蛋白启动子SmaI-片段

<400>6

cccccgggca ggcagcggtg gggccagcag tggggcccaa tggcagcgcc tggggcctgg 60

agggggtagc ttaggcgggg cgggcggggg gggcggggtg ggaggcggtg tgggcgccca 120

ggcgttggct ctgctgcgtg ggggctgggc taggattggg tcaggccccc ctatgctgcc 180

gccccccgcc ccaggccccg ctgggtctga gggccctgcc ccccgcgcat ctccctgggt 240

gcggcagctg cagcggggca gccacgcccg cagccactcc tcgccagtgg acctgaccag 300

cccgcagctc acccaggcgc tgctggacga gtggcatggg ggggaggagc cagggggggg 360

ccctggtctg gcccctaggc acaacagctt tgacttgagg ctcagggccg gccaataatg 420

gggtggttgg gaagggtagg ggggtccggg agggggktkg gkaagggtaa ggtagggtta 480

ggtaaggtag gctaggctca gggtgttatg catggcaatg gtagcaggcg tagctgcagc 540

tggggaagat tcatggtaaa cgtataaagg gacccagctg atggtgggcg aatgacggac 600

acctgcatgt attctttaca tttcaagtat ttcaaagttg gtttgcaacg atgtggggct 660

aggctatgca ataagactgc tacatgaggc cgggctgatc accgctcgtg acgtatggac 720

gtatctgacg tgatcaacct gacccttacc gaaccctgac ctgcagtgcc caatccatga 780

tatcagctgg tgctctgtgc cacactattg cagtttacag cgatggatgc ttacttggct 840

tgcgttgctt ggattctgcg accgtggcct tccaatgcgg ttcacctttc aagccacgat 900

caatatcaca agcatgggtt gcatgagcgc taaccacctg cctttggaga cttgcgcgcc 960

atacccattg tgtgggatac agcacccctt ccacacaccc gagatcccca cggtcagctg 1020

tcgcgcttaa cccgctcccc cctcgcgcct cttgctcgtg atcattgtgg gttgccgcga 1080

cgtcaccgct ccgtcaacgt gctttcaaac agggatcaaa aatgctccat cacccggtgc 1140

agagtctttg ctgcaagcag cacaatggct gaggagggag aggtatctgc ccttgtctgc 1200

gacaatggct cggggatggt gaaagccggg ttcgctgggg atgatgcgcc ccgtgcagtc 1260

ttccccagca ttgtgggcag gccgcgccac acaggcgtga tggtgggcat ggggcaaaag 1320

gtaagaacgc tgtgtgcgac gaactgcatc gctgcagctg gcccagctca acgtggcgct 1380

ctatgtgtgc aggactcata cgtcggcgat gaggcacagt ccaagcgagg catcctgacg 1440

ctacgctacc caatcgagca cggcattgtc acaaactggg atgacatgga aaaaatttgg 1500

catcacacat ggttcaacga gcttcgcggt aaaaaatttg gcatcacaca tggttcaacg 1560

agcttcgcgt ggctccagag gtgagtagcg agtccctgag gtgcagcact ggctgccctg 1620

tttgcctctg ctttagccac tgattccctg gtcagtccca ggccaggact gacatgcatc 1680

tacatgcgtt gaagtgcaat gtcgcaagcc cagctcagcc acctatattg ggtgcagggc 1740

gcgtgggttt gccttccttc ccctgtaatc tgtttccccg atgtacaaaa cgatagtgtg 1800

gtaggcctac aaggaaatgg tgtcatgggg gtccactgtc acgcctgagc tgatgctggt 1860

cacaaggctc gcagcacgcc aaagctcagc agggtggctc aggccatatg gctcaagtac 1920

gctgtgcctc caagctgggg ccatgtcact gcatggcgcc tgcatgtgtt aggaaacaaa 1980

cgctaggatg ggcgtgaggc ccctttcctg cccccttccc gcagctctag cagcagagcc 2040

atgagttagg gctagggtta gtcatggggc tgccttgcta gcttcgaatg ccggctgagc 2100

acattctagt tgcatgcatt ggatatgcac ttgcgtgcag cttcccgctc cccatccaga 2160

catttgttgt ccagctcccc gcccggg 2187

<210>7

<211>1300

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>rbsc-启动子PstI-片段

<400>7

ctgcagggcc agccactaat gctgcaacgg gaccagtaaa aggaacaggt tcaggaccag 60

caggtgtcga gtatcgcgcc agctttgtgt gtttccgtgc gtgtgtgttg gggcgctgtt 120

acatgccatg ccatgccacg tcactgcgac gacttctgat tgcagcggca agagcccggg 180

cagtcgctat ttgcagaaac gagaggtttt atctcttgag catgggggtg accattggtg 240

aaacactcga ggacgatctc atgcattcaa tggatcttat tcgccataca tataaacacg 300

cgacgaccga tattaaggaa tgcagccaca agcttcagta agtgatggag cacttgccgg 360

atttgtttct tgcagacaag gcttcaacat tgtcgtaaaa taggagtagt aaaggtatgg 420

acagtagcag gctgcgggcc gctgtgaacc ttatctcgaa agctgggata aagcattaaa 480

gtccatcact ccaagagtgt aatcaccatg acaatctcta ttgggtcgcc aacaaggact 540

gtcgggttca gacagtgaga caagcagcag caatggccac catcgcagcc cgctcaacca 600

gctctgccgt ctcctgcggc cgcccttgca cgcagctgcg tgcaggtgcg cgctgccctg 660

aagcccagcg tgaaggccgc tcccgcggtc tccaccgctg gcgccaacca gatgatggtc 720

tggcagccca ttaacaacaa gtgcggaccc ttatccactt cctgaaaccg agctcgaccc 780

cagcctgcga cccgtcgtaa cacggcattc actgcctctt cctcgcaggc aatacgagac 840

tttctcttac ttgcctccct tgacatccga ccagattgct cgccaggtcg actatgtcgt 900

tggcaacggt tggattccat gcctggagtt cgctgacgcc agccaggcct atgtcagcaa 960

cgccagcaca gtgcgctttg gctccgtgtc cgctgtgagt gtcttaggag acatgcgtac 1020

cctatgcctt tctcgcccgt cgcctgctgc tcatgattcc cagtcgattg ctctccggac 1080

tgacttttat cgtgtttgac ttttgcccga tcgcagtgct actacgacaa caggtactgg 1140

acactgtgga agctgcccat gttcggttgc actgacccct ccgccgtgct gactgagatc 1200

agccgcgcct ccaaggcctt cccccaggcc tacattcgca tggtgtgtag gaacagtgtt 1260

cgcagcagca ttgtgtaaag cagcgtccgc tgttctgcag 1300

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>8

ccaagcagaa gtaccgcgcc tccatggagg g 31

<210>9

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>9

ccctccatgg aggcgcggta cttctgcttg g 31

<210>10

<211>474

<212>PRT

<213>聚球藻PCC7942

<220>

<223>八氢番茄红素去饱和酶

<400>10

Met Arg Val Ala Ile Ala Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ser Cys Ala

1 5 10 15

Lys Tyr Leu Ala Asp Ala Gly His Thr Pro Ile Val Tyr Glu Arg Arg

20 25 30

Asp Val Leu Gly Gly Lys Val Ala Ala Trp Lys Asp Glu Asp Gly Asp

35 40 45

Trp Tyr Glu Thr Gly Leu His Ile Phe Phe Gly Ala Tyr Pro Asn Met

50 55 60

Leu Gln Leu Phe Lys Glu Leu Asn Ile Glu Asp Arg Leu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Ser Met Ile Phe Asn Gln Pro Thr Lys Pro Gly Thr Tyr Ser

85 90 95

Arg Phe Asp Phe Pro Asp Ile Pro Ala Pro Ile Asn Gly Val Ala Ala

100 105 110

Ile Leu Ser Asn Asn Asp Met Leu Thr Trp Glu Glu Lys Ile Lys Phe

115 120 125

Gly Leu Gly Leu Leu Pro Ala Met Ile Arg Gly Gln Ser Tyr Val Glu

130 135 140

Glu Met Asp Gln Tyr Ser Trp Thr Glu Trp Leu Arg Lys Gln Asn Ile

145 150 155 160

Pro Glu Arg Val Asn Asp Glu Val Phe Ile Ala Met Ala Lys Ala Leu

165 170 175

Asn Phe Ile Asp Pro Asp Glu Ile Ser Ala Thr Val Val Leu Thr Ala

180 185 190

Leu Asn Arg Phe Leu Gln Glu Lys Lys Gly Ser Met Met Ala Phe Leu

195 200 205

Asp Gly Ala Pro Pro Glu Arg Leu Cys Gln Pro Ile Val Glu His Val

210 215 220

Gln Ala Arg Gly Gly Asp Val Leu Leu Asn Ala Pro Leu Lys Glu Phe

225 230 235 240

Val Leu Asn Asp Asp Ser Ser Val Gln Ala Phe Arg Ile Ala Gly Ile

245 250 255

Lys Gly Gln Glu Glu Gln Leu Ile Glu Ala Asp Ala Tyr Val Ser Ala

260 265 270

Leu Pro Val Asp Pro Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Ala Trp Lys Ala

275 280 285

Met Pro Tyr Phe Gln Gln Leu Asp Gly Leu Gln Gly Val Pro Val Ile

290 295 300

Asn Ile His Leu Trp Phe Asp Arg Lys Leu Thr Asp Ile Asp His Leu

305 310 315 320

Leu Phe Ser Arg Ser Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Asp Met Ser Asn

325 330 335

Thr Cys Arg Glu Tyr Glu Asp Pro Asp Arg Ser Met Leu Glu Leu Val

340 345 350

Phe Ala Pro Ala Lys Asp Trp Ile Gly Arg Ser Asp Glu Asp Ile Leu

355 360 365

Ala Ala Thr Met Ala Glu Ile Glu Lys Leu Phe Pro Gln His Phe Ser

370 375 380

Gly Glu Asn Pro Ala Arg Leu Arg Lys Tyr Lys Ile Val Lys Thr Pro

385 390 395 400

Leu Ser Val Tyr Lys Ala Thr Pro Gly Arg Gln Gln Tyr Arg Pro Asp

405 410 415

Gln Ala Ser Pro Ile Ala Asn Phe Phe Leu Thr Gly Asp Tyr Thr Met

420 425 430

Gln Arg Tyr Leu Ala Ser Met Glu Gly Ala Val Leu Ser Gly Lys Leu

435 440 445

Thr Ala Gln Ala Ile Ile Ala Arg Gln Asp Glu Leu Gln Arg Arg Ser

450 455 460

Ser Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ser Gln Ala

465 470

Claims

1.一种载体，其包含

(a)编码在一个位点具有赋予抗性的氨基酸置换的八氢番茄红素去饱和酶蛋白的DNA序列，和

(b)能克隆入任意DNA序列的MCS。

2.权利要求1所述的载体，其特征在于，编码八氢番茄红素去饱和酶蛋白的DNA序列(a)获自雨生红球藻(H.pluvialis)并通过定向突变导入氨基酸置换。

3.权利要求1或2所述的载体，其特征在于，载体在蛋白质的位点504上具有从亮氨酸至精氨酸的氨基酸置换。

4.权利要求1至3任一项所述的载体，其特征在于，所述载体具有(a)赋予转化体对除草剂的抗性的DNA序列。

5.权利要求1至4任一项所述的载体，其特征在于，所述载体具有(a)赋予转化体对漂白除草剂特别是氟草敏的抗性的DNA序列。

6.权利要求1至5任一项所述的载体，其特征在于，所述载体具有DNA序列SEQ ID NO：3。

7.权利要求1至6中任一项的载体，其特征在于，所述克隆入MCS中的任意DNA序列是编码序列。

8.权利要求7所述的载体，其特征在于，所述编码序列是植物来源的。

9.权利要求8所述的载体，其特征在于，所述编码序列包含至少一个启动子序列。

10.权利要求9所述的载体，其特征在于，所述启动子序列选自肌动蛋白基因和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的红球藻(Haema tococcus)基因的启动子。

11.权利要求1至10任一项所述的载体，其特征在于，除了至少一个启动子基因外，所述编码序列还包含待表达的功能基因。

12.权利要求11所述的载体，其特征在于，编码序列选自类胡萝卜素生物合成基因、变胞藻黄素生物合成基因和类异戊二烯生物合成基因。

13.权利要求1至12任一项所述的载体，其特征在于，从可自由获得的载体制备载体。

14.权利要求1至13任一项所述的载体用于真核细胞特别是单细胞植物细胞的转化的用途。

15.权利要求14所述的用途，其用于藻类细胞特别是雨生红球藻细胞的转化。

16.权利要求1至15中任一项所述的载体作为选择标记用于转化目的的用途。

17.权利要求16所述的用途，其中所述载体作为显性选择标记用于转化目的。

18.一种转化方法，其特征在于，使用权利要求1至17任一项所述的载体。

19.权利要求18所述的方法，其特征在于，通过粒子轰击进行转化。

20.权利要求18或19所述的方法，其特征在于，在500-2500psi的压力下和真空中使用大小为0.4～1.7μm的钨颗粒进行粒子轰击。

21.权利要求1至20中任一项的转基因植物细胞和其后代，其特征在于，具有进入细胞核基因组中的导入的DNA的整合。

22.权利要求21所述的转基因植物细胞和其后代，其特征在于，具有进入细胞核基因组中的导入的DNA的一个或多个整合。

23.权利要求21和22之一所述的转基因植物细胞和其后代，其特征在于，所述导入的基因组成型地表达。