ES2351258T3 - Biosíntesis de astaxantina en eucariotas. - Google Patents
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Abstract
Un vector que comprende (a) una secuencia de ADN, que codifica la proteína fitoeno desaturasa, la cual posee en una posición una sustitución de aminoácidos que confiere una resistencia frente a herbicidas, y (b) un sitio de clonación múltiple (MCS), en el que se puede introducir por clonación una secuencia arbitraria de ADN, realizándose que la secuencia de ADN que codifica la proteína fitoeno desaturasa, tomando en cuenta la degeneración del código genético, codifica una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:2, teniendo la proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:2 un intercambio de aminoácidos de leucina por arginina en la posición 504.
Description
Biosíntesis de astaxantina en eucariotas.
El invento se refiere a un vector de ADN, que
posee (a) una secuencia de ADN, que codifica la proteína fitoeno
desaturasa, que está modificada en una posición por medio de un
intercambio de aminoácidos que confiere una resistencia, y (b) un
sitio de clonación múltiple (en inglés "multiple cloning
site"), en el que se puede introducir por clonación una
secuencia arbitraria de ADN, a su utilización para la transformación
de células de eucariotas y a procedimientos para la transformación
y a unas células de plantas transgénicas producidas de esta
manera.
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Los carotenoides son unos pigmentos que se
presentan en todos los organismos fotosintéticos. Ellos desempeñan
un cometido importante como componentes del centro de reacción
fotosintética y en el caso de la protección contra daños causados
por fotooxidación.
La ruta de biosíntesis de los carotenoides
transcurre desde el geranil-geranil difosfato (GGDP)
hasta la astaxantina. Mediante la condensación de dos moléculas de
pirofosfato de geranil-geranilo, la fitoeno sintasa
(PSY) forma el cuerpo de C40 fitoeno. Partiendo del fitoeno, la
fitoeno desaturasa (PDS), mediante una separación de protones y la
introducción de dos enlaces dobles, sintetiza el
\xi-caroteno. El producto intermedio de esta etapa
de síntesis es el fitoflueno. El \xi-caroteno es
luego transformado químicamente de nuevo en licopina en una
reacción de desaturación de dos etapas pasando por el producto
intermedio neurosporina. La enzima responsable de esto es la
\xi-caroteno desaturasa (ZDS). La licopina es
transformada, pasando por una licopina ciclasa (LCYB), en el
\beta-caroteno. Partiendo del
\beta-caroteno, en la formación de astaxantina
participan otras dos enzimas adicionales. Por una parte, la
\beta-caroteno cetolasa (BKT) adosa junto a las
posiciones 4 y 4' en cada caso un grupo ceto. Por otra parte, por
medio de la carotenoide hidroxilasa (CHY) se engancha al anillo de
iones del compuesto precursor de la astaxantina en cada caso un
grupo hidroxilo junto a las posiciones 3 y 3'.
Mediante la sobreexpresión de una fitoeno
sintasa bacteriana procedente de Eriwinia uredovora se pudo
influir sobre, o estimular, la biosíntesis de los carotenoides en
plantas transgénicas de tomate, y aumentar por consiguiente la
cantidad sintetizada de carotenoides en el factor de
2-4 veces (Fraser, Romer y colaboradores 2002).
La posición clave primordial en la ruta de
biosíntesis de los carotenoides es ocupada, no obstante, por la
enzima fitoeno desaturasa (Fig. 1). Los genes pds, que
codifican la fitoeno desaturasa, fueron clonados a partir de
cianobacterias (Chamovitz y colaboradores, 1991;
Martínez-Férez y Vioque, 1992;
Martínez-Férez y colaboradores, 1994) y a partir de
plantas superiores (Bartley y colaboradores, 1991; Pecker y
colaboradores, 1992) y se sobreexpresaron con éxito en el seno de
E. coli. El herbicida blanqueador norflurazona es conocido
como un inhibidor reversible, no competitivo, de la fitoeno
desaturasa. Para la cianobacteria Synechococcus se han
descrito unas formas mutadas de la fitoeno desaturasa, que confieren
a la bacteria una resistencia frente a norflurazona. Las mutaciones
que confieren una resistencia, se basan en este contexto en cada
caso en un único intercambio de aminoácidos. Dentro del marco de
los estudios acerca de mutaciones, que se llevaron a cabo en
Synechococcus, se encontraron unas resistencias para los
siguientes intercambios de aminoácidos: Arg195Pro; Leu320Pro;
Val403Gly; Leu437Arg (Linden y colaboradores 1990; Chamovitz y
colaboradores, 1993). A pesar de que la norflurazona y otros
herbicidas blanqueadores de este tipo son utilizados desde hace
mucho tiempo para la represión de malezas, hasta ahora no se ha
podido aislar ninguna planta resistente que esté presente en la
naturaleza.
El documento de solicitud de patente
internacional WO2004/007691 divulga unos vectores, que comprenden
una secuencia de ADN que codifica en cada caso una fitoeno
desaturasa, que en una posición tiene una sustitución de
aminoácidos, que confiere una resistencia. Las secuencias que se
divulgan de acuerdo con el documento WO2004/007691, proceden de las
plantas multicelulares del género Hydrill y de soja, maíz y
arroz.
Entre los compuestos intermedios y productos de
la ruta de biosíntesis de los carotenoides, el cetocarotenoide
astaxantina presenta en particular una importancia comercial. La
astaxantina posee una actividad antioxidante más alta que la de
otros productos intermedios de la ruta de biosíntesis de los
carotenoides. La astaxantina actúa como un agente extintor (en
inglés quencher) contra radicales libres y especies activas con
oxígeno (Kobayashi y Sakamoto, 1999), como un agente reforzador de
respuestas inmunitarias (Jyonouchi y colaboradores, 1995) y como un
agente contra el cáncer (Tanaka y colaboradores, 1994, 1995). Debido
a su efecto natural como un potente agente antioxidante, la
astaxantina se emplea también como un agente de complemento
nutritivo. Como aditivo para piensos con efecto de colorante, ella
se utiliza también en la piscicultura.
Algunas especies de algas verdes tales como p.
ej. Dunaliella bardawil y Haematococcus pluvialis
poseen la capacidad singular de acumular carotenoides en
condiciones de estrés. En este contexto, en particular la H.
pluvialis se adecua para la producción natural de astaxantina.
La H. pluvialis puede acumular astaxantina hasta llegar a un
4% de su peso en seco. En la producción comercial de astaxantina, la
H. pluvialis desempeña un cometido primordial, en particular
por el hecho de que la ruta de síntesis química para la producción
de astaxantina se cuenta entre las más costosas, que se emplean
comercialmente para la producción de una sustancia activa.
\newpage
La transformación genética de algas verdes se
describió múltiples veces para Chlamydomonas reinhardtii y
para algunas especies de Chlorella (Kindle 1990; Lumbreras y
colaboradores 1998; Hawkins y Nakamura, 1999; Kim y colaboradores
2002). Las dos especies de algas son consideradas como poco
interesantes para la producción a gran escala de carotenoides debido
a su metabolismo.
La transformación genética de H.
pluvialis fue descrita por Teng y colaboradores (2003). Por
medio de un bombardeo con micropartículas, el gen reportero de la
\beta-galactosidasa lacZ fue integrado bajo el
control del promotor de SV40 en el genoma de algas. Las células de
algas transformadas con éxito tienen que ser detectadas y
seleccionadas individualmente mediando toma de ayuda de medios
ópticos.
Las células de algas transformadas con el gen
lacZ no poseen ninguna resistencia frente a agentes de selección que
actúan de manera tóxica o respectivamente dominante.
A pesar de que la biosíntesis de astaxantina se
investigó detalladamente durante los últimos 10 años (Lu y
colaboradores, 1995; Fraser y colaboradores, 1998), la producción de
astaxantina por medio de H. pluvialis a gran escala
biotecnológica sigue siendo todavía problemática, puesto que, entre
otras cosas, la división celular es inhibida durante la biosíntesis
de astaxantina (Boussiba y von Vonshak, 1991).
Es una misión de este invento poner a
disposición un vector de ADN, que se pueda utilizar para modificar
genéticamente de un modo adecuado, al genoma de células de
eucariotas, en particular de algas tales como H. pluvialis,
con el fin de poder influir de esta manera sobre, o respectivamente
aumentar, la síntesis in vivo de carotenoides e isoprenoides
naturales, y en particular la biosíntesis de astaxantina. Constituye
una misión adicional del invento el poner a disposición un vector,
que se pueda emplear como marcador selectivo dominante para la
transformación en células de eucariotas, en particular de algas
tales como H. pluvialis, y que haga posible seleccionar de
un modo sencillo unas células de eucariotas transformadas con éxito,
en particular las de algas tales como H. pluvialis.
El problema planteado por esta misión lo
resuelve el invento por medio de un vector, que comprende (a) una
secuencia de ADN, que codifica la proteína fitoeno desaturasa, que
posee en una posición una sustitución de aminoácidos, la cual
confiere una resistencia frente a herbicidas, y (b) un sitio de
clonación múltiple, en el que se puede introducir por clonación una
secuencia arbitraria de ADN, realizándose que la secuencia de ADN
que codifica la proteína fitoeno desaturasa, tomando en cuenta la
degeneración del código genético, codifica una proteína de acuerdo
con la SEQ ID NO:2, teniendo la proteína de acuerdo con la SEQ ID
NO:2 un intercambio de aminoácidos de leucina por arginina en la
posición 504.
Los vectores conformes al invento comprenden en
este caso cualesquiera moléculas de ADN, que se pueden utilizar como
vehículos, con el fin de infiltrar en una célula con su ayuda un ADN
ajeno. Ellos incluyen cósmidos, fagos, virus, YACs, BACs, moléculas
lineales de ADN y en particular plásmidos con forma anular.
Dentro del marco del invento, se aisló la
secuencia de ADN de la enzima fitoeno desaturasa (PDS) procedente
de H. pluvialis a partir de una biblioteca de ADN genómico, y
se secuenció (SEQ ID NO:1). La correspondiente secuencia de
proteína de la fitoeno desaturasa procedente de H. pluvialis
se muestra en la SEQ ID NO:2. El objeto del invento comprende todas
las secuencias de ácidos nucleicos, que, tomando en cuenta la
degeneración del código genético, codifican la secuencia de proteína
SEQ ID NO:2.
Se prefieren unos vectores de ADN, en los que la
secuencia de ADN (a), que codifica la proteína fitoeno desaturasa,
el gen pds, procede de manera preferida de H.
pluvialis, y la sustitución de aminoácidos que confiere la
resistencia se había introducido por medio de una mutagénesis
dirigida. Los vectores conformes al invento codifican la proteína
fitoeno desaturasa procedente de H. pluvialis, que posee un
intercambio de aminoácidos, de leucina por arginina, en la posición
504 de su secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:3).
El intercambio de aminoácidos conforme al
invento, de leucina por arginina, en la posición 504 de la proteína
PDS procedente de H. pluvialis, corresponde al intercambio
Leu437Arg en Synechococcus PCC7942 (Fig. 2). Mediante una
mutagénesis dirigida se reemplaza a este fin el codón para Leu
"CTG" por el codón para Arg "CGC". Esta mutación confiere
a los mutantes el máximo factor conocido de resistencia frente a
norflurazona. La resistencia proporcionada confiere a los mutantes
conformes al invento, en comparación con el tipo silvestre, una
resistencia hasta 70 veces más alta frente a norflurazona. Conforme
al invento, se utilizan unas concentraciones de norflurazona de
0,5-50 \muM como sustancia para selección.
Además, se describen unas posiciones para un
intercambio de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de H.
pluvialis, a saber arginina 264, leucina 388, valina 465 (Fig.
3). Para el intercambio de aminoácidos en posiciones homólogas, en
Synechococcus se conoce un efecto que confiere una
resistencia.
Los vectores conformes al invento confieren a
los transformantes una resistencia frente a herbicidas, en
particular frente a herbicidas blanqueadores, y de manera
especialmente preferida frente a norflurazona.
Dentro del marco del invento, por el concepto de
"sitio de clonación múltiple" (MCS, acrónimo de Multiple
Cloning Site), que es designado también como poliengarzador, se
entiende una región en una secuencia de ácido nucleico, que dispone
de un número acumulado de diferentes sitios de corte utilizables
para endonucleasas de restricción, sin que, en el caso de que tenga
lugar una hidrólisis por restricción, sea perjudicada la función de
otros elementos de la secuencia de ácido nucleico. De manera
preferida, la molécula de ADN es hidrolizada solamente en una
posición por unas endonucleasas de restricción cuyos sitios de corte
están fijamente establecidos en el MCS. Ejemplos de MCS útiles son
bien conocidos para un experto en la especialidad a partir de los
vectores y plásmidos que son obtenibles comercialmente. Por el
concepto de MCS se entiende además, dentro del sentido de este
invento, cualquier sitio de corte por restricción situado dentro de
un vector, que se puede usar para introducir por clonación en la
secuencia del vector unas secuencias arbitrarias de ADN, de un modo
dirigido o no dirigido, sin que en este contexto sean perjudicados
otros elementos funcionales conformes al invento del vector.
Una forma de realización preferida conforme al
invento, de un MCS se muestra en la SEQ ID NO:4. En una forma
preferida de realización, el vector de ADN conforme al invento posee
la secuencia SEQ ID NO:5 (véase también la Fig. 4).
El presente invento se refiere de manera
preferida a los vectores de ADN, que como una secuencia arbitraria
de ADN que debe ser introducida por clonación, contienen una
secuencia codificadora en el sitio de clonación múltiple.
Por el concepto de "secuencia codificadora"
se entiende cualquier secuencia de ADN, que codifica una proteína
activa completa o un fragmento de proteína, que dispone de una
actividad biológica.
Se prefieren especialmente unas secuencias
codificadoras, que son de procedencia vegetal. Se prefieren
especialmente además unas secuencias codificadoras, que contienen
por lo menos una secuencia de un promotor. En este contexto, se
prefieren unos promotores, que hacen posible una transcripción
constitutiva o respectivamente una expresión de las secuencias
codificadoras, que están puestas bajo su control. Un promotor
preferido es el promotor de \beta-tubulina. Se
prefieren en particular las secuencias de promotores, que se escogen
entre el conjunto, que se compone depromotores de H.
pluvialis del gen de actina (SEQ ID NO:6) y del gen de Rubisco
(SEQ ID NO:7).
Además, el invento se refiere a unos vectores de
ADN, en los que la secuencia codificadora, junto a por lo menos un
gen de promotor, contiene un gen funcional que se ha de expresar. En
este caso, se prefieren especialmente unos vectores de ADN, que
contienen una secuencia codificadora, que se escoge entre el
conjunto que se compone de genes para la biosíntesis de los
carotenoides, de genes para la biosíntesis de astaxantina, y de
genes para la biosíntesis de los isoprenoides. En particular, se
prefieren las secuencias de genes de la
\beta-caroteno cetolasa, de la carotenoide
hidroxilasa, de la \xi-caroteno desaturasa, de la
fitoeno sintasa, de la leucopina ciclasa, de la
desoxi-xilulosa sintasa y de la
1-desoxi-xilosa-5-fosfato
reductoisomerasa (Berthold y colaboradores, 2002, Hallmann y Sumper,
1996, Mahmoud y Croteau, 2001).
El invento se refiere además a la utilización
del vector conforme al invento para la transformación de células
eucarióticas, en particular de células de plantas unicelulares. Se
prefiere especialmente la utilización del vector conforme al
invento para la transformación de células de algas, en particular de
células de H. pluvialis. Por el concepto de
"transformación", dentro del marco del invento se entiende la
incorporación de un ADN ajeno en un organismo.
La utilización del vector conforme al invento
como un marcador selectivo para la transformación es asimismo un
objeto del invento. En este caso, se prefiere especialmente la
utilización como un marcador selectivo dominante.
Un marcador selectivo, dentro del sentido del
presente invento, confiere a un organismo transformado una
propiedad, a través de la cual éste puede ser diferenciado
fácilmente con respecto de los organismos no transformados de la
misma especie. Por el concepto de "marcador selectivo
dominante" se entiende un marcador, que confiere una propiedad a
través de la cual se puede ejercer una presión de selección en el
sentido de que, en una población de organismos transformados y no
transformados de la misma especie, sólo sean capaces de sobrevivir
los organismos transformados. A modo de ejemplo, mediante la
adición de norflurazona a un medio de crecimiento, es posible
seleccionar unas células de H. pluvialis, que habían sido
transformadas con éxito con el vector conforme al invento de la SEQ
ID NO:4, con respecto de las células que no habían sido
transformadas, que no son capaces de sobrevivir en estas
condiciones. La selección de los transformantes se efectúa conforme
al invento en el caso de unas concentraciones de norflurazona de
0,5-50 \muM. La selección se puede efectuar en un
cultivo líquido o mediante una adición del herbicida a unas placas
con un medio nutricio.
Mediante la utilización de una PDS mutada como
primer marcador selectivo dominante para la transformación de
eucariotas, en particular de algas tales como H. pluvialis,
el presente invento presta una importante contribución al
aprovechamiento biotecnológico de eucariotas, en particular de algas
tales como H. pluvialis. El vector conforme al invento se
puede utilizar por ejemplo con y sin inserción de una secuencia
codificadora en el MCS, con el fin de influir sobre, o
respectivamente modificar, la biosíntesis de carotenoides en los
transformantes.
Además, el invento se refiere a un procedimiento
para la transformación de células eucarióticas mediando utilización
de un vector conforme al invento. Tales procedimientos para la
transformación son conocidos para un experto en la especialidad.
Ellos comprenden, por ejemplo, la utilización de un PEG
(poli(etilenglicol)), de bolitas de vidrio, de una
electroporación y de un bombardeo con micropartículas. Se prefiere
especialmente conforme al invento un procedimiento, en el que la
transformación se lleva a cabo mediante un bombardeo con partículas.
Una forma preferida de realización es en este caso el bombardeo con
partículas de wolframio u oro con un tamaño de 0,4 a 1,7 \mum,
que habían sido revestidas previamente con un ADN de vector conforme
al invento, a una presión de 500 a 2.500 psi (de 35 a 175
kg/cm^{2}) y en vacío. Después de la transformación, las células
se regeneran de manera preferida en el medio líquido OHA (2,42 g de
una mezcla de Tris y acetato, de pH 6,8) mediando sacudimiento
durante una noche en la oscuridad. Las células se siembran luego
sobre placas de OHA bajo una presión de selección con
OHA-agarosa al 0,7%. Los transformantes se pueden
observar después de 3-4 semanas mediando cambios de
luz a oscuridad con unos intervalos de igual duración (en cada caso
de 6-12 h) con luz (de 15-25
\muE*m^{-2*}s^{-1}) y en la oscuridad. La eficiencia de la
transformación es desde aproximadamente 1*10^{-4} hasta
10*10^{-8} células/\mug de ADN, de manera preferida de
1*10^{-6} células/\mug de ADN.
Adicionalmente, el invento comprende una célula
de planta transgénica y sus descendientes, caracterizada
porque ella comprende un vector de acuerdo con la
reivindicación 1. En este caso se prefieren unas células de plantas
transgénicas y sus descendientes, que muestran una incorporación
simple o múltiple del ADN introducido en el genoma nuclear. Se
prefieren especialmente unas células de plantas transgénicas y sus
descendientes, en las que el gen incorporado es expresado de un modo
constitutivo.
SEQ ID NO:1: la secuencia de nucleótidos del gen
pds, que codifica la proteína fitoeno desaturasa procedente de H.
pluvialis.
SEQ ID NO:2: la secuencia de proteína de la
fitoeno desaturasa procedente de H. pluvialis.
SEQ ID NO:3: la secuencia de proteína de la
fitoeno desaturasa con el intercambio de aminoácidos Leu504Arg.
SEQ ID NO:4: la secuencia de ácido nucleico del
MCS del vector conforme al invento
Plat-pdsMod4.1.
SEQ ID NO:5: la secuencia de ácido nucleico del
vector de ADN preferido Plat-pdsMod4.1.
SEQ ID NO:6: la secuencia de ácido nucleico, que
comprende el promotor de actina (el fragmento de SmaI). La secuencia
de ácido nucleico comprende las regiones codificadoras con intrones,
exones y la secuencia promotora, que está resaltada (-).
SEQ ID NO:7: la secuencia de ácido nucleico que
comprende el promotor de rbsc (la subunidad pequeña de Rubisco, en
inglés "Rubisco small subunit") (el fragmento de PstI). La
secuencia de ácido nucleico comprende las regiones codificadoras con
intrones, exones y la secuencia promotora, que está resaltada.
Fig. 1: la ruta de biosíntesis de los
carotenoides desde el geranil-geranil difosfato
hasta la astaxantina
Fig. 2: una confrontación de la fitoeno
desaturasa de Synechococcus y de H. pluvialis con
mutaciones conocidas y factores conocidos de resistencia (RF) frente
a norflurazona.
Fig. 3: una alineación de las secuencias de
aminoácidos de las proteínas PDS procedentes de H. pluvialis
y Synechococcus. Las posiciones preferidas para un
intercambio de aminoácidos, que confiere una resistencia frente a
norflurazona, están marcadas.
Fig. 4: un mapa plasmídico del vector
Plat-pdsMod4.1; MCS (sitio de clonación múltiple),
ori (origen de replicación).
Fig. 5: borrón de transferencia Southern de un
ADN genómico después de haber realizado una digestión con XbaI y
XhoI y una detección por medio de una sonda dirigida contra la
fitoeno desaturasa. Marcador (M) en kilobases (kb).
Fig. 6: (A) borrón de transferencia Northern de
tres cepas de tipo silvestre (WT, acrónimo del inglés "wild
type", a las 0, 18 y 36 horas) sometidas a un estrés provocado
por luz intensa permanente (de 120 \muE*m^{-2*}s^{-1}) y los
transformantes P1-P13. (B) borrón de transferencia
Western con anticuerpos contra:
Fig. 7: la proteína fitoeno desaturasa. La banda
discurre al nivel de los 55 kDa calculados. El ARNm (mensajero) para
la fitoeno desaturasa (pds), el ARNm para la carotenoide
hidroxilasa (hyd), la proteína fitoeno desaturasa (PDS).
Representación de la extinción no fotoquímica (NPQ, acrónimo del
inglés "Non-photochemical quenching"). NPQ =
(Fº_{m}-F'_{m})/F'_{m}. Fº_{m} es la
fluorescencia máxima de unos organismos adaptados a la oscuridad,
después de unos impulsos saturadores de luz en intervalos definidos
de 20 s (segundos).
Fig. 8: una representación de la acumulación del
cetocarotenoide astaxantina en H. pluvialis WT y de dos
transformantes (P3, P13) sin la adición de ningún herbicida bajo una
luz intensa permanente (de 175 \muEm^{-2'}s^{-1}). Peso en
seco (DW), período de tiempo en horas (h).
Fig. 9: el vector de transformación para la
expresión constitutiva del gen de la hidroxilasa (hyd) bajo
el control del promotor de la subunidad pequeña de Rubisco
(rbcS2).
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Un fragmento con un tamaño de 6,1 kilobases de
la fitoeno desaturasa se aisló desde una biblioteca de ADN genómico
de H. pluvialis y se subclonó a través de los sitios de corte
por restricción con XbaI y XhoI en el sitio de clonación múltiple
(MCS) del vector pBluescriptSK (de Stratagene). A través de una
mutagénesis dirigida, con los cebadores
PDS-Qmut-plu2 CCA AGC AGA AGT ACC
GCG CCT CCA TGG AGG G y
PDS-Qmut-min2 CCC TCC ATG GAG GCG
CGG TAC TTC TGC TTG G se llevó a cabo un intercambio de nucleótidos
de CTG a CGC, y el plásmido se designó como
pPDS-Q2. Este intercambio de nucleótidos conduce a
un intercambio de aminoácidos de leucina a arginina en el codón 504
(Fig. 2) y confiere a los mutantes una resistencia frente a
norflurazona.
Partiendo del plásmido pPDS-Q2,
mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, acrónimo de
Polymerase Chain Reaction) con los cebadores específicos, se
eliminaron los sitios de corte por restricción con XbaI y HhoI
situados en los extremos y se introdujeron dos nuevos sitios de
corte con EcoRV. A través de estos sitios de corte por restricción
se subclonó el gen mutado de la fitoeno desaturasa en un sitio de
corte con NaeI de un vector pBluescriptSK. De esta manera, el sitio
de clonación múltiple (SEQ ID NO:4) del vector está libre para
realizar otras clonaciones. La plataforma de transformación
producida de esta manera se designó como
Plat-pdsMod4.1 (Fig. 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Unas células de H. pluvialis se
cultivaron durante 4 días en un medio líquido en condiciones
normalizadas (con cambios de luz a oscuridad de 12 horas de luz (20
\muE*m^{-2*}s^{-1}) y 12 horas de oscuridad) hasta llegar a
una densidad de células de 3,5*10^{5} células/ml (Kobayashi,
Kakizono y colaboradores 1991). Las células se separaron por
centrifugación durante 5 min a 16ºC y 4.000 x g (aceleración de la
gravedad), se resuspendieron, y en cada caso 1*10^{8} células se
sembraron en placas sobre filtros de nilón (de Roche). Los filtros
fueron transferidos a placas con el medio OHM (Fábregas, Domínguez y
colaboradores 2000) y se secaron hasta la transformación. Las
partículas de wolframio con un tamaño de 0,4-1,7
\mum, fueron revestidas con 2 \mug del vector de ADN
Plat-pdsMod4.1 según el protocolo de Klein y
colaboradores (Klein, Wolf y colaboradores 1987). Se transformó con
el cañón de partículas PDS-1000/He de la entidad
Bio-Rad a una presión de 1.350 psi (24,5
kg/cm^{2}) y a un vacío de 25 mm de Hg. Por lo demás, se
mantuvieron los ajustes clásicos.
Después de la transformación, las células se
regeneraron sobre el filtro de nilón en el medio líquido OHA (2,42
g de una mezcla de Tris y acetato, de pH 6,8) durante una noche
mediando un ligero sacudimiento en la oscuridad. Después de esto,
las células se separaron brevemente por centrifugación y se
sembraron con OHA Top-agarosa al 0,7% sobre 10
hasta 20 placas con OHA (con 5 \muM de norflurazona). Los primeros
transformantes se pudieron observar después de una fase de
crecimiento de tres a cuatro semanas con un cambio de luz a
oscuridad de 12 horas de luz (de 20 \muE*m^{-2*}s^{-1}) y 12
horas de oscuridad. La eficiencia de la transformación se sitúa en
aproximadamente 1*10^{-6} células/\mug de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Los transformantes positivos se sobreinocularon
múltiples veces sobre unas placas con OHA con una concentración de
norflurazona de 0,7 \muM. El crecimiento de las células WT es
fuertemente inhibido a estas concentraciones. Para realizar la
investigación molecular de los transformantes por medio de unos
análisis por transferencia de borrones Southern, Northern y Western,
los transformantes fueron cultivados en un medio líquido con una
concentración de norflurazona de 3 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de un crecimiento durante cuatro días,
en condiciones normalizadas, en el caso de una concentración de
norflurazona de 3 \muM en un medio líquido, las células se
separaron por centrifugación y se aisló el ADN genómico a partir de
los diferentes transformantes, así como de varios testigos de WT. El
ADN genómico obtenido se digirió con las enzimas de restricción XbaI
y XhoI y se separó sobre un gel de agarosa al 0,8%. El ADN se
transfirió en un borrón según métodos clásicos y se hibridó con una
sonda dirigida contra la PDS (Fig. 5).
En un borrón de transferencia Southern se puede
volver a encontrar manifiestamente la fitoeno desaturasa endógena a
aproximadamente 5,9 kb en todos los transformantes, así como también
en el WT. Las fitoeno desaturasas mutadas, integradas
adicionalmente, se desplazan en todos los casos a más altura que la
fitoeno desaturasa endógena. De otros organismos, tales como, por
ejemplo, del hongo Neurospora crassa, se sabe que los
vectores se integran en el genoma frecuentemente en forma de unas
denominadas repeticiones en tándem (en inglés "tandem
repeats") (Cogoni y Macino 1997). Este fenómeno explica las muy
intensas bandas en los transformantes P6, 7, 11 y P13. El ADN
genómico se hibridó adicionalmente todavía con una sonda dirigida
contra el casete de resistencia frente a ampilicina del vector de
transformación PlatpdsMod4.1. En estas condiciones, en todos los
casos, excepto en el caso del transformante P3, eran reconocibles
varias bandas nítidas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Después de un crecimiento durante cuatro días en
condiciones normalizadas en el caso de una concentración de
norflurazona de 3 \muM en un medio líquido, las células se
separaron por centrifugación y el ARN se aisló a partir de los
diferentes transformantes, así como de varios testigos WT. Para el
análisis ulterior de los modelos de transcripción de los
transformantes, las muestras de ARN se separaron sobre un gel de
agarosa desnaturalizante al 1%, se transfirieron en borrones y se
hibridaron con una sonda dirigida contra el ARNm para la fitoeno
desaturasa (pds) y contra el ARNm para la carotenoide
hidroxilasa (hyd) (Fig. 6A). La hidroxilasa sirve como un
patrón interno, para poder realizar declaraciones sobre el estado de
estrés de los transformantes. La hidroxilasa es inducida en unas
condiciones de estrés tales como un estrés provocado por luz o por
sales y, por lo demás, se presenta en una cantidad situada por
debajo del límite de detección (Steinbrenner y Linden 2001;
Steinbrenner y Linden 2003).
Para la obtención de muestras de proteínas, las
células se cosecharon asimismo después de un crecimiento durante
cuatro días en condiciones normalizadas y se separaron sobre un gel
de SDS-poliacrilamida al 12,5%. La proteína fitoeno
desaturasa se detectó con un anticuerpo específico (Grunewald,
Eckert y colaboradores 2000).
Las células WT, que habían sido sometidas a unas
condiciones de luz intensa permanente (de 120
\muE*m^{-2*}s^{-1}), muestran para la fitoeno desaturasa
(pds) una expresión basal del gen pds en el momento de la
inducción (a las 0 horas). Esta señal aumenta en el transcurso de
18 horas. La carotenoide hidroxilasa se comporta en estas
condiciones de inducción de un modo adecuado, la transcripción está
no obstante algo retardada.
Los modelos de expresión del ARNm para la
fitoeno desaturasa de los transformantes P1, P2, P5 y P6 se han de
comparar con los de la expresión basal del WT a las 0 horas en
condiciones normalizadas. Los niveles de expresión para los
transformantes P8, P9 y P10 se sitúan incluso algo por debajo del
nivel de la expresión basal del WT a las 0 horas. En otros dos
análisis por transferencia de borrón Northern adicionales
independientes, la expresión de los transformantes P8, P9 y P10 se
correspondió con la expresión basal del WT a las 0 horas. Los
transformantes P3, P4, P7, P11, P12 y P13 muestran en este caso un
nivel elevado de transcripción que, en comparación con el del
testigo con luz intensa permanente, se sitúa entre las 0 horas y 18
horas; este hecho se observó asimismo en otros dos análisis por
transferencia de borrón Northern adicionales independientes. En
este caso, el aumento no se puede atribuir a una inducción por
estrés, sino a una incorporación múltiple del vector de
transformación Plat-pdsMod4.1 en el genoma de H.
pluvialis. La expresión de la carotenoide hidroxilasa como
testigo de estrés no muestra en estas condiciones normalizadas
ningún nivel elevado de la transcripción.
En el borrón de transferencia Western con un
anticuerpo dirigido contra la PDS, la cantidad de la proteína
aumenta constantemente hasta llegar al valor a las 36 horas (Fig.
6B).
Las cantidades de proteínas de todos los
transformantes se sitúan ligeramente por encima del valor a las 0
horas del testigo WT. Las cantidades de proteínas de los
transformantes P3, P5, P7, P11 y P13 están nuevamente aumentadas
con respecto a los otros niveles, y se han de comparar con la
cantidad de proteínas del valor a las 18 horas para WT en
condiciones de luz intensa permanente. Los más grandes niveles de
transcripción de la fitoeno desaturasa se pueden encontrar en el
plano de las proteínas en los transformantes P3, P7, P11 y P13.
\vskip1.000000\baselineskip
Algunas plantas superiores con una biosíntesis
modificada de carotenoides, fueron investigadas más detalladamente
en el pasado. Así, tuvo lugar una transformación de tabaco con el
gen de la fitoeno desaturasa crtl de Erwinia
uredovora (Misawa, Yamano y colaboradores 1993). En uno de los
transformantes resultantes, designado con ET4-208,
se comprobó una resistencia más alta frente a norflurazona. Más
tarde se pudo detectar también una composición modificada de
carotenoides en las plantas transgénicas con crtl frente a
unos testigos no transformados (Misawa, Masamoto y colaboradores
1994).
Una posibilidad de investigar modificaciones de
la composición de carotenoides en plantas transgénicas, la
constituye la medición de la fluorescencia de la clorofila. Por una
parte, de esta manera se pueden escrutar muy rápidamente unos
mutantes por fotosíntesis, y, por otra parte, en la fluorescencia de
la clorofila se refleja una modificación de los contenidos de
xantófilas (Niyogi, Bjorkman y colaboradores 1997).
Los diferentes transformantes se cultivaron
sobre placas con OHA sin norflurazona en condiciones normalizadas
durante tres hasta cuatro semanas. Antes de las mediciones, las
placas se adaptaron a la oscuridad durante 24 horas. Mediando
utilización de un fluorímetro PAM (de Walz, Alemania) se midió la
fluorescencia de la clorofila de todos los transformantes y se
calculó la NPQ a través de la siguiente fórmula: NPQ =
(Fº_{m}-F'_{m})/F'_{m}.
Fº_{m} es la fluorescencia máxima de los
organismos adaptados a la oscuridad después de un impulso saturador
de luz. F'_{m} es la fluorescencia máxima después de unos impulsos
saturadores de luz en intervalos definidos; en nuestro caso, los
intervalos estaban situados en 20 s. Un buen artículo de
recopilación acerca de este tema fue redactado por Kate Maxwell y
Giles N. Johnson (Maxwell y Johnson 2000).
Los transformantes medidos mostraron todos
ellos, con las excepciones de P3 y P13, unas curvas de fluorescencia
y unas curvas de NPQ como las del tipo silvestre (WT). La NPQ de los
transformantes P3 y P13 se sitúa en el transcurso global de la
medición aproximadamente en un valor 50% más alto que en el caso del
WT (Fig. 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Los transformantes se cultivaron en condiciones
normalizadas en un medio líquido sin ninguna adición de herbicidas
durante cuatro días, las células se separaron por centrifugación y
los sedimentos se liofilizaron. Se determinaron los pesos en seco
de los sedimentos y las células se trituraron con un mortero
mediando adición de metanol. Las clorofilas se midieron
fotométricamente y fueron saponificadas más tarde mediando adición
de KOH al 6%. Los carotenoides se extrajeron en una mezcla de éter
de petróleo y éter etílico (punto de ebullición
35ºC-60ºC) (9:1 v/v = volumen/volumen), se
concentraron por evaporación y se recogieron en acetona al 100%. Las
muestras se separaron luego en una columna de HPLC (cromatografía
de fase líquida de alto rendimiento).
Tal como resulta bien visible en la Tabla 1, la
distribución porcentual de los carotenoides individuales en el WT y
en el transformante P1 es muy similar. En comparación con esto, las
composiciones de carotenoides se han modificado grandemente en los
transformantes P3 y P13. En el P3, el contenido de xantófilas ha
aumentado aproximadamente en un 6% y el contenido de
\beta-caroteno ha disminuido en comparación con el
WT en el orden de este valor. En el transformante P13, el contenido
de violaxantina ha aumentado aproximadamente en un 3%. La
zeaxantina, que participa directamente en el proceso de NPQ, no
puede ser medida en las condiciones normalizadas. Para ello serían
necesarias unas mediciones por HPLC de células estresadas por luz
intensa. El aumento de los contenidos de violaxantina
aproximadamente en un 3% de los transformantes P3 y P13 permite
establecer, de todas formas, un acoplamiento directo con la NPQ
aumentada de estos transformantes, ya que la agrupación de
violaxantina en condiciones de luz intensa es transformada en
zeaxantina.
\vskip1.000000\baselineskip
Es conocido el hecho de que la expresión
heteróloga del gen pds procedente de Erwinia uredovora en
tabaco modifica la composición de los carotenoides en la hoja
(Misawa y colaboradores (1994)). El análisis de unos mutantes de
Synechococcus, que son resistentes frente a norflurazona, confirmó
que la desaturación del fitoeno en el caso de la biosíntesis de
carotenoides es la etapa determinante de la velocidad en
cianobacterias (Chamovitz y colaboradores (1993)). Para realizar la
confirmación de estos resultados, los transformantes P3, P13 y el
WT de H. pluvialis se cultivaron en condiciones de luz débil,
y se extrajeron todos los carotenoides. Ninguno de los
transformantes investigados mostró, en comparación con el peso en
seco, unas cantidades modificadas de carotenoides. Un análisis por
HPLC, que se llevó a cabo seguidamente, de la composición de
carotenoides en los transformantes P3, P13 y en el WT, mostró para
el transformante P3 una cantidad ligeramente aumentada de la
xantofila violaxantina, al contrario de lo cual, las cantidades de
luteína y neoxantina habían disminuido ligeramente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los experimentos con luz intensa, las
células de H. pluvialis se cultivaron durante 4 días en
condiciones normalizadas. Después de este período de tiempo, la
intensidad de la luz aumentó desde 20 \muEm^{-2'}s^{-1} hasta
175 \muEm^{-2'}s^{-1},y el ritmo de luz y oscuridad se aumentó
a 24 horas de luz permanente. En determinados momentos (a las 0, 6,
12, 24, 48 y 72 horas) después de una inducción, se sacaron unas
muestras y éstas se separaron por centrifugación. La extracción de
los carotenoides se llevó a cabo según el método de Boussiba y
colaboradores (1992). De este modo, se determinó el peso en seco
(TG, acrónimo del alemán "TrockenGewicht") de las células
liofilizadas, y mediando adición de arena de mar, de metanol al 30%
y de KOH al 5%, ellas fueron trituradas de nuevo con un mortero.
Después de la saponificación de las clorofilas durante 10 min a
70ºC, las muestras se separaron por centrifugación durante 5 min a
4.000 rpm (revoluciones por minuto) y se desechó el material
sobrenadante que contenía clorofila. El sedimento se recogió en DMSO
(dimetilsulfóxido) al 100% y se calentó durante 10 min a 70ºC. Esta
etapa de extracción se repitió tantas veces hasta que el sedimento
ya no mostró ninguna coloración rojiza. La astaxantina y sus ésteres
muestran su punto máximo de absorción principal a 492 nm. No
obstante, se prescindió de una medición a esta longitud de onda, ya
que los carotenoides totales (predominantemente
\beta-caroteno, luteína y violaxantina) también
mostraban una absorción en esta región de longitudes de onda. Así,
mediando toma de ayuda de un patrón de astaxantina (de Sigma, en
DMSO (dimetil-sulfóxido) al 100%), se determinó un
factor de cálculo, que permitió determinar el contenido de
astaxantina en una región de longitudes de onda (550 nm), en la que
los carotenoides totales ya no mostraban ninguna absorción. Así, la
absorción del patrón de astaxantina se midió en primer lugar a una
longitud de onda de 492 nm (A_{492}) y a continuación a una
longitud de onda de 550 nm (A_{550}). Con el cociente
A_{492}/A_{550} = 3,2 se multiplicaron entonces los valores de
absorción medidos a 550 nm y se calculó el contenido de astaxantina
con un coeficiente de absorción para la astaxantina (E1%/1 cm =
2.220) de acuerdo con la fórmula de Davies (1976).
A las seis horas después de la modificación de
las condiciones de luz, todavía no se podía detectar nada de
astaxantina (Fig. 8). Después de una exposición a luz intensa
durante 8 h, el transformante P3 mostró un fenotipo visiblemente
rojo, mientras que el WT y los otros transformantes permanecieron de
color verde. A las 12 horas después de una inducción, la cantidad
de astaxantina formada estaba situada en el WT y en el transformante
P13 en 1,47 mg/g de TG y en 1,32 mg/g de TG respectivamente. Al
contrario de esto, el valor alcanzado para el transformante P3
estaba situado en 2,37 mg/g de TG. Después de 24 horas, la cantidad
medida de astaxantina del WT o respectivamente del transformante
P13 estaba situada en 3,48 mg/g de TG o en 3,79 mg/g de TG
respectivamente. El transformante P3 mostró en este momento, con
una cantidad de astaxantina de 6,22 mg/g de TG, un aumento de
aproximadamente 40% con relación al tipo silvestre. Después de 48
horas bajo luz intensa permanente, el WT o respectivamente el
transformante P13 mostraron unos valores de 8,6 \pm 1,4 mg/g de TG
o respectivamente de 8,4 \pm 1,6 mg/g de TG. Una acumulación de
astaxantina, aumentada en un 28% en comparación con el WT o
respectivamente con el P3, se pudo determinar después de 48 horas
para el transformante P3 (11,4 \pm 0,9 mg/g de TG). 72 horas
después de un estrés por luz permanente, el WT o respectivamente el
transformante P13 mostraron una cantidad de 10,5 mg/g de TG y de
10,1 mg/g de TG, realizándose que el transformante P3, con un valor
de 12,1 mg/g de TG, mostró una acumulación de astaxantina más alta
en un 14%.
El transformante P3 se diferenció, por
consiguiente, grandemente en lo que respecta a su acumulación de
astaxantina bajo una luz intensa permanente en comparación con el
transformante P13 y con el WT. En el transcurso del experimento con
luz intensa, el P3 mostró, en comparación con el WT, un aumento de
las cantidades de astaxantina de aproximadamente un 40% después de
24 horas. Esta diferencia disminuye a 26% después de 48 horas, y
después de 72 horas alcanza un valor de 14%.
Los resultados muestran que, en H.
pluvialis, la etapa de desaturación del fitoeno en condiciones
de luz intensa es determinante para la velocidad, pero no lo es en
condiciones de luz débil.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediando la utilización de la plataforma de
transformación Plat-pdsMod4.1, se produjeron unos
plásmidos de transformación con los promotores del gen de actina o
de la ribulosa-bisfosfato carboxilasa con un
subsiguiente sitio de clonación para diversas endonucleasas de
restricción; ambs promotores se aislaron a partir de una biblioteca
de ADN genómico. Estas plataformas contienen además la región no
traducida en 3' de los respectivos genes, que sirven también como
una señal de poliadenilación para los ADNc (cromosomales)
incorporados. Por medio de una PCR se amplificaron los ADNc de la
carotenoide hidroxilasa y de la \beta-caroteno
cetolasa, y éstos fueron provistos de unos sitios de corte por
restricción situados en los extremos. De esta manera resultó la
posibilidad de incorporar estos ADNc dentro del cuadro de lectura en
la plataforma de transformación. Las respectivas construcciones
artificiales se produjeron también para los ADN genómicos de ambos
genes para la biosíntesis de carotenoides. En la Fig. 9 se
representa un vector de transformación para la expresión
constitutiva del gen de la hidroxilasa bajo el control de la
subunidad pequeña de Rubisco.
Para los ADNc y las secuencias genómicas de la
hidroxilasa se clonaron tres construcciones artificiales bajo el
control de un promotor de actina con diferentes comienzos de la
traducción, y en cada caso una construcción artificial bajo el
control del promotor de Rubisco, y se transformaron en el seno de
H. pluvialis. Las presiones de selección se redujeron desde
5 \muM hasta 3 \muM mediante una disminución de la concentración
de norflurazona. De este modo se deberían obtener también unos
transformantes, que poseen por una parte una resistencia más
pequeña frente a norflurazona, y cuyas probabilidades de crecimiento
empeoraron, por otra parte, debido a un desplazamiento del
equilibrio metabólico en dirección a la zeaxantina o cantaxantina.
Un desplazamiento de este equilibrio podría significar, por
ejemplo, una formación disminuida de luteína, que, desempeña un
cometido importante en la acumulación de complejos con antenas en la
membrana de los tilacoides. La formación de la clorofila o también
la formación de tocoferoles podrían ser afectadas asimismo por un
tal desplazamiento, puesto que ésta/éstos se separan asimismo de la
biosíntesis muy temprana de los isoprenoides.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la transformación, las colonias
obtenidas se sobreinocularon con norflurazona sobre otras
adicionales placas de medio nutricio. Después de esto, a partir de
cada construcción artificial se sobreinocularon 15 transformantes en
un medio líquido bajo una presión selectiva muy débil.
Después de una fase adicional de crecimiento, en
la que ninguno de los transformantes inoculados mostró una
manifiesta acumulación de carotenoides del tipo de cantaxantina o
zeaxantina, las células se expusieron durante 24 horas a una luz
intensa (de 120 \muE*m^{-2*}s^{-1}).
Los transformantes, que habían sido
transformados con las construcciones artificiales de hidroxilasa a
base de un ADN genómico bajo el control del promotor de Rubisco
(Plat-rbcS2gHyd) y del segundo promotor de actina
(Plat-ActPII-gHyd) (segundo comienzo
de la traducción con un intrón), mostraron, en comparación con los
transformantes de las otras construcciones artificiales de la
hidroxilasa, unas células más coloreadas de
rojo-parduzco.
En el caso de los transformantes de las
construcciones artificiales de la cetolasa, se investigaron
ulteriormente los que habían sido transformados con el ADNc y con el
gen de la cetolasa, bajo el control del segundo promotor de actina
(Plat-ActPIIgBkt y PlatActPIIcBkt) (segundo comienzo
de la traducción con un intrón).
\vskip1.000000\baselineskip
Entre los en cada caso 15 transformantes que
habían sido escrutados previamente, se escogieron 10 y se cultivaron
ulteriormente para realizar investigaciones de biología molecular.
Después de haber aislado los ADN genómicos de los transformantes
individuales, éstos fueron digeridos por restricción y separados
sobre un gel de agarosa, transferidos en borrones e hibridados con
una sonda dirigida contra la hidroxilasa. Entre los 10
transformantes, que estaban bajo el control del segundo promotor de
actina (Plat-ActPII-gHyd), dos
transformantes mostraron inequívocamente unas copias adicionales de
la hidroxilasa en el genoma. Entre los 10 transformantes, que habían
sido puestos bajo el control del promotor de Rubisco
(Plat-rbcS2gHyd), eran positivos 6 con copias
adicionales en el genoma. La disminución de la concentración de
norflurazona en las placas de selección en favor de los
transformantes perjudicados en su crecimiento, repercute de un modo
inequívocamente negativo sobre la selección.
Desde los transformantes remanentes se extrajo
el ARN y se separó sobre un gel desnaturalizante de agarosa, se
transfirió en borrón y se hibridó con una sonda dirigida contra el
ARNm para la hidroxilasa. Dos de los transformantes mostraron un
nivel aumentado de transcritos del ARNm para la hidroxilasa. Los
experimentos testigos con otras sondas dirigidas contra genes de la
biosíntesis de carotenoides, la \beta-licopina
ciclasa y la fitoeno sintasa, mostraron en el caso de estos dos
transformantes asimismo un nivel aumentado de transcritos.
\vskip1.000000\baselineskip
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de Erwinia uredovora en plantas transgénicas que muestran un aumento
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carotenoide hidroxilasa durante la formación de astaxantina inducida
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una rata inducida por azoximetano por administración dietética de
las xantófilas que se presentan en la naturaleza, astaxantina y
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Peter und Traudl
Engelhorn-Stiftung zur Förderung der
Biotechnologie
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Biosíntesis de astaxantina en
eucariotas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 34309P DE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 10 2005 049 072.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2005-10-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6.149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> H. pluvialis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen pds
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 570
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> H. pluvialis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fitoeno desaturasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 569
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> H. pluvialis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de proteína de la fitoeno
desaturasa con el intercambio Leu504Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácido nucleico del MCS
del vector conforme al invento Plat-pdsMOD4.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8.742
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de ADN
Plat-pdsMOD4.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.187
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de SmaI del promotor de
actina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1.300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de PstI del promotor de
rbsc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagcagaa gtaccgcgcc tccatggagg g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctccatgg aggcgcggta cttctgcttg g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 474
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> synechococcusPCC7942
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fitoeno desaturasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (24)
1. Un vector que comprende
- (a)
- una secuencia de ADN, que codifica la proteína fitoeno desaturasa, la cual posee en una posición una sustitución de aminoácidos que confiere una resistencia frente a herbicidas, y
- (b)
- un sitio de clonación múltiple (MCS), en el que se puede introducir por clonación una secuencia arbitraria de ADN, realizándose que la secuencia de ADN que codifica la proteína fitoeno desaturasa, tomando en cuenta la degeneración del código genético, codifica una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:2, teniendo la proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:2 un intercambio de aminoácidos de leucina por arginina en la posición 504.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Vector de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el vector posee una secuencia de ADN
(a), que confiere a los transformantes una resistencia frente a
herbicidas.
3. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el vector posee
una secuencia de ADN (a), que confiere a los transformantes una
resistencia frente a herbicidas blanqueadores.
4. Vector de acuerdo con la reivindicación 3,
caracterizado porque el herbicida blanqueador es
norflurazona.
5. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque posee la
secuencia de ADN SEQ ID NO:5.
6. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado porque la secuencia
ADN arbitraria, que debe de ser introducida por clonación en el MCS,
es una secuencia codificadora.
7. Vector de acuerdo con la reivindicación 6,
caracterizado porque la secuencia codificadora es de
procedencia vegetal.
8. Vector de acuerdo con la reivindicación 7,
caracterizado porque la secuencia codificadora contiene por
lo menos una secuencia de un promotor.
9. Vector de acuerdo con la reivindicación 8,
caracterizado porque las secuencias de promotores se escogen
entre el conjunto que se compone de los promotores de
Haematococcus del gen de actina y del gen de Rubisco.
10. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado porque la secuencia
codificadora, junto a por lo menos un gen de promotor, contiene un
gen funcional que se ha de expresar.
11. Vector de acuerdo con la reivindicación 10,
caracterizado porque la secuencia codificadora se escoge
entre el conjunto que se compone de los genes para la biosíntesis de
carotenoides, los genes para la biosíntesis de astaxantina y los
genes para la biosíntesis de isoprenoides.
12. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizado porque el vector
se produce a partir de un vector obtenible libremente.
13. Utilización de un vector de acuerdo con una
de las reivindicaciones 1 hasta 12 para la transformación de células
eucarióticas.
14. Utilización de acuerdo con la reivindicación
13 para la transformación de células de plantas unicelulares.
15. Utilización de acuerdo con la reivindicación
13 ó 14 para la transformación de células de algas.
16. Utilización de acuerdo con la reivindicación
15 para la transformación de células de H. pluvialis.
17. Utilización del vector de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 hasta 12 como marcador selectivo para la
transformación.
18. Utilización del vector de acuerdo con la
reivindicación 17 como marcador selectivo dominante para la
transformación.
19. Procedimiento para realizar una
transformación, caracterizado porque se utiliza un vector de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 12.
20. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, caracterizado porque la transformación se
lleva a cabo mediante un bombardeo con partículas.
21. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 19 o 20, caracterizado porque el bombardeo
con partículas se lleva a cabo con unas partículas de wolframio, que
tienen un tamaño de 0,4-1,7 \mum, a una presión de
500-2.500 psi y en vacío.
22. Célula de planta transgénica y sus
descendientes, caracterizada/os porque contiene(n) un
vector de acuerdo con la reivindicación 1 en su genoma nuclear.
23. Célula de planta transgénica y sus
descendientes de acuerdo con la reivindicación 22,
caracterizada/os porque tiene(n) una incorporación
simple o múltiple del ADN introducido en el genoma nuclear.
24. Célula de planta transgénica y sus
descendientes de acuerdo con una de las reivindicaciones 22 y 23,
caracterizada/os porque el gen introducido es expresado
constitutivamente.
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