KR101259682B1

KR101259682B1 - 미세조류 유래 베타카로틴 케톨레이제（ｋｅｔｏｌａｓｅ）유전자 및 이를 이용한 케토형 카로티노이드 생산과 동시에 베타카로틴 증산하는 형질전환 식물체 제조 방법

Info

Publication number: KR101259682B1
Application number: KR1020100107289A
Authority: KR
Inventors: 배정명; 안미정; 하선화; 백경환; 이신우
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2013-05-02
Also published as: KR20120045631A

Abstract

본 발명은 미세조류 유래 HpBkt 유전자의 cDNA, 상기 cDNA와 ibAGP1 프로모터, 그리고 ibAGP1 전분체 이동신호를 포함하는 식물 형질전환용 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 생산한 형질전환 식물체에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의한 미세조류 HpBkt 유전자의 cDNA와 ibAGP1 프로모터, 그리고 ibAGP1 전분체 이동신호를 이용한 형질전환 당근에서는 케토형 카로티노이드가 생산되었으며, 동시에 베타카로틴의 함량이 최대 2.5배 증가하였다. 따라서 이 유전자는 ibAGP1 프로모터와 ibAGP1 전분체 이동신호와 함께 사용하였을 시에 케토형 카로티노이드 생산과 동시에 베타카로틴의 함량을 증가시킬 수 있는 형질전환 식물체 제작에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

미세조류 유래 베타카로틴 케톨레이제（ｋｅｔｏｌａｓｅ）유전자 및 이를 이용한 케토형 카로티노이드 생산과 동시에 베타카로틴 증산하는 형질전환 식물체 제조 방법{Haematococcus pluvialis beta-carotene ketolase cDNA and method for generation of transgenic plants producing keto-carotenoids and higher level of beta-carotene using the same}

본 발명은 케토형 카로티노이드 생산 및 베타카로틴 증산용 형질전환 식물체 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 미세조류 (藻類) 유래 베타카로틴 케톨레이제 (HpBkt) cDNA와 ibAGP1 프로모터, 그리고 ibAGP1 유전자 유래 전분체 이동신호(TP1: Transit peptide of ibAGP1)를 사용하여 케토형 카로티노이드를 생산하고 동시에 베타카로틴 함량이 증가된 형질전환 식물체 제조 방법에 관한 것이다.

카로티노이드는 천연 색소로써 식물, 몇몇 세균 및 곰팡이 등에서 합성된다. 식물에서 카로티노이드는 광합성이 일어나는 막에서 광포획 안테나의 중요 성분으로 사용되며, 광합성 기구들이 광산화되는 것을 방지한다. 카로티노이드는 식물 호르몬인 앱시스산의 전구체이기도 하다. 한편, 동물들은 이 카로티노이드 색소를 합성하지 못하므로 반드시 음식물을 통해 섭취하여야 한다. 카로티노이드의 일종인 베타카로틴은 독성 산소에 의한 유전자, 효소, 세포막 등의 파손 등을 막아주는 강력한 항산화제이다. 한편, 케토형 카로티노이드는 그 구조에 있어서 직선 체인 혹은 β-ionone 고리에 한 개 이상의 케토 그룹을 함유하고 있으며 특히 매우 높은 항산화능이 있어서 광에 안정적인 색소이다.

케토형 카로티노이드의 일종인 아스타잔틴 (astaxanthin)은 많은 수생 동물들의 천연 먹잇감에 존재한다. 아스타잔틴의 노화나 암의 원인이 되는 유해 활성 산소를 제거해 주는 항산화 능력이 기존의 천연물 중 가장 효능이 높다고 알려져 있는 비타민 E 보다 550-1000배 정도의 높은 항산화능을 가지고 있어서 (Miki, 1991, Pure and Applied Chemistry 63, 141-146; Iwamoto et al., 2000, 7, 216-222) 식품 첨가물, 천연 색소, 그리고 사료 첨가물 등으로 널리 쓰인다. 특히, 항산화능이 강한 베타카로틴 및 아스타잔틴을 가축 사료에 첨가하는 경우 가축의 면역력 증대 및 생산성이 증대되는 것으로 알려져 있다. 아스타잔틴은 베타카로틴의 양쪽 말단의 ionone 그룹에 3-수산화, 그리고 4-케토화에 의해 합성이 된다 (Sandmann, 2001, Archives of Biochemistry and Biophysics 385, 4-12). 수산화 반응을 매개하는 베타카로틴 수산화효소 (hydroxylase)는 다수의 생물체에 존재하지만, 베타카로틴 케톨레이제 (ketolase)는 몇몇 박테리아, 곰팡이, 그리고 단세포 녹조류 등의 생물체에만 존재한다 (Johnson and An, 1991, Critical Reviews in Biotechnology 11, 297-326).

카로티노이드 합성에 관련된 유전자들이 식물 (Cunningham and Gantt, 1998, 49, 557-583; Hirschberg 2001, Plant Biol. 4, 210-218; Fraser and Bramley, 2004, Prog Lipid Res 43, 228-265; Just et al., 2007, 114, 693-704; Clotault et al., 2008, 59, 3563-3573), 녹조류 (Lotan and Hirschberg, 1995, FEBS Lett 364, 125-128), 이스트 (Visser et al., 2003, FEMS Yeast Res. 4, 221-231), 그리고 박테리아 (Goodwin 1980, The biochemistry of the carotenoids, vol 1, 2^ndedn.Chapman and Hall, London)에서 확인이 되어 클로닝 되었다. 이런 카로티노이드 합성 관련 유전자들을 이용한 유전자 조작에 의해 토마토, 당근, 감자, 카놀라, 벼 등에서 전체 카로티노이드 함량이나 특정 카로티노이드 함량 조절이 보고된 바 있다 (reviewed in Fraser and Bramley, 2004, Prog Lipid Res 43, 228-265; Yu et al., 2008, Transgenic Res. 17, 573-585). 식물에서는 아도니스 (Adonis) 꽃과 같은 극히 드문 경우를 제외하고는 케토형 카로티노이드가 합성되지 않는다 (Seybold and Goodwin, 1959, Nature 184, 1714-1715; Renstorm et al., 1981, Biochem Syst. Ecol 9, 249-250). 박테리아 혹은 녹조류에서 유래한 베타카로틴 케톨레이제 (ketolase)를 이용하여 식물에서 케토형 카로티노이드를 성공적으로 합성하였다 (Mann et al., 2000, Nature Biotechnology 18, 888-892; Stalberg et al., 2003, Plant Journal 36, 771-779; Gerjets and Sandmann, 2006, Journal of Experimental Botany 57, 3639-3645; Jayaraj et al., 2008, Transgenic Research 17, 489-501).

하지만 베타카로틴 케톨레이제 (ketolase)를 이용하여 케토형 카로티노이드를 생산할 때의 문제점은 케토형 카로티노이드 생산 형질전환체에서 베타카로틴의 함량이 감소하는 것이다 (Mann et al., 2000, Nature Biotechnology 18, 888-892; Gerjets and Sandmann, 2006, Journal of Experimental Botany 57, 3639-3645; Jayaraj et al., 2008, Transgenic Research 17, 489-501). 특히, 가축의 사료로 많이 사용하는 당근의 경우 이러한 베타카로틴 함량의 감소가 현저하였다 (Jayaraj et al., 2008, Transgenic Research 17, 489-501). 베타카로틴 역시 강한 항산화제임을 고려할 때 이러한 베타카로틴의 함량이 감소된 당근은 가축사료용 당근으로써의 상품성은 매우 떨어진다고 볼 수 있다. 이것을 극복하기 위해 베타카로틴 케톨레이제 (ketolase) 유전자 외에 카로티노이드 합성 관련 유전자들을 동시에 형질전환 시켜서 두 개 이상의 유전자를 과다발현 시켰으며, 이렇게 제작된 형질전환체에서는 전체 베타카로틴 함량의 감소 없이 케토형 카로티노이드를 생산할 수 있었다 (Ralley et al., 2004, Plant Journal 39, 477-486; Fujisawa et al., 2009, Journal of Experimental Botany 60, 1319-1332; Hasunuma et al., 2008, Plant Journal 55, 857-868). 하지만 두 개 이상의 유전자가 삽입된 형질전환 식물을 제작하기 위해서는 한 개의 유전자가 삽입된 형질전환체를 제작하는 것에 비해 시간과 노력이 훨씬 더 많이 소요된다.

따라서 베타카로틴 케톨레이제 (ketolase) 유전자 한 개가 삽입된 형질전환 식물체에서 베타카로틴 함량의 감소 없이 케토형 카로티노이드를 생산 할 수 있는 형질전환체, 혹은 케토형 카로티노이드 생산과 동시에 베타카로틴 함량을 증가 시킬 수 있는 형질전환 식물체 제작에 대한 요구가 계속적으로 있어 왔다.

본 발명은 상기 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 미세조류 유래 베타카로틴 케톨레이제 (ketolase) HpBkt 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 ibAGP1 프로모터와 ibAGP1 전분체 이동신호의 조절을 받는 HpBkt 유전자의 cDNA를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 형질전환 식물체에서 케토형 카로티노이드를 생산하고 동시에 베타카로틴 함량을 증가시키고자 하는 경우, 상기 ibAGP1 프로모터와 ibAGP1 전분체 이동신호의 조절을 받는 HpBkt 유전자의 cDNA를 포함하는 벡터를 이용하여 제조된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 형질전환 식물체에서 케토형 카로티노이드를 생산함과 동시에 베타카로틴 함량을 증가시키기 위한 형질전환 식물체 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 미세조류 (Haematococcus pluvialis strain UTEX 16)로부터 HpBkt 유전자의 cDNA를 클로닝하여 ibAGP1 프로모터와 ibAGP1 전분체 이동신호에 연결하여, 식물체 형질 전환용 발현 벡터를 제작하였으며 동일 벡터를 이용하여 당근 형질전환체를 제작하여 그 카로티노이드 함량을 확인한 바 케토형 카로티노이드가 생산되었으며, 베타카로틴의 함량 역시 증가한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자(HpBkt)를 제공한다.

상기 유전자는 미세조류 (Haematococcus pluvialis strain UTEX 16)의 베타카로틴 케톨레이제 유전자 (HpBkt)의 cDNA에서 유래된 것임을 특징으로 한다.

상기 cDNA 염기서열은 총 990 bp의 ORF (Open Reading Frame: 서열번호 1; 330개 아미노산) 로 이루어짐을 특징으로 한다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 서열의 유전자를 제공한다.

본 발명의 다른 양태는 상기 유전자 및 ibAGP1 프로모터와 ibAGP1 전분체 이동신호를 포함하는 식물 형질전환용 바이너리 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 유전자 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 상기 식물체 형질전환용 벡터는 외래 유전자를 도입된 식물체 내에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 형질전환용 바이너리 벡터이다.

또한, 상기 본 발명에 의한 조류 HpBkt cDNA는 pMBP1 벡터 상의 ibAGP1 프로모터와 NOS 터미네이터 사이에 위치할 수 있다. 본 발명에서는 pMBP1 벡터를 사용하였으나, 다른 식물 형질전환용 벡터로 치환할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

상기 바이너리 벡터는 아그로박테리움을 이용하는 방법, 혹은 유전자 총을 이용한 방법 등으로 식물체를 형질전환시킬 수 있다. 본 발명에서는 그 예로서 아그로박테리움을 이용하여 당근에 형질전환시켰다.

본 발명에서 상기 식물체는 특별히 제한이 있는 것은 아니나, 당근과 같은 베타카로틴 함량이 높은 작물이 바람직하다. 본 발명에 의한 조류 HpBkt 유전자의 cDNA는 당근 외에도 케토형 카로티노이드를 생산하고자 하는 어떤 식물에도 도입될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 ibAGP1 프로모터는 이에 한정되는 것은 아니나 NCBI ACCESSION NO.: AY694185 (서열번호 3)가 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 ibAGP1 전분체 이동신호는 이에 한정되는 것은 아니나 TP1 (NCBI ACCESSION NO.: Z79635 (서열번호 4))이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 HpBkt 유전자를 ibAGP1 프로모터와 ibAGP1 전분체 이동신호에 의해 조절 받는 식물 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물에서 케토형 카로티노이드를 생산하는 동시에 베타카로틴 함량이 증가된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기와 같이 본 발명에 의해 케토형 카로티노이드를 생산하면 전체 베타카로틴 함량 역시 증가되는 이점이 있다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 HpBkt 유전자를 ibAGP1 프로모터와 ibAGP1 전분체 이동신호에 의해 조절되는 식물 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 케토형 카로티노이드 및 베타카로틴을 동시에 생합성하는 방법을 제공한다. 상기한 본 발명에 의하면 사료첨가제, 화장품, 식품 착색제, 항산화제, 항암제 등의 유용한 용도를 갖는 아스타잔틴 등을 안전하게 생합성으로 대량 생산이 가능하다.

상술한 바와 같이 본 발명은 ibAGP1 프로모터의 조절을 받는 미세조류 (Haematococcus pluvialis strain UTEX 16) 유래 HpBkt 유전자에 관한 것으로서, 상기 유전자는 ibAGP1 프로모터 및 ibAGP1 전분체 이동신호와 함께 사용하였을 시에 식물체에서 케토형 카로티노이드의 합성과 동시에 베타카로틴 함량이 최대 2.5배 증가를 가능하게 할 수 있다. 그러므로 본 발명은 케토형 카로티노이드 생산과 동시에 베타카로틴 함량이 증대된 식물 형질전환체 개발에 효과적으로 이용될 수 있는 매우 유용한 발명이다.

도 1은 본 발명에 의한 미세조류 유래 HpBkt 유전자의 cDNA 클로닝 과정을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에 의한 미세조류 유래 HpBkt 유전자의 cDNA와 ibAGP1 프로모터, 그리고 ibAGP1 전분체 이동신호를 포함하는 식물 형질전환용 벡터 제작에 관한 과정을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 의한 미세조류 유래 HpBkt 유전자의 cDNA가 삽입된 당근 형질전환체에서 유전자 삽입을 확인한 도면으로, M은 사이즈 마커; WT는 야생형 (wild-type)이다.
도 4는 본 발명에 의한 미세조류 유래 HpBkt 유전자의 cDNA가 삽입된 당근 형질전환체를 보여주는 도면이다.
도 5는 본 발명에 의한 미세조류 유래 HpBkt 유전자의 cDNA가 삽입된 당근 형질전환체의 저장뿌리에서 HpBkt 유전자의 발현을 확인한 도면이다.
도 6은 본 발명에 의한 미세조류 유래 HpBkt 유전자의 cDNA가 삽입된 당근 형질전환체 저장뿌리의 절단면을 나타내는 도면이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 미세조류 HpBkt 유전자의 cDNA 클로닝 및 염기서열 분석

아스타잔틴을 생성하는 미세조류로부터 HpBkt 유전자의 클로닝을 위해 인하대(이철균 교수)로부터 제공받은 미세조류 (Haematococcus pluvialis strain UTEX 16) 배양 시료 약 1g을 액체질소를 이용하여 막자사발로 분쇄하여 2 ml 튜브에 옮긴 다음 각 튜브에 500 ㎕의 RNA 추출 완충액 (50mM sodium acetate pH 5.5, 150mM LiCl, 5mM EDTA, 0.5% SDS)과 500 ㎕ 페놀을 넣고 혼합하였다. 혼합액을 65℃에서 10분 동안 처리한 후 상온에서 15분 동안 교반기 (rotary shaker)를 이용해 섞어주었다. 4℃ 에서 원심분리(10000rpm, 10분)한 후 상등액 층을 조심스럽게 새 튜브에 옮기고, 클로로포름 500㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 다시 원심분리 하여 상등액을 취하였다. 여기에 0.6배 부피의 8M 리튬 크로라이드 (LiCl)를 첨가한 후 -20℃에 2시간 이상 보관하였다. 4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심분리 후 RNA 침전물을 4M LiCl와 80% 에탄올로 각각 한차례씩 씻어준 후 수득한 최종 RNA 침전물을 50㎕의 증류수에 녹였다. RNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기 (UV spectrophotometer)를 이용하여 A₂₆₀/A₂₈₀를 측정하여 정량한 후 이용하였다.

이를 주형으로 이미 보고된 베타카로틴 C-4 oxygenase cDNA (NCBI accession number X86782) 염기서열에 근거하여 제작된 프라이머 세트 (5'-ATGCAGCTAGCAGCGAC-3': 서열번호 5)와 (5'-CTAGGCAGGAACCAGAC-3': 서열번호 6)를 사용하여 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)의 방법으로 본 발명에 사용된 HpBkt 유전자를 분리하였다. 이 때 RT-PCR 반응은 추출한 전체 RNA 약 2㎍ 주형으로 50uM 올리고 dT(oligo dT) 프라이머를 이용해 55℃에서 20분, 99℃에서 5분 처리 후 얼음에서 식힌 후 여기에 다시 RNase H를 1㎕를 첨가하고 37℃에서 20분간 처리하여 cDNA를 합성(10X RT buffer, 25mM MgCl_2,0.1M DTT, RNase OUT, SuperScript^TM RT)하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 상기 프라이머 각각 10pmol를 사용하여 10x Taq 중합효소 버퍼, 250uM MgCl_2,100uM dNTP, 1 unit Ex-Taq 중합효소(Takara)를 총 20㎕가 되도록 섞은 후, 94℃ 3분; 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 30 사이클; 75℃ 5분의 조건으로 수행하였다.

증폭된 PCR 산물을 아가로스 젤에 전기영동하여 사이즈를 확인 한 후 (도 1) PCR 클로닝 전용 벡터인 pGEM-T easy (Promega)에 클로닝하였으며, 이를 pGEM-HpBkt 벡터라고 하였다. 벡터에 삽입한 후 플라스미드 DNA를 추출하여 염기서열을 결정한 후 분석하였다. 클로닝된 HpBkt cDNA는 총 990 bp로서 번역 개시 코돈인 메티오닌부터 번역 stop 코돈까지 총 330개의 아미노산으로 이루어진 ORF를 encoding하고 있었다. HpBkt cDNA의 염기서열은 이미 보고된 베타카로틴 C-4 oxygenase (NCBI accession number X86782) cDNA의 염기서열과 97.5%, 그리고 그 아미노산 서열과 97.6% 상동성을 보였다. 한편, 또 다른 베타카로틴 C-4 oxygenase (NCBI accession number DQ086233)의 염기서열과는 1 bp를 제외한 모든 염기서열이 일치하였으며, 아미노산 서열은 100% 일치하였다.

실시예 2 : 바이너리 벡터 제작

HpBkt 유전자의 cDNA를 고구마 유래 ibAGP1 프로모터 (NCBI ACCESSION NO.: AY694185 (서열번호 3))에 의해 발현하도록 한 후, 발현된 HpBkt 유전자를 전분체 이동신호 (TP1: NCBI ACCESSION NO.: Z79635 (서열번호 4))를 이용하여 엽록체내로 타겟팅할 수 있는 벡터를 제작하고자 하였다 (도 2). 확보되어진 1kb 유전자의 염기서열을 근거로 BamH I 제한효소 인식부위를 첨가시킨 (5'-gacggatccATGCAGCTAGCAGCGACA-3': 서열번호 7) 프라이머와 Sac I 제한효소 인식부위를 첨가시킨 5'-gacgagctcCTAGGCAGGAACCAGACC-3': 서열번호 8) 프라이머를 작성하여 전체 1kb의 유전자 부위를 PCR로 증폭시킨 후, 이 PCR 산물을 BamH I과 Sac I 제한요소를 이용하여 GUS 유전자를 제거시킨 pBI101 벡터에 삽입시켰다. 이후, ibAGP1 프로모터 염기서열과 이에 결합되어진 전분체 이동신호 염기서열 벡터 (ibAGP1:TP1:GUS)를 근거로 SalI 제한효소 인식부위를 첨가시킨 (5'-cgagtcgacACTGATACTTTGGTGACT: 서열번호 9) 프라이머와 Xba I 제한효소 인식부위를 첨가시킨 프라이머(5'-gactctagaCTGCGAATTCTGCGAATC: 서열번호 10)를 이용하여, 전분체 이동신호를 포함한 전체 2.4kb ibAGP1 프로모터 + TP1을 PCR로 증폭시켰으며, 이 PCR 산물을 HpBkt 유전자가 삽입된 pBI101 벡터에 삽입 시켰다. 이렇게 제작된 벡터를 E.coli 내로 형질전환시킨 후 증폭시켜, 이를 분리하여 Sal I 과 Xba I으로 처리하여 삽입한 유전자가 잘 들어가 있는지 확인하였고 (도 2), TP1과 HpBkt 유전자 사이의 frame의 유지 여부는 E.coli의 플라스미드를 추출한 후 염기서열을 결정하여 확인 하였다. 확인된 벡터(ibAGP1:TP1:HpBkt)를 당근 형질전환에 사용하기 위해 Agrobacterium LBA4404에 형질전환시켰으며, 형질전환 후 colony PCR을 이용하여 벡터가 Agrobacterium 내로 잘 들어가 있는지 확인하였다 (도 2).

실시예 3 : 당근 형질전환체 제조

실시예 2에서 제작된 ibAGP1:TP1:HpBkt 벡터가 삽입되어져 있는 pBI101을 Agrobacteria LBA4404에 transformation 시킨 후 M9 배지에 이틀 동안 배양한 후 형질전환을 위해 공동배양에 사용하였다. 기내에서 키운 하파5촌당근(신젠타종묘)은 하배축이 자라나도록 MS 배지에 키운 후 하배축이 0.5-1.0 cm 크기로 자라나면, 하배축을 절단하여 암상태로 25℃에서 이틀 동안 MS 액체 배지에서 배양하였다. M9배지에서 배양된 Agrobacteria LBA4404를 원심분리하여 수확한 후 배양된 하배축과 함께 5-10분 동안 MS 액체배지 내에서 공동 배양한 후 새로운 MS 액체배지로 세척하여, 2,4-D가 함유된 MS 배지로 옮겨서 배발생 캘러스를 유도하였다. 유도된 배발생 캘러스는 카나마이신 (kanamycin)과 2,4-D가 함유된 배지로 옮겨 3-4주 간격으로 계대배양을 하면서 형질전환 캘러스를 선발하였다. 형질전환 캘러스에서 배발생 캘러스를 유도 한 후 2,4-D를 제거시킨 MS 배지에서 당근 식물체를 재분화시킨 후 식물체의 지상부가 5-10 cm로 자라면 흙으로 옮긴 후 순화 과정을 거쳐 온실에서 재배하였다.

실시예 4 : 당근 형질전환체 확인 및 발현 분석

형질전환 당근 식물체에서 어린잎을 채취하여 DNeasy plant mini kit (Qiagen)를 이용하여 매뉴얼에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. HpBkt 유전자의 형질전환 여부를 확인하기 위하여 유전자 특이 프라이머 세트 (5'-GCACTGGCTGCCCGTGTC-3': 서열번호 11)와 (5'-GGCTTGTGGGGCATGTAC-3': 서열번호 12)를 이용하여 PCR을 실시하였다. 형질전환 당근의 어린잎으로부터 DNeasy plant mini kit (Quiagen)을 사용하여 게놈 DNA를 추출한 후 50ng 게놈 DNA를 PCR의 주형으로 사용하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초간 반응 후 55℃에서 30초간 어닐링반응, 72℃에서 30초간의 중합반응의 일련의 반응을 30회 실시한 후 72℃에서 7분간의 중합반응을 실시한 후 PCR 산물을 아가로스 젤에서 전기영동하여 형질전환 식물체를 확인하였다(도 3). 형질전환체로 확인된 당근 식물은 온실에서 저장뿌리의 직경이 2 cm 이상이 되도록 재배한 후 수확하여 (도 4) 카로티노이드 분석에 사용하였다.

형질전환 당근 식물체에서 도입된 HpBkt 유전자의 발현을 분석하기 위해 직경이 1 cm 이상 성장한 저장뿌리를 사용하여 RNeasy Plant Mini Kit^TM(Quiagen)를 사용하여 전체 RNA를 추출하여 RT-PCR 분석에 이용하였다. 전체 RNA (1 μg)을 Transcriptor first-strand cDNA synthesis kit (Roche)를 사용하여 first strand cDNA를 합성한 후 30 μl TE에 희석하여 PCR에 사용하였다. HpBkt의 발현 정도는 상기의 HpBkt 특이 프라이머를 사용하여 증폭하고 당근 EF1a 발현 양을 equal loading internal control로 사용하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95 ℃에서 30초간 반응 후 58 ℃에서 30초간 어닐링반응, 72 ℃에서 30초간의 중합반응의 일련의 반응을 35회 실시한 후 72 ℃에서 7분간의 마지막 중합반응을 실시하였다. PCR 산물을 아가로스 젤에 전기영동 하여 발현 양을 확인하였다.

상기의 RT-PCR 결과에 의해 형질전환 당근에서 야생형에서는 없었던 HpBkt의 발현을 확인할 수 있었다 (도 5). 특히, 형질전환 당근 #8, #11, #37에서는 HpBkt의 발현이 상대적으로 약하였던 반면, #42, #45에서는 HpBkt의 발현이 강하였다. 하지만 아래 실시예 5의 카로티노이드 분석 결과에 의해 이런 HpBkt의 발현 정도와 케토형 카로티노이드 생산량 정도와는 비례하지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 5 : 형질전환 당근의 카로티노이드 함량 분석

당근 형질전환체의 저장뿌리의 직경이 3 cm 이상 자라도록 재배한 후 수확하여서 카로티노이드 분석에 사용하였다. 동결건조하여 -80도에 보관중이던 당근시료를 품종별로 약 250 mg을 정확하게 취하여 9 cm 유발에 넣은 다음 seasand와 무수황산나트륨, NaHCO₃을 넣고, 약 5 ml의 아세톤(0.01% BHT)을 넣어 곱게 갈아 주었다. 1 ml pipette tip으로 추출액을 취한 다음, 시료의 색이 미색이 될 때까지 아세톤으로 3-4회 더 갈아 추출액을 15 ml polypropylene centrifuge tube에 옮겨 담았다. 미리 4도로 냉각해 놓은 원심분리기에서 5,000 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 0.45 μm membrane filter를 사용하여 여과한 후 아세톤으로 총부피를 같게 맞추었다. 여과한 추출액 1 ml를 취하여 450 nm에서 흡광도를 기록하고, 1 ml를 다시 취하여 autosampler용 vial에 옮겨 담아 HPLC를 실시하였다. 나머지 여과액은 질소하에서 건조시켜 -80도에 보관하였다. 모든 과정은 ice bath에서 행하고, 인공조명은 최대한 줄인 상태에서 실시하였다.

당근 형질전환체에서 케토형 카로티노이드인 아스타잔틴이 7-17 μg/g DW (dry weight) 생산 되었으며, 베타카로틴 함량도 야생형에 비해 최대 2.5배 증가하였다 (표 1). 형질전환 당근의 저장뿌리를 횡단으로 절단하여 관찰 한 바 생산된 아스타잔틴으로 인해 야생형에 비해 형질전환체의 저장뿌리는 더 진한 주홍색을 띠고 있었다 (도 6). 특히, 물관부와 형성층에서 색깔이 더 선명한 주홍색이었다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Haematococcus pluvialis beta-carotene ketolase cDNA and method for generation of transgenic plants producing keto-carotenoids and higher level of beta-carotene using the same <130> P11-101020-01 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 990 <212> DNA <213> Haematococcus pluvialis <400> 1 atgcagctag cagcgacagt aatgttggag cagcttaccg gaagcgctga ggcactcaag 60 gagaaggaga aggaggttgc aggcagctct gacgtgttgc gtacatgggc gacccagtac 120 tcgcttccgt cagaagagtc agacgcggcc cgcccgggac tgaagaatgc ctacaagcca 180 ccaccttccg acacaaaggg catcacgatg gcgctagctg tcatcggctc ttgggccgca 240 gtgttcctcc acgccatttt tcaaatcaag cttccgacct ccttggacca gctgcactgg 300 ctgcccgtgt cagatgccac agctcagttg gttggcggta gcagcagtct gatgcacatc 360 gtcgtcgtat tctttgtcct ggagttcctg tacacaggcc tttttatcac cacgcatgat 420 gctatgcatg gcaccatcgc catgagaaac aggcagctta atgacttctt gggcagagta 480 tgcatctcct tgtatgcctg gtttgattac aacatgctgc accgcaagca ttgggagcac 540 cacaatcaca 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Thr Ser Leu Asp 85 90 95 Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Gly 100 105 110 Gly Ser Ser Ser Leu Met His Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu 115 120 125 Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly 130 135 140 Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val 145 150 155 160 Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys 165 170 175 His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp 180 185 190 Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met 195 200 205 Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr 210 215 220 Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe 225 230 235 240 Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly 245 250 255 Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Ser Ala Ala Ser Gly Ser Pro 260 265 270 Pro Val Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp 275 280 285 Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His 290 295 300 His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg 305 310 315 320 Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala 325 <210> 3 <211> 1908 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 3 actgatactt tggtgactgc attgtgtttg ggtcttgcca aatctattga gggaggggaa 60 gaaagtagaa gtgtcaggga ttggtgtgtg gtggggtttc caaagtttcc ctcttttcct 120 ttcttattct tagtttgctc gtcataagtg tcagggattg gtaaccaata gaaatctcat 180 ctttaaccta tatgtatgtt ctagtatcat aattaagctc ttactcaaag gaatgttcca 240 tttaggtcat ttttaatgtc tatcaattga tcatttcaag taaacaaaac tctggctcta 300 atgctgggac tttggtttct ttattatgca gtnttatggg ataaaggttg gttatggtgg 360 catcccgggg ccatcaatcg gaagagatgg agctcctgct ccaggagggg gttgctgcag 420 ctgaaaatgg gacgtaattt cttttgagta aatgcttgtt tcattgtnaa ttcgtgacta 480 attgttcttt gtttttcaat tgttcaaaag cttactatgt atacgtggtg tataatgtaa 540 tacaacagcc agcattagga tgnaatagag gtttcaaatt aaactcaacc agaatcctgc 600 ttatttcgag aattactacc attctcaaaa aataaataaa taaatcatga gatgtgttga 660 tataaataaa taaatcatga gatgtgttga acgctcttca agtttttcac agttgtatga 720 ataatgacga gcacatgata gttagagaac ttaggagcat tgaatctggt gcttgggctg 780 atcgatttat ggcatgatgc agtgcattca ctgtatagcg tgtgattgca ggcattagat 840 cttggtttat ggtctgcatt tcacgtgggg tgaccatttt gtgccgtttc cgtcagccac 900 ttaaatggac caacatcccc tgaggaagac ctgcaaattc agacttagac acactaatta 960 taggggcata tgatattatg attggataat ggctgatgaa attttcagcc gttaattcta 1020 aacaataaac agtatggcgg tctatgaatg ataacgatct ttaagctgaa gatgggcaaa 1080 acaatatgga tcgtctacta gtatttgtct ctttccctat cctgcttgtc tacaccacaa 1140 tactaaagac caaaacttga gtgactgaga gaaatatgca ttcattatcc gagtctgtat 1200 catgtaaatt ttatcttgta attttaacta ataaaaaatc aggagaaaat cagcctaaat 1260 tatttatagc tcataactta ctagttcaga ctaagaagac taataaaaca tccccgttac 1320 aaaattaaca ttttgactaa cttgtaacgt ttgcatggtc agaaacagga tacaccaact 1380 ttggttgtga tgatgatatc atatcataaa caaaccctcc aaaaagtcac ttgcaaggtg 1440 gcactttgcg acagaccacc atgcttaatt gctcataatc agctaaacta ttattattac 1500 tttataaaat attttcgccc catatcatat aatttggcca ataatatatc attttatctg 1560 tcttacttat tatttattaa ttacataaaa tgaaacggaa tgaataacat aaataatata 1620 aagatatact ccgtataagt aacggtgcaa aggagccgat tagatatttt cagtaatcac 1680 aagtcacatg tgatcatatc atgtgtattt ttcatataaa ataaaactag tataccccac 1740 cctgattttt gctctaaact tccaaatata cccttggtca cgcaaatgct agccgctggt 1800 ttggaagggc aaaccgtaaa tgttgacaaa ttctttggca attaggtaat aggtgtcacc 1860 tatttgaaca cttactataa aaggacgcct agtttctgtc caaatttc 1908 <210> 4 <211> 311 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 4 aacagaatca ctcgcttcca cacactccaa agtccgcaga gagctcagag tggtagcgcg 60 gcgttaaaat ggcagcagcg acgatcggag ctctgtcgtc tccgtatacc ggcggcgttg 120 gggagagaat tgacggtgat gttagcaagg cgtcgttccg gaggttgtcg ttcgcgtcgt 180 ctcatctctc tggcgataag ctgatgccat tgcctcctcg acggcttcgt tccggcggta 240 aatcctccga ggttcggact gctccgttca tcgtttctcc aaaggctgtt tccgattcgc 300 agaattcgca g 311 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 5 atgcagctag cagcgac 17 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 6 ctaggcagga accaga 16 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 7 gacggatcca tgcagctagc agcgaca 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 8 gacgagctcc taggcaggaa ccagacc 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 9 cgagtcgaca ctgatacttt ggtgact 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 10 gactctagac tgcgaattct gcgaatc 27 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 11 gcactggctg cccgtgtc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 12 ggcttgtggg gcatgtac 18

Claims

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서열번호 1의 염기서열로 구성되는 미세조류 (Haematococcus pluvialis) 유래 베타카로틴 케톨레이제(HpBkt) 유전자 및 서열번호 3의 ibAGP1 프로모터, 그리고 서열번호 4의 ibAGP1 전분체 이동신호(TP1: Transit peptide of ibAGP1)를 포함하며 도 2에 도시된 개열지도를 갖는 식물 형질전환용 바이너리 벡터.
제4항 기재의 벡터에 의해 형질전환된 아그로박테리아.
제4항 기재의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 당근.
서열번호 1의 염기서열로 구성되는 미세조류 (Haematococcus pluvialis) 유래 베타카로틴 케톨레이제(HpBkt) 유전자를 서열번호 3의 ibAGP1 프로모터와 서열번호 4의 ibAGP1 전분체 이동신호에 의해 조절 받는 식물 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 당근에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당근에서 케토형 카로티노이드를 생산하는 동시에 베타카로틴 함량이 증가된 형질전환 당근을 제조하는 방법.
서열번호 1의 염기서열로 구성되는 미세조류 (Haematococcus pluvialis) 유래 베타카로틴 케톨레이제(HpBkt) 유전자를 서열번호 3의 ibAGP1 프로모터와 서열번호 4의 ibAGP1 전분체 이동신호에 의해 조절되는 식물 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 당근에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당근 내에서 케토형 카로티노이드 및 베타카로틴을 동시에 생합성하는 방법.