CN108486148A - 含烟草pds基因片段的黄瓜花叶病毒rna2弱毒突变型质粒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用。所述质粒载体含有CMV_Fny株系RNA2全序列，并在2a蛋白终止密码子后插入有烟草PDS基因199bp的片段。该质粒载体与含野生型CMV_Fny RNA1和野生型CMV_FnyRNA3的质粒通过农杆菌浸润方法接种本氏烟，可显示弱致病症状以及不依赖仪器可裸眼判断其诱导基因沉默的能力；为弱毒疫苗的深入研究提供极大便利。

Description

含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载 体及其应用

技术领域

本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用。

背景技术

黄瓜花叶病毒(Cucumer mosaic virus，CMV)是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，可侵染100多科2000多种植物。造成多种具有重要经济价值的植物(农作物、园艺作物等)出现黄化、矮化、畸形等症状，严重影响其产量和品质。对于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品种的筛选与培育，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种方法是弱毒交叉保护，是利用弱毒刺激植物自身的免疫系统而防治后期侵染的强毒株系；是一种行之有效的病毒防治策略。弱毒突变体可以是天然存在的，也可以通过分子生物学手段进行人工制备。

CMV基因组由三条RNA(RNA1、RNA2和RNA3)组成，共编码5个蛋白。RNA1编码的1a蛋白是病毒复制酶重要组分。RNA2编码2a与2b蛋白，其中，2a蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性，与1a蛋白共同参与病毒的体内复制(Hampton，1992)；与2a蛋白存在编码序列部分重叠的2b蛋白由亚基因组RNA4A产生，是一种基因沉默抑制因子，能够最大限度地保护病毒基因组不被寄主植物降解(Csorba，2015)。RNA3编码3a蛋白(运动蛋白MP)和外壳蛋白CP；MP与病毒在寄主细胞间移动和长距离移动有关(Palukaitis，2003)，CP由亚基因组RNA4产生，与病毒粒体组装、蚜虫传播、病毒血清型及寄主症状表现有关(Palukaitis，1992；Edwardson，1991；Roossinck，2001；Chen，1990；Ding，1994)。由于CMV的2b蛋白是病毒编码的基因沉默抑制因子，对寄主植物对病毒基因组的基因沉默作用有很强的抑制作用，因此，在保持2a蛋白完整性的前提下，对2b蛋白的编码基因进行突变改造是构建CMV弱毒突变体的研究热点。

发明内容

针对上述研究背景，本发明的目的是提供一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用。本发明针对2b蛋白编码序列进行改造获得弱毒突变体，同时在弱毒突变体改造过程中插入烟草PDS基因片段，可形成裸眼可视型诱导基因沉默症状，为基于CMV的弱毒疫苗的深入研究提供了极大便利。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q，所述质粒载体含有CMV_Fny株系RNA2全序列，并在2a蛋白终止密码子后插入有烟草PDS基因片段；造成2b蛋白提前终止的同时尽可能保持了其他病毒核苷酸的潜在的顺式调控作用。

优选的，所述烟草PDS基因片段的长度199bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面，提供上述质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q的制备方法，包括以下步骤：

(1)以CMV_Fny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMV_Fny2为模板，利用反向PCR扩增方法获得中间载体；

(2)利用RT-PCR从烟草中扩增得到烟草PDS基因片段；

(3)利用酶切和连接方法将PDS基因片段插入到中间载体中，即构建得到含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体。

优选的，步骤(1)中，用于反向PCR扩增的引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。

优选的，步骤(1)中，所述中间载体是在紧邻2a蛋白终止密码子后的2661位与2662位间引入BamH I，Spe I，Sma I酶切位点，并在酶切位点后添加TAATA与2662位的G构成双终止密码子。

优选的，步骤(2)中，用于扩增烟草PDS基因片段的引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明的第三方面，提供上述质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q在植物病毒病防治中的应用；具体的，所述植物病毒病是由黄瓜花叶病毒引起的植物病毒病。

进一步的，本发明还保护上述质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q在弱毒疫苗制备和/或研究中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过对2b蛋白编码序列进行改造获得弱毒突变体，同时在弱毒突变体改造过程中插入烟草PDS基因片段，从而制备得到含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q。利用本发明制备的质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q，与含野生型CMV_Fny RNA1和野生型CMV_Fny RNA3的质粒通过农杆菌浸润方法共同接种本氏烟，接种12d后，与野生型CMV_Fny RNA1+RNA2+RNA3混合接种症状相比显示弱侵染性，表现为株高基本正常且单个叶片较平展；同时系统叶片表现肉眼可见的白化症状，表明该CMV弱毒突变体具备诱导基因沉默的能力，满足弱毒疫苗的基本要求(弱侵染和诱导内源免疫系统)。在此基础上，可以进行外源插入片段长度范围、疫苗提前接种时间等疫苗应用性细节的研究，此肉眼可视性白化症状为基于CMV_Fny的弱毒疫苗的深入研究提供便利；而且此199bp序列是在已报道的茄科植物PDS基因中较保守的序列，因此本发明的弱毒突变体表现出的可视化优势，不仅适用于烟草，还可以潜在应用到其他茄科植物。

附图说明

图1为中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b中含有的CMV RNA2及多克隆位点的示意图。

图2为中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b的酶切鉴定结果电泳示意图；其中M为Tiangen公司的D15000+2000分子量标准，酶切后片段约为7.6kb；质粒为pCB301-CMV_Fny2-del2b。

图3为烟草PDS保守片段的PCR产物电泳结果示意图；其中M为Novoprotein公司的DNA Ladder 2000，PCR产物应为200bp。

图4为质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS-Q的酶切鉴定结果电泳示意图；其中M为Tiangen公司的D15000+2000，酶切后得到中间载体和200bp插入的PDS片段。

图5为质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS-Q的生物学效应；其中mock为空农杆菌侵染，CMV_FnyR1+R2+R3表示CMV_Fny野生型RNA1+RNA2+RNA3混合侵染；CMV_FnyR1+R2-PDS-Q+R3表示CMV_FnyRNA2的PDS-Q插入突变体与野生型RNA1+RNA3混合侵染。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，对2b蛋白的编码基因进行改造是目前研究的热点，例如，有研究采用外源片段替换2b蛋白编码基因的策略。而本发明对于2b蛋白编码基因的改造策略为：以CMV_Fny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMV_Fny2(姚敏，2011)为模板，利用反向PCR扩增方法，获得2b蛋白提前终止的中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b，同时在紧邻2a蛋白终止密码子后的2661位和2662位间插入含BamH I、Spe I和Sam I的多克隆位点及TAATA序列。然后，利用RT-PCR从烟草中扩增PDS较保守的199bp序列，再利用酶切和连接方法将此199bp PDS序列插入到中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b中，由此获得了含有PDS序列的CMV_Fny2突变型质粒载体，该质粒载体名称为pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q。

特别的，本发明的中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b是在紧邻2a蛋白终止密码子后的2661位和2662位间引入BamH I，Spe I，Sma I酶切位点，并在酶切位点后添加TAATA与2662位的G构成双终止密码子，造成2b蛋白的提前终止，同时保留了其他核苷酸序列的完整性，尽可能保证核苷酸序列潜在的顺式调控作用。

另外，插入的目的基因片段的长度会影响基因沉默的效果，若插入的基因片段的长度过短，则不能有效的启动目标基因沉默的发生；若插入的基因片段的长度过长，则可能会导致病毒不能在宿主植物体内传播，也可能导致插入片段易于丢失。本发明插入的烟草PDS基因片段的长度选择为199bp，基于两方面的考虑，一方面考虑是长度适中，实验结果也表明此199bp的插入既可以形成弱毒突变体，又可在CMV基因组稳定存在而不丢失。另一方面考虑是此199bp序列是在已报道的茄科植物PDS基因中较保守的序列，因此本发明的弱毒突变体表现出的可视化优势，不仅适用于烟草，还可以潜在应用到其他茄科植物。

外源片段的插入位点也会对沉默效率产生影响，本发明是在2a蛋白终止密码子后引入BamH I，Spe I，Sma I酶切位点，由此插入外源片段，并在酶切位点后添加TAATA与2662位的G构成双终止密码子，这样一方面可以保证2a蛋白编码区核苷酸序列的完整性，另一方面可以造成2b蛋白的提前终止，形成突变体同时还兼顾了其他核苷酸序列的潜在的顺式调控作用。

在本发明的一个优选实施方案中，给出了黄瓜花叶病毒(CMV_Fny)RNA2突变型质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q的构建方法，具体如下：

(1)pCB301-CMV_Fny2-del2b中间载体的构建：根据GenBank中公布的CMV_Fny RNA2的序列(登录号：D00355)，设计引物Fny2-del2b 3'-BSST-2662-F和Fny2-del2b 3'-B-2661-R(详细信息见表1)。以pCB301-CMV_Fny2为模板，在PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)作用下进行PCR反向扩增，利用Dpn I(NEB)降解质粒模板后，对PCR扩增片段进行BamH I酶切后自连，连接产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR、质粒酶切鉴定和DNA测序，确认得到中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b。该中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b是在2a蛋白终止密码子后引入BamH I，Spe I，Sma I酶切位点，并在酶切位点后添加TAATA与2662位的G构成双终止密码子，造成2b蛋白的提前终止，但同时尽可能保留了其他核苷酸序列的完整性(图1)。

表1：本发明中用到的引物

注：保护碱基用粗体表示，酶切位点用下划线表示，非病毒序列用斜体表示。

(2)烟草PDS部分片段的克隆：根据GenBank中公布的5种茄科植物PDS全序列(登录号：DQ469932，M88683，KT366011，KC190187，KC190188)，利用DNAMAN软件进行序列比对，发现其序列保守的区域并设计引物PDS-Sma1-333-F和PDS-BamH1-531-R(详细信息见表1)。提取本氏烟的总RNA，利用RT-PCR扩增对应于烟草PDS基因333-531位的199bp片段。

(3)pCB301-CMV_Fny2-PDS-Q的构建：分别利用BamH I和Sma I双酶切pCB301-CMV_Fny2-del2b以及烟草PDS 199bp片段，然后经胶回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR、质粒酶切鉴定和DNA测序，确认得到载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1.中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b的构建：

根据CMV_Fny侵染性克隆RNA2序列，设计引物Fny2-del2b 3'-BSST-2662-F和Fny2-del2b 3'-B-2661-R，这对引物的PCR扩增产物即为构建CMV肉眼可视型弱毒突变型质粒载体的线性化中间载体。

以CMV_Fny侵染性克隆质粒pCB301-Fny2为模板(CMV_Fny侵染性克隆质粒pCB301-Fny2的构建参照“农杆菌介导的CMV侵染性克隆及2b缺失突变体的构建”，姚敏等，中国农业科学，2011,44(14)：3060-3068)，在PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara)作用下，进行反向PCR扩增，引物对为Fny2-del2b 3'-BSST-2662-F和Fny2-del2b 3'-B-2661-R；PCR条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸8min，7个循环；98℃变性10s，68℃延伸8min，25个循环；4℃保存；扩增得到的PCR产物即为线性化中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b。

利用Dpn I(NEB)降解PCR反应中的质粒模板pCB301-Fny2，反应条件为：37℃，2h；80℃，20min；产物利用无水乙醇沉淀法进行回收：将产物加入ddH₂O至450μl，加入50ulpH5.2 3.0mM醋酸钠，1ml无水乙醇，-80℃沉淀2h，常温12000rpm，离心10min，将液体倒掉，加入600μl 70％乙醇，常温12000rpm，离心5min，将液体倒掉，常温12000rpm，离心1min后将离心管内液体吸净，加入ddH₂O 30μl回溶。

然后利用BamH I(Takara)酶切回收产物，酶切产物经DNA回收试剂盒回收后，在T₄DNA连接酶(Takara)作用下16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂带有100μg/mL卡那霉素的LB平板，经菌落PCR、质粒酶切鉴定和DNA测序，确认得到中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b。

结果分析：PCR产物经BamH I酶切后自连，转化产物经菌落PCR初筛后，提质粒进行酶切鉴定，选用BamH I和Sma I分别进行酶切鉴定，酶切结果显示质粒可以被这位两个酶线性化，且线性化质粒长度约为7.6kb(图2)，基本确认该质粒中含有BamH I、Spe I和Sam I的多克隆位点；并最终通过质粒的DNA测序确认。

实施例2.PDS部分片段的克隆：

利用TransZol Up(TransGen)提取6叶期本氏烟植物总RNA，在ReverseTranscriptase M-MLV(Takara)作用下，进行反转录反应，反向引物为PDS-BamH1-531-R，反应条件：在不加酶的条件下，80℃变性3min；加入反转录酶后，42℃反应1.5h；

再以反转录产物cDNA为模版，在2×Es Taq MasterMix(Dye)(CWBIO)作用下，进行PCR反应，引物对为PDS-Sma1-333-F和PDS-BamH1-531-R；PCR条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸10s，30个循环；72℃延伸2min；4℃保存；PCR产物为本氏烟PDS中200bp保守序列片段。对PCR产物经DNA回收试剂盒回收后备用。

结果分析：PCR反应产物的电泳结果显示，PCR产物约为200bp(图3)，与本氏烟PDS保守区域200bp长度吻合。

实施例3.pCB301-CMV_Fny2-PDS-Q构建：

将中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b经BamH I和Sma I双酶切，酶切产物经DNA回收试剂盒回收；本氏烟PDS中200bp保守序列片段经BamH I和Sma I双酶切，酶切产物经DNA回收试剂盒回收。将同样双酶切的中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b和PDS片段在T₄DNA连接酶作用下16℃过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂带有100μg/mL卡那霉素的LB平板，经菌落PCR筛选、酶切鉴定和DNA测序确认得到阳性克隆pCB301-CMV_Fny2-PDS-Q。

结果分析：连接产物转化后，产物经菌落PCR初筛后，提质粒进行酶切鉴定，选用BamH I和Sma I双酶切鉴定，酶切结果显示有约200bp的酶切条带，并且剩余的酶切片段大小约为7.6kb(图4)，基本确认该质粒中含有本氏烟PDS 200bp的基因序列；并通过质粒的DNA测序进行最终鉴定。

实施例4.质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS-Q的生物学效应:

首先将质粒转化农杆菌，利用农杆菌浸润法接种本氏烟，观察发病症状及诱导内源免疫的能力。

农杆菌浸润侵染本氏烟：首先将pCB301-CMV_Fny2-PDS-Q、野生型CMV_Fny RNA1、野生型CMV_Fny RNA3的质粒分别转化农杆菌GV3101的感受态细胞，涂带有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml利福平的LB平板，培养(一般为48h)后挑取单斑进行菌落PCR验证后，挑取单斑于2mlLB培养液(50μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平)中，28℃，200rpm培养24h。

诱导：分别取pCB301-CMV_Fny2-PDS-Q、pCB301-CMV_Fny1、pCB301-CMV_Fny3 300μL菌液加至5ml LB培养液(含10mM乙酰丁香酮(MES)和20uM 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(AS)；50μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平)中，于28℃振荡培养至对数生长期(一般过夜培养)。

重悬：将经诱导的菌液于10ml离心管，在室温条件下，6000rpm离心10min；收集菌体并重新悬浮于1ml农杆菌菌体重悬溶液(10mM MgCl₂，10mM MES，0.1mM AS)中吸打混匀，取50ul菌液到1ml重悬液，测其OD₆₀₀値，调整浓度使其OD₆₀₀为0.4-0.5，根据菌液和重悬液的比例调整剩余菌液OD₆₀₀为0.4-0.5，并使得3种菌液OD₆₀₀一致。

将三种调节好OD₆₀₀值的菌液(分别含有pCB301-CMV_Fny2-PDS-Q、pCB301-CMV_Fny1、pCB301-CMV_Fny3)等比例混匀，28℃静置3h。

接种：取1ml一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，选取6叶期的本氏烟植株，用压力将注射器中的菌液从叶片背面注入叶片的两个叶脉之间，每株共注射两片叶片，每片叶片注射量覆盖叶片的1/3。

接种完的植株放置25℃光照培养箱中培养，16h光照/8h黑暗交替；第6天开始观察并记录症状，12天后拍照记录。

(野生型CMV组接种时，是将野生型CMV_Fny RNA1、野生型CMV_Fny RNA2、野生型CMV_FnyRNA3转化农杆菌进行侵染；负对照组采用不携带任何质粒的农杆菌进行接种)

结果分析：接种6d，接种农杆菌本氏烟叶片正常(负对照)；接种野生型CMV本氏烟叶片开始皱缩；接种CMV _Fny2-PDS-Q的本氏烟初生叶片平展同时出现白化。12d后，未接种本氏烟叶片平展，长势良好；接种野生型CMV的本氏烟叶片皱缩，植株矮化严重；接种弱毒CMV_Fny2-PDS-Q的本氏烟叶片平展，初生叶片变白，植株长势与未接种的同期本氏烟相似(图5)；实验结果表明质粒pCB301-CMV_Fny2-PDS-Q为CMV弱毒突变体，且出现肉眼可视型基因沉默现象，因为白化症状是内源PDS被抑制表达的结果。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用

<130> 2018

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 199

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

caggttctgc atatttgggt aagccccaaa gaatatgtgc aacccagtct cgtaccaatc 60

tccatcatca tctttccatg cagctacctt tccacctagg acatctcttg cctccagcaa 120

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<210> 2

<211> 3266

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gtttatttac aagagcgtac ggttcaaccc ctgcctcccc tgtaaaactc cctagactta 60

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acatggaagc taaggtgatg gaacctgccg taccatatat ttgttcgaag ttcttactct 2040

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tgctgtagac aagccaccca aacctgcacc agcaataaca atctcccccg ggtaatagcc 2880

tctcgtttag agttatcggc ggaagaccat gattttgacg atacagattg gttcgccggt 2940

aacgaatggg cggaaggtgc tttctgaaac ctccccttcc gcatctccct ccggttttct 3000

gtggcgggag ctgagttggc agtattgcta taaactgtct gaagtcacta aacacattgt 3060

ggtgaacggg ttgtccatcc agcttacggc taaaatggtc agtcgtagag gaatctacgc 3120

cagcagactt acaagtctct gaggcacctt tgaaaccatc tcctaggttt cttcggaagg 3180

acttcggtcc gtgtacttct agcacaacgt gctagtttca gggtacgggt gccccccact 3240

tttgtggggc ctccaaaagg agacca 3266

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tcggatccac tagtcccggg taatagcctc tcgtttagag ttatcggcg 49

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atggatccct cagactcggg taactccgcc 30

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atcccggggg agattgttat tgctggtgca gg 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atggatccca ggttctgcat atttgggtaa gc 32

Claims (8)

1.一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q，其特征在于，所述质粒载体含有CMV_Fny株系RNA2全序列，并在2a蛋白终止密码子后插入有烟草PDS基因199bp的片段。

2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述烟草PDS基因199bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.权利要求1-3任一项所述的质粒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以CMV_Fny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMV_Fny2为模板，利用反向PCR扩增方法获得中间载体；

(2)利用RT-PCR从烟草中扩增得到烟草PDS基因片段；

(3)利用酶切和连接方法将PDS基因片段插入到中间载体中，即构建得到含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，用于反向PCR扩增的引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述中间载体是在紧邻2a蛋白终止密码子后的2661位与2662位间引入BamH I，Spe I，Sma I酶切位点，并在酶切位点后添加TAATA与2662位的G构成双终止密码子。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，用于扩增烟草PDS基因片段的引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

8.权利要求1-3任一项所述的质粒载体在弱毒疫苗制备和/或研究中的应用。