CN110468129A - 一种基于cmv rna2的体外干扰黄瓜花叶病的制剂、其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段，及所述RNA2片段在抑制黄瓜花叶病上的应用。本发明的含有CMV‑RNA2片段的制剂在抗黄瓜花叶病中具有显著的抑制作用，抑制效率高，部分处理组能够完全抑制病毒积累，且具有无农药残留的优势，安全性较高；由于采用CMVRNA2小片段混合GKP缓冲液和吐温展着剂直接涂抹或喷施于植株表面的预处理方式，尤其适于苗床期幼苗的病毒病防治。

Description

一种基于CMV RNA2的体外干扰黄瓜花叶病的制剂、其制备方 法与应用
【技术领域】
本发明涉及植物抗病与分子生物学技术领域。具体涉及一种基于基于CMV RNA2的体外干扰黄瓜花叶病的制剂，还涉及所述制剂的制备方法及其应用。
【背景技术】
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型代表成员。该病毒的基因组由三条正义链RNA(RNAl、RNA2、RNA3)以及两条亚基因组(RNA4、RNA4A)组成，RNA4A是RNA2的亚基因组，RNA4是RNA3的亚基因组。三条正义链RNA共编码5种蛋白(1a位于RNA1链、2a和2b位于RNA2链、MP和CP位于RNA3链)，CMV 2b蛋白是基因沉默抑制子，缺失2b蛋白的CMV虽然能够浸染植物，但是寄主植物的症状明显减弱。CMV寄主广泛，能够侵染单、双子叶植物达85科、1200多种，CMV浸染可引起植株矮化、叶片畸形和花叶等症状，使植株正常生长受到严重抑制，不仅降低了农作物产量还影响了农产品质量，是目前发生最广和危害最大的病害之一。
由于病毒大多具有绝对寄生性和系统侵染性，以及植物没有像动物那样完整的免疫代谢系统，使得一旦被侵染就终生处于被为害状态，这也使得植物病毒病较其它植物病害更难防治。尤其是一旦发生病毒病后就很难找到一种有效药剂控制其蔓延和危害。同时，农药的大量应用也不符合可持续生产的要求。近年来，由于耕作制度变迁，田间病毒复合侵染现象严重，加重了病毒病对植株的危害。在生产上应用抗多个病毒病的品种几乎没有，直接表现为抗病毒育种对病毒病防治的贡献率较低。由于年度间气候变化和单一农药的长期使用，病毒病仍频发，在局部地区造成严重损失。
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)又称基因沉默，是由外源基因导入植株体内或内源双链RNA(double-strands RNA，dsRNA)诱发在DNA水平修饰或转录后水平降解同源RNA的特异性沉默现象。RNAi现象在生物体内普遍存在，被生物学家誉为“生物体在基因组水平上的免疫系统”。本发明则利用RNA干扰原理，通过筛选病毒的RNA片段，并进行外源预处理，创制了一种达到抑制病毒增殖的技术，形成了一种防治病毒的新思路。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术缺陷，针对当前黄瓜花叶病防治效果较差、防治费用较高的问题，提供了一种利用CMV RNA小片段对植株进行外源预处理，进而诱导、增强寄主对黄瓜花叶病的抗病作用，建立了一种作用高效、操作简便的防治黄瓜花叶病的新技术，同时也为其它病毒的防治提供新思路。
为了实现上述目的，本发明从黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)的三条RNA链出发，确定来源于RNA2链的小片段能够介导对CMV的抑制作用。
基于此，本发明提供黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段，所述片段的序列如SEQ NO.1所示。
进一步地，本发明还提供上述黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段在抑制黄瓜花叶病上的应用。
本发明还提供含有上述黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段的制剂。
另一方面，本发明还提供一种体外干扰黄瓜花叶病的制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)获取根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段；
(2)取步骤(1)的RNA2片段与2×GKP接种缓冲液等体积混合均匀，再加入以总体积百分数计1％～5％的吐温-80。混合均匀后即为所述制剂。
在本发明中，步骤(1)的RNA2片段有两种方式可以获得，第一种获得方式包括以下步骤：
(1.1)取黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)侵染的植物的发病区域，以氯化锂沉淀法提取黄瓜花叶病毒总RNA；
(1.2)以步骤(1.1)的总RNA为模板，以特异性引物CMVRNA2F和CMVRNA2R进行PCR扩增，得到CMV-RNA2的DNA片段，其中：
CMVRNA2F:TAATACGACTCACTATAGGGTTCTCACTAGCCAATCTTTT；
CMVRNA2R:GGGCCCAACCAATCGGTATCGTCAAA
(1.3)将步骤(1.2)得到的DNA片段在T7RNA转录酶作用下转录为RNA，65℃温浴10分钟，室温放置几小时获得降解的小片段，保存于-70℃冰箱备用。
其中，所述步骤(1.1)包括：取材料于离心管中，用液氮研磨成细粉状，加入400μLRNA提取缓冲液(1％SDS，0.2M NaCl，0.05M EDTA，0.02M Tris-HCl(PH8.0))和400μL体积比为25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇，充分混匀；12000rpm离心10min，吸取上清液并加入两倍体积4M LiCl混匀后在-20℃下沉淀至少2h；12000rpm离心10min，弃上清液；沉淀用70％的乙醇漂洗，12000rpm离心5min，弃上清液，室温下充分干燥沉淀；再用30μL溶解，放置于-20℃保存备用。
所述步骤(1.2)的扩增体系是cDNA 3μl，上下游引物(10μmol/L)各0.5μl,ExTaq0.5μl,10×ExTaq Buffer 2μl，dNTP Mixture 1μl,加ddH2O 12.5μl补足到20μl。扩增条件是94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃10分钟，共33个循环。
根据另一种优选的实施方式，步骤(1)的RNA2片段也可以这样获取：
(1.1)取黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)侵染的植物发病叶片，以氯化锂沉淀法提取含黄瓜花叶病毒的植物总RNA；
(1.2)将步骤(1.1)的总RNA为模板反转录为cDNA，利用特异性引物CMVRNA2F和CMVRNA2R进行PCR扩增，得到CMV-RNA2的DNA片段，其中：
CMVRNA2F:TAATACGACTCACTATAGGGTTCTCACTAGCCAATCTTTT；
CMVRNA2R:GGGCCCAACCAATCGGTATCGTCAAA
(1.3)步骤(1.2)得到的DNA片段构建于T载体得到重组质粒，将所述重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株并提取质粒，酶切质粒获得线性化含CMV-RNA2的DNA片段；
然后将所得DNA片段在T7RNA转录酶作用下转录为RNA，65℃温浴10分钟，室温放置2-6小时获得降解的RNA2片段，保存于-70℃冰箱备用。
进一步地，本发明还提供一种体外干扰防治黄瓜花叶病的方法，其特征在于在易感染黄瓜花叶病的植物的幼苗期，以喷施或涂抹的方式向植株叶片施本发明的制剂或根据本发明的制备方法制备得到的制剂。
其中，易感染黄瓜花叶病的植物包括烟草、黄瓜和番茄等。
优选地，施用量为所述制剂计10μg-50μg/株。
更优选地，在幼苗期重复施用2～3次，每次间隔时间为24h或以上。
本发明通过实验验证了本发明的含有CMV-RNA2小片段的制剂在抗黄瓜花叶病中具有显著的抑制作用。采用本发明的制剂处理植物叶片12-24小时后，在同一处理叶片出均匀撒上石英砂，通过机械摩擦接种CMV。7天后通过RT-PCR检测叶片中的病毒的积累水平，并观察植株症状，与正常植株进行对比，确认本发明的制剂对黄瓜花叶病的抑制作用。
本发明通过RNA干扰技术有效抑制了黄瓜花叶病度在植株中的积累，相比于现有技术，本发明首次建立了基于黄瓜花叶病毒的RNA链小片段的病毒防治的技术；实验证实，本发明的制剂对黄瓜花叶病的抑制效率比药剂处理高，部分处理组能够完全抑制病毒积累，且具有无农药残留的优势，安全性较高；由于采用CMVRNA2小片段混合GKP缓冲液和吐温展着剂直接涂抹或喷施于植株表面的预处理方式，尤其适于苗床期幼苗的病毒病防治。
本发明是一种作用高效、操作简单和安全性高的防治技术，也为其它病毒的防治提供新思路。
【附图说明】
图1为CMV RNA1、CMV RNA2和CMV RNA3的体外转录降解物电泳图；
图2为CMV RNA1、CMV RNA2和CMV RNA3体外转录产物对CMV积累的检测电泳图；
图3为CMV-RNA2体外转录产物预处理对症状形成的影响，其中左边为处理组，右边为对照组；
图4为CMV-RNA2体外转录物诱导植株抗性的最佳间隔时间的电泳检测图；
图5为CMV-RNA2体外转录产物对三种病毒积累的检测结果。
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
在本发明中，如无特殊说明，用于描述浓度的“％”为重量百分比，“：”为重量比，“份”为重量份。
在本发明中涉及以下引物：
所需引物序列
实施例1CMV-RNA小片段的制备
(1)DNA模板制备
采摘感染黄瓜花叶病的心叶烟植株的叶片，根据氯化锂沉淀法提取CMV侵染的烟草的总RNA，通过1％的琼脂糖凝胶电泳和核酸检测仪确定RNA提取的质量及浓度。
取RNA2μl(约300ng-500ng)，分别加入下游引物CMVRNA1R，CMVRNA2R，CMVRNA3R各1μl，于70℃水浴5min，迅速置于冰上。再分别加入2.5μl 5×RT buffer，0.5μl 2mM dNTP，RNA酶抑制剂0.2μl，MMLV 0.2μl，最后用水补足10μl，再放入40℃水浴中1h，得到反转录产物cDNA，然后，所得产物加水稀释到20μl。
以所得cDNA为模板，分别通过引物对CMVRNA1F和CMVRNA1R；CMVRNA2F和CMVRNA2R；CMVRNA3F和CMVRNA3R进行PCR扩增，获得目标序列，该PCR扩增产物可直接用于后续RNA的转录。
其中，扩增体系是cDNA 3μl，上下游引物(10μmol/L)各0.5μl,ExTaq 0.5μl,10×ExTaq Buffer 2μl，dNTP Mixture 1μl,加ddH2O 12.5μl补足到20μl。扩增条件是94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃10分钟，共33个循环
(2)体外转录物小片段的制备
以CMVRNA1、CMVRNA2和CMVRNA3的DNA为模板(序列参考Genebank登录号为EF213023.1，EF213024.1，EF213025.1)，转录体系为：4μl的5×T Buffer，2μl 100mM的DTT，4μl 5mM的Mix rNTP，DNA模板4μl，RNA酶抑制剂0.5μl，混合均匀放入水浴锅中37℃处理5min，再加入0.5μL T7RNA聚合酶，继续温育1h，得到CMVRNA2的体外转录物。
所得体外转录物在65℃下温育10分钟，使酶失活；然后将装有转录产物的EP管开盖室温放置2小时，分别加入60μl ddH2O保存在-70℃冰箱中备用。
取2.5μl体外转录产物与0.5μl的6×Loading Buffer混合，跑胶检测如图1，得到具有目标条带的体外转录产物以及降解的弥散小片段。
实施例2抗黄瓜花叶病制剂的制备及验证
(1)体外转录物小片段的预处理对病毒的抑制作用
取长势一致的5到7片真叶的心叶烟，编号为实验组和对照组，将实施例1得到的CMV RNA2体外转录产物与等体积的2×GKP接种缓冲液(含50mmol/L甘氨酸，l％硅藻土，l％皂土，30mmol/L K2HPO4，pH9.4)，及终体积为1％的吐温80混合均匀得到抗黄瓜花叶病制剂，涂抹到实验组叶片上，再取等体积的GKP溶液涂抹到对照组。
以CMVRNA1和CMVRNA3做相同处理。
另取侵染CMV的烟叶0.5g，加入1ml的0.02MPBS(PH7.0)，研磨成匀浆，得到带有CMV的汁液。
24小时以后在各处理组分别接种10μl带有CMV的汁液。接种后第7天，取各实验组和对照组烟叶的接种叶并根据氯化锂沉淀的方法提取植物总RNA，通过半定量RT-PCR检测CMV外壳蛋白的积累水平：
取500ng的总RNA，加入下游引物CMV CP-R 1μl，于70℃水浴5min，迅速置于冰上。再分别加入2.5μl 5×RTbuffer，0.5μl 2mM dNTP，RNA酶抑制剂0.2μl，MMLV 0.2μl，最后用水补足10μl，再放入40℃水浴中1h，得到反转录产物cDNA，然后，所得产物加水稀释到20μl。
以cDNA为模板，引物对CMV CP-F和CMV CP-R进行PCR扩增，扩增体系是cDNA3μl，上下游引物(10μmol/L)各0.5μl,ExTaq0.5μl,10×ExTaq Buffer 2μl，dNTP Mixture 1μl,加ddH2O 12.5μl补足到20μl。扩增条件是94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃10分钟，共28个循环。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图2所示。
图2显示CMVRNA2处理的植株表现出低CMV外壳蛋白基因的表达，表明CMVRNA2片段的处理有效抑制了CMV的积累，而CMVRNA1和CMVRNA3的处理组对CMV没有抑制作用，植株表现出高表达量。
此外观察植株状态，如图3所示。图3显示经过CMVRNA2处理的烟苗在CMV接种后7天，其系统叶完全没有症状，对未处理组烟苗的叶片已表现明显的畸形。
实施例3CMV-RNA2体外转录物诱导植株抗性的最佳间隔时间筛
选取生长状况一致的烟株，处理10μl实施例2制备得到的制剂，分别在处理后的12h、24h、48h按照实施例2相同的操作接种CMV病毒，并于接种后第7天取叶片，用液氮速冻保存在-70℃冰箱中备用。
提取叶片总RNA，核酸检测仪检测RNA浓度，以与实施例1相同的方法分别对各样品，取300ng RNA进行反转录及PCR检测。PCR扩增产物电泳结果如图4。
图4表明RNA2体外转录产物处理12h和24h之内接种，CMV积累量明显少于未处理组，而在处理48h接种，对CMV已没有显著的抑制作用。表明体外转录产物随着处理间隔时间的延后，对CMV的抑制作用逐渐减弱。因此，CMV-RNA2体外转录产物对CMV抑制的有效处理间隔时间为24h，尤其在12h内受CMV浸染，抑制效果最为明显。
实施例4CMV-RNA2制剂对其它病毒积累的影响
选取生长状况一致的烟株，以实施例2得到的制剂处理植株叶片，12h后分别接种三种病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)；(Potato Yvirus，PVY)；(Tobacco vein bandmosaic virus,TVBMV)，于接种后第7天取材，提取叶片总RNA，半定量RT-PCR检测各病毒外壳蛋白的积累水平，方法同实施例2。
电泳检测结果如图5，TMVCP目的条带大小为450bp，PVYCP目的条带大小为540bp，TVBMV目的条带条带大小为794bp，显示处理组与未处理组烟株中的TMV、PVY、TVBMV积累量不存在较大差异。
结果表明本发明的制剂在间隔一定时间内对MV、PVY、TVBMV的积累没有抑制作用。由于CMV-RNA 2与TMV、PVY、TVBMV没有存在序列同源性，不能有效抑制这些病毒在烟草体内的复制和增殖，进而说明CMV-RNA2体外转录产物降解的病毒需要有同源性的核酸序列。
实施例5：CMV-RNA2制剂在番茄和黄瓜中对CMV积累的影响
与实施例2-4的方法相似，选取长势相当的番茄和黄瓜幼苗，编号为实验组和对照组。取5μl的实施例1得到的CMV-RNA2体外转录产物与5μl的GKP接种缓冲液(含50mmol/L甘氨酸，l％硅藻土，l％皂土，30mmol/LK2HPO4，pH9.4)摩擦接种到实验组番茄(A)和黄瓜(B)，再取10μl的GKP溶液摩擦在对照组番茄(CKA)和黄瓜(CKB)。实验组和对照组处理24h后分别接种上带有10μl CMV病毒汁液。
在接种病毒后第7天，对实验组、对照组处理的叶片取材，检测RT-PCR检测CMVCP的积累水平，PCR产物电泳如表2所示。
表2病毒检测引物序列及扩增片段长度
其中，CMV-CP基因片段大小为600bp，CMV-RNA2处理的番茄(A)和黄瓜(B)，CMV积累量明显少于对照组番茄(CKA)和黄瓜(CKB)，说明RNA2的体外转录产物在番茄和黄瓜植物体内同样能抑制CMV的积累，对CMV具有一定的防治效果。
综上所述，本发明的含有CMV-RNA2小片段的制剂在抗黄瓜花叶病中具有显著的抑制作用，抑制效率高，部分处理组能够完全抑制病毒积累，且具有无农药残留的优势，安全性较高；由于采用CMVRNA2小片段混合GKP缓冲液和吐温展着剂直接涂抹或喷施于植株表面的预处理方式，尤其适于苗床期幼苗的病毒病防治。
序列表
<110> 四川农业大学
四川省烟草公司宜宾市公司
<120> 一种基于CMV RNA2的体外干扰黄瓜花叶病的制剂、其制备方法与应用
<130> 19111.1
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2610
<212> DNA/RNA
<213> 黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)
<400> 1
ttctcactag ccaatctttt gaatggtagt tacggtgtcg acactcccga ggatgtggaa 60
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agcgacacac tcaatatcga cagaccggtt ccagctacta taacgtatca taagaagagt 1380
ataacctccc agttctcacc gttatttaca gcgctattcg agcgcttcca gagatgcctt 1440
cgagaacgta ttattcttcc tgttggtaag atttcatctc ttgagatggc aggatttgat 1500
gtcaaaaaca agtactgcct cgagattgat ttgtctaagt ttgataagtc tcaaggtgaa 1560
tttcacttac caattcagga acatattttg aatggtctgg ggtgtccagc tccgataacc 1620
aagtggtggt gcgatttcca ccgattctct tacatcagag atcgtagagc tggtgttggt 1680
atgcctatta gtttccagag acgaactggt gatgcattca cttattttgg caataccatt 1740
gtcaccatgg ctgagtttgc ctggtgttat gacaccgatc aattcgaaaa acttttattc 1800
tcaggcgatg actctctagg attttcacag cttccccctg ttggtgatcc gagtaaattc 1860
acgactcttt acaacatgga agctaaggtg atggaaccat cagtaccata tatttgttcg 1920
aagttcttac tctctgacga gttcggtaac acattttccg ttccagatcc attgcgcgag 1980
gttcagcggt taggaacaaa gaaaatcccc tattccgaca atgatgaatt cttgtttgct 2040
cacttcatga gctttgttga tcgattgaag tttttggacc gaatgtctca gtcgtgtatc 2100
gatcaacttt cgattttctt tgaattgaaa tacaagaagt ctggggaaga ggccgcttta 2160
atgttaggcg cctttaagaa atataccgct aatttccagt cctacaaaga actctattat 2220
tcagatcgtc gtcagtgcga attgatcaat tcgttttgta gtacagagtt cagggttgag 2280
cgtataaatt ccaataaaca gcgaaagaaa catggaattg aacgtaggcg cgatgacaaa 2340
cgtcgaactc caactggctc gtatggtgga ggcgaagaag cagagacgaa ggtctcacaa 2400
gcagaatcga cgggaacgag gtcacaaaag tcccagcgag agagcgcgtt caaatctcag 2460
actgttccgc ttcctaccgt tctatcaagt ggatggtccg gaactgacag ggttatgccg 2520
ccatgtgaac gtggcggagt tacccgagcc tgaggcctct cgtttagagt tatcggcgga 2580
agaccatgat tttgacgata ccgattggtt 2610
<210> 2
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
taatacgact cactataggg ttctcactag ccaatctttt 40
<210> 3
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
gggcccaacc aatcggtatc gtcaaa 26
<210> 4
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
actccatctc agttcgtgt 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
gaccagaggt ccaaaccaa 19
<210> 6
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
atggacaaat ctggatctcc caatgc 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
ctaagtcggg agcatccgtg ag 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
gcyaycacgy ccaaaaygag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
ttgggctgat ttcaatgctg 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
gagcgtacgg ttcaayccct g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
tccgaagaaa yctaggagat g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
atggctttcc aaggtaccag 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 13
ccttccgaag aaayctagga g 21

Claims (11)

1.黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段，所述片段的序列如SEQ NO.1所示。
2.权利要求1所述的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段在抑制黄瓜花叶病上的应用。
3.含有根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段的制剂。
4.一种体外干扰黄瓜花叶病的制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)获取根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段；
(2)取步骤(1)的RNA2片段与2×GKP接种缓冲液等体积混合均匀，再加入以总体积百分数计1％～5％的吐温-80；混合均匀后即为所述制剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(1)的RNA2片段的制备方法包括以下步骤：
(1.1)取黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)侵染的植物发病叶片，以氯化锂沉淀法提取含黄瓜花叶病毒的植物总RNA；
(1.2)以步骤(1.1)的总RNA为模板反转录为cDNA，利用特异性引物CMVRNA2F和CMVRNA2R进行PCR扩增，得到CMV-RNA2的DNA片段，其中，所述特异性引物的序列为：
CMVRNA2F:TAATACGACTCACTATAGGGTTCTCACTAGCCAATCTTTT；
CMVRNA2R:GGGCCCAACCAATCGGTATCGTCAAA
(1.3)将步骤(1.2)得到的DNA片段在T7 RNA转录酶作用下转录为RNA，65℃温浴10分钟，室温放置2～6小时获得降解的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段，保存于-70℃冰箱备用。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1.2)的扩增体系是cDNA 3μl，上下游引物(10μmol/L)各0.5μl,ExTaq 0.5μl,10×ExTaq Buffer 2μl，dNTP Mixture 1μl,加ddH2O 12.5μl补足到20μl；扩增条件是94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃10分钟，共33个循环，得到CMV-RNA2的DNA片段。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(1)的RNA2片段的制备方法包括以下步骤：
(1.1)取黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)侵染的植物发病叶片，以氯化锂沉淀法提取含黄瓜花叶病毒的植物总RNA；
(1.2)以步骤(1.1)的总RNA为模板反转录为cDNA，利用特异性引物CMVRNA2F和CMVRNA2R进行PCR扩增，得到CMV-RNA2的DNA片段，其中，所述特异性引物的序列为：
CMVRNA2F:TAATACGACTCACTATAGGGTTCTCACTAGCCAATCTTTT；
CMVRNA2R:GGGCCCAACCAATCGGTATCGTCAAA
(1.3)将步骤(1.2)得到的DNA片段构建于T载体得到重组质粒，将所述重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株并提取质粒，酶切质粒获得线性化含CMV-RNA2的DNA片段；
然后将线性化含CMV-RNA2的质粒在T7 RNA转录酶作用下转录为RNA，65℃温浴10分钟，室温放置2～6小时获得降解的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)RNA2片段，保存于-70℃冰箱备用。
8.一种体外干扰防治黄瓜花叶病的方法，其特征在于在易感染黄瓜花叶病植物的幼苗期，以喷施或涂抹的方式向植株叶片施用根据权利要求3所述的所述的制剂或根据权利要求4-7中任一项权利要求所述的制备方法制备得到的制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述易感染黄瓜花叶病植物包括烟草、黄瓜和番茄。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于施用量为10μg-50μg/株。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于在幼苗期重复施用2～3次，每次间隔时间为24h以上。
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