CN113388637A - 含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体及其应用 - Google Patents

含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型载体pCCFR2‑2bPTⅢ，所述载体的CMVFny突变型RNA2核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的突变体与CMVFnyRNA1、CMVFnyRNA3混合接种，对CMV具有交叉保护效果；且突变型载体pCCFR2‑2bPTⅢ至少可以容纳350bp的外源片段并保持遗传稳定性，为研发多价弱毒疫苗提供了更优化的基础载体，为田间防治CMV及其他病毒提供了疫苗材料和有效防治措施。

Description

含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体及其 应用
技术领域
本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一种含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ的构建及其应用。
背景技术
植物病毒病素有植物“癌症”之称，是农作物的重要病害之一，每年给世界各地农作物造成不同程度的危害，仅在我国，每年由于病毒造成的损失高达300亿元(解昆仑等，2020)，防治植物病毒病一直是农业生产中的难题。黄瓜花叶病毒(cucumber mosaicvirus，CMV)是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，可侵染100多科1200多种植物，造成多种具有重要经济价值的植物(农作物、园艺作物等)出现黄化、矮化、畸形等症状，严重影响其产量和品质(Mochizuki et al.,2012)。关于植物病毒病的防治，利用弱毒疫苗进行交叉保护，是一种有效的病毒防治策略，存在期效长、无污染、对环境友好等优点。
对于通过分子生物学手段人工制备的多价弱毒疫苗，由于其在构建时需要插入异源病毒的片段，既要插入一定长度的异源病毒片段以保证潜在的基因沉默对异源病毒的防治效果，同时还要保证弱毒突变体的稳定性(即在插入异源病毒片段后的稳定存在)，相对于抗单独病毒的弱毒疫苗，多价弱毒疫苗的构建难度更大。因此，研究能够容纳更长外源片段的疫苗构建载体，是多价弱毒疫苗构建的重要解决方案。
本发明在前期研究中开发设计了一种2b蛋白翻译提前终止的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅡ，其针对2b蛋白编码序列进行改造获得弱毒突变体。但是，由于病毒对自身尺寸存在包装限制，所以构建多价弱毒疫苗时，插入的外源病毒片段具有长度限制。以pCCFR2-2bPTⅡ作为基础载体，构建多价弱毒疫苗时，可以容纳200bp外源片段并保持遗传稳定性，插入200bp以上的外源片段时不稳定。为获得多价弱毒疫苗，需要基础载体有较大的容纳外源片段的能力。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体。本发明的突变型质粒可以CMV具有交叉保护效果；其作为疫苗载体，至少可以容纳350bp的外源片段并保持遗传稳定性。以此弱毒疫苗载体为基础，为插入更多种类的外源病毒片段提供了更多选择，为研发多价弱毒疫苗提供了更优化的基础载体。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体，将其命名为pCCFR2-2bPTⅢ，所述突变型质粒载体含有CMVFny分离物突变型RNA2；所述CMVFny分离物突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面，提供上述含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ的制备方法，包括以下步骤：
以CMVFny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMVFny-R2为模板，利用反向PCR扩增技术获得线性化载体；利用BamHI酶切与连接技术，最终获得载体pCCFR2-2bPTⅢ。
所述载体pCCFR2-2bPTⅢ是将RNA2的2662-2751位核苷酸序列缺失，然后再依次引入双终止密码子TAATAG及多克隆酶切位点GGATCCACTAGTCCCGGG(BamH I、SpeI、SmaI)。
优选的，用于反向PCR扩增的引物序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
优选的，反向PCR扩增的条件为：98℃变性10s，68℃延伸7min 30s，30个循环；4℃保存。
本发明的第三方面，提供含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ在构建植物病毒弱毒疫苗中的应用。
优选的，所述植物病毒弱毒疫苗为多价弱毒疫苗。
本发明的第四方面，提供含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ作为弱毒疫苗在植物病毒病CMV防治中的应用。
本发明的第五方面，提供含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ在测定容纳外源片段限度中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明对黄瓜花叶病毒的2b蛋白编码序列进行了部分缺失，将RNA2的2662-2751位核苷酸序列进行缺失，在2661G后插入双终止密码子TAATAG，然后依次引入多克隆酶切位点GGATCCACTAGTCCCGGG(BamHI、SpeI、SmaI)，获得一种黄瓜花叶病毒的弱毒突变体，该质粒与含有CMVFny分离物的RNA1和RNA3的质粒混合接种，可以预防CMV强毒株系的侵染，可作为抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗。
(2)本发明获得的黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗载体pCCFR2-2bPTⅢ作为多价弱毒疫苗构建的基础载体，至少可以容纳350bp外源片段并保持遗传稳定性，为构建多价弱毒疫苗提供更多病毒种类的选择。
(3)对于获得的黄瓜花叶病毒弱毒突变体，本发明可以作为多价弱毒疫苗构建的基础载体，利用引入的多克隆酶切位点，插入其他重要的植物病毒序列，得到兼抗黄CMV及其他病毒的多价弱毒疫苗。
附图说明
图1：基础载体pCB301-CMVFny-R2、突变型载体pCCFR2-2bPTⅢ及用于外源片段插入长度测定的突变体pCCFR2-2bPTⅢ-PDS示意图；图中，LB，T-DNA left border(LB)；RB，T-DNA right border(RB)；35S，promoter(from gene 2x35S)；RZ，ribozyme(HDV-RZ)；NOS，terminator(NOS terminator)。
图2：载体pCCFR2-2bPTⅢ的酶切鉴定结果电泳示意图；其中Marker为Tiangen公司的D15000+2000分子量标准，酶切后片段约为7.5kb。
图3：pCCFR2-2bPTⅢ在本氏烟上致病力及交叉保护CMV效果测定；mock，空的农杆菌菌液；wt，CMVFny；R1，CMVFny RNA1；R3，CMVFny RNA3。
图4：pCCFR2-2bPTⅢ容纳外源片段的长度限度测定。A.外源片段插入型突变体致病力测定；其中wt，CMVFny；R1，CMVFny RNA1；R3，CMVFny RNA3；P200、P300、P350、P400、P600、P800分别代表长度为200bp、300bp、350bp、400bp、600bp、800bp的PDS序列；dpi，接种后的天数。B.RT-PCR检测外源片段插入型突变体遗传稳定性；其中Marker为Tiangen公司的D2000分子量标准。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所介绍的，基础载体容纳外源片段的能力是衡量基础载体的性能的关键指标之一。CMV是三分体RNA病毒，共编码5个蛋白，其中2b蛋白是一种基因沉默抑制因子，能够最大限度地保护病毒基因组不被寄主植物降解(Csorba et al.，2015)。由于CMV的2b蛋白是病毒编码的基因沉默抑制因子，对寄主植物对病毒基因组的基因沉默作用有很强的抑制作用，对2b蛋白的编码基因进行突变改造是构建CMV弱毒突变体的研究热点。本发明在前期研究中开发设计了一种2b蛋白翻译提前终止的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅡ，以其基础载体，构建多价弱毒疫苗时，由于病毒对自身尺寸存在包装限制，所以对插入的外源病毒片段长度存在限制。以pCCFR2-2bPTⅡ作为多价弱毒疫苗构建的基础载体，可以容纳长度为200bp或以内的外源片段，其作为基础载体容纳外源片段的能力还有待进一步提高。
基于此，为增大基础载体容纳外源片段的能力，本发明对黄瓜花叶病毒2b蛋白编码基因的改造策略进行了改进，本发明的基础载体是将RNA2的2662-2751位核苷酸序列进行缺失后，在2661G后依次引入双终止密码子(TAATAG)及多克隆酶切位点GGATCCACTAGTCCCGGG(BamHI、SpeI、SmaI)，得到含有突变型CMVFny RNA2的质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ。质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ中突变型CMVFny RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
gtttatttacaagagcgtacggttcaacccctgcctcccctgtaaaactccctagacttaaatcttttctttctagtatcttttctatggctttccctgcccccgcattctcactagccaatcttttgaacggcagttacggtgtcgacactcccgaggatgtggaacgtttgcgatctgagcaacgcgaagaggctgctgcggcctgtcgtaattacaggcccctacccgctgtggatgtcagcgagagtgtcacagaggacgcgcattccctccgaactcctgacggagctcccgctgaagcggtgtctgatgagtttgtaacttatggtgctgaagattaccttgaaaaatctgatgatgagctccttgtcgcttttgagacgatggtcaaacccatgcgtatcggacaactatggtgccctgcgtttaataaatgttcttttatttccagcattgctatggccagagctttgttgttggcacctagaacatcccaccgaaccatgaagtgttttgaagacctggtcgcggctatttacactaaatctgatttctactacagtgaagagtgtgaagccgacgacgctcagatagatatctcgtctcgcgatgtacccggttattctttcgaaccgtggtcccgaacgtctggatttgaaccgccgcccatttgtgaagcgtgcgacatgatcatgtaccagtgcccgtgttttgattttaatgctttaaagaaatcgtgcgctgagaggaccttcgctgatgattatgttattgaaggtttagatggtgttgttgataatgcgactctgttgtcgaatttgggtccatttttggtacccgtgaagtgtcaatatgaaaaatgtccaacgccaaccatcgcgattcctccggatttaaaccgtgctactgatcgtgttgatatcaatttagttcaatccatttgtgactcgactctgcccactcatagtaattacgacgactcttttcatcaagtgttcgtcgaaagtgcagactattctatagatctggatcatgttagacttcgacagtctgatcttattgcaaaaattccagattcagggcatatgataccggttctgaacaccgggagcggtcacaagagagtaggtacaacgaaggaggtccttacagcaattaagaaacgtaatgctgacgttccagagctaggtgattccgttaatttgtctagattgagtaaagctgtggctgagagattcttcatttcatacatcaatggtaactctctagcatccagtaactttgtcaatgtcgttagtaacttccacgattacatggaaaaatggaagtcctcaggtctttcttatgatgatcttccggatcttcatgctgagaatttgcagttttatgaccacatgataaaatccgatgtgaaacctgtggtgagcgacacactcaatatcgacagaccggttccagctactataacgtatcataagaagagtataacctcccagttctcaccgttattcacagcgctattcgagcgcttccagagatgccttcgagaacgtattattcttcctgttggtaagatttcatcccttgagatggcaggatttgatgtcaagaacaagcactgcctcgagattgacctgtctaagtttgataagtctcaaggtgaatttcacttgctaatccaggaacacattttgaatggtctaggatgtccagctccgataactaagtggtggtgtgatttccatcgattctcttacattagagaccgtagagctggtgttggtatgcctattagtttccagagacgaactggcgatgcactcacttattttggcaataccatcgtcaccatggctgagtttgcctggtgttatgacaccgaccaattcgaaaagcttttattctcaggcgatgattctctaggattttcactgcttccccctgttggtgacccgagtaaattcacaactcttttcaacatggaagctaaggtgatggaacctgccgtaccatatatttgttcgaagttcttactctctgacgagttcggtaacacattttccgttccagatccattgcgcgaggttcagcggttaggaacaaagaaaattccctattctgacaatgatgaattcttgtttgctcacttcatgagctttgttgatcgattgaagtttttggaccgaatgtctcagtcgtgtatcgatcaactttcgattttcttcgaattgaaatacaagaagtctggggaagaggctgctttaatgttaggcgcctttaagaagtataccgctaatttccagtcctacaaagaactctattattcagatcgtcgtcagtgcgaattgatcaattcgttttgtagtacagagttcagggttgagcgtgtaaattccaacaaacagcgaaagaattatggaattgaacgtaggtgcaatgacaaacgtcgaactccaactggctcgtatggtggaggcgaagaagcagagacgaaggtctcacaaacagaatcgacgggaacgaggtcacaaaagtcccagcgagagagcgcgttcaaatctcagactattccgcttcctaccgttctatcaagtggatggttcggaactgacagggtcatgccgccatgtgaacgtggcggagttacccgagtctgagTAATAGGGATCCACTAGTCCCGGGaacctccccttccgcatctccctccggttttctgtggcgggagctgagttggcagtattgctataaactgtctgaagtcactaaacacattgtggtgaacgggttgtccatccagcttacggctaaaatggtcagtcgtagaggaatctacgccagcagacttacaagtctctgaggcacctttgaaaccatctcctaggtttcttcggaaggacttcggtccgtgtacttctagcacaacgtgctagtttcagggtacgggtgccccccacttttgtggggcctccaaaaggagacca
上述序列中，小写字母表示缺失2662-2751位核苷酸的CMVFnyRNA2序列，大写字母表示引入的外源序列，其中斜体表示终止密码子，下划线表示酶切位点。
采用本发明的这种设计，可以保证2a蛋白的完整性的同时，将载体容纳外源片段的能力提升为350bp。
在本发明的一个优选实施方案中，给出了含有突变型CMVFny RNA2的质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ的构建方法，具体如下：
根据GenBank中公布的CMVFny RNA2的序列(登录号：D00355)，设计引物Fny2-del2b-BSS-2752-F和Fny2-del2b-2661-R(详细信息见表1)。以pCB301-CMVFny-R2为模板，在PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)作用下进行PCR反向扩增，利用DpnI(NEB)降解质粒模板后，对PCR扩增片段进行BamHI酶切后自连，连接产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR、质粒酶切鉴定和DNA测序，确认得到载体pCCFR2-2bPTⅢ。该载体pCCFR2-2bPTⅢ是将RNA2的2662-2751位序列缺失，并依次引入双终止密码子(TAATAG)及多克隆酶切位点GGATCCACTAGTCCCGGG(BamH I、SpeI、SmaI)(图1)。
表1：本发明中用到的引物
Primers Sequences(5'to 3') 序列号
Fny2-del2b-BSS-2752-F TC<u>GGATCCACTAGTCCCGGG</u>AACCTCCCCTTCCGCATCT SEQ ID No.2
Fny2-del2b-2661-R AT<u>GGATCC</u>CTATTACTCAGACTCGGGTAACTCCGCC SEQ ID No.3
PDS-SmaI-333-F AT<u>CCCGGG</u>GGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGG SEQ ID No.4
PDS-BamHI-531-R AT<u>GGATCC</u>CAGGTTCTGCATATTTGGGTAAGC SEQ ID No.5
PDS-BamHI-632-R AT<u>GGATCC</u>GGAAAATCAAAGCGGCTGAACT SEQ ID No.6
PDS-BamHI-682-R AT<u>GGATCC</u>TGTTCTTTAGTATGGCCAAAATTCCA SEQ ID No.7
PDS-BamHI-732-R AT<u>GGATCC</u>CAAGAGTCCAATAGCAAATTTGACT SEQ ID No.8
PDS-BamHI-932-R AT<u>GGATCC</u>TTCTCCTGAAGAAATCTGTTCAAAGC SEQ ID No.9
PDS-BamHI-1132-R AT<u>GGATCC</u>CAAACACAAAAGCATCTCCTTTAATTGT SEQ ID No.10
CM-Fny2-2510-F AGAATCGACGGGAACGAGGT SEQ ID No.11
CM-Fny2-R TGGTCTCCTTTTGGAGGCCCC SEQ ID No.12
注：保护碱基用粗体表示，酶切位点用下划线表示，终止密码子用斜体表示。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。
实施例1.载体pCCFR2-2bPTⅢ的构建：
以CMVFny侵染性克隆质粒pCB301-CMVFny-R2为模板(CMVFny侵染性克隆质粒pCB301-Fny2的构建参照“农杆菌介导的CMV侵染性克隆及2b缺失突变体的构建”，姚敏等，中国农业科学，2011,44(14)：3060-3068)，在PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara)作用下，进行反向PCR扩增，引物对Fny2-del2b-BSS-2752-F和Fny2-del2b-2661-R；PCR条件：98℃变性10s，68℃延伸7min 30s，30个循环；4℃保存；扩增得到的PCR产物即为线性化基础载体pCCFR2-2bPTⅢ。
利用DpnI(NEB)降解PCR反应中的质粒模板pCB301-CMVFny-R2，反应条件为：37℃，1h；80℃，20min；产物利用无水乙醇沉淀法进行回收：将产物加入ddH2O至450μl，加入50μlpH5.2，3.0mM醋酸钠，1ml无水乙醇，-80℃沉淀2h；常温12000rpm，离心10min，将液体倒掉，加入600μl 70％乙醇；常温12000rpm，离心5min，将液体倒掉；常温12000rpm，离心1min后将离心管内液体吸净，加入30μl ddH2O回溶。
然后利用BamHI(Takara)酶切回收产物，酶切产物经DNA回收试剂盒回收后，在T4DNA连接酶(Takara)作用下16℃过夜自连，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂带有100μg/mL卡那霉素的LB平板，经菌落PCR、质粒酶切鉴定和DNA测序，确认得到疫苗基础载体pCCFR2-2bPTⅢ。
结果分析：PCR产物经BamHI酶切后自连，转化产物经菌落PCR初筛后，提质粒进行酶切鉴定，选用BamHI和SmaI分别进行酶切鉴定，酶切结果显示质粒可以被这位两个酶线性化，且线性化质粒长度约为7.5kb(图2)，基本确认该质粒中含有BamHI、SpeI和SmaI的多克隆位点，并最终通过质粒的DNA测序确认。
本实施例构建得到的疫苗基础载体pCCFR2-2bPTⅢ是将RNA2的2662-2751位核苷酸序列缺失，然后再依次引入双终止密码子TAATAG及多克隆酶切位点GGATCCACTAGTCCCGGG(BamH I、SpeI、SmaI)。
实施例2.质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ的生物学效应及交叉保护效果测定：
农杆菌浸润侵染本氏烟：首先将含有野生型CMVFnyRNA1、pCCFR2-2bPTⅢ、野生型CMVFny RNA3的质粒分别转化农杆菌GV3101的感受态细胞，均匀涂抹于LB固体培养基(50μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平)，28℃，培养48h后挑取单斑进行菌落PCR验证后，挑取单斑于2ml LB培养液(50μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平)，28℃，200rpm振荡培养24h。
取100μl菌液于5ml LB培养液(50μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平)，28℃，200rpm振荡培养至OD600为1.0-2.0。
将菌液于10ml离心管，室温条件下，6000rpm离心10min；收集菌体并重新悬浮于1ml农杆菌菌体重悬溶液(10mM MgCl2，10mM MES，0.15mM AS，调整浓度使其OD600为1.2，并使得3种菌液OD600一致。
将3种调节好OD600值的菌液(分别含有CMVFnyRNA1、pCCFR2-2bPTⅢ、CMVFnyRNA3)等比例混匀，28℃静置3h。
取1ml一次性注射器，去掉针头并吸取农杆菌菌液，选取6-8叶期的本氏烟，利用压力将注射器中的菌液从叶片背面的叶脉之间注入，每株共注射两个叶片，每片叶片注射量至少覆盖叶片的1/3。
接种突变体的7d后，用农杆菌注射的方式，用靶标强毒CMV侵染预先接种突变体的植株和未预先接种突变体的植株，分别测试其交叉保护效果。
接种完的植株放置25℃培养，16h光照/8h黑暗交替。
结果分析：接种14d后，接种症状显示，mock本氏烟不发病，长势良好；野生型CMV(wt)接种本氏烟发病严重，植株矮化，叶片皱缩；接种R2-2bPTⅢ的本氏烟，植株症状与mock植株基本一致，无明显的病毒症状，表明R2-2bPTⅢ为CMVFny RNA2的弱毒突变体(图3)。CMV强毒直接接种前期未接种R2-2bPTⅢ突变体的本氏烟，植株叶片皱缩严重，与wt相似；CMV强毒接种预接种R2-2bPTⅢ突变体的本氏烟，植株生长状态良好，叶片平展，与mock相似。说明R2-2bPTⅢ为CMVFny RNA2的弱毒突变体，且对CMV具有较好的预防作用(图3)。
实施例3.质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ容纳外源片段的限度测定：
含有不同长度PDS序列的质粒载体构建，方法参见前期研究(专利号：202011259238.8)中质粒构建方法，提取6叶期本氏烟植物总RNA，利用反向引物PDS-BamHI-1132-R进行反转录反应；再以反转录产物cDNA为模版，以正向引物PDS-SmaI-333-F，反向引物PDS-BamHI-531-R、PDS-BamHI-632-R、PDS-BamHI-682-R、PDS-BamHI-732-R、PDS-BamHI-932-R、PDS-BamHI-1132-R分别进行PCR反应，扩增长度为200bp、300bp、350bp、400bp、600bp、800bp的部分PDS序列；将载体pCCFR2-2bPTⅢ与PDS片段经BamHI和SmaI双酶切后经DNA回收试剂盒回收；将经过相同酶切后的载体pCCFR2-2bPTⅢ和不同长度的PDS片段分别进行连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂带有100μg/mL卡那霉素的LB平板，经菌落PCR筛选、酶切鉴定和DNA测序确认得到阳性克隆pCCFR2-2bPTⅢ-P200、pCCFR2-2bPTⅢ-P300、pCCFR2-2bPTⅢ-P350、pCCFR2-2bPTⅢ-P400、pCCFR2-2bPTⅢ-P600、pCCFR2-2bPTⅢ-P800。
利用实施例2中的方法，接种上述含PDS序列的质粒载体，接种14天后，记录突变体接种情况(图4A)，并对上部非接种系统叶片提取总RNA，在RNA2-2bPTⅢ的外源片段插入位点的上下游分别设计引物CM-Fny2-2510-F(SEQ ID NO.11)和CM-Fny2-R(SEQ ID NO.12)，进行RT-PCR检测，通过扩增片段的长度判断插入的PDS片段是否稳定存在(图4B)，若pCCFR2-2bPTⅢ-PDS稳定，当插入PDS长度为0bp、200bp、300bp、350bp、400bp、600bp、800bp时，对应的PCR产物片段长度应为470bp、670bp、770bp、820bp、870bp、1070bp、1270bp。
结果分析：接种症状显示，mock本氏烟不发病，长势良好；野生型CMV(wt)接种本氏烟发病严重，植株矮化，叶片皱缩；接种不同外源片段插入型突变体的本氏烟，植株新生叶片白化明显，叶片平展，株高与mock植株相似，无明显致病症状，说明外源片段插入型突变体均为弱毒突变体(图4A)。
需要说明的是，图3、图4A中，上下两排的植物照片中，同一位置的上和下两张照片对应着同一株植物从不同角度的观察结果。
RT-PCR结果显示，wt接种样品的扩增条带约为540bp，与预期条带大小一致(图4B，lane3)；突变体R2-2bPTⅢ接种样品的扩增条带约为470bp，与预期条带大小一致(图4B，lane4)，表明未插入外源片段的突变体R2-2bPTⅢ能够稳定存在于植物体内；突变体R2-2bPTⅢ-P200、R2-2bPTⅢ-P300、R2-2bPTⅢ-P350接种样品的扩增条带分别约为670bp、770bp和820bp(图4B，lane5/6/7)，与预期条带大小一致，表明插入200-350bp的外源片段均可以稳定存在；突变体R2-2bPTⅢ-P400、R2-2bPTⅢ-P600和R2-2bPTⅢ-P800(图4B，lane8/9/10)的扩增条带小于预期870bp、1070bp或1270bp，说明插入的400bp、600bp和800bp外源片段没有完整存在。表明突变体R2-2bPTⅢ、R2-2bPTⅢ-P200、R2-2bPTⅢ-P300、R2-2bPTⅢ-P350具有稳定遗传性，而突变体R2-2bPTⅢ-P400、R2-2bPTⅢ-P600、R2-2bPTⅢ-P800不具备稳定遗传性。
结合以上结果，说明突变型载体pCCFR2-2bPTⅢ至少可以容纳350bp的外源片段并保持遗传稳定性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体及其应用
<130> 2021
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2984
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtttatttac aagagcgtac ggttcaaccc ctgcctcccc tgtaaaactc cctagactta 60
aatcttttct ttctagtatc ttttctatgg ctttccctgc ccccgcattc tcactagcca 120
atcttttgaa cggcagttac ggtgtcgaca ctcccgagga tgtggaacgt ttgcgatctg 180
agcaacgcga agaggctgct gcggcctgtc gtaattacag gcccctaccc gctgtggatg 240
tcagcgagag tgtcacagag gacgcgcatt ccctccgaac tcctgacgga gctcccgctg 300
aagcggtgtc tgatgagttt gtaacttatg gtgctgaaga ttaccttgaa aaatctgatg 360
atgagctcct tgtcgctttt gagacgatgg tcaaacccat gcgtatcgga caactatggt 420
gccctgcgtt taataaatgt tcttttattt ccagcattgc tatggccaga gctttgttgt 480
tggcacctag aacatcccac cgaaccatga agtgttttga agacctggtc gcggctattt 540
acactaaatc tgatttctac tacagtgaag agtgtgaagc cgacgacgct cagatagata 600
tctcgtctcg cgatgtaccc ggttattctt tcgaaccgtg gtcccgaacg tctggatttg 660
aaccgccgcc catttgtgaa gcgtgcgaca tgatcatgta ccagtgcccg tgttttgatt 720
ttaatgcttt aaagaaatcg tgcgctgaga ggaccttcgc tgatgattat gttattgaag 780
gtttagatgg tgttgttgat aatgcgactc tgttgtcgaa tttgggtcca tttttggtac 840
ccgtgaagtg tcaatatgaa aaatgtccaa cgccaaccat cgcgattcct ccggatttaa 900
accgtgctac tgatcgtgtt gatatcaatt tagttcaatc catttgtgac tcgactctgc 960
ccactcatag taattacgac gactcttttc atcaagtgtt cgtcgaaagt gcagactatt 1020
ctatagatct ggatcatgtt agacttcgac agtctgatct tattgcaaaa attccagatt 1080
cagggcatat gataccggtt ctgaacaccg ggagcggtca caagagagta ggtacaacga 1140
aggaggtcct tacagcaatt aagaaacgta atgctgacgt tccagagcta ggtgattccg 1200
ttaatttgtc tagattgagt aaagctgtgg ctgagagatt cttcatttca tacatcaatg 1260
gtaactctct agcatccagt aactttgtca atgtcgttag taacttccac gattacatgg 1320
aaaaatggaa gtcctcaggt ctttcttatg atgatcttcc ggatcttcat gctgagaatt 1380
tgcagtttta tgaccacatg ataaaatccg atgtgaaacc tgtggtgagc gacacactca 1440
atatcgacag accggttcca gctactataa cgtatcataa gaagagtata acctcccagt 1500
tctcaccgtt attcacagcg ctattcgagc gcttccagag atgccttcga gaacgtatta 1560
ttcttcctgt tggtaagatt tcatcccttg agatggcagg atttgatgtc aagaacaagc 1620
actgcctcga gattgacctg tctaagtttg ataagtctca aggtgaattt cacttgctaa 1680
tccaggaaca cattttgaat ggtctaggat gtccagctcc gataactaag tggtggtgtg 1740
atttccatcg attctcttac attagagacc gtagagctgg tgttggtatg cctattagtt 1800
tccagagacg aactggcgat gcactcactt attttggcaa taccatcgtc accatggctg 1860
agtttgcctg gtgttatgac accgaccaat tcgaaaagct tttattctca ggcgatgatt 1920
ctctaggatt ttcactgctt ccccctgttg gtgacccgag taaattcaca actcttttca 1980
acatggaagc taaggtgatg gaacctgccg taccatatat ttgttcgaag ttcttactct 2040
ctgacgagtt cggtaacaca ttttccgttc cagatccatt gcgcgaggtt cagcggttag 2100
gaacaaagaa aattccctat tctgacaatg atgaattctt gtttgctcac ttcatgagct 2160
ttgttgatcg attgaagttt ttggaccgaa tgtctcagtc gtgtatcgat caactttcga 2220
ttttcttcga attgaaatac aagaagtctg gggaagaggc tgctttaatg ttaggcgcct 2280
ttaagaagta taccgctaat ttccagtcct acaaagaact ctattattca gatcgtcgtc 2340
agtgcgaatt gatcaattcg ttttgtagta cagagttcag ggttgagcgt gtaaattcca 2400
acaaacagcg aaagaattat ggaattgaac gtaggtgcaa tgacaaacgt cgaactccaa 2460
ctggctcgta tggtggaggc gaagaagcag agacgaaggt ctcacaaaca gaatcgacgg 2520
gaacgaggtc acaaaagtcc cagcgagaga gcgcgttcaa atctcagact attccgcttc 2580
ctaccgttct atcaagtgga tggttcggaa ctgacagggt catgccgcca tgtgaacgtg 2640
gcggagttac ccgagtctga gtaataggga tccactagtc ccgggaacct ccccttccgc 2700
atctccctcc ggttttctgt ggcgggagct gagttggcag tattgctata aactgtctga 2760
agtcactaaa cacattgtgg tgaacgggtt gtccatccag cttacggcta aaatggtcag 2820
tcgtagagga atctacgcca gcagacttac aagtctctga ggcacctttg aaaccatctc 2880
ctaggtttct tcggaaggac ttcggtccgt gtacttctag cacaacgtgc tagtttcagg 2940
gtacgggtgc cccccacttt tgtggggcct ccaaaaggag acca 2984
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcggatccac tagtcccggg aacctcccct tccgcatct 39
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggatccct attactcaga ctcgggtaac tccgcc 36
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcccggggg agattgttat tgctggtgca gg 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggatccca ggttctgcat atttgggtaa gc 32
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggatccgg aaaatcaaag cggctgaact 30
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggatcctg ttctttagta tggccaaaat tcca 34
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggatccca agagtccaat agcaaatttg act 33
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggatcctt ctcctgaaga aatctgttca aagc 34
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggatccca aacacaaaag catctccttt aattgt 36
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agaatcgacg ggaacgaggt 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tggtctcctt ttggaggccc c 21

Claims (8)

1.一种含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ，其特征在于，所述突变型质粒载体含有CMVFny分离物突变型RNA2；所述CMVFny分离物突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以CMVFny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMVFny-R2为模板，利用反向PCR扩增技术获得线性化载体；利用BamHI酶切与连接技术，最终获得突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ；
所述突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ是将RNA2的2662-2751位核苷酸序列缺失，然后再依次引入双终止密码子TAATAG及多克隆酶切位点GGATCCACTAGTCCCGGG。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，用于反向PCR扩增的引物序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反向PCR扩增的条件为：98℃变性10s，68℃延伸7min 30s，30个循环；4℃保存。
5.权利要求1所述的含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ在构建植物病毒弱毒疫苗中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物病毒弱毒疫苗为多价弱毒疫苗。
7.权利要求1所述的含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ作为弱毒疫苗在植物病毒病CMV防治中的应用。
8.权利要求1所述的含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCCFR2-2bPTⅢ在测定容纳外源片段限度中的应用。
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