KR940007772B1 - 작물 바이러스 또는 이들의 작용을 변형시키는 방법 - Google Patents

작물 바이러스 또는 이들의 작용을 변형시키는 방법 Download PDF

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애그리컬춰럴 제네틱스 캄파니 리미티드
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Abstract

내용 없음.

Description

작물 바이러스 또는 이들의 작용을 변형시키는 방법
제 1 도는 CMV부수 RNA(Satellite RNA)에 상응하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다.
제 2 도는 부수 cDNA 멀티머(multimer)의 작제 방법을 개괄적으로 도시한 것이다.
제 3 도는 이원성(binary) Ti 플라스미드 발현 벡터에서 CMV 부수 cDNA 분자를 상세한 구조이다.
제 4 도는 형질전환된 직물로부터이 RNA를 노오던 블롯 분석(Northern blot analysis)한 것을 도시한 것이다.
제 5 도는 형질전환된 작물에서 부수 RNA의 발생에 관한 CMV감염의 영향을 도시한 것이다.
제 6 도는 증상 발생에 관한 전사된 부수체의 영향을 나타낸 것이다.
본 발명은 작물 바이러스 또는 이들의 작용을 변형시키는 방법에 관한 것이다.
오이 모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus ; CMV)의 몇몇 배양물의 입자는 일본쇄 RNA의 3개의 제놈 종 및 CMV 입자 단백질에 대해 mRNA로서 작용하는 서브-제놈종 외에도, 전형적으로 약 335 뉴클레오타이드 길이인 또다른 일본쇄 선형 RNA 분자를 함유한다. 부수 RNA(satellite RNA)로 알려진 이러한 여분의 문자는 CMV 제놈 RNA와는 어떤 인지할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 공유하고 있지는 않지만 CMV로 감염된 작물 또는 원형질체에서만 복제한다. 부수 RNA를 함유하지 않은 CMV 분리물은 부수체-부재 상태로 작물에서 반복적으로 배양할 수 있지만, 이 배양물에 부수 RNA를 가하는 경우 합성되어 바이러스 분리물의 성분으로서 존속한다. CMV 감염에 대한 부수 RNA의 작용은 균주마다 다르다. 많은 경우에 있어서, CMV의 정상적인 증상은 억제되며 이 결과 감염된 작물은 감염의 뚜렷한 증세를 나타내지 않는다. 그러나, 부수 RNA를 갖는 다른 균주가 존재하면 CMV의 증상과는 매우 다른 심각한 증상이 나타난다.
부수 RNA를 갖는 일부 CMV 균주로 감염된 작물이 부수체 없이 감염된 작물보다 훨씬 경미한 증상을 나타내므로, 부수, RNA를 함유하는 완전 바이러스를 사용하여 CMV 감염의 영향에 대해 작물을 보호하자는 제안이 있었다. 실제, 부수 RNA를 함유하는 CMV 균주로 미리 감염시키는 CMV로부터 보호되므로 후추작물의 수확량이 증가함이 실험으로 밝혀졌다. 또한, 양성 부수 RNA를 함유하는 CMV 균주로 토마토 작물을 감염시킨 결과 악성 부수 RNA를 함유하는 CMV 균주의 영향에 대해 교차 보호가 일어남이 밝혀졌다. 그러나, 예방제로 완전 바이러스를 사용하면 몇가지의 문제점이 야기될 수 있다. 보호 균주는 자체로 성장 및 수확에 역효과를 줄 수 있거나 다른 작물 종의 감염에 대한 병독보유생물(reservoir)일 수 있다. 또한, 비악성 균주가 악성으로 돌연변이될 가능성도 있다.
생물학적으로 활성이 있는, 바람직하게는 바이러스-유도된 유전 물질, 특히 부수 RNA가 헥 제놈으로부터 전사에 의해 작물에 유지되는, 본 발명에 설명되어 있는 방법으로 이들 어려움을 해결하고자 노력해왔다.
본 발명은 유전물질을 작물에 이입시키고 상기 작물을 작물 바이러스로 감염시켜 이입된 유전 물질의 발현으로 작은 바이러스 또는 이의 작용이 변형되도록 함이 특징으로 하여, 작물 바이러스 또는 이의 작용을 변형시키는 방법을 제공한다.
이입되는 유전물질은 바람직하게는 작물을 감염시킬 작물 바이러스와 동일하거나 상이한 작물 바이러스로부터, 임의로 변형시켜, 유도한다.
바람직한 태양에서, 작물내로 이입된 유전물질의 발현으로 작물에 대한 작물 바이러스의 공격의 증상이 약화된다.
작물에 전이된 유전물질은 바람직하게는 작물 바이러스 부수 RNA에 상응하는 cDNA이며, 여기에서 cDNA 및/또는 부수 RNA는 임의로 변형된다.
바이러스 RNA의 발현으로 관련 바이러스 RNA의 병원성작용에 대해 작물을 보호할 수 있다. 한편, 바이러스 기원의 RNA의 발현으로 서열 상동성을 갖지 않는 바이러스 RNA의 병원성 작용에 대해 보호할 수 있다. 또한, RNA와 같은 바이러스 유전물질의 발현은 독립적으로 상기 RNA의 단백질로의 해독에 영향을 미칠수도 있음을 주의해야 한다.
본 발명은 또한 작물에서 발현될 수 있고, 작물 바이러스에 의해 작물이 공격 받을때 상기 작물 바이러스 또는 이의 작용을 변형시킬 수 있는 DNA를 작물의 핵제놈에 이입시킴을 특징으로 하여, 작물을 유전적으로 조작하는 방법도 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 유전적으로 조작된 작물, 및 이러한 작물의 자손에 관한 것이다.
본 발명에서 사용하기에 특히 적합한 바이러스는 비교적 저분자량, 일반적으로 1000개 이하의 뉴클레오타이드를 갖는 부수 RNA를 함유하는 바이러스이다. 예로는 오이 모자이크 바이러스 또는 다른 큐커므바이러스(cucumovirus), 토바코 링스폿 바이러스(Tobacco Ringspot virus) 또는 다른 네포바이러스(nepovirus), 토마토 부시 스턴트 바이러스(Tomato Bushy Stunt Virus) 또는 다른 톰버스바이러스(tombusvirus), 순무 로제트 바이러스(Turnip Rosette Virus) 및 소베모바이러스(sobemovirus) 또는 그밖에 이들과 관련이 있는 다른 바이러스가 있다. 이러한 바이러스에 의해 감염될 수 있는 어떠한 작물이라도 본 발명에서 사용할 수 있다.
바람직하게는 바이러스는 오이 모자이크 바이러스(CMV)이고 형질전환이 사용되는 유전물질은 CMV 부수 RNA에 사응하는 cDNA이다. cDNA를 바람직하게는 수령작물의 핵 제놈내로 cDNA를 전이시킬 수 있는 발현 벡터, 예를 들어 아그로박테이움 투메페시언스(Agrobacteriumtumefaciens)의 Ti 플라스미드 계를 기본으로 하는 발현벡터 내로 전이시킨다.
따라서, 본 발명은 또한 수령 작물에서 발현될 수 있고, 작물이 작물 바이러스에 의해 공격받을 때 상기 작물 바이러스 또는 이의 작용을 변형시킬 수 있는 전이 가능한 DNA를 이입시킴을 특징으로 하여, 수령작물 핵제놈내로 DNA를 전이시킬 수 있는 발현 벡터도 제공한다. 발현 벡터는 바람직하게는 아그로박테리움 투메페시언스의 Ti 플라스미드로부터의 T-DNA 경계 서열, 전사 프로모터, CMV 부수 RNA에 상응하는 cDNA, 및 전사 터미네이터를 포함하는 플라스미드이다. 보호시킬 작물 세포, 예를 들어 잎 디스크(leaf disk)를 발현 벡터를 함유하는 아그로박테리움 투메페시언스 균주로 감염시키고 전체작물을 형질전환된 감염 세포로부터 재생시킨다.
여러 실험에서, 아그로박테리움의 Ti 플라스미드를 사용하여 신규 DNA서열을 작물의 핵 DNA에 도입시킬 수 있음을 알았다. 또한, 이들 DNA 서열이 적절한 프로모터 및 터미네이터 서열을 함유하는 경우, 형질전환된 세포에서 DNA가 RNA로 전사됨을 알았다. 아그로박테리움에 관련되지 않은, 신규 DNA 서열의 도입에 대한 다른 방법 및 바이러스도, 전사 프로모터 및 전시 터미네이터가 적절한 바이러스 서열에 대한 발현 카세트로서 벡터 분자에 이입된다면, 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 작물 세포의 형질전환을 위한 직접적인 DNA 흡수 방법도 사용할 수 있으며 이러한 방법은 하기 문헌들에 기술되어 있다[참조 : Krens, F. et al. Nature 296, 72-74(1982) ; Paskowski, J. et. al. EMBO J. 3, 2717-2722(1984) ; Hains, R. et al. Mol. Gen. Genet. 199, 161-168(1985) ; Potrykus et al. 상기 참조. 199. 183-188(1985) ; Fromm et al. Natuer. 319, 791-793(1986)].
담배 작물에서 CMV-RNA로 공동-감염되는 경우 부수 RNA 멀티머가 단위 길이 분자로 프로세싱(processing)되고 후속으로 복제됨을 알 수 있다. 이러한 관찰은 형질전환된 세포에서 RNA로서 신규 DNA의 발현을 성취하는 방법이 RNA 전사체가 전사 터미네이터 및 프로모터 영역으로부터의 서열을 함유함을 필수적으로 하기 때문에 중요하다. 다른 바이러스 계상에서 수행한 결과, 외래 서열을 바이러스 RNA분자의 말단에 첨가하면 RNA의 복제 능력에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 부수 RNA가 멀티머로부터 프로세싱에 의해 생성될 수 있다는 입증 부재하에, 부수 RNA의 cDNA 복사체가 형질전환된 세포에서 RNA로서 발현된다는 실험의 가장 그럴듯한 결과가 전사체가 도입 바이러스에 의해 복제되지 않는다는 것이라고 생각된다. 바이러스 증상의 억제시 부수 RNA의 작용이 복제 기착에 대한 부수 RNA와 바이러스 RNA 사이의 경쟁에 의해 조정되기 쉬우므로, 이것은 형질전환된 세포에서 부수 전사체가 CMV 증상 발생에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
그러나, 부수 RNA가 멀티머로부터 프로세싱될 수 있다는 것이 확증된 이상, 생물적 활성 부수 RNA가 형질전환된 작물 세포에서 발현될 수 있다는 것이 확실해진다. 1차 전사 생성물은 프로모터로부터 및 전사 터미네이터로부터의 말단에 추가의 서열을 함유하는 멀티머성 부수 RNA 분자일 것이다. CMV 감염 전 또는 후에, 부수 멀티머 전사체가 단위 길이 분자로 프로세싱된 다음 CMV 감염된 세포에서 정상적인 부수 RNA활성을 수행할 것이라고 예상할 수 있다. 이러한 활성에는 복제 및 증상약화가 포함될 것이라고 예상된다. 이러한 설명을 개괄적으로 나타내면 멀티머성 구조물로서 부수 RNA를 함유하는 cDNA 클론의 작제 방법 및 이들 서열을 Ti 플라스미드 발현 벡터에 삽입하는 방법이다. 부수 RNA의 멀티머 전사체의 생물적 활성은 형질전환된 담배 세포에서 나타났다.
[실시예]
본 발명의 태양을 설명하기 위해, CMA 부수 RNA의 DNA 복사체로 담배 작물을 형질전환시키는 방법, 이러한 작물에서 부수 RNA 전사체를 생산하는 방법 및 이러한 작물에서 성장한 CMV 배양물로 부수 RNA를 획득하는 방법을 설명한다.
이러한 작업에 사용되는 부수 RNA는 CMV 균주 I17N(ref 20)으로부터 분리되고 상보성 DNA(cDNA)로서 클론화된다. cDNA 클론의 뉴클레오타이드 서열은 CMV의 다른 균주의 뉴클레오타이드 서열과 매우 유사하다. 2개의 수미식 콘카테머성 부수 cDNA 분자를 작제한다. 이들은 5'말단에서의 불완전 단위와 함께 1개(pT 104) 또는 2개(pT 105)의 완전 부수 RNA 서열 단위로 이루어져 있으며(제 3 도), 복제 중간물질이라고 생각되는 멀티머성 부수 RNA를 모방하려는 것이다. 형질전환된 작물에서 이들 부수 서열의 발현을 성취하기 위해, cDNA 분자를 아그로박테리움 투메페시언스의 이원성Ti 플라스미드계를 기본으로 하는 발현 벡터(RoK 1)내로 전이시킨다. 생성된 플라스미드 Rok 1/104 및Rok 1/105로 표기한다.
설명은 4부분으로 나눈다 : 부수 RNA의 분리 및 정제 ; cDNA로서 부수 RNA의 클로닝 ; 부수 cDNA 멀티머의 작제 ; 부수 cDNA의 Ti 플라스미드내로의 전이.
[부수 RNA의 분리 및 정제]
니코티아나 클레벨란디(Nicotiana clevelandii) 작물을 오이 모자이크 바이러스(균주 I17N ; Dr. M. Jacquemond, INRA, Montfavet, FRNAce 제공)로 감염시키고 바이러스 입자를 로트(Lot)등의 문헌(참조 문헌 1)에 기술된 방색대로 정확하게 분리하고 정제한다. 바이러스입자에 나트륨 모데실 설페이트를 1%로 가하고, 완충액 포화된 페놀(50mM 트리스-Hcl pH S)로 추출하고 에탄올 침전시킴으로서 바이러스 입자로부터 RNA를 추출한다. RNA를 원심분리로 회수하고 물에 0.5mg/ml로 재현탁시킨다. 부수 RNA를 슈크로오즈 구배 원심분리로 정제한다. CMV RNA 33㎍ H2O 100μl로 희석하고 1M의 트리스-보레이트 완충액(pH 8) 2μl를 1M 메틸 제 2 수은 수산화물 5μl와 함께 가한다. 실온에서 5분후 β-머캅토 에탄올 5μl을 가하고 시료를 Sorvall AH 650 회전기 튜브에서 5-20%(w/v) 슈크로오즈 구배상에 적재한다. 구배물을 10mM 트리스-HCl pH 7.5, 100mM NaCl, 1mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) pH 8로 완충시킨다. 구배물을 20℃에서 50000rpm으로 2시간 동안 원심분리하고 20 등용적의 분획을 바닥으로부터 적하(dripping)로 수거한다. 각 분획으로부터의 분취량(20μl)을 부수 RNA의 존재를 검출하기 위해 에티듐 브로마이드로 염색한 아가로오즈 겔에서 전기영동에 의해 검정한다. 부수 RNA를 함유하는 분획들을 합하고 부수 RNA를 에탄올 침전으로 수거하여 증류수 20μl에 용해시킨다.
[상보성 DNA(cDNA)로서 부수 RNA의 클로닝]
cDNA 합성의 유도(priming)를 용이하게 하기 위해, 폴리아데닐레이트 서열을 부수 RNA의 3'말단에 가한다. 부수 RNA 10μl를 2.5mM MnCl2, 500μM ATP, 태좌 리보뉴클레아제 억제제 15U 및 폴리 A 폴리머라제 0.2U와 함께 25mM 트리스-HCl pH 7.9 및 250mM NaCl 25μl중 37℃에서 15분 동안 배양한다. 75μl로 희석하고 페놀로 추출함으로써 반응을 종결시킨다. 이어서, 폴리아데닐화된 부수체를 에탄올로 2회 침전시키고 증류수 10μl에 재현탁시킨다.
이 RNA로부터 cDNA의 합성은 25mM 트리스-HCl pH 8.3, 10mM KCl, 4mM MgCl2, 0.025mg/ml 올리고 dT12-18, 5mM 디티오트레이톨, 각가 500μM의 dATP, dGTP, dCTP 및 TTP, 대좌 리보뉴클레아제 억제제 15U, 역전사효소 15U 및32P(α 표시된) dATP(500Ci mmole)(New England Nuclear) 10μCi를 함유하는 반응 용적 25μl에서 올리고 dT12-18을 사용하여 유도한다. 42℃에서 1시간 후, 반응혼합물을 1분 동안 비등시키고, 얼음상에 10분동안 냉각시킨 다음 10000×g로 10분동안 원심분리한다. 상등액을 1M HEPES 완충액 pH 7 2.5μl, 20mM dATP, dGTP, dCTP 및 TTP 각각 0.5μl, 0.1M KCl 1.5μl, 물 2.6μl 및 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편) 5U에 가한다. DNA를 세파덱스(Sephadex) G-50의 1ml 컬럼에 통과시키고, 에탄올 침전시킨 다음 0.3M NaCl, 0.03M NaOAc(pH 4.5), 4 5mM ZnSO4, 및 S1 뉴클레아제 3000U/ml를 함유하는 5% 글리세롤 50μl에 재현탁시킨다. 37℃에서 1시간후, 반응 혼합물을 50μl TE를 가함으로써 희석하고 시료를 10mM 트리스-HCl pH 7.5, 1mM EDTA 및 100mM NaCl중에서 5-20% 슈크로오즈 구배상에 도말하고 SORVALL AH 650회전기 내에서 50000rpm으로 4시간 동안 원심분리한다. 구배를 바닥으로부터 분획화하고, 분획에서 반사능을 모니터 함으로써 검출되는 최대 50%의 cDNA 분자를 하나의 분획으로 수거한다. 시료를 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시키고 SORVALL AH 650회전기 내에서 40000rpm으로 30분 동안 원심분리하여 수거한다. 시료를 에탄올 100μl로 재침전시키고, 에탄올로 세정하고 건조시키고 1mM 트리스-HCl pH 8, 0.1mM EDTA의 혼합물 10μl에 용해시킨다.
cDNA를 말단 전이효소 및 dCTP와 함께 배양한 다음, cDNA를 플라스미드 벡터내로 용이하게 클로닝시키고 올리고 dC 말단을 가한다. 반응 혼합물은 cDNA 5μl, 10×완충액(1.4M 카코딜산, 0.3M 트리스 염기, 1.1M KOH) 1μl, 10mM dCTP 0.2μl, 20㎛ 디티오트레이톨 0.1μℓ, 물 1.7μl, 10mM CoCl21μl 및 말단 전이효소 10U를 함유한다. 반응 혼합물을 37℃에서 10분동안 배양한 다음 65℃에서 2분동안 배양하여 반응을 정지시킨다.
클로닝을 위한 벡터는 말단 전이효소와 유사한 반응에서 PstI으로 분해되고 dGTP로 말단화된 프라스미드 pUC9(참고문헌 2)이다. 말단화 cDNA(4μl)를 10mM 트리스-HCl pH 7.4, 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA의 30㎍중에서 말단화 플라스미드(80ng)와 아닐링한다. 반응 혼합물을 65℃ 가열하고 밤새 4℃로 냉각시킨다. 아닐링 혼합물 분취량(5μl)을 사용하여 이. 콜라이 균주 MC 1022를 형질전환시키고 LacZ 유전자중 cDNA 삽입물의 존재를 지시하기 위한 지시자(1PTG 및 Xgal)와 함께 앰피실린 상에 도말한다. 청색을 나타내지 않은 클로니를 더 분석하기 위해 선별한다.
처음에는 플라스미드 DNA를 정제된 부수 RNA에 하이브리드화되는 삽입물의 존재에 대해 분석한다. 후속으로, 이것을 확인한 다음, 플라스미드 DNA를 정제하고 삽입물의 크기를 PstI으로 분해시키고 폴리아크릴아미드에서 전기영동시켜 측정한다.
클론중 하나(B7 표기)에 대해, 삽입물 크기는 대략 410bp이라고 나타났다. 이는 cDNA 삽입물이 클로닝을 용이하게 하기 위해 상기한 바와 같이 가해진 균일중합체(homopolymer) 말단과 결합된 부수체 서열(335bp)의 대부분 또는 전부를 함유함을 지시한다.
B7의 삽입물에서 cDNA의 범위를 확인하기 위해, 뉴클레오타이드 서열을 막삼(Maxam)과 길버트(Gilbert)의 방법(참고문헌 3)을 사용하여 측정하고 제 1 도에 나타내었다. 서열은 아마 역전사효소에 의한 불완전 복제의 결과이리라고 생각되는데 5'말단에서 3개의 뉴클레오타이드가 cDNA에서는 결여된 것을 제외하고는, RNA로부터 직접 측정한 다른 CMV 부수 RNA 분자의 서열과 매우 유사하다.
후속의 조직은, 상이한 올리고뉴클레오타이드 시약(하기에서 기술)을 사용하여 보완하는 것을 제외하고는, 5'말단에서 상이한 정도의 완전성을 보여주는 클론을 사용하여 수행할 수 있다.
[부수 cDNA 멀티머의 작제]
서론에서 기술한 이유로, 부수 cDNA의 멀티머성 복사체를 작제하는 것이 필요하다고 생각된다. 이들은 제 2 도에서 개괄적으로 나타낸 조작의 복합 시리즈이며, 제 2 도에서의 목적은, 첫째 부수체 서열의 3'로부터 균일중합체 말단을 제거하는 것이다. 이어서 cDNA 분자를 2개의 부수체 서열 사이의 연결점에서 5'균일중합체 말단을 포함하도록, 다이머성 구조로 작제한다. 다음 단계는 연결 영역을 클로닝 아웃하고, 올리고뉴클레오타이느 지시된 돌연변이 유발 기술을 사용하여 5'균일 중합체 말단을 제거하고, 5말단으로부터 결손된 3개의 뉴클레오타이드를 대체하는 것이다. 이어서 변형된 연결 영역을 부수 cDNA를 함유하는 제한 단편에서 연결시켜 부수체 서열의 완전 단위 1개 또는 2개를 함유하는 구조물을 창조한다. 이들 조작은 하기에 더욱 상세히 기술되어 있다.
a) 부수체 서열의 3'로부터 균일중합체 말단을 제거하는 방법.
이 방법은 Bal 31 뉴클레아제를 사용하여 수행한다. 먼저 플라스미드 b7 60㎍을 BamHI로 절단하여 선형화한다. B7은 cDNA가 삽입되는 PsT I 부위에 인접하고 삽입물이 3'측에 존재하는 단일 BamHI 부위를 함유한다. 이어서, DNA를 페놀 추출하고, 에탄올 침전시킨 다음 10mM 트리스-HCl(pH 8) 1mM EDTA 400μl에 현탁시킨다. Bal 331 완충액 100μl를 가하고 0.5U의 Bal 31 뉴클레이제를 가한다. 분취량 130μl를 8, 12, 16분에 회수하여 페놀에 추출한다. 그런 다음 DNA를 에탄올 짐전으로 수거한다. Bal 31 분해된 DNA의 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 돌출 3'말단을 제거하고 3'오목말단을 재운다. 반응 혼합물은 TA 완충액(33mM 트리스-아세테이트 pH 7.9, 66mM K 아세테이트, 10mM Mg 아세테이트, 4mM 스페르민, 0.5mM 디티오트레이톨), 2.5μM dATP, dGTP, dCTP 및 TTP 및 T4 DNA 폴리머라제 5U를 75μl로 함유한다. 37℃에서 3시간 후에 반응 혼합물을 100μl로 희석하고 DNA를 Pst 1으로 분해시켜 2개의 단편을 유리시킨다. 더 큰 단편은 BamHI부위로 부터 결손된 벡터 플라스미드이다. 더 작은 단편은 5'Pst I 부위로부터 Bal 31 결실 부위가지 연장된 cDNA 삽입물이다. cDNA 삽입물의 거의 말단 뉴클레오타이드(- - -CCCOH)까지 연장되고 균일중합체 말단은 포함하지 않는 절제된 cDNA 분자를 분리하기 위해, DNA를 5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분획화하고 대략 350 뉴클레오타이드의 cDNA 단편을 분리하다. 이들 단편은 Pst I과 SmaI으로 분해된 pUC9내로 클로닝한다. cDNA의 말단 뉴클레오타이드가 SmaI 부위의 5'뉴클레오타이드를 나타내므로, cDNA의 정확한 3'말단에 대한 결실부를 함유하는 클론을 재조합 플라스미드에서 SmaI 부위의 존재에 의해 인지될 수 있다. 하나의 클론(D26으로 표기)이 이 기준을 충족시키는 것으로 확인되었다. 정확한 삽입물의 존재를 다른 제한 효소를 분해시켜 확인한다. 이 클론의 삽입물은, 본 명세서에서 기술하는 조작에 필수적이지는 않지만, 다른 실험을 위해 다른 플라스미드 pSP 6/4(참조문헌 4)로 전이시킨다. 후속의 조작은 pSP 6/4중 D26의 작제물(pSP 102로 표기)를 기본으로 한다. pSP 102의 적합한 형태를 제 2 도에 나타내었다.
b) 연결 영역의 돌연변이
다음 단계는 제 2 부수 cDNA 삽입물을 pSP 102에 가하여 수미식 다이머 구조를 창조함을 포함한다. 이렇게 하기 위해, pSP 102의 삽입물을, 10㎍ DNA를 SmaI 및 PstI으로 분해시킴으로써 유리시킨다. Pst I부위의 도출 3' 말단을 100μM dATP, dGTP, dCTP 및 TTP 및 T4 폴리머라제 4U를 25μl로 가하고 평활말단화한다. 이어서, 37℃에서 15분 동안 배양하고 cDNA 삽입물을 5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분획화함으로써 정제한다. 이 cDNA 삽입물을 pSP 102의 SmaI 부위내로 클론화하고 생성된 클론을 Taq1으로 분해시켜 수수식(head to head) 또는 수이식(head to tail)배열의 삽입물의 존재에 대해 선별한다. 수미식 다이머를 갖는 1개의 클론을 pSP 103으로 표기한다.
균일중합체 말단이 제거되도록 다이머의 연결영역을 돌연변이시키고, cDNA로부터 결손되었으리라고 생각되는 5'뉴클레오타이드를 복구하기 위해, 연결 영역 클론을 일본쇄 파지 벡터 mp10(참고문헌 5)내로 클로닝시킴이 필요하다. 정확한 연결 영역에서 서열 상보성을 나타내는 합성 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 것도 필요하다. 이 올리고뉴클레오타이드는 닥터 에스. 민터(Dr. S. Minter ; UMIST)로부터 구입하며 서열 TCCATCAAACAAAACGGGTCCTGTGTAGGA(이 서열내에서 GGG는 부수 RNA의 3'말단의 상보체이고 서열 AAAAC는 결손된 뉴클레오타이드를 포함한 부수체의 5'말단의 상보체이다)이다.
제 2 도에서 볼수 있는 바대로, TaqI 부위 사이에 있는 pSP 103의 DNA를 Accl부위에서 mp 10내로 클로닝한다. 이 클론(Taq 3으로 표기)으로 부터의 일본쇄 DNA를 표준방법(참고문헌 5)으로 분리한다.
합성 올리고뉴클레오타이드를 ATP와 폴리뉴클레오타이드 키나제를 반응시킴으로써 사용하기 위해 제조한다. 반응 혼합물은 올리고뉴클레오타이드 15pmol, 70mM 트리스ㆍHCl pH 7.6, 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨, 1mM ATp 및 폴리뉴클레오타이드 키나제 10U를 20μl 함유한다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양한 다음 70℃에서 10분 동안 가열함으로서 반응을 정지시킨다.
이어서 키나제 올리고뉴클레오타이드(5pmol)를 10mM 트리스 -HCl pH 8, 1mM EDTA의 반응 용적 12μl에서 서열 프라이머(서열 GTAAAACGACGGCCAGT을 갖는 합성 올리고 뉴클레오타이드 ; New England Biolabs사 제품) 25ng을 사용하여 Taq3으로부터의 DNA 2㎍에 아닐링 시킨다. 반응을 물 250ml 비이커내 80℃에서 시작한 다음 얼음상에서 15℃로 냉각시킨다. 이 반응 혼합물에 100mM 트리스 -HCl pH 81μl, 10mM MgCl2, 5mM dATP, dGTP, dCTP 및 TTP 1μl, 5mM ATP 1μl, 0.1M 디티오트레이톨 1μl, 물 4μl, DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편) 1U 및 T4 DNA 리가제 6U를 가한다. 반응 혼합물을 15℃에서 4시간 동안 배양하고 180μl의 10mM 트리스-HCl pH 8 및 1mM EDTA로 희석한다. 이 반응 혼합물이 분취량 1μl를 사용하여 이. 콜라이(균주 JM 101)를 형질전환시킨다.
생성된 플라그를32P 표지된 합성(연결 서열)올리고뉴클레오타이드과 하이브리드화하여 돌연변이된(수성된) 연결 영역을 함유하는 클론을 검출한다. 돌연변이된 클론은 생선된 하이브리드의 안정성이 증가하기 때문에 돌연변이되지 않은 클론과는 구별된다.
합성 올리고뉴클레오타이드를 표지하기 위해, 반응 혼합물을 올리고뉴클레오타이드 15pmol,32P 표지된(γ위치) ATP(3000Ci mmol) 200μCi, 70mM 트리스 -HCl pH 7.6, 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨 및 폴리 뉴클레오타이드 키나제 10U를 함유한다. 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 배양한 다음 70℃에서 가열하여 반응을 정지시킨다. 하이브리드화 단계를 위해, 파지 플라그의 레플리카(replica)를, 플라그상에 필터를 30초 동안 도말함에 의해 니트로 셀룰로오즈 필터상에 형성시킨다. 이어서 필터(9cm 직경)를 0.5N NaOH 및 0.5M NaCl상에 1분동안 부유시킨 다음 1.5M NaCl 및 0.5M 트리스 -HCl pH 7.5상에 1분동안 2회 부유시킨다. 필터를 진공중 80℃에서 2시간 동안 굽고, 1M NaCl, 33mM PIPES pH 6.8, 6.6mM EDTA, 0.2% 젤라틴, 0.2% Ficoll, 0.2% 폴리비닐피톨리돈 360 및 0.1% 나트륨 도데실 설페이트중 65℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화한 다음 1M NaCl, 33mM PIPES pH 6.8 및 6.6mM EDTA 1ml중 25℃에서 16시간 동안32P 올리고뉴클레오타이드(1.5pmol)와 하이브리드화한다. 필터를 0.9M NaCl 및 0.09M 나트륨 시트레이트에서 수회 세정한 다음 오오토라디오그라피하여 하이브리드화 정도를 검출한다. 필터를 0.9M NaCl 및 0.09 나트륨 시트레이트중 42℃, 52℃, 62℃ 및 72℃에서 세척한 다음 하이브리드화를 각 온도 단계사이에서 오오토라디오그라피에 의해 모니터한다.
62℃ 및 72℃에서 안정한 하이브리드화를 나타내는 플라그중 6개를 선별하여 배양한다. 일본쇄 DNA를 표준방법(참조문헌 5)으로 제조하고, 연결 영역을 가로지르는 서열을 디데옥시 서열화 방법(참조문헌 6)을 사용하여 확인한다. 이를 클론을 Taq 3'로 표기한다.
이러한 수정된 연결 영역을 함유하는 멀티머성 부수체 단위를 작제하기 위해서는, 이본쇄 형태의 DNA를 충분한 양으로 수득하는 것이 필요하다. 이러한 일은 Taq 3'로부터의 연결 영역을 함유하는 TaqI 단편을 플라스미드 벡터에 클로닝시킴으로써 성취된다. 일본쇄 Taq 3' DNA(25μl)을 상기에서 정의한 서열화 프라이머 40ng을 함유하는 75μl 및 100mM 트리스-HCl pH 8 및 10mM MgCl2, 10μl중 65℃에서 1시간 동안 배양한다. 이 반응 혼합물에 5mM dATP, dGTP, dCTP 및 TTP 20μl 및 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편) 25U를 가한다. 20℃에서 30분 동안 배양한 후, 시료를 EcoRI 및 HindIII(각각 50U)로 분해시킨 다음 37℃에서 1시간동안 배양한다. 이들 효소는 연결 단편 cDNA의 각 측면에 인접한 Taq 3' DNA를 절단한다. 계속해서, 방출된 연결 단편을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 정제하고 플라스미드 벡터 pUC9에 클로닝한다. Taq 3'의 목적하는 단편을 함유하는 1개의 클론을 제한 효소 분해로 동정하여 pUC 1로 표기한다.
c) 부수체 멀티머의 작제
TaqIa부위로부터 부수 DNA의 3' 말단까지의 범위인 cDNA 단편에 연결된 pUS1의 연결 단편을 함유하는 cDNA 단편을 작제하기 위해서는 하기 조작을 수행한다 : 먼저 pSP 102의 ScaI/SstI 단편과 pUS1의 BamHI/ScaI 단편을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, BamHI 및 SstI으로 분해한 벡터 DNA(pT 7/2, 참조문헌 7)와 연결한다. 벡터의 선택은 상이한 실험에 의해 결정된다. 이 벡터 대신에 다른 벡터(예를 들면 pUC9)를 사용할 수도 있다. pUS1및 pSP 102로부터의 2개의 단편의정확한 삽입물을 함유하는 클론을 BamHI 및 SstI를 사용하여 제한효소 분해로 동정한다(삽입된, 대략 450 뉴클레오타이드의 cDNA를 생성한다). 이들중 하나를 pT 104로 표기한다.
서두에서 개괄적으로 나타낸 예상이 멀티머성 전사체가 형질전환된 작물에서 프로세싱될 것이라는 것이지만, 이용가능한 정보로부터 이 결과를 수득하는데 필요한 정확한 작제를 예상할 수가 없다. 예를들어, 프로세싱 반응을 결정하는 서열이 프로세싱된 단위에 대해 내부에 함유되어 있는 경우 pT 104 작제 발현은 적합하다. 그러나, 필요한 서열이 프로세싱된 단위에 대해 외부에 위치한 경우 양 측면에 cDNA 서열을 함유하는 멀티머성 전사체를 발현시킴이 필수적이다. 이러한 이유로, 불완전 단위에 의해 5' 측면상에 위치한 2개의 완전 부수 단위를 함유하도록 추가의 작제를 수행한다.
이러한 작제를 수행하기 위해, pT 104 및 pUS 1 DNA를, 플라스미드 분자가 분자당 평균 1회 절단되도록 하는 조건하에서 TaqI으로 분해한다. 분해된 DNA를 0.7% 아가로오즈 겔상에서 분획화한 다음 완전길이 선형분자를 분리한다. pT 104 DNA를 SstI으로 분해시킨 다음 5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분획화하여 TaqIa부위와 SstI 부위 사이의 거리에 대해 예상한 크기(대략 450bp)의 단편을 분리한다(제 2 도). 유사한 방식으로, pUS1을 BamHI로 분해하고, 단편을 BamHI/TaqIb단편에 대해 예상한 크기(대략 350bp)로 분리한다(제 2 도). 이들 단편을 합하고, BamHI 및 SstI으로 분해한 pT 7-2와 연결한 다음 이.콜라이를 형질전환시킨다. 목적하는 삽입물을 함유하는 수개의 클론을 동정하고 이들 중 하나를 pT 105로 표기한다.
부수 cDNA 멀티머의 Ti 플라스미드내로의 전이
형질전환된 작물에서 부수체 서열을 발현시키기 위해, pT 104 및 pT 105의 cDNA 삽입물을 아그로박테리움(Agrobacterium) Ti 플라스미드 벡터(Rok1으로 명명 ; M. Bevan제품)에 전이한다. 이것은 추가로 프로모터 및 전사 터미네이터, 및 이들 사이의 신규 서열의 삽입을 위한 BamHI 부위를 함유하는, 앞서 기술한(참조문헌 8) 벡터 Bin 19를 기본으로 한다. 프로모터 및 터미네이터는 이전에 기술한 바대로(참조문헌 9) 형질전환된 세포에서 바이러스 외피 단백질의 발현용으로 작제된 벡터내에 있으며, RoK1의 프로모터가 전사개시점의 3' 측면상에 6개의 뉴클레오타이드를 함유하는 것과는 상이하게, 이전에 사용된 프로모터는 이 영역에서 132bp를 함유한다.
Rok1 DNA(5㎍)를 40μl에서 BamHI로 분해한 다음 T4 DNA 폴리머라제 5U 및 각각 100μM의 dATP, dGTP, dCTP 및 TTP로 37℃에서 15분 동안 및 65℃에서 10분 동안 처리한다. 이 반응 혼합물에 송아지 장내 포스파타제 0.6U를 가한 다음 DNA를 37℃에서 60초 동안 배양한다. 이어서 65℃에서 10분 동안 처리한 다음 DNA를 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. pT 104 및 pT 105 DNA를 BamHI 및 EcoRI로 분해하고 DNA 폴리머라제 Ⅰ(클레노우 단편) 2.5U 및 각각 50μM의 dATP, dGTP, dCTP 및 TTP를 함유하는 반응 용적 50μl중 37℃에서 15분 동안 처리한다. DNA를 5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분획화한 다음 부수 cDNA 삽입물을 분리한다.
제 3 도는 이원성 Ti 플라스미드 발현 벡터에서 CMV 부수 cDNA 분자의 상세한 구조를 도식적으로 나타낸 것이다. 104 작제물의 5' 말단에는 전사 개시점으로부터 연장되고 pT 104의 작제에 사용된 플라스미드 pT 7-2 및 다른 벡터들의 폴리링커 서열을 포함하는 플라스미드 pT 7-2의 폴리링커로부터의 51 뉴클레오타이드가 있다.
도식에서 나타낸 바내로 이 작제물의 3' 말단상에는 부수 서열의 위치 227로부터 부수 단위의 3' 뉴클레오타이드의 위치 335까지의 범위인 98 뉴클레오타이드가 있다("TE3").
이 작제물의 3' 바로 옆에는 벡터 플라스미드 pT 7-2(참조문헌 7)의 SmaⅠ 부위와 EcoRI 부위 사이의 범위인 16 뉴클레오타이드에 의해 3' 말단에서 측면 위치한, 불완전 단위와 동일 배향인, 완전 부수 단위가 있다. 105 작제물은 2개의 완전 부수단위가 동일 배향으로 존재하는 것을 제외하고는 104 작제물과 같다. 104 및 105로부터의 삽입물을 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 EcoRI로 분해하여 절단하고, DNA 폴리머라제(클레노우 단편)의 작용으로 평활말단화한 다음 이원성 Ti 플라스미드 Rok1의 BamHI 부위에 삽입한다. Rok1의 BamHI 부위를 DNA 폴리머라제(클레노우 단편)의 작용으로 평활 말단화한다. Rok1은 폴리링커 부위에 삽입된 발현 카세트를 추가로 함유하는, 이전에 기술한(참고문헌 8), 이원성 벡터 Bin 19의 유도체이다. 발현 카세트는 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스 35S RNA의 프로모터(참조문헌 10)와 아그로박테리움 T-DNA의 노팔린(nopaline) 합성효소(nos) 유전자의 터미네이터 단편(참조문헌 11)(NOS TERM)으로 이루어져 있다. 이것은 프로모터 단편을 Bal 31 뉴클레아제를 사용하여 35S 전사체의 캡 부위의 3'의 6bp를 역으로 결손시킨 것을 제외하고는, 담배 모자이크 바이러스 외피 단백질 유전자(참조문헌 9)의 발현용으로 기술한 발현 카세트와 거의 유사하다. 독특한 BamHI 부위를 프로모터 단편과 터미네이터 단편 사이에 삽입한다. 이 카세트로부터 유도된 전사체는 BamHI 부위에서 삽입된 서열외에 프로모터로부터의 10 뉴클레오타이드 및 터미네이터로부터의 200 뉴클레오타이드(참조문헌 11)를 함유한다.
도면에는 Rok1의 발현 카세트 영역 및 pT 104 및 pT 105의 cDNA 삽입물에 인접한 영역만을 나타내었다.
분해된 Rok1 DNA를 pT 104 또는 pT 105의 삽입물에 별도로 연결시킨 다음 이를 사용하여 이.콜라이를 형질 전환시킨다. 재조합 클론을 EcoRI 및 HindIII(이들 부위의 위치에 대해서는 제 3 도 참조)로 분해시켜 동정하고 필요한 삽입물을 함유하는 플라스미드를 각각 Rok1/104 또는 Rok1/105로 표기한다. 이어서 이들 플라스미드를 문헌(참조문헌 8)에 기술한 바대로 매이팅(mating)하여 아그로박테리움 내로 전이한다. 생성된 아그로박테리움 균주를 사용하여 (i) 사용한 잎이 무균적으로-성장한 작물로부터의 것으로, 멸균하지 않았으며; (ii) 형질전환된 작물 세포의 선별을 100㎍/ml 카나마이신 상에서 수행하는 것을 제외하고는 정확하게 호오쉬(Horsch)등의 문헌(참조문헌 12)에 기술된 방법에 따라 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum; Var Samsun NN)의 잎 디스크에서 세포를 형질전환시킨다.
성숙 작물을 호오쉬 등의 문헌(참조문헌 12)에 기술된 방식대로 형질전환된 직물로부터 재생시킨다.
이들 작물의 분석은 하기에서 기술한 바와 같이 수행한다.
형질전환된 담배 작물(CV. Samsun NN)을 아그로박테리움-감염된 잎 디스크로부터 재생시키고, 각각 사우던 및 노오던 블롯 분석으로 DNA 및 RNA에서 부수 서열의 존재에 대해 검정한다. 사우던 블롯 분석으로, 형질전환된 작물의 DNA가 반수체 제놈당 부수 cDNA 1 내지 3복사체 등가물을 함유한다는 것을 알 수 있다. 사우던 블롯 분석으로 cDNA 서열, 프로모터 부위 및 RNA 종결부위가 재정렬되거나 결손되지 않은 것도 알 수 있다. 노오던 블롯 분석(제 4 도)으로, 원래의 작제물(제 3 도)에서 프로모터 및 터미네이터 서열의 위치로부터 예상한 대략의 크기이고 3' 폴리아데닐레이트 트랙트의 존재를 허용하는 약 700 뉴클레오타이드(Rok1/104) 또는 1000 뉴클레오타이드(Rok1/105)의 전사체를 볼 수 있다. 이들 RNA 분자는 전체 RNA 또는 폴리아데닐화된 RNA에서 용이하게 검출된다. 성장, 개화 또는 종자 생성시 바이러스-형증상 또는 다른 이상이 형질전환된 작물에서 관찰되지 않았다.
제 4 도는 형질전환된 작물로부터 RNA를 노오던 블롯 분석한 결과이다.
전체 RNA(20㎍) 또는 폴리 A+RNA(1㎍)를 형질전환되지 않은 작물 또는 Rok1/104 및 Rok1/105로 형질전환된 작물의 잎으로부터 분리하여 포름알데하이드/아가로오즈 겔상에 분획화한다. 전사된 부수 RNA 서열을, 겔을 니트로셀룰로오즈 상에 블롯팅한 다음 pT105로부터의 니크 해독된 삽입물로 하이브리드화하여 검출한다. 부수 RNA를 함유하는 CMV로 감염된 세포로부터의 전체 RNA는 부수 단위 길이(1X) 및 직경 길이(2X) 분자에 대한 참조용으로서 포함된다. 크기 표지물은 CMV 제놈 RNA(DCB, 공지되지 않음)의 cDNA 클론(C20)을 사용하여 검출된, CMV의 비리온 RNA이다. 이것을 CMV RNA-3 및 CMV RNA-4 및 약하지만 CMV RNA-1 및 RNA-2와 하이브리드화한다. 주어진 크기값은 고울드(Gould) 및 시몬스(Symons)등의 방법(참조문헌 13)의 값이다. Rok1에서 104 및 105의 작제물을 참조문헌 8에 기술한 바대로, 삼모 매이팅(triparental mating) 방법으로 pRK2013을 함유하는 이 클라이 균주 HB101을 사용하여 아그로박테리움 균주 LBA 4404에 이동시킨다. 이원성 벡터 작제물을 함유하는 생성된 아그로박테리움 균주를 사용하여 무균적으로 성장한 니코티아나 타바쿰(CV. Samsun NN)으로부터의 잎 디스크를 감염시킨다. 감염되고 형질전환된 세포를 호오쉬 등의 문헌(참조문헌 12)에 기술된 바와 같이 디스크를 담배 공급 세포층 상에서 및 이어서 어린 가지 및 뿌리 유도 배지 상에서 연속적으로 배양함에 의해 작물로 재생시킨다. 어린 가지 및 뿌리 유도 배지는 Rok1의 T-DNA 영역(Bin 19로부터의)에 함유되어 있는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 세포를 선별하기 위해 카나마이신을 100㎍/ml로 함유한다. (참고문헌 8). 형질전환된 작물을, 줄기 절단물을 뿌리 유도 배지에 전이하여 증식시킨다.
RNA 분리방법은 아펠(Apel) 및 클롭스테치(kloppstech)27의 문헌(참조문헌 14)에 기술되어 있고 전기영동 및 블롯팅 분석법은 골드버그(Goldberg)의 문헌(참조문헌 15) 및 토마스(Thomas)의 문헌(참조문헌 16)에 기술되어 있다.
제 5 도는 형질전환된 작물에서 부수 RNA 상에서의 CMV 감염의 영향을 나타낸 것이다.
형질전환되거나 형질전환되지 않은 니코티아나 타바쿰(Var. Samsun NN)의 잎에 CMV 균주 R76B를 접종하고 35mm 디스크를 5시간후에 절단한다. 5디스크의 배치를 SPS 배지(10g/l) 슈크로오즈, 0.2g/l Ca(H2PO4)2ㆍH2O 0.3g/l 설프아닐아미드상에 부유시킨다. 이들 시료로부터, 또는 하기에서 지시한 바대로 전체 RNA(1㎍)를 분리하고, 제 4 도에 대해 기술한 바대로 탐침으로서 pT105의 삽입물(부수 RNA) 또는 C2O CMV RNA)을 사용하여 노오던 블롯팅으로 분석한다. 크기 표지물은 CMV RNA-1, CMV RNA-2, CMV RNA-3 및 CMV RNA-4 또는 부수 모노머(1X) 또는 다이머 단위(2X)를 나타내기 위해 CMV 단독(트랙 1 및 26) 또는 부수체를 갖는 CMV(트랙 18, 19 및 27)로 감염시킨 조직의 RNA이다.
a) 1차 감염시 RNA, 트랙 2 내지 4는 CMV R 76B로 접종하고 접종한지 5시간후에 (트랙 2) 또는 배양한지 4일후에 (트랙 3) 및 7일후에 (트랙 4) 시료화한, 형질전환되지 않은 작물의 디스크로부터의 RNA를 나타낸다. 트랙 5 및 6은 배양한지 4일후에 (트랙 5) 또는 7일후에 (트랙 6) 모의 접종한(형질전환되지 않은) 작물의 디스크로부터의 RNA를 나타낸다. 트랙 7 내지 9는 Rok1/C20로 형질전환시킨 작물로부터의 RNA를 나타낸다. 이것은 Rok1의 BamH1 부위에서의 삽입물이 CMV 외피 단백질 mRNA의 cDNA(C20)인 것을 제외하고는 Rok1/104(제 3 도)와 유사하다. RNA를 감염시킨지 5시간후에 (트랙 7) 또는 4일 동안 (트랙 8) 및 7일 동안 (트랙 9) 배양한 디스크로부터 분리한다. 트랙 10 내지 13 및 14 내지 17은 각각 Rok1/104 또는 Rok1/105로 형질전환된 작물로부터의 RNA를 함유한다. RNA를 감염시키기 전에 (트랙 10 및 14), 감염시킨지 5시간후에 (트랙 11 및 15) 및 배양한지 4일후에 (트랙 12 및 16) 및 7일후에 (트랙 13 및 17) 분리한다.
b) 2차 감염시 RNA, 제5a도의 실험에서 기술한 것과 유사한, CMV-감염된 잎 디스크의 추출물을 니코티아나 클레벨란디(Nicotiana clevelandii)상에 접종한다. 10일후에 전신 감염된 조직으로부터 RNA를 분리한다. RNA(1㎍)를 Rok1/C20(트랙 20 내지 22), Rok1/104(트랙 23) 또는 Rok1/105(트랙 24 및 25)로 형질전환된 작물의 디스크 추출물을 접종한 작물로부터 분리한다.
c) CMV 입자에서 RNA, Rok1/105로 형질전환된 CMV(R76B)-감염된 작물로부터의 디스크를 접종한지 7일후에 추출하고 접종물을 형질전환되지 않은 니코티아나 클레벨린디를 통과시킨 다음 니코티아나 클레벨란디 상에 재접종한다. 감염시킨지 10일후에 CMV 입자를 전신 감염된 잎으로부터 분리하고 바이러스 RNA를, 나트륨 토대실 설페이트를 1% 가하고 페놀로 처리함으로써 추출한다. 전체 세포 RNA도 대조용 조직으로부터 분리한다. 나타난 시료는 100ng 바리온 RNA(트랙 33 또는 전체 세포 RNA(2.9㎍, 트랙 28 ; 0.7㎍, 트랙 29 ; 0.29㎍, 트랙 30 ; 0.07㎍, 트랙 31 ; 0.029㎍, 트랙 32)이다.
이들 전사된 RNA 분자의 생물 활성을 측정하기 위해, 형질전환된 작물을 CMV 균주 R76B로 감염시킨다. 이것은 원래 스코틀랜드산의 자연적으로 감염된 나무딸기 작물로부터 수득한 CMV의 부수체가 없는 분리물이다. 이러한 시험에서, 디스크는 접종한지 5시간후에 잎으로부터 절단한다. RNA를 이 시간에, 또는 디스크를 SPS 배지상에 4 또는 7일 동안 부유시킨 후에 디스크로부터 분리한다. CMV(C20)에 대한 탐침을 사용하여 RNA를 노오던 블롯 분석한 결과(제5a도), 4일까지 CMV 제놈 RNA가 형질전환되거나 형질전환되지 않은 작물 둘다의 디스크에서 축적됨을 알았다. 서브제놈 RNA중(참조문헌 18)으로 나타낼 수 있는 많은 조그만 RNA종도 동일한 기간동안에 축적된다(제5a도). 부수 RNA는 Rok1/104 또는 Rok1/105로 형질전환된 작물로부터의 디스크에서만 4일 및 7일후에 노오던 블롯 분석으로 검출한다(제5a도). 이 RNA는 다량으로 존재하며 주로 단위 부수 RNA 길이이고, 부수체를 함유하는 감염에 대해 정상이고, 일부의 다이머도 검출된다(제5a도). 제5a도의 RNA의 적재 및 오오토라디오그라피 노출에서, 약 700 및 1000 뉴클레오타이드의 전사된 부수 RNA 분자는 검출할 수 없다. 이 겔의 일부 트랙상에서 고분자량 RNA에 대해 부수 담침의 약한 하이브리드화는 리보좀 RNA와 탐침의 집성물의 유사품이다.
주기의 시험에서, 접종한지 4일 및 7일후에 샘플 디스크로부터의 수액(Sap)을 그 자체로 니코티아나 클레벨란디에 접종한다. 접종한지 10일후에, RNA를 이들 작물의 전신 감염된 잎으로부터 분리한다. 부수 RNA를 천연 부수 RNA의 전형적인 양으로, 및 단위 및 다이머 길이로 노오던 블롯 분석에 의해 검출하는데, 접종물은 Rok1/104 또는 Rok1/105로 형질전환된 작물로부터의 CMV-감염된 디스크로부터 수득한다(제5b도). CMV 탐침으로 모든 샘플에서 바이러스 제놈 RNA를 검출한다(제5b도).
유사한 실험에서, Rok1/105로 형질전환된 CMV-감염된 작물로부터의 바이러스 배양물을 니코티아나 클레벨란디에서 2회 증식시킨 다음 RNA를 이들 작물로부터 정제된 CMV 입자로부터 분리한다. 또다시 단위 및 다이머 길이의 부수 RNA가, 다이머의 양이 전체 세포 RNA에서의 양에 비해 비리온에서 결손되었더라도, 천연 부수체를 함유하는 제조물에 전형적인 양으로 검출된다(제5C도).
단위 및 다이머 길이의 부수 RNA가 Rok1/104 및 Rok1/105로 형질전환된 CMV-접종된 작물로부터의 전신 감염된 잎의 추출물에서 고수준으로 검출된다. 부수 RNA는 대조용의 형질전환되지 않은 작물의 전신 감염된 잎으로부터의 추출물에서는 검출되지 않는다.
확실히 형질전환된 작물에서 전사된 부수 RNA는 CMV 감염후에 단위 길이 분자로 프로세싱된 다음 계속해서 바이러스 배양물의 신규 부분으로서 획득되어 영속된다.
전사된 부수 RNA의 생산 능력은 Rok1/104 및 Rok1/105로 형질전환된 작물의 자손에 유전된다. 이것은 정확하게 1차 형질전환된 작물에 대해 상기 기술한 바대로(제 4 도의 노오던 블롯 분석 참조), 이들 형질전환된 작물의 F1 자손에서 폴리 A+RNA를 노오던 블롯 분석함으로써 알 수 있다.
부수 cDNA 및 Rok1 벡터로부터의 관련 DNA를 갖는 발현 카세트를 유전받은 형질전환된 작물의 F1 자손을 1㎍/ml 카나마이신을 함유하는 MS 배지[MS 배지 1은 4.6g 무라시지(Murashige) 및 스국(Skoog)염 혼합물(Flow Lab. Cat no. 26-330-24), 0.1g 이노시톨, 0.01g 티아민-HCl, 0.001g 니코틴산, 0.001g 피리독신 HCl, 30g 슈크로오즈 및 7.0g 아가로오즈를 최종 pH 5.8에서 함유한다]상에서 발아시킴에 의해 이 분석에 대해 선별한다. 원래 Rok1/105 또는 Rok1/104로부터 유도된, 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 작물은, 이들이 정상적인 잎 초록색 및 단지 약간 지연된 잎 성장을 나타내므로, 이 선별 방법에서 동정할 수 있다. 카나마이신 내성 유전자를 함유하지 않은 담배 작물은 정상적인 뿌리 또는 초록색 잎으로 성장하지 못한다. 카나마이신 내성 묘목을 카나마이신 내성 묘목과 활성 카나마이신 내성 유전자를 유전받지 못한 묘목 사이에 차별적 성장이 관찰되자마자 카나마이신 배지로부터 토양에 전이하거나 배양토에 폿팅(potting)한다. F1 자손 작물에서 생성된 전사된 부수체는 1차 형질전환체의 부수 RNA와 동일한 방식으로 생물 활성이 있다. 이것은 F1 자손 작물의 전사된 부수 RNA를 프로세싱시켜, 전신 감염된 잎에서 고수준으로 축적되고 형질전환되지 않은 작물상에서 통과하는 동안에 바이러스 배양물의 일부로서 증식할 수 있는 단위 길이 부수 RNA 분자로서 복제시키는 부수 RNA 유리 바이러스(큐커모바이러스, 하기 참조)로 F1 자손 작물을 감염시켜 알아볼 수 있다. 이들의 영향은 1차 형질전환된 작물에 대해 기술한 방법(제5b도에 대한 문헌참조)을 사용하여 설명할 수 있다.
전사된 부수 RNA는 CMV 균주 R76B 뿐만 아니라 오이 모자이크 바이러스의 다른 균주에 의해서도, 상기 기술한 바대로, 단위 다이머 길이 분자로서 복제된다. 이것은 CMV 균주 KIN 또는 CMV 균주 Y로 형질전환된 작물 또는 이들의 F1 자손을 감염시켜 알아볼 수 있다. CMV-KIN은 던디(Dundee) 근처의 킨네어드(kinnaird)에서 천연 작물 감염체로부터 분리되고, CMV-Y는 일본국 요꼬하마 227 우메까오까 소재의 일본국 담배 및 염 공영 기업체의 닥터 다까나미(Dr. Takanami)로부터 RNA로서 수득된다. CMV의 관련된 바이러스인 토마토 아스페르미(aspermy) 바이러스(TAV)도 전사된 부수 RNA의 복제를 일으키는데 효과적이다. 그러나, CMV와는 거리가 먼 땅콩 스턴트(stunt) 바이러스, 또는 오이 모자이크 바이러스와는 별도의 바이러스 그룹으로 분류되는 브로옴(brome) 모자이크 바이러스는 둘다 전사된 부수 RNA의 복제를 야기시키지 못한다.
형질전환된 작물에서 부수 RNA의 축적으로 이러한 작물상에서 변형된 CMV 감염 특성을 야기시킨다. 이것은 1차 형질전환된 작물상에 또는 이러한 작물의 F1 자손상에 접종한 CMV-R76B 또는 CMV-KIN에 대해 전신 감염된 잎에서 바이러스 RNA를 분석함으로써 알아볼 수 있다.
전사된 부수 RNA를 생성하는 작물에서 바이러스 제놈 RNA를 갖는 세포 RNA의 비율은 전사된 부수체를 생성하지 않는 감염된 작물에서의 정도의 20% 미만이다. 이것을 알아보는데 사용되는 방법에는 상기 기술한 바와 같은 노오던 블롯 분석이 포함된다.
전사된 부수체의 존재가 CMV 감염의 변형을 야기하는지를 알아보는 두번째 방법은 CMV-KIN 및 토마토 아스페르미 바이러스를 접종한 형질전환된 작물에서 알아보는 것이다. 이들 경우에 있어서, 바이러스 질병의 증상은 형상전환되지 않은 작물 또는 전시된 부수 RNA를 생성하지 않는 형질전환된 작물과 비교해 볼때 전사된 부수 RNA를 생성하는 작물에서 훨씬 약화된다. 이것은 제 6 도에 나타내었는데, 여기에서는 토마토 아스페르미 바이러스로 감염시킨지 대략 4주일후에 Rok1/104 및 Rok1/105로 형질전환된 작물 및 형질전환되지 않은 작물을 나타내었다. 영향은 전신 감염된 잎에서 가장 명확한데, 토마토 아스페르미 바이러스에 의해 생성된 모자이크 및 잎의 찌그러짐이 전사된 부수 RNA를 생성하는 작물로부터는 없다. 형질전환된 작물 또는 형질전환되지 않은 작물에 토마토 아스페르미 바이러스를 접종하고 감염시킨지 4주일후에 사진을 찍는다. a)는 손상되지 않은 작물을 보여주고 b)는 전신 감염된 잎을 보여준다. 104 및 105는 상기 기술한 바대로 부수체를 발현하는 형질전환된 작물이다. 30K는 담배 래틀(rattle) 바이러스의 서열을 발현하는 형질전환된 작물이며 자체 형질전환이 증상에 아무런 영향을 주지 않는다는 것을 보여주기 위한 대조용이다. NT는 형질전환되지 않은 작물이다.
TAV에 의한 증상 약화 영향은 접종물의 농도, 및 가장 긴 시험기간인 접종후 6주일까지의 감염 길이와는 무관하다. 이 영향은 시험한 전사된 부수체를 생성하는 작물 모두에서 관찰되므로 재생 가능하다.
전사된 부수 RNA를 생성하는 작물에 통과시킨 결과로서 부수 RNA를 획득한 CMV 또는 TAV 배양물도 변형된 특성을 나타낸다. 이것은 니코티아나 클레벨란디 작물에 제5b도에 관한 참조문헌으로 상기에서 기술한 바대로 여러가지 담배 작물을 통과시킨 CMV 또는 TAB를 접종하는 경우 설명할 수 있다. 질병 증상은 접종물을 전사된 부수 RNA를 생성하는 작물에 통과시키는 경우 현저하게 저하된다.
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Claims (13)

1차 작물 바이러스의 증상-약화 부수(satellite) RNA 서열에 대해 상보적이고 작물내에서 전시될 수 있는 DNA 단편을 식물의 제놈내로 전이시킴으로써, DNA 단편이 작물내에 전사될때(이때, 반드시 작물내에서 해독될 필요는 없다.) 작물이 2차 작물 바이러스로 감염되어 유발되는 증상을 약화시킴을 특징으로 하여, 작물 바이러스의 작용으로부터 작물을 보호하는 방법.
제 1 항에 있어서, DNA 단편이 이를 지니는 재조합 벡터를 통해 상기 작물의 제놈내로 전이되는 방법.
제 1 항에 있어서, DNA 단편이 작물 세포에 의해 이를 직접 흡수하도록 함으로서 상기 작물의 제놈내로 전이되는 방법.
제 1 항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 1차 및 2차 작물 바이러스가 동일한 바이러스계인 방법.
제 4 항에 있어서, 작물 바이러스계가 큐커므바이러스(Cucumovirus), 네포바이러스(Nepovirus), 통버스바이러스(Tombusvirus) 및 소베모바이러스(Sobemovirus)중에서 선택되는 방법.
제 4 항에 있어서, 작물 바이러스가 큐커모바이러스인 방법.
제 6 항에 있어서, 큐커모바이러스가 오이 모자이크 바이러스(CMV)인 방법.
제 1 항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 부수 RNA 또는 상응하는 DNA 단편이 작물의 제놈내로 전이되기 이전에 변형되는 방법.
제 1 항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, DNA 단편이 상기 부수 RNA로부터 유도된 cDNA 단편인 방법.
제 1 항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 부수 RNA가 멀티머성 RNA 구조를 갖는 방법.
제 1 항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 재조합 벡터가 아그로박테리움 투메페시언스(Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드의 T-DNA 경계 서열, 전사프로모터, 작물 바이러스의 부수 RNA에 상보적인 DNA 단편 및 전사터미네이터를 함유하는 플라스미드인 방법.
제11항에 있어서, 전이 단계가 재조합 벡터를 함유하는 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 균주로 작물 세포를 감염시키고 DNA 단편을 세포의 제놈내로 전이시킨후, 상기 감염되어 형질전환된 세포로부터 전체 작물을 재생시킴으로써 수행되는 방법.
1차 작물 바이러스의 증상-약화 부수 RNA 서열에 상보적이고, 작물내에서 전사될 수 있는 DNA 단편을 식물의 제놈내로 전이시킴으로써, DNA 단편이 작물내에서 전사될때(이때, 반드시 작물내에서 해독될 필요는 없다.) 제 2 작물 바이러스로 상기 작물이 감염되어 유발되는 증상을 약화시킴을 특징으로 하여, 작물 바이러스 또는 이의 효과를 변형시키는 방법.
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