CN1045994C - 植物病毒或其作用的改变 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改变植物病毒或其作用的方法，包括将遗传物质引入到植物体并用一种植物病毒感染该植物体，从而通过表达所引入的遗传物质而改变该植物病毒或其作用。在一个优选实施例中，所引入的遗传物质在植物中表达后可减轻由植物病毒侵袭植物引起的症状。

Description

植物病毒或其作用的改变
本发明涉及植物病毒或其作用的改变。
有些黄瓜花叶病毒(CMV)培养物的颗粒除了含有三种基因组类型的单链RNA和一种作为黄瓜花叶病毒(CMV)的颗粒病毒的mRNA而起作用的亚基因组外，还含有另一种通常长为约335核苷酸的单链线性RNA分子。这种已知作为随体RNA的额外的分子，并不与黄瓜花叶病毒基因组RNA共有相当大的核苷酸顺序，但是它只在由黄瓜花叶病毒侵染的植物体或原生质体内复制。不含有随体RNA的黄瓜花叶病毒分离物可以以无随体状态在植物体内重复培养，但如把随体RNA加到这种培养物中，即合成这种随体并作为病毒分离物的组成成分而继续存在。随体RNA对黄瓜花叶病毒感染的作用随病毒株不同而变化。在许多情况下，黄瓜花叶病毒的正常症状受到抑制，结果是受感染的植物没有显示出明显的感染症状。但是，有其他病毒株的随体RNA存在时导致产生与黄瓜花叶病毒有明显区别的严重症状。
由于感染了带有某些毒株的随体RNA的黄瓜花叶病毒(CMV)的植物比无随体情况下感染时所表现的症状更轻，因此建议使用含有随体RNA的完全病毒以保护植物抵御黄瓜花叶病毒感染的作用。事实上，实验表明，用含有随体RNA的黄瓜花叶病毒株进行预感染可以防止黄瓜花叶病并导致胡椒产量增加。实验还证明用含有良性的随体RNA的黄瓜花叶病毒株感染蕃茄时，可产生抵抗带有毒性随体RNA的黄瓜花叶病毒株作用的交叉保护作用。但是，使用作为预防剂的完全病毒时会产生严重问题。保护株本身对生长和产量会有不利影响，或者成为感染其他植物品种的病毒储存宿主。还存在着无毒株突变为有毒侏的可能性。
我们试图采用本发明所提供的方案来消除这些困难，本发明通过转录核基因组而使生物活性物质，优选的是由病毒衍生的遗传物质，尤其是随体RNA，维持于植物体内。
本发明提供了一种改变植物病毒或其作用的方法，包括将遗传物质引入到植物体内并用植物病毒感染该植物，借助于所引入的遗传物质的表达而改变植物病毒或其作用。
优选的是，从植物病毒中产生，经过任意改变，有待引入的遗传物质，该植物病毒可以是与感染植物的植物病毒相同，也可以不相同。
在一个优选实施例中，所引入的遗传物质在植物体内表达使由植物病毒侵染植物的症状得到减轻。
转移到植物体内的遗传物质优选的是相当于植物病毒随体RNA的cDNA，该cDNA和/或随体RNA可以已进行了任意的改变。
病毒RNA的表达可保护植物抵抗相应的病毒RNA的致病作用。换言之病毒源的RNA的表达可以抵抗没有序列同源性的病毒RNA的致病作用。还应注意到，作为RNA形式的病毒遗传物质的表达，可以发挥其独自将该RNA转译为蛋白质的作用。
本发明还提供了一种植物遗传工程的方法，包括将一种DNA掺入到植物核基因组中，该DNA能在植物中进行表达并且能在植物病毒侵袭植物后，改变所说植物病毒或其作用。本发明进一步涉及由上述遗传工程方法得到的植物以及该植物的子代。
特别适合用于本发明中的病毒是那些含有较低分子量随体RNA，通常低于1000个核苷酸的病毒。这样的具体例子是黄瓜花叶病毒或其他黄瓜病毒，烟草环斑病毒或其他nepoviruses，蕃茄丛矮病毒或其他蕃茄病毒，芜菁叶丛生病毒和Sebomoviruses或与他们有关的病毒。能够用这些病毒感染的任何植物都可用于本发明中。
优选的病毒是黄瓜花叶病毒(CMV)，用于转化的遗传物质是相应于CMV随体RNA的cDNA。优选的是将cDNA转移到一种表达载体中，该表达载体能将DNA转移到受体植物的核基因组内，例如，基于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒系统的表达载体。
因此本发明还提供了能将DNA转移到受体植物基因组中的表达载体结合了能在受体植物基因组中的表达载体，其特征在于该载体结合了能在受体植物中表达，并且能在植物病毒侵染植物时改变所说植物病毒或其作用的可转移的DNA。该表达载体优选地是一种质粒，该质粒含有来自于根癌土壤农杆菌的Ti质粒的T-DNA边缘序列，一种转录启动子，相当于CMV随体RNA的cDNA，以及一种转录终止子。
用含有表达载体的根癌土壤杆菌菌株感染要保护的植物细胞，例如叶片，并且从已转化的感染细胞再生出完整植株。
在若干实验室里已证明，利用土壤杆菌的Ti质粒可以把新的DNA序列引入到植物的核DNA中。进一步还证明，如果这些DNA序列含有合适的启动子和终止子序列，则在转化细胞中将该DNA转录为RNA。只要将转录启动子和转录终止子掺入到作为合适病毒序列的表达盒的载体分子中，任何用于引入新的并且与土壤农杆菌无关的DNA序列的其他方法和载体都适用于本发明。使用转化植物的直接DNA摄取法也是可能的，并且该方法已在下列文献中描述：
Krens,F.et al.Nature 296,72-74(1982)
Paskowski,J et al.EMBO J.3,2717-2722(1984)
Hains,R.et al.Mol.Gen.Genet.199,161-168(1985)
Potrykus et al.ibid.199,183-188(1985)
Fromm et al.Nature,319,791-793(1986)
我们已经证明，将随体RNA多体处理成单位长度分子，并且如果将它与CMV-RNA共感染到烟草植物体内，则随即能复制。这一结果十分重要，因为在转化细胞中使新DNA表达为RNA的方法要求RNA转录物包含转录终止子和启动子区域的序列。关于其他病毒的研究认为，把外源序列加到病毒RNA分子的末端会影响该RNA进行复制的能力。在没有证明可以从多体经过加工后再生出随体RNA的情况下，似乎最有希望的一个实验结果在于转录产物并不能由新来的病毒复制的，在该实验中随体RNA的cDNA复制体在转化细胞中表达为RNA。由于随体RNA抑制病毒症状的作用可能是由随体和病毒RNA之间竞争复制机构而介导的，因而这意味着转化细胞中的随体转录产物并不影响CMV症状的产生。
但是，由于确定了随体RNA可以通过加工多体产生，显而易见，在转化植物细胞中可以表达生物活性的随体RNA。初级的转录产物在启动子和转录终止子的末端含有附加序列的多体随体RNA分子。从而推测在黄瓜花叶病毒感染前或感染后，随体多体转录物被加工为单位长度分子，然后这些分子在CMV感染的细胞中发挥正常的随体RNA活性。预测这些活性作用包括复制和减轻症状。本文的介绍概述了构建含有多体结构形式的随体RNA的cDNA克隆以及将这些序列插入到Ti质粒表达载体中。在转化的烟草细胞中已证明了随体RNA的多体转录产物的生物活性。
附图说明如下；
图1是对应于黄瓜花叶病毒随体RNA的cDNA的核苷酸序列；
图2是随体cDNA多体的结构的简图。
图3是双Ti质粒表达载体中的黄瓜花叶病毒随体cDNA分子的详细结构；
图4是来自转化植株的RNA的Northern印迹分析结构；
图5表示黄瓜花叶病毒感染对转化植株中随体RNA存在的作用。
图6表示转录的随体对症状产生的作用。
                   实施例
为了阐述本发明的具体方案，我们描述了用CMV随体RNA的DNA复制体转化烟草植株，由该植株产生的随体RNA转录物以及由在该植株中生长的CMV培养物获得的随体RNA。
从CMV株T17N(参考文献20)中分离到用于该研究中的随体RNA，并以互补DNA(cDNA)形式被克隆。该cDNA克隆的核苷酸序列与其他CMV株的核苷酸序列非常相似。构建两个头接尾的连体随体cDNA分子。这两个分子包含一个(pT104)或两个(pT105)完全随体RNA序列单位，但带有5′末端(图3)不完全单位，计划将这两个分子模拟，据认为是复制中间体的多体随体RNA。为了在转化植株中实现这些随体序列的表达，将该cDNA分子转移到基于根癌土壤农杆菌的双Ti质粒系统的表达载体(RORI)中。将得到的质粒称为Rokl/104和Rokl/105。
现分四个部分进行描述：随体RNA的分离和纯化；以cDNA形式克隆随体RNA；构建随体cDNA多体；将随体cDNA转移至Ti质粒中。
随体RNA的分离和纯化
用黄瓜花叶病毒(I17N株，由Dr.M.Jacquemond,INRA,Montfauet,France提供)感染烟草植株，完全按照Lot et al.(参考文献1)的描述分离和纯化病毒颗粒。通过加浓度至1％的十二烷基磺酸钠，用缓冲饱和酚(50mMTris-HCl pH8)提取并用乙醇沉淀的方法从病毒颗粒中提取RNA。通过离心回收该RNA，并以0.5毫克/毫升重悬于水中。通过蔗糖梯度离心而纯化随体RNA。将33μg的CMV RNA稀释至100μ1的水中，再将2μl的1MTris-硼酸盐缓冲液(pH8)和5μl的1M氢氧化甲基汞一起加入。在室温下放置5分钟后，加入5μl的β-巯基乙醇，并将样品加至Sorvall AH650转子离心管中的5-20％(W/V)蔗糖梯度上，该梯度用10mMTris-HCl pH7.5,100mM NaCl,1mM EDTApH8进行缓冲。在20℃以50000rpm将该梯度离心2小时，并用从底部滴液的方法收集体积相等的20份。从每份中取出20微升进行琼脂糖凝胶电泳分析，用溴化乙锭染色该凝胶，检测随体RNA的存在。将含有随体RNA的各份合并在一起，并通过乙醇沉淀而收集随体RNA并溶于20微升的蒸馏水中。
克隆互补DNA(cDNA)形式的随体RNA
为了易于起动cDNA的合成，将多聚腺苷酸序列加到随体RNA的3′末端。将10μl的随体RNA在包括25mMTris-HCl pH7.9，带有2.5mMMnCl2的250mM NaCl,500μM ATP,15单位的胎盘核糖核酸酶抑制剂以及0.2单位的多聚腺苷酸聚合酶的25μl溶液中，37℃下保温15分钟。通过稀释至75μl并用苯酚提取而终止反应。然后用乙醇将多聚腺苷酸化的随体沉淀二次，并重悬于10μl蒸馏水中。
用寡聚dT12-18，在25μl反应容积内激发从该RNA合成cDNA，在该反应容积内含有pH8.3的25mM Tris-HCl,10mM KCl,4mM MgCl2,0.025毫克/毫升的寡聚dT12-18,5mM二硫苏糖醇，dATP,dGTP,dCTP和TTP各500μm,15单位的胎盘核糖核酸酶抑制剂，15单位的逆转录酶和10μCi的32P(α标记)dATP(≌500Ci毫摩尔)(New England Nuclear)。在42℃下维持1小时后，反应沸腾1分钟，冰上冷却10分钟；并以10000xg离心10分钟。将上清液加到2.5μl的1M HEPES缓冲液pH7,0.5μl的各为20mM的dATP,dGTP和TTP,1.5μl的0.1MKCl,2.6μl的水和5单位的DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)中。然后将该DNA通过一个1ml的Sephadex G-50柱，乙醇沉淀，并重悬于50μl的0.3M NaCl,0.03M Na2OAc(pH4.5),4.5mM ZnSO4，含3000单位/毫升的S1核酸酶的5％甘油中。在37℃放置1小时后，通过加入50μlTE而稀释该反应，将该样品铺在溶于10mM Tris-HCl pH7.5,1mM EDTA,100mM NaCl中的5-20％蔗糖梯度上，并用SORVALL AH650转头以50000rpm离心4小时。将该梯度从底部分成几部分，将通过监测各部分中的放射性而检测出的为最大活性值的50％的cDNA分子集中在一起。用苯酚/氯仿提取该样品，用乙醇进行沉淀，通过在SORVALL AH650转头中以4000rpm离心30分钟而收集。用乙醇从100μl体积中沉淀样品，用乙醇冲洗，并干燥，溶于10μl的1mM Tris-HCl pH8,0.1mMEDTA中。
然后用末端转移酶和dCTP保温该cDNA，以加上能使cDNA克隆到质粒载体中的寡聚dC尾。该反应物含有5μl的cDNA,1μl的10×缓冲液(1.4M二甲胂酸，0.3M Tris碱，1.1M KOH),0.2μl的10mM d CTP,0.1μl的20μM二硫苏糖醇，1.7μl的水，1μl的10mM CoCl2以及10单位的末端转移酶。在37℃将反应保温10分钟，然后通过在65℃保温2分钟而终止反应。
用于克隆的载体是pUC9质粒(参考文献2)，该质粒已用PstⅠ消化并在用末端转移酶进行的类似反应中在其末端加上dGTP尾。在30μg的10mM Tris-HCl pH7.4,100mM NaCl,0.1mM EDTA中将已加尾的cDNA(4μl)与已加尾的质粒(80ng)一起退火。将反应物加热至65℃并冷却至4℃过夜。将退火混合物的样品(5μl)转化到大肠杆菌MCl022菌株中并涂布于含指示剂CIPTG和Xgal)的氨苄青霉素平板上培养，以检测LacZ基因中cDNA插入片段的存在。选择出未显色蓝色的菌落作进一步分析。
首先，分析该质粒DNA中是否存在与纯化的随体RNA杂交的插入片段。继而，在确证有插入片段存在后，纯化该质粒DNA并通过用PstⅠ消化以及聚丙烯酰胺电泳而确定该插入片段的大小。
对于命名B7的一个克隆，证明其插入片段大小为约410bp。这表明，该cDNA插入物含有大部分或全部随体序列(335bp)，并且结合了如上文中描述的为了易于克隆而加上的同聚体尾端。
为了确定在B7的插入片段中cDNA的含量，用Maxam和Gilbert(参考文献3)的方法测定核苷酸序列并显示于图1中。该序列与直接从其RNA测得的其他CMV随体RNA分子的序列十分相似，不同之处在于该cDNA上缺失了5′末端的3个核苷酸，推测这是由于逆转录酶不完复制的结果。
除了用不同的寡核苷酸试剂(见第13页)进行补偿外，用在5′末端显示出不同程度互补性的克隆完成随后的操作。
随体cDNA多体的构建
由于在引言部分中描述的原因，必须考虑构建随体cDNA的多体复制体。在图2中概括了一系列复杂的操作过程。其目的在于首先从随体序列的3′端移走同聚体尾。然后构建二聚体结构的cDNA分子，该分子包含在两个随体序列之间的接头处有一个同聚体尾。接下来的步骤是将连接区进行克隆，并用寡核苷酸定位诱变技术移走5′同聚体尾，并回复5′末端丢失的3个核苷酸。然后将经过修饰的连接区连接到含有随体cDNA的限制性片段上以产生含有一个或二个完整的随体序列单位的结构。
这些操作在下文中进行了更详细的描述。
a)从随体序列的3′端移走同聚体尾
这一过程可用Bal31核酸酶完成。首先通过用BamHⅠ切割将60微克的B7质粒线性化。B7含有一个BamHⅠ位点，该位点正好与cDNA插入处的PstⅠ位点相连接，并在插入片段的3′侧。然后用酚提取该DNA，乙醇沉淀，再悬浮于400微升的10mM Tris-HCl(pH8)和1mM EDTA中。加入100微升的Bal31缓冲液和0.5单位的Bal31核酸酶。在8,12,16分钟时移走130微升样品，并用酚提取。然后通过乙醇沉淀而收集DNA。用T4DNA聚合酶处理已用Bal31消化的DNA的末端，以便移走突出的3′端并填平凹进的3′末端。该反应物共为75微升，含有TA缓冲液(33mM Tris一乙酸盐pH7.9,66mM乙酸钾，10mM乙酸镁，4mM鲑鱼精子，0.5mM二硫苏糖醇)，2.5μM的dATP,dGTP,dCTP和TTP以及5单位的T4 DNA聚合酶。在37℃反应3小时后，将反应物稀释至100微升，并用PstⅠ消化该DNA以释放二个片段。较大的片段是缺失了BamHⅠ位点的载体质粒。较小的片段是从5′PstⅠ位点延伸至Bal31缺失位点处的cDNA插入片段。为了分离被缺失的大约延伸至cDNA插入片段的末端核苷酸(…CCCOH)并且未延伸进同聚体尾的cDNA分子，在5％聚丙烯酰胺凝胶上将该DNA分成几部分，分离出约350核苷酸的cDNA片段。然后将这些片段克隆至已用PstⅠ和SmaⅠ消化的pUC9中。由于cDNA的末端核苷酸表示SmaⅠ位点的5′核苷酸，根据重组质粒中存在的SmaⅠ位点识别含有恰好缺失至cDNA的3′端的克隆。识别出一个符合该标准的命名为D26的克隆。通过用其他限制性酶消化证实存在合适的插入片段。尽管对于本文中描述的操作法不是必要的，但为了进行另一个实验，将该克隆的插入片段转移至另一个质粒pSP6/4(参考文献4)。随后的操作是以在pSP/4中构建D26为依据，将该质粒命名为pSP102。在图2中显示了pSP102的相关特征。
b)连接区的突变
接下来的步骤包括将第二个随体cDNA插入片段加至pSP102中以产生一个头尾相连的二聚体结构。为了完成这步骤，通过用SmaⅠ和PstⅠ消化10微克DNA以释放出pSP102中的插入片段。通过在25微升体积中加入dATP,dGTP,dCTP和TTP至100μM以及4单位的T4聚合酶而使PstⅠ位点的突伸的3′端变为钝端。在37℃培养15分钟后，通过在5％聚丙烯酰胺凝胶上分离而纯化该cDNA插入物。然后将该cDNA插入片段克隆至pSP102的SmaⅠ位点，并且通过用TaqⅠ消化而筛选得到的克隆中是否存在头与头或头与尾相连接构型的插入物。将具有头与尾相连接的二聚体的克隆命名为pSP103。
为了使该二聚体的连接区发生突变而移走同聚体尾，并由此恢复据认为是从cDNA上丢失的5′核苷酸，将连接区的克隆克隆至单链噬菌体载体mp10(参考文献10)中是必要的。获得代表合适的接头序列的补体的合成的寡聚核苷酸也是必要的。该寡聚核苷酸可从Dr.S.Mint-er(UMIST)购买，并且是下列序列：TCCATCAAACAAAACGGGTCCTGTGTAGGA(该序列内的GGG是随体RNA的3′末端补体)序列AAAAC是该随体的5′末端的补体，包括缺失的核苷酸)。
将显示于图2中的在TagⅠ位点之间延伸的pSP103DNA克隆至mp10的AccⅠ位点处。采用标准方法(参考文献5)从该命名为Tag3的克隆中分离出单链DNA。
为了上述用途，通过用ATP和多聚核苷酸激酶进行反应而制备合成的寡聚核苷酸。该反应物包括在20微升中含有15皮摩尔的寡聚核苷酸，70mM Tris.HCl pH7.6,10mM MgCl2,5mM二硫苏糖醇，1mM ATP以及10单位的多聚核苷酸激酶。将反应物在37℃下保温1小时，并通过在70℃加热10分钟而终止反应。
在12微升的反应体积中，将激酶寡聚核苷酸(5皮摩尔)与2微克的Tag 3 DNA,25纳克的引物序列(一种序列为GTAAAACGACGGCCAGT的寡聚核苷酸，从New England Biolabs获得)，以及10mM Tris-HClpH8,1mM EDTA一起退火。在250ml烧杯的水中80℃起始反应，燃后将烧杯在冰上冷却至15℃。然后向其中加入下列物质：1微升100mMTris-HCl pH8,10mM MgCl2,1微升的5mM dATP,dGTP,dCTP和TTP,1微升的5mM ATP,1微升的0.1M二硫苏糖醇，4微升的水，1单位的DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)和6单位的T4DNA连接酶。将反应物在15℃保温4小时，并用180微升的10mM Tris-HCl pH8,1mM EDTA稀释。将1微升的该反应物样品转化大肠杆菌(JM1101菌株)。
用32P标记的合成的(连接序列)寡核苷酸与得到的噬菌斑杂交以便检测含有突变的(合适的)连接区的克隆。由于提高了得到的杂交体的稳定性因而突变克隆与非突变克隆有明显区别。
为了对合成的寡核苷酸进行标记，该反应物含有15皮摩尔的寡核苷酸，200μCi的32P标记(γ位)ATP(3000Ci亳摩尔)，70mM Tris-HClpH7.6,10mM MgCl2,5mM二硫苏糖醇以及10单位的多聚核苷酸激酶。将反应物在37℃保温30分钟并在70℃加热以终止反应。对于杂交步骤，通过将滤膜铺在噬菌斑上30秒而在硝酸纤维素滤膜上形成噬菌体噬菌斑的复制物。然后将滤膜(9cm直径)在0.5N NaOH,0.5M NaCl中漂浮1分钟以及在1.5M NaCl,0.5M Tris-HCl pH7.5中漂浮1分钟漂浮二次。然后将滤纸在真空及80℃条件下烘烤2小时，在1M NaCl,33mM PIPES pH6.8,6.6mM EDTA,0.2％明胶，(0.2％Ficoll,0.2％聚乙烯基吡咯烷酮360,0.1％十二烷基磺酸钠中65℃下预杂交1小时，然后在1毫升的1M NaCl,33mM PIPES pH6.8,6.6mM EDTA中25℃下与32P寡核苷酸(1.5皮摩尔)杂交16小时。然后将滤膜在0.9M NaCl,0.09M柠檬酸钠中浸洗几次，并进行放射自显影以检测杂交作用。在0.9MNaCl,0.09M柠檬酸钠中将滤膜在42℃,52℃,62℃和72℃洗涤，在各个温度步骤之间进行放射自显影检测杂交作用。
筛选出六个在62℃和72℃时显示稳定杂交作用的噬菌斑并培养。通过标准方法(参考文献5)制备单链DNA，用双脱氧测序法(参考文献6)验证横跨连接区域的序列。将这些克隆命名为Taq3′。
为了构建含有这些合适连接区的多体随体单位，获得足够量的双链形式的DNA是必要的。通过将含有Taq3′的连接区的TaqⅠ片段克隆至质粒载体中而得到上述结果。在75微升体积中将单链Taq3′DNA(25微升)与上文中定义的40ng测序列物以及10微升的100mM Tris-HClpH8,10mM MgCl2一起在65℃保温1小时。向其中加入20微升的5mMdATP,dGTP,dCTP,TTP以及25单位的DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)。在20℃培养30分钟后，用EcoRⅠ和HindⅢ(各50单位)消化该样品，并在37℃保温1小时。这些酶切割掉与连接片段cDNA的任一端相邻接的Taq3′DNA。然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳而纯化释放出的连接片段，并将其克隆到pUC9质粒载体上。通过限制性酶消化而识别出一个含有所需的Taq3′片段的克隆，将其命名为pUSⅠ。
c)构建随体多体
为了构建含有pUSⅠ的连接片段的cDNA，并且其中的连接片段与从TaqⅠα位点延伸到该随体DNA的3′末端的一个cDNA片段相连接，完成下列操作。
首先采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出pSP102的ScaⅠ/SstⅠ片段以及pUSⅠ的BamHⅠ/ScaⅠ片段，并与已用BamHⅠ和SstⅠ消化的载体DNA(pT7/2，参考文献7)相连接。载体的连接可通过不同的实验确定。可以用其他载体(例如pUC9)代替上述载体。通过用BamHⅠ和SstⅠ限制酶消化(产生约450个核苷酸的被插入cDNA)而鉴别出含有来自pUSⅠ和pSP102的两个片段的合适插入片段的克隆。将其中之一命名为pT104。
虽然在引言中已预言并提出多体转录产物是在转化植物中加工的，但不可能从现有的信息中推测产生该结果所必要的精确结构。例如，如果决定加工反应的序列是包含在被加工的单位内的，那么表达pT104构建体是足够的，但是如果必要序列定位于被加工单位之外，那么必须要表达在二端含有随体cDNA序列的多体转录产物。为了上述原因，进一步制备含有在5′端以一个不完全单位为侧端的两个完全随体单位的构建体。
为了制备该构建体，在能切割质粒分子，并且平均每分子切割一次的条件下用TaqⅠ消化pT104和pUSⅠDNAs。然后在0.7％琼脂糖凝肢上将经消化的DNA分成几部分，并分离出全长度的线性分子。然后用SstⅠ消化pT104 DNA，并在5％聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，以分离出估测大小(约450bp)为TaqⅠa位点和SstⅠ位点(图2)之间的距离的片段。同样，用BamHⅠ消化pUSⅠ并且分离出推测其大小(约350bp)为BamHⅠ/TaqⅠb片段(图2)的片段。将这些片段合在一起并与用BamHⅠ和SstⅠ消化的pT7-2连接并转化到大肠杆菌中。鉴别出几个含有所需插入片段的克隆，将其中的一个克隆命名为pT105。
将随体cDNA多体转移至Ti质粒中
为了实现在转化植株中表达随体序列，将pT104和pT105的cDNA插入片段转化到称作为Rokl(从M.Bevan获得)的土壤农杆菌Ti质粒载体中。该质粒是以前面描述的Bin19载体(参考文献8)为基础的，含有额外的一个启动子和转录终止子，以及位于它们之间的用于插入新序列的BamHⅠ位点。如以前描述的(参考文献9)上述启动子和终止子存在于为了在转化细胞中表达病毒外壳蛋白而构建的载体中，不同的是Rokl的启动子在转录起始点的3′端含有6个核苷酸，而以前使用的启动子在该区域有132个bp。
在40微升体积中用BamHⅠ消化Rokl DNA(5微克)，然后用T4 DNA聚合酶(5单位)，dATP,dGTP,dCTP和TTP各100μM在370℃处理15分钟以及在65℃处理10分钟。向其中加入0.6单位的牛肠道磷酸酶并将该DNA在37℃保温60分钟。在65℃处理10分钟后用酚提取DNA并用乙醇沉淀。用BamHⅠ和EcoRⅠ消化pT104和pT105DNA，并在50微升体积中用2.5单位的DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)以及dATP,dGTP,dCTP和TTP各50μM在37℃处理15分钟。然后在5％聚丙烯酰胺凝胶上将该DNA分级分离，并分离出随体cDNA。
图3显示在双Ti质粒表达载体中CMV随体cDNA分子的详细结构。在104构建体的5′端有来自pT7-2质粒的多接头的51个核苷酸，它们横跨了转录起始点并包括pT7-2以及在pT104构建中使用的其他载体的多接头序列。如在图中所示在该构建体的3′端有从随体序列的227位延伸至该随体单位335位的的3′核苷酸(“TE3′”)的98个核苷酸。紧挨着该构建体的3′端有一个完全随体单位，它与不完全单位的定向相同，在3′末端的侧面有位于pT7-2载体质粒(参考文献7)的SmaⅠ位点和ECoRⅠ位点之间的16个核苷酸。105构建体与104的不同之处在于存在相同定向的两个完全随体单位。通过用限制性核酸内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ消化而从104和105上切下插入片段，通过DNA聚合酶(Klenow片段)的作用而提供钝端，并将其插入到双Ti质粒Rokl的BamHⅠ位点。通过DNA聚合酶(Klenow片段)的作用使Rokl的BamHⅠ位点变为平齐末端。如在前面描述(参考文献8),Rokl是双载体Bin19的衍生物，它另外还含有一个插入到多接头位点中的表达盒。该表达盒包括花椰菜花叶病毒35S RNA(参考文献10)的启动子和土壤农杆菌T-DNA(参考文献11)的蓝曙红合成酶(nos)基因的终止子片段(NOS TERM)。它基本上与所描述的用于表达烟草花叶病毒外壳蛋白基因(参考文献9)的表达盒相似，不同之处在于用Bal 31核酸酶将该启动子往回缺失至35S转录物的帽位点的3′端的6个bp。在启动子和终止子片段之间插入唯一的BamHⅠ位点。来源于该表达盒的转录产物除含有在BamHⅠ位点处插入的序列外还含有来自该启动子的10个核苷酸以及来自终止子的200个核苷酸(参考文献1)。
该图中只显示了与pT104和pT105的cDNA插入物相邻198域以及Rokl的表达盒区域。
然后将经消化的Rokl DNA分别与pT104或p105的插入物相连接并转化至大肠杆菌中。通过用EcoRⅠ和HinclⅢ(见图3所示的这些位点的定位)消化而鉴别出重组克隆并分别将含有所需插入物的质粒盒名为Rokl/104或Rok/105。采用如(参考文献8)描述的交配法而将这些质粒转移到土壤农杆菌中。然后正确地按照Horsch等人的方法将得到的土壤农杆菌菌株用于转化烟草(Samsum NN变种)叶片中的细胞，不同之处在于(ⅰ)所使用的叶片来源于无污染生长的植株，并不是经过灭菌的叶片；(ⅱ)在100μg/ml的卡那霉毒上选择经转化的植株细胞。
还按照Horsch等人的描述(参考文献12)从转化植株上再生出成熟植株。
下文中描述了上述植物的分析结果。
从土壤农杆菌感染的叶片再生出转化烟草植株(SamsunNN变种)，并分别采用Southern和Northern印迹分析检测其中的DNA和RNA中存在的随体序列。Southern印迹分析显示在转化植株的DNA中每个单倍体基因含有1-3拷贝的随体cDNA量。采用Southern印迹分析还证明cDNA序列，启动子位点以及RNA终止位点没有被重排或缺失。Northern印迹分析(图4)显示了约700核苷酸(Rokl/104)或1000核苷酸(Rokl/105)的转录产物，该产物近似于从原始构建体(图3)的启动1和终止子序列位点推导出的大小并估计存在有3′多腺苷酸区。在总RNA或多腺苷酸RNA中容易检测到这些RNA分子。在转化植株中观察到在生长成熟开花期或种子产品中没有类似病毒的症状或其他异常。
图4是转化植株的RNA的Northern印迹分析
从非转化植株(非转化)或用Rokl/104和Rokl/105转化的植株的叶中分离出总RNA(20微克)或多聚A+RNA(1微克)，并在甲醛/琼脂糖凝胶上分级分离。通过将凝胶吸印到硝基纤维素膜上而检测经转录的随体RNA，并与pT105的经缺口转译的插入物相杂交。以含有随体RNA的用CMV感染的细胞的总RNA作为随体RNA单位长度(1×)和二聚体长度(2×)分子的参照物。大小标记物是CMV的病毒粒子RNA，用CMV基因组RNA的cDNA克隆(C20)(DCB，未出版)检测该标记物。它与CMVRNA-3,CMV RNA-4杂交，与CMV RNA-1和RNA-2微弱杂交。所给出的大小值是Gould和Symon(参考文献13)方法得到的。利用含有pRK2013的大肠杆菌HB101菌株，按照所描述的三亲本交配法(参考文献)，将Rokl的104和105构建体迁移到土壤农杆菌LBA4404中。然后将得到的含有双载体构建体的土壤农杆菌菌株用于感染无污染生长的烟草(Samsun NN变种)的叶片。按照Horsch NN变种)的叶片。按照Horsch等人的描述(参考文献12)通过将烟草供养细胞层，随后在诱导芽和叶的培养基上连续培养而将感染和转化细胞再生为植株。芽和根诱导培养基含有100μg/ml的卡那霉毒以选择能表达存在于Rokl的T-DNA区(来自于Bin19)(参考文献8)的新毒素磷酸转移酶基因的细胞。将基插条转移到根诱导培养基中而繁殖转化植株。
RNA的分离是按照Apel和Kloppstech27(参考文献14)的描述进行的并按照Goldberg(参考文献15)和Thomas(参考文献16)的描述进行电泳和吸印试验。
图5显示CMV感染对转化植株中随体RNA的影响。
用CMV菌株R76B接种转化的或未转化的烟草(Samsun NN变种)的叶，感染后5小时切下35mm的叶片。以五个叶片为一批，分批地漂浮于SPS培养基(10克/升蔗糖，0.2克/升Ca(H2PO4)2.H2O,0.3克/升磺胺)，从这些样品中分离出总RNA(1微克)，或按照下文中描述方法进行，并按图4描述的方法进行Northern印迹分析，并以pT105(随体RNA)和C20(CMV RNA)的插入物作为探针。大小标记物为仅用CMV(轨迹1和26)或CMV和随体(轨迹18,19和27)感染的组织的RNA以显示CMV RNA-1,CMV RNA-2,CMV RNA-3和CMV RNA-4或随体单位(1×)或二聚体单位(2×)。
a)在一级感染中的RNA。轨迹2-4显示来自非转化植株，用CMVR76B接种，以及接种后5小时(轨迹2)或培养4天(轨迹3)和7天(轨迹4)的样品的叶片的RNA。轨迹5和6显示模似接种(未转化)植株在培养4天(轨迹5)或7天(轨迹6)后的叶片的RNA。轨迹7-9显示用Rokl/C20转化的植株的RNA。该Rokl/C20相似于Rokl/104(图3)，不同之处在于Rokl的BamHⅠ位点的插入物是CMV的外壳蛋白mRNA的cDNA(C20)。在感染后5小时(轨迹7)或从培养4天(轨迹8)和7天(轨迹9)的叶片中分离RNA。轨迹10-13和14-17分别含有来自用Rokl/104或Rokl/105转化的植株的RNA。在感染前(轨迹10和14)，感染后5小时(轨迹11和15)，以及从培养4天(轨迹12和16)以及7天(轨迹13和17)的叶片中分离RNA。
b)二级感染中的RNA。按照类似于图5a的实验中描述的方法，将CMV感染的叶片的提取物接种于烟草(Nicotiana clevelandii)。RNA是在整体感染10天后的组织中分离到的。从用Rokl/C20(轨迹20-22),Rokl/104(轨迹23)或Rokl/105(轨迹24,25)转化的植株叶片的提取物接种的植株中分离出RNA(1微克)。
c)CMV颗粒的RNA。在培养7天时提取用Rokl/105转化的CMV(R/6B)感染的植株的叶片，将接种物在未转化的烟草中传代，并重新接种于烟草上。在感染10天后，从整体感染的叶中分离CMV颗粒。通过加入终浓度为1％的十二烷基磺酸钠并用酚处理而提取病毒RNA。所显示的样品是100纳克病毒粒子RNA(轨迹33)或总细胞RNA(2.9微克，轨迹28；0.7微克，轨迹29；0.29微克，轨迹30；0.07微克，轨迹31；0.029微克，轨迹32)。
为了测定这些经转录的RNA的生物活性，用CMVR76B株感染转化植株。该病毒株是一种无随体的CMV分离物，最初是从苏格兰的天然感染的悬钩子植株中获得(参考文献17)。在一种上述的试验中，从接种5小时的叶上切下叶片。或者是在此同时，或在SPS培养基上将叶片漂浮4或7天后从叶片中分离出RNA。用检测CMV(C20)的探针进行RNA的Northern吸印分析(图5a)显示经过4天后在转化或未转化植株的叶片中积累了CMV基因组RNA。在同一时期内还积累了代表亚基因组RNA种(参考文献18)的许多小RNA种类(图5a)。尽管相对于总细胞RNA中的量而言病毒粒子中的二聚体量被耗尽，但Northern吸印分析检测了武随体RNA。
显然在CMV感染后将转化植株中的转录随体RNA加工为单体长度分子，随后获得该分子并作为病毒培养物的新成分而永久存在。
产生转录随体RNA能力由用Rokl/104和Rokl/105转化的植株遗传给子代。这一结果由这些转化植株的F1子代的多聚A RNA的Northern吸印分析证实，这一分析试验完全按照上面描述的用于分析起始的转化植株的方法(见图4的Northern吸印试验分析)进行。
通过在含有1微克/毫克卡那霉素的MS培养基(1升MS培养基含有4.6克Murashige和Skoog盐混合物(Flow Lab.cat no.26-330-24)，0.1克肌醇，0.01克盐酸硫胺，0.001克烟酸，0.001克盐酸吡哆素，30克蔗糖，7.0克琼脂糖，最后的pH为5.8)萌芽生长而选择出已遗传了带有随体cDNA和来自Rokl载体的相关DNA的表达盒的转化植株用于该分析。在该选择方法中可以鉴别最初来源于Rokl/105或Rokl/104的携带卡那霉素抗性基因的植株，因为这些植株与正常叶片一样发绿，只是叶片的发育略有推迟。没有携带卡那霉素抗性基因的烟草植株未能发育出正常的根和绿叶。一旦在卡那霉素抗性种子和未遗传到活性卡那霉素抗性基因的幼苗之间有生长差异。立即将卡那霉素抗性幼苗从卡那霉素培养基上转移到土壤或混合肥料中。在F1子代植株中产生的转录随体以相同于原始转化体的随体RNA的方式显示生物活性。这结果可以通过用无随体RNA的病毒(黄瓜病毒，见下文)感染F1子代植株而得到证实，该病毒能使F1子代植株的转录随体RNA被加工并以复制为单位长度随体RNA分子，该分子能以高含量积累于整体感染的叶中并作为病毒培养物的一部分在非转化植株中传代过程中繁殖。利用所描述的用于原始转化植株(见上述参考文献图5b)的方法证明这些效果。
不只是由CMVR76B株，也能由黄瓜花叶病毒的其他株将转录随体RNA复制为单位二聚体长度分子，如上文描述。通过用CMV KIN株或用CMVY株感染转化植株或其F1子代可以证明上述结论。CMV-KIN是从Dundee附近的Kinnaird处天然感染的植株中分离的，CMV-Y是从日本烟盐公司(Umegaoka,Yokohama227,JAPAN)的Takanami博士处获得的RNA形式。与CMV相关的病毒，蕃茄无籽病毒(TAV)也能有效地引起转录随体RNA的复制。但是与CMV相关较远的花生矮病毒，或归类于由黄瓜花叶病毒分出的一个单独病毒组中的雀麦花叶病毒，都不能引起转录随体RNA的复制。
在转化植株中积累的随体RNA能够使黄瓜花叶病毒在这些植株上的感染特征得到改变。对于CMV-R76B或CMV-KIN，可将其接种至原始转化植株或接种至这些植株的F1子代上并通过分析整体感染的叶中的病毒RNA而证实上述结果。在产生转录随体RNA的植株中具有病毒基因组RNA的细胞RNA所占的比例小于没有产生转录随体的感染植株中含量的20％。该方法用于证明如上文所描述的相关的Northern印迹分析。
在用CMV-KIN和蕃茄无籽病毒接种在转化植株中显示了第二种由于转录随体的存在引起CMV感染改变的方法。在这些例子中，与未产生转录附体RNA的转化植株，或非转化植株相比，在产生转录随体RNA的植株中大大减轻了病毒病的症状。这一结果显示于图6中，该图描述了在用蕃茄无籽病毒感染约4周时，已用Rokl/104转化的植株以及未转化植株的情况。在整体感染的叶中效果最显著，在这类叶中；产生转录随体RNA的植株没有由蕃茄无籽病毒产生的花叶和叶片畸形。用蕃茄无籽病毒接种转化植株或非转化植株并在感染后4周照相。a)表示完整植株和b)整体感染的叶。104和105是表达随体的转化植株，如上文所述。30K是一种表达烟草脆裂病毒顺序的转化植株，并且作为对照以证明转化本身对症状产生没有作用。NT是一种非转化植株。
用蕃茄无籽病毒减轻症状的这种作用在直至进行最后一次检测的接种后6周并不依赖于接种物强度以及感染长度。在测试的所有产生转录随体的植株中观察到上述结果的高度再现性。
由于在产生转录随体RNA的植株中传代而获得随体RNA的CMV或TAV培养物也显示了改变的特性。当用经过上文描述的各种烟草植株传代的CMV或TAB接种烟草(Nicotiana clevelandii)植株时可证明该结果，参见所描述的图5b。如果接种物经过产生转录随体RNA的植株传代则可显著地减少病毒症状。
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Claims (13)

1．一种保护植物免受植物病毒感染的方法，该方法包括：将一个DNA片段转化到一种植物中，其中所述DNA片段互补于第一种黄瓜病毒的减轻症状的随体RNA序列，所述DNA片段能够在所述植物中转录并能遗传给子代植物；当在所述植物或子代植物中转录或转录并转译时，所述DNA片段能够减轻由于第二种黄瓜病毒感染所述植物而引起的症状，从而保护所述植物。
2．根据权利要求1所述的方法，其中所述随体RNA或相应DNA片段在转化到植物中之前被改变。
3．根据权利要求1的方法，其中引入的DNA片段在植物中的表达可使植物病毒侵袭植物的症状减轻。
4．根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA片段是来源于随体RNA的cDNA片段。
5．根据权利要求3所述的方法，其中所述DNA片段来源于减轻症状的随体RNA。
6根据权利要求3所述的方法，其中所述DNA片段来源于能从多体结构加工得到的RNA。
7．根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA片段来源于黄瓜病毒的随体RNA。
8．根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒是黄瓜花叶病毒。
9．根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述病毒是黄瓜花叶病毒(CMV)，用于转化的DNA片段是相应于CMV随体RNA的cDNA。
10．根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其中用可以将DNA转化到受体植物核基因组中的表达载体把所述DNA片段转化到植株内。
11．根据权利要求10所述的方法，其中的表达载体是以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒系统为基础的。
12．根据权利要求11所述的方法，其中表达载体是一种质粒，该质粒含有来自根癌土壤杆菌的Ti质粒的T-DNA边缘序列，一种转录启动子，相应于植物病毒随体RNA的DNA片段，以及一种转录终止子。
13．根据权利要求11或12所述的方法，其中用含有表达载体的根癌土壤杆菌菌株感染待转化的植物的细胞，并从已转化的感染细胞再生出完整植株。
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