CN87100463A - 植物病毒或其作用的改变 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改变植物病毒或其作用的方法，包括将遗传物质引入植物体以及用植物病毒感染该植物体，以引入的遗传物质的表达来改变植物病毒或其作用。在较佳实施例中，引入遗传物质的植物中的表达，可减轻植物病毒侵染植物引起的症状。

Description

本发明涉及植物病毒或其作用的改变。
有些黄瓜花叶病毒培养物的颗粒除了含有三种单链RNA基因组和一种对黄瓜花叶病毒颗粒蛋白起mRNA作用的亚基因组外，还含有另一种一般长约335核苷酸的单链直线RNA分子。这种附加的分子已知为随体RNA，并不与黄瓜花叶病毒RNA基因组共用相当大的核苷酸顺序，但是只在由黄瓜花叶病毒感染的植物体内或原生质体内复制。不含有随体RNA的黄瓜花叶病毒隔离群在无随体情况下，可以在植物体内重复培养，但在把随体RNA加到这种培养物时，它就被合成，并成为病毒隔离群的组成而继续存在。随体RNA对黄瓜花叶病毒感染的作用随菌株不同而各有差异。在许多情况下，黄瓜花叶病的正常症状消除了，结果是受感染的植物显示出没有明显感染的痕迹。因此，其他种的随体的存在导致与黄瓜花叶病毒有明显区别的严重症状的产生。
由于含有用某些随体RNA株的黄瓜花叶病毒感染的植物所表现的症状较之无随体感染的要轻，因此建议使用含有随体RNA的完全病毒以保护植物抵御黄瓜花叶病毒感染的作用。事实上，实验表明：用带有随体的黄瓜花叶病毒株进行预感染可以防止黄瓜花叶病并导致胡椒产量的增加。实验还证明，用含有良好的随体RNA黄瓜花叶病毒株感染的蓄茄对带有病毒随体RNA的黄瓜花叶病毒株的影响具有交叉保护作用。用完全病毒作为预防剂也会产生严重的问题。保护株本身对生长和产量也可以有不利影响，或者成为其他种植物的一种感染储藏。无毒株突变为有毒株也是可能的。
我们试图采用本发明所提供的方法来消除这些困难，本发明通过由核基因组的转录，让生物活性物质，较理想的是由病毒衍生的遗传物质，特别是随体RNA，保持在植物体内。
本发明提供一种改变植物病毒或其作用的方法包括将遗传物质引入植物体内并用植物病毒感染该植物借以引入遗传物质的表达改变植物病毒或其作用。
较为可取的是通过任意的改变，从植物病毒中产生有待引入的遗传物质，该植物病毒可以是与感染植物的植物病毒相同，也可以不相同。
在较佳实施例中，已引入遗传物质的植物体的表达使由植物病毒侵染的植物的症状得到减轻。
转移到植物体内的遗传物质最好是相当于植物病毒随体RNA的cDNA，cDNA和/或随体RNA都可进行任意改变。
病毒RNA的表达可以使植物免受相应的病毒RNA的致病作用。换言之，病毒源的RNA的表达可以防止不具有顺序同源的病毒RNA的致病作用。还应该注意的是作为RNA的病毒遗传物质可以独自发挥其将该RNA转译到蛋白质的作用。
本发明还提供了一种植物遗传工程的方法，包括掺入植物DNA核基因组，该植物DNA可以在植物体内表达，并且能够由植物病毒来解决植物难题，能够解决所述植物病毒或其作用的改变问题。本发明进一步涉及用这种方法解决植物及其后代的遗传工程问题。
病毒尤其是适用于本发明那些分子量相当低的，一般少于100个核苷酸的随体RNA。例如有黄瓜花叶病毒或其他黄瓜病毒，烟草环斑病毒或其他nepo病毒，番茄丛矮病毒或其他番茄病毒，芜菁叶丛生病毒和sobemo病毒或与他们有关的病毒。能够用这些病毒感染的任何植物都可以用于本发明。
较佳的病毒是黄瓜花叶病毒，而用于转化的遗传物质是对应于黄瓜花叶病毒随体RNA的cDNA。cDNA最好是转移到能将DNA转移到受体植物核基因组内的表达载体，例如以根癌土壤杆菌（Agrobacterium    tumefaciens）Ti质粒系统为基础的表达载体。
因此本发明还提供一种能够把DNA转移到受体植物核基因组内的表达载体，其特征在于其把可以表达的能够转移的DNA掺入受体植物，并且由植物病毒来解决植物难题，能够解决该植物病毒或其作用的改变问题。表达载体最好是一种包括由根癌土壤杆菌的Ti质粒、转录启动子、、对应于黄瓜花叶病毒随体RNA的cDNA和转录终止区组成的T-DNA边缘顺序的质粒。
受保护的植物细胞如叶片受到积聚在表达载体的根癌土壤杆菌株感染，并且全部植株从被转移的感染细胞重新生出。
在若干实验室里已经证明，根癌土壤杆菌的Ti质粒可以用于把新的DNA顺序引入植物的核DNA。此外还证明，如果这些DNA顺序含有适当的启动子顺序和终止区顺序，则DNA就可转录到转化细胞的RNA中，能够引入新的并且与根癌土壤杆菌无关的DNA顺序的其他任何方法和载体也都适用于本发明，只要将转录启动子和转录终止区掺入作为适宜病毒顺序表达带的载体分子中。采用转化植物细胞的DNA直接吸收方法也是可能的，关于这个方法可参阅下列论文：
Krens，F.et    al.Nature    296，72-74（1982）
Paskowski，J    et    al.EMBO    J.3，2717-2722（1984）
Hains，R.et    al.Mol.Gen.Genet.199，161-168（1985）
Potrykus    et    al.ibid.199，183-188（1985）
Fromm    et    al.Nature，319，791-793（1986）
我们已经证明，将随体RNA多体处理成单位长度分子，如果与黄瓜花叶病毒RNA共同感染到烟草植物体内，则还能进行复制。这个观察十分重要，因为获得表达新的DNA的方法如同表达转化细胞中的RNA需要RNA的转录包括转录的终止区和启动子的顺序。关于其他病毒系统的研究认为，把外来顺序加到病毒RNA分子的末端，影响该RNA复制的能力。在没有证明处理多体能够产生随体RNA的情况下，似乎最有希望的一个实验结果在于随体RNA的cDNA复制可表示为转化细胞中的RNA的转录并不能由外来病毒复制。由于随体RNA抑制病毒症状的作用可能是由随体与病毒RNA之间争夺复制机构而起的中介作用，所以这意着转化细胞中的随体转录并不影响黄瓜花叶病毒症状的产生。
但是，由于确定了随体RNA可以由多体产生，显然具有生物活性的随体RNA能够表达在转化的植物细胞内。主要的转录产物是含有在启动区和转录终止区末端附加顺序的多体随体RNA分子。这意味着在黄瓜花叶病毒感染前或感染后，随体多体转录被处理成单位长度分子，它们承受黄瓜花叶病毒感染细胞中正常随体RNA的作用。这种作用意味着包括复制和症状减轻。本文的介绍概述了含有作为多体结构以及把这些顺序插入Ti质粒表达载体的随体RNA的cDNA克隆的结构。随体RNA多体转录的生物活性显示在转化烟草的细胞中。
附图说明如下：
图1是对应于黄瓜花叶病毒随体RNA的cDNA的核苷酸顺序;
图2是随体cDNA多体结构简图;
图3是双Ti质粒表达载体中黄瓜花叶病毒随体cDNA分子的详细结构图;
图4是转化植株RNA的北方斑渍分析;
图5表示黄瓜花叶病毒感染对转化植株中随体RNA发生的影响;
图6表示转录随体对症状产生的作用。
实施例
为了说明本发明的实施例，我们介绍具有黄瓜花叶病毒随体RNA的DNA复制的烟草转化植株，由这种植物产生的随体RNA转录，以及由生长在该种植物中的黄瓜花叶病毒培养物得到随体RNA。
本文中所用的随体RNA是由黄瓜花叶病毒株I17N（参考文献20）分离出来并且作为互补DNA（cDNA）被克隆。cDNA克隆的核苷酸顺序与黄瓜花叶病毒的其他植株的核苷酸顺序非常相似，构成两个头尾连环的随体cDNA分子，包括一个（pT104）或两个（pT105）完全随体RNA顺序单位，带有5′末端（图3）不完全单位，用于被认为是复制中间体的模拟型多体随体RNA，为了表达转化植物中这些随体顺序，将cDNA分子转移到以根癌土壤杆菌的双Ti质粒系统为基础的表达载体（Rokl）中，生成的质粒称作Rokl/104的Rokl/105。
现分四个部分：随体RNA的分离和纯化;作为cDNA的随体RNA的克隆：随体cDNA多体的结构：随体cDNA转移到Ti质粒。
随体RNA的分离和纯化
用黄瓜花叶病毒（毒株I17N由法国蒙特法威INRA M.Jacquemond博士提供）感染烟草植株，分离和纯化的病毒颗粒与Lot等人（参考文献1）所介绍的完全一样。将病毒颗粒加入十二烷基磺酸钠至1%，用缓冲饱和酚（50mM Tris-Hcl pH8）和乙醇沉淀提取得到RNA。离心回收RNA，并再悬浮在0.5毫克/毫升水中。用蔗糖梯度离心纯化随体RNA。将33微克黄瓜花叶病毒RNA稀释至100微升水，再加2微升1M三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐缓冲液（pH8）和5微升1M氢氧化甲基汞。在室温条件下5分钟后，加入5微升β-巯基乙醇，然后将样品吸附在Sorvall AH650转子离心管中的5-20%（重量/体积）蔗糖梯度上，梯度用10mM Tris-Hcl pH 7.5，100mM Nacl，1mM EDTA pH8进行缓冲后，在20℃条件下，50000rPm，离心2小时，用底部滴注法收集积相等的20份，从每份中取出20微升进行琼脂糖胶电泳分析，琼脂糖胶用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡着色，以检测随体RNA是否存在。将含有随体RNA的各份收集物合并，用乙醇沉淀收集随体RNA并溶于20微升蒸馏水。
作为互补DNA（cDNA）的随体DNA的克隆
为易于起动cDNA的合成，将多腺苷酸顺序加到随体RNA的3′端。把10微升随体RNA置于25微升的25mM    Tris-Hcl，pH7.9，250mM    Nacl与2.5mM    Mncl，500μm    ATP，15单位的胎盘核糖核酸酶抑制剂和0.2单位多腺苷酸多聚酶，在37℃条件下温育元分钟。稀释至75微升时，反应结束，用酚提取。多腺苷酸随体用乙醇沉淀两次后再悬浮在10微升蒸馏水中。
由该RNA合成cDNA是在25微升反应容积内提供有寡dT12-18，在该反应容积内含有pH8.3的25mM Tris-Hcl，10mM Kcl，4mM Mgcl，0.025毫克/毫升寡dT12-18，5mM二硫苏糖醇，dATP、dGTP，dCTP和TTP各500μM，15单位胎盘核糖核酸酶抑制剂，15单位逆转录酶和10微居里32P（α标记原子）dATP（≈500居里毫摩尔）（New England Nuclear）。在42℃条件下1小时后，反应沸腾1分钟，冰上冷却10分钟，然后1000×g离心10分钟。将上清液加到pH7的2.5微升1摩尔HEPES缓冲液20毫摩尔dATP，dGTP，dCTP和TTP各0.5微升，1.5微升0.1摩尔Kcl，2.6微升水和5单位DNA聚合酶I〔克列诺夫（Klenow）片段〕。将DNA通过1毫升的交联葡萄糖G-50层析柱，乙醇沉淀后悬浮在50微升的0.3摩尔Nacl，0.03摩尔NaOAc（PH4.5），4.5毫摩尔ZnSO4，含有300单位/毫升S1单链核酸酶中。在37℃条件下1小时后，加入50微升TE稀释反应物，将样品置于pH7.5的10毫摩尔Tris-Hcl，1毫摩尔EDTA，100毫摩尔Nacl的5-20%蔗糖梯度上，然后在SORVALL AH 650转于50000rPm上离心4小时。将梯度从底部分离，由测出的放射性同的各部分中最大的50% cDNA分子集中在一起，样品用酚/氯仿提取，乙醇沉淀，在SORVALL AH650转子中40000rPm离心30分钟收集。再用乙醇将100微升样品进行沉淀，用乙醇冲洗，干燥后溶于10微升pH8的1毫摩尔Tris-Hcl和0.1毫摩尔EDTA。
cDNA用末端转移酶和dCTP培养，加能使cDNA克隆到质粒载体中去的寡dC尾。反应物含有5微升cDNA，1微升10×缓冲液（1.4摩尔二甲胂酸，0.3摩尔Tris碱，1.1摩尔KOH），0.2微升10毫摩尔dCTP，0.1微升20微摩尔二硫苏糖醇，1.7微升水，1微升10毫摩尔CoCl2和10单位末端转移酶。反应物在37℃条件下温育10分钟，再在65℃温育2分钟后停止反应。
克隆用的载体是质粒PUC9（参考文献2），它是在与末端转移酶的类似反应中用PstI消化并以dGTP结尾。尾cDNA（4微升）在30微克10毫摩尔Tris-Hcl（pH7.4），100毫摩尔Nacl，0.1毫摩尔EDTA中用尾质粒（80毫微克）退火。反应加热到65℃，然后冷却到40℃过夜。将5微升退火混合物转移到大肠杆菌（E.coli）株MC1022，然后涂在带指示剂（1PTG和Xgal）的氨苄青霉素上，该指示剂指示是否有cDNA插入LacZ基因。选出不显示兰色的克隆作进一步分析。
首先分析质粒DNA是否存在与纯化随体RNA杂交的插入，继而对此进行确证，然后纯化质粒DNA，通过消化PstI和聚丙烯酰胺电泳分析测定插入的大小。
对各为B7的一个克隆而言，插入大小约为410bp。这说明cDNA的插入包含大多数或全部上述易于克隆的所加同聚体尾相结合的随体顺序（335    bp）。
为了确证cDNA在B7插入中的范围，用Maxam和Gilbert（参考文献3）方法测定核苷酸顺序，见图1。该顺序与直接从RNA测定的其他黄瓜花叶病毒随体RNA分子的顺序非常相似，只是在cDNA的5′端缺少3个核苷酸，可能是由于逆转录酶不完全复制的结果。
除了各种可用作补偿的寡核苷酸试剂（见第9页）外，可用5′端显示出的不同互补情况的克隆以求得解决。
随体cDNA多体的结构
由于引言部分所述原因，必须考虑随体cDNA多体复制的结构。图2中给出了一系列复杂的操作程序，目的在于，首先从随体顺序3′处去除同聚体尾端，然后使cDNA分子具有两侧对称的结构，包括在两个随体顺序之间连接处的5′同聚体尾部。第二步是连接区的克隆，用寡核苷酸定向诱变技术去除5′同聚体尾部，补充5′端中缺少的3个核苷酸。将改变的连接区连接到含有随体cDNA的限制性片段，以形成含有一个或两个完整的随体顺序单位。这些操作程序详述如下。
a）去除随体顺序3′端同聚体尾部
这是用Bal    31核酸酶实现的。首先将60微克质粒B7通过BamHI切割成为直线排列。B7含有一个BamHI位点，它正好是贴近cDNA插入的PStI位点上，并且是在插入的3′端一侧。用酚提取DNA，乙醇沉淀，再悬浮在400微升的10毫摩尔Tris-Hcl（pH8）和1毫摩尔EDTA中。加入100微升Bal    31缓冲液和0.5单位Bal    31核酸酶。在8、12、16分钟时，分别除去130微升，用酚提取。用乙醇沉淀收集DNA。为了去除突出的3′端和填补凹进的3′端，用T4DNA聚合酶处理Bal    31消化DNA的末端。反应含有TA缓冲液（33毫摩尔Tris乙酸，pH7.9，66毫摩尔乙酸钾，10毫摩尔乙酸镁，4毫摩尔第二性征激素，0.5毫摩尔二硫苏糖醇），2.5微摩尔dATP，dGTP，dCTP和TTP以及75微升中5单位T4    DNA聚合酶。在37℃3小时后，将反应物稀释至100微升，用PstI消化DNA，以分离出两个片段。较大的一个片段是从BamHI位点缺失的载体质粒。较小的一个片段则是从5′PstI位点延伸到Bal    31缺失位点的cDNA插入。为了分离延长到大约cDNA插入（…CCCoH但并不插入同聚体尾部的末端核苷酸的缺少cDNA分子，在5%聚丙烯酰胺凝胶上分离DNA并且分离出约350个核苷酸的cDNA片段。然后将这些片段克隆到由PstI和SmaI消化的pUC9。由于cDNA末端核苷酸就是SmaI位点的5′核苷酸，所以含有缺失而对精确的cDNA    3′端的克隆就可以由重组体质粒中SmaI位点的存在而被识别。一个消化D26的克隆满足这种判据就可以被鉴别。是否正确的插入通过用其他限制性酶消化即可被确认。为了另一个实验的需要将这种克隆的插入转移到另一个质粒pSP6/4（参考文献4），尽管这对本文所介绍的操作程序无关重要。继而处理以pSP6/4中D26的结构为基础的称之为pSP102。关于pSP102的性质在图2中给出。
b）连接区的诱变
第二步包括增加第二个随体cDNA插入pSP102，以形成头一尾二聚体结构。为此，通过用SmaI和PstI消化10微克DNA，可释放出pSP102的插入。PstI位点突出的3′端通过把dATP，dGTP，dCTP和TTP加至100微摩尔并加4单位T4多聚酶25微升，使其变成钝端。紧接着在37℃条件下保温15分钟，将cDNA插入在5%聚丙烯酰胺凝胶上分离纯化。然后把这个cDNA插入克隆到pSP102，的SmaI位点，生成的克隆用于筛选用TagI消化的头-头或头-尾构型的插入。一个具有头一尾二聚体的克隆称之为pSP103。
为了诱变二聚体连接区，以去除同聚物尾部并使被认为缺少cDNA的5′核苷酸得到恢复，必须将连接区的克隆克隆到单链噬菌体，mp10（参考文献5）。还需要得到表示矫正连接顺序补体的人工合成寡核苷酸。该寡核苷酸是从S.Minter（UMIST）博士处购来的，其顺序为
TCCATCAAACAAAACGGGTCCTGTGTAGGA
（在该顺序内，顺序GGG是随体RNA3′端的补体，顺AAAAC是随体包括缺少核苷酸的5′端的补体）。
如图2所示，将在TaqI位点间的pSP103    DNA克隆到Accl位点上的mP10。用常规方法（参考文献5）从该克隆中分离出单链DNA，各为Taq3。
通过ATP与多核苷酸激酶反应制备可用的人工合成寡核苷酸。反应物含有15pmol寡核苷酸70毫摩尔Tris.Hcl（pH7.6），10毫摩尔Mgcl2，5毫摩尔二硫苏糖醇，1毫摩尔ATP和20微升10单位多核苷酸激酶。反应在37℃保温1小时，在70℃加热10分钟后停止反应。
将激酶寡核苷酸（5pmol）在含有10毫摩尔Tris-Hcl（pH8），1毫摩尔EDTA的12微升的反应体积内退火到含有25ng顺序引物（一种人工合成寡核苷酸，其顺序为GTAAAACGACGGCCAGT，从新英国生物实验室取得）的2微克Taq 3DNA。反应开始是在80℃条须件下在装有水的250毫升的烧杯中进行的，然后将水倒在冰上冷却到15℃，再加入1微升100毫摩尔Tris-Hcl（pH8），10毫摩尔Mgcl2，1微升5毫摩尔dATP，dGTP，dCTP和TTP，1微升5毫摩尔ATP，1微升0.1摩尔二硫苏醇糖，4微升水，1单位DNA聚合酶I（克列诺夫片段）和6单位T4DNA连结酶。反应在15℃保温4小时，用180微升10毫摩尔Tris-Hcl（pH8），1毫摩尔EDTA稀释，然后取每份1微升转移到大肠杆菌（菌杆JM101）内。
将生成的噬菌斑与人工合成的（连接顺序）寡核苷酸（标记32P）杂交，以检测含有诱变（矫正）连接区的克隆。诱变克隆与未诱变克隆的区别在于前者形成的杂种的稳定性提高了。
为了标记人工合成的寡核苷酸，反应含有15pmol寡核苷酸，200微居里32P标记（γ位）ATP（3000居里毫摩尔），70毫摩尔Tris-Hcl（pH7.6），10毫摩尔Mgcl2，5毫摩尔二硫苏醇糖和10单位多核苷酸激酶。反应在37℃保温30分钟后在70℃加热至反应终止。杂交的方法是将硝基纤维素滤器放在噬菌斑上30秒钟。在该滤器上完成噬菌斑的复制。然后将滤器（直径9厘米）浮在0.5NNaOH，0.5摩尔Nacl上1分钟，再在1.5摩尔Nacl，0.5摩尔Tris-Hcl CPH7.5）上飘浮两次，每次1分钟。滤器在80℃真空烘2小时。预杂交是在1摩尔Nacl，33毫摩尔PIPES（pH6.8），6.6毫摩尔EDTA，0.2%明胶，0.2%Ficoll，0.2%聚乙烯吡咯烷酮360，0.1%十二烷基磺酸钠中，在65℃下进行1小时，然后与32P寡核苷酸（1.5Pmol）在1毫升1摩尔Nacl，33毫摩尔PIPES（pH6.8），6.6毫摩尔EDTA中在25℃杂交16小时。再将滤器在0.9摩尔Nacl，0.09摩尔柠檬酸钠中清洗若干次后进行放射自显影，以检测杂交进展情况。然后分别在42℃，52℃，62℃和72℃温度条件下在0.9摩尔Nacl，0.09摩尔柠檬酸钠中洗涤，在各个温度阶段之间用放射自显影检查杂交情况。
从在62℃和72℃时显示稳定杂交的噬菌斑中，选出6个进行培养。用常规方法（参考文献5）制备单链DNA，并用（参考文献6）的双脱氧顺序法确认与连接区交叉的顺序。这些克隆称为Taq    3′。
为了构成含有矫正连接区的多体随体单位，需要得到足够的双链DNA。这可通过将含有Taq3′连接区的TaqI片段克隆到质粒载体解决。单链Taq 3′DNA（25微升）在按上述定义的75微升含有40ng顺序引物和10微升100毫摩尔Tris-Hcl（pH8），（10毫摩尔Mgcl2中在65℃保温1小时。加入20微升5毫摩尔dATP，dGTP，dCTP，TTP和25单位DNA多聚酶I（克列诺夫片段）。在20℃条件下保温30分钟后，用EcoRI和HindⅢ（各50单位）消化样品并在37℃下保温1小时。切割Taq 3′DNA的这些酶贴近连接片段cDNA的两侧，接着用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化释放的连接片段并将其克隆到质粒载体pUC9。一个含有所需Taq 3′片段的克隆可通过限制酶的消化进行鉴定，并称之为pUS1。
C）随体多体的结构
为了构成含有与cDNA片段（该片段从TaqI位点至随体DNA3′末端）连接的pUS1连接片段的cDNA采取以下方法实现。
首先pSP102的ScaI/SstI片段和pUS1的BamHI/ScaI片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并且与由BamHI和SstI消化的载体DNA（pT    7/2，参考文献7）连接。载体的选择可通过互异实验预以确定。为此，其他载体（例如pUC9）已能被取代。含有pUS1和pSP102两个片段3矫正插入的克隆通过用BamHI和SstI（产生的插入cDNA约为450个核苷酸）的限制酶消化预以鉴定。其中之一即为pT104。
尽管在前言部分已经提及多体转录是在转化植株中进行处理的，但不可能从现有的信息中预示产生该结果所必需的精确结构。例如确定处理反应的顺序对被处理的单位是包含在内的，则pT104结构的表达足以满足。因此，假如所需顺序对处理单位说是在外部的，则需要表达在两侧含有随体cDNA顺序的多体转录。由于这个原因，进一步的结构则是用不完全单位使之含有两个在5′侧翼的完全随体单位。
为了组成该结构，在切割质粒分子平均每分子一次的条件下，用TaqI消化pT104和pUS1    DNAs。在0.7%琼脂糖胶上分离经消化的DNA并且分离出标准长度的直线分子。pT104    DNA用SstI消化并在聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，以分离出对TaqI位点和SstI位点之间的距离预计（约450bp）大小所需的片段（图2）。与此类似的还有用BamHT消化的pUS1和分离出对BamHI/TaqI片段预计（约350bp）大小所需的片段（图2）然后将这些片段混合，用由BamHI和SstI消化的pT7-2连接并且转移到大肠杆菌。被鉴定的若干克隆中，含有所需的插入，其中之一即为pT105。随体cDNA多体转移到Ti质粒
为了得到转化植株中随体顺序的表达，将pT104和pT105的cDNA插入转移到根癌土壤杆菌Ti质粒载体，即由M.Bevan得到的Rokl。这就是按前所述的载体Bin    19（参考文献8），它额外还含有启动子和转录终止区以及在他们之间用于新顺序插入的BamHI位点。如前所述（参考文献9），启动子和终止区构建在载体内，以表达转化细胞中的病毒壳体蛋白，区别在于Rokl启动子在转录起始点的3′侧含有6个核苷酸，正如前所述，在这个区内含布132bp。
Rokl    DNA（5微克）在40微升中用BamHI进行消化，然后用5单位T4DNA多聚酶和dATP，dGTP和TTP各100微摩尔在37℃下处理15分钟，在65℃下处理10分钟。加入0.6单位牛肠磷酸酶，DNA在37℃下保温60分钟。继而在65℃处理10分钟，DNA用酚提取，乙醇沉淀。用BamHI和EcoRI消化pT104和pT105    DNA，并在50微升体积内具有2.5单位DNA多聚酶I（克列诺夫片段）中，用dATP，dGTP和TTP各50微摩尔，在37℃处理15分钟。然后在5%聚丙烯酰胺凝胶分离DNA，并将随体cDNA插入也分离出来。
图3所示是双Ti质粒表达载体中黄瓜花叶病毒cDNA分子的详细结构。在104结构的5′端处有从转录起始点并且包括pT7-2多联结子顺序和用于pT104结构中其他载体的pT7-2质粒多联结子的51个核苷酸。在图中所示的104的3′端处，有从随体顺序227位至335位上（“TE3′”）随体单位3′核苷酸的98个核苷酸。紧接104的3′处，有一个完全的随体单位，在同一方向上有一个不完全单位，位于3′的侧翼，有从载体质粒pT7-2（参文献7）SamI至EcoRI之间的16个核苷酸。105结构与104相同，只是在同一个方向上有两个完全的随体单位。104和105的插入是通过限制核酸内切酶BamHI和EcoRI消化切割的，由于DNA多聚酶（克列诺夫片段）的作用变为钝端，并且插入双Ti质粒Rokl的BamHI位点。Rokl的BamHI位点由于DNA多聚酶（克列诺夫片段）的作用变为平端。如前所述（参考文献8），Rokl是双载体Bin    19的一个衍生物，额外含有插入多联结子位点的表达带。表达带包括花椰菜花叶病毒35SRNA（参考文献10）的启动子和根癌土壤杆菌T-DNA（参考文献11）蓝曙红合成酶基因的终止子片段。它与对烟草花叶病毒壳体蛋白基因（参考文献9）所述的表达带基本相似，仅仅缺失启动子片段，又返回到用Bal    31核酸酶的35S转录冠位点（capsite）的6    bp    3′。插入于启动片段和终止片段之间只有一个BamHI位点。源于该表达带的转录除了在BamHI位点插入的顺序外，还可含有启动区的10个核苷酸和终止区的200个核苷酸（参考文献11）。
图中仅仅给出与pT104和pT105的cDNA插入和Rokl表达带区贴近的区。
将消化的RoklDNA分别与pT104和pT105插入连接并且转移到大肠杆菌。通过用EcoRI和HindⅢ的消化鉴定重组克隆（见图3所示这些位点），含有所需插入的质粒分别为Rokl/104或Rokl/105。然后将这些质粒通过所述交配（参考文献8）转移到根癌土壤杆菌。将所生成的根癌土壤杆菌菌株用Horsch等人精密的方法（参考文献12），用以转化烟草（Nicotiana.tabacum-var    Samsun    NN）叶片中的细胞。其区别在于（ⅰ）叶片来自无毒生长的植株而不是灭菌生长的植株;ⅱ）在100微克/毫升卡那霉素上选出转化的植株。
如Horsch等人所述（参考文献12），成熟植株可从转化植株中再生长。
上述植物的分析介绍如下。
转化烟草植株（CV.Samsun    NN）是从根癌土壤杆菌感染的叶片中再生的，并且分别用南方斑渍分析法和北方斑渍分析法分析在其DNA和RNA中有无随体顺序的存在。南方斑渍分析法证明，转化植株的DNA含有每个单倍体基因组1-3个随体cDNA的复制，用南方斑渍分析法还证明cDNA顺序，启动区位点和RNA终止位点不再新排列或缺失。北方斑渍分析法（图4）证明，大约有700个核苷酸（Rokl/104）或1000个核苷酸（ROKl/105）进行转录，这些核苷酸是从启动区顺序和终止区顺序在原结构（图3）中的位置估约量并且考虑到3′多腺苷酸区存在。这些RNA分子已在完全的RNA或聚腺苷酸RNA中被检测到。在生长、开花或结实中没有观察到转化植株中有类似病毒症状或其他不正常现象。图4是一种对转化植株中RNA的北方斑渍分析。
由非转化植株（non-trans）或用Rokl/104和Rokl/105转化的植株的叶片中分离出完全的RNA（20微克）或聚A+RNA（1微克）并在甲醛/琼脂糖凝胶上进行分离。借助硝基纤维素上涂胶并且与由pT105的切口转译插入杂交方法检测转录随体RNA顺序。包括用含有随体DNA的黄瓜花叶病毒感染的细胞中的完全RNA作为参考来检测随体RNA单位长度（1×）和二聚体长度（2×）的分子。量的标记则是用黄瓜花叶病毒基因RNA（DCB，未发表）的cDNA克隆（C20）检测的黄瓜花叶病毒颗粒RNA.并与黄瓜花叶病毒RNA-3黄瓜花叶病毒RNA-4和弱与黄瓜花叶病毒RNA-1和RNA-22杂交。给出的量值即是Gould和Synons（参考文献13）方法所采用的量值。如上所述将Rokl    104和105的结构通过包含三亲株杂交pRK2013的大肠杆菌株HB101移入根癌土壤杆菌LBA4404内（参考文献8）。产生的根癌土壤杆菌株含有双载体结构，可用于感染无菌生长的烟草（CV.Samsun    NN.）叶片。如Horsch等所述（参考文献12），通过成功地在一层烟草饲养细胞，然后在诱发根和芽生长的介质上培养叶片，可使受感染和转化的细胞在植株内再生。诱发芽和根的介质包括100微克/毫升的卡那霉素，选此可用于细胞表达Rokl（自Bin19起）的T-DNA区内含有的新霉素磷酸转移酶基因（参考文献8）。通过把茎的切割转移到根的诱发介质，使转化的植株得到生长。
RNA的分离可参考Apel和Kloppstech的介绍（参考文献14），电泳和斑渍分析则可参考Goldberg（参考文献15）和Thomas（参考文献16）的介绍。
图5表示黄瓜花叶病毒感染对转化植株随体RNA的作用
将转化或未转化的烟草Var.Samsun NN）叶片用黄瓜花叶病毒株R76B培育，5小时后切割35毫米叶片。以5片叶子为一组，在SPS溶剂（10克/升蔗糖，0.2克/升Ca（H2PO4）.H2O，0.3克/升磺胺）中飘洗，从这些样品中分离出完全RNA（1微克）或按下述方法分离，并用图4所示的北方斑渍法进行分析，使用的探查物为pT105插入（随体RNA）或C20插入（黄瓜花叶病毒RNA）。量的标记或是单用黄瓜花叶病毒（轨迹1和26）或者用黄瓜花叶病毒与随体（轨迹18，19和27）感染的组织的RNA，以说明黄瓜花叶病毒RNA，即CMV RNA-1，CMV RNA-2，CMV RNA-3和CMV RNA-4或随体单体（1X）或二聚体单位（2X）。
a）RNA的初次感染。图中2～4表示未转化植株叶片的RNA，用CMV    R76B接种，接种后5小时（2）或保温4天（3）和7天（4）后取样。5和6表示在保温4天（5）或7天（6）时假接种（非转化的）植株叶片的RNA。7～9表示用ROKl/C20转化的植株的RNA。这与ROKl/104（图3）相似，只是在ROKl的Bam    HI位点上插入的是黄瓜花叶病毒外壳蛋白mRNA的cDNA（C20）。RNA是在感染后5小时（7）或是从保温4天（8）和7天（9）的叶片中分离的。10～13和14～17分别含有用ROKl/104或ROKl/105转化的植株的RNA。RNA是在感染前（10和14）、感染后5小时（11和15）和保温4天（12和16）和7天（13和17）时从叶片分离得到的。
b）RNA的继发感染。与图5a的实验所述相似，将黄瓜花叶病毒感染的叶片提取液接种在烟草（Nicotiana    clevelandii）上。RNA是10天后从整体感染的组织中分离得到的。RNA（1微克）是从用ROKl/C20（20～22），ROKl/104（23）或
ROKl/105（24，25）转化的植株叶片提取液接种的植株中分离得到的。
c）黄瓜花叶病毒颗粒中的RNA。用ROK1/105转化的并由黄瓜花叶病毒（R/6B）感染植株的叶片在保温7天时提取，接种物通过未转化的烟草再接种在烟草上。感染10天右，从整体感染的叶片中分离出黄瓜花叶病毒颗粒，加入十二烷基磺酸钠至1%，再用酸处理，提取得到病毒RNA。为比较起见，也从该组织中分离得到全细胞RNA。给出的样品为100ng病毒RNA（33），或全细胞RNA（2.9微克，28;0.7微克，29;0.29微克，30;0.07微克，31;0.029微克，32）。
为了测定这些已转录的RNA分子的生物活性，用黄瓜花叶病毒株R76B感染已转化的植株。这是从原来生长在苏格兰受天然感染的悬钩子植物中得到的无随体黄瓜花叶病毒分离物（参考文献17）。在一个这样的试验中，从接种后5小时的叶片切割下来的叶片片段。与此同时或在SPS溶剂中飘洗4天或7天后的叶片中分离得到RNA。北方斑渍分析具有黄瓜花叶病毒（C20）探查物的RNA（图5a）说明，4天的黄瓜花叶病毒基因组RNA积累在已转化和未转化植株的叶片内。许多很小的RNA，可以代表亚基因组RNA（参考文献18）也超过了同一时期的积累（图5a）。4天和7天后，采用北方斑渍分析测定随体RNA，但仅仅对用ROK1/104或ROK1/105（图5a）转化的植株叶片进行分析测定。这种RNA大量存在，虽然主要是单位随体RNA长度，但对含有随体的感染而言仍属正常，此外还检测到了一些二聚体（图5a）。在图5a负载有RNA和放射自显影曝光时，大约700和1000核苷酸的转录随体RNA分子并未测到。随体探查物对在这个胶的某些点上的高分子量RNA的弱杂交则是具有核糖体RNA探查物聚集作用的产物。
在进一步试验中，是将接种后4天和7天采取的叶片的浆液接种到烟草上。接种后10天，从整体感染的这些植物的叶片中分离得到RNA。采用北方斑渍分析方法检测随体RNA，总之，天然随体RNA在单位和二聚体长度方面，天然随体RNA都具代表性，但只是在由ROK1/104或ROK1/105（图5b）转化的植株中被黄瓜花叶病毒感染的叶片内得到的接种物才如此。黄瓜花叶病毒探查物在所有样品中都测到了病毒基团组RNA（图5b）。
在一个类似的实验中，将用ROK1/105转化的并受黄瓜花叶病毒感染的植株中得到的病毒培养物，两次感染烟草，从由这些植株中纯化的黄瓜花叶病毒颗粒分离出RNA。在测到的随体单位和二聚体长度方面都具有天然随体的制备特征（图5c），尽管二聚体的量与全细胞RNA的相应量比较是减少了。
从整体感染的叶片提取液中测到的随体RNA的单位和二聚体长度都是高水平的，该叶片取自用ROKl/104和ROK1/195转化的被黄瓜花叶病毒接过种的植株。在由未转化的对照植株取得的整体感染叶片提取液中未检测到随体RNA。
显然，转化植株中的转录随体RNA在黄瓜花叶病毒感染后，可以处理成单位长度分子，尔后得到并保持新的病毒培养物。
产生转录随体RNA的能力是由用ROKl/104和ROKl/105转化的植株的后代遗传的。用北方斑渍分析法对这些转化植株F1后代中POlyA+RNA的分析证明了这一点，与以上所述原始转化植株完全一致（参见图4的北方斑渍分析）。
选择具有随体cDNA表达带遗传特性的转化植株的F1后代和ROK1载体的结合DNA，置于每毫升含有1微克卡那霉素的MS溶剂上进行萌芽分析。（1升MS溶剂含有4.6克的Murashige和Skoog盐混合物-实验室编号为26-330-24，0.1克肌醇，0.01克盐酸硫，0.001克烟酸，0.001克盐酸吡哆素，30克蔗糖，7.0克琼脂糖，最后的pH为5.8）。植株带有来自ROKl/105或ROKl/104的抗卡那霉素的基团，在这个选择处理中，与正常叶片一样发绿，只是叶片的发育略有推迟。不带有抗卡那霉素基因的烟草植株，其正常的根或绿叶都未能发育。将抗卡那霉素的秧苗从卡那霉素溶液移到土壤或混合肥料，立即可观察到在抗卡那霉素的秧苗与没有抗卡那霉素活性基因遗传特征的秧苗之间存在着生长差异。在F1后代植株中产生的转录随体与原始转化突变型的随体RNA的生物活性是一样的。通过用随体RNA游离病毒（黄瓜病毒，见下）感染F1后代植株就可说明这一点，这种病毒使F1后代植株的转录随体RNA能够被处理和复制，如同单位长度随体RNA分子一样，在整体感染的叶片中积累水平很高，并且在流经未转化植株时能作为病毒培养物的一部分被感染。这种作用可用所述原始转化植株的方法（参见上述图5b）予以说明。
转录随体RNA作为单位二聚体长度分子被复制，正如上所述，不仅可用黄瓜花叶病毒R76B，而且也可用黄瓜花叶病毒的其他毒株。使用黄瓜花叶病毒KIN或黄瓜花叶病毒株Y感染转化植株及其F1后代即可得到证明。毒株KIN是从Dundee附近Kinnaird的天然植物感染中分离得到的，毒株Y则由日本烟盐公司（Umegaoka，Yokohama    227，Japan）的Takanami博士处作为RNA得到的。与黄瓜花叶病毒有关的一个病毒即番茄无籽病毒（tomato    aspormy    virus，TAV）对于产生转录随体RNA复制也是一种有效的病毒。然而与黄瓜花叶病毒关系较远的花生矮病毒或由黄瓜花叶病毒中分出的一个独立的病毒组即雀麦花叶病毒，这两种病毒都不能产生转录随体RNA的复制。
转化植株中随体RNA的积累，因而能够依顿这类植株改变黄瓜花叶病毒的性质。为了说明这一点，可将黄瓜花叶病毒CMV-R    76B或CMV-KIN接种到原始转化植株或这种植株的F1后代，并且分析受整体感染的叶片中的病毒RNA。在产生转录随佬RNA的植株中，具有病毒基因组RNA的细胞RNA的比例少于受感染的不产生转录随体20%。对此采用的方法包括以上所述的北方斑渍分析法。
另一种方法即转化随体的存在改变了黄瓜花叶病毒的感染可以用黄瓜花叶病毒CMV-KIN和番茄无籽病毒接种的转化植株来说明。在这些例子中，与未转化的植株或不产生转录随体RNA的转化植株相比，产生转录随体RNA的植株中，病毒病的症状大为减轻。这点在图6中予以说明，该图说明的是用ROKl/104和ROKl/105转化的植株以及用番茄无籽病毒感染后约4周时的未转化植株。病毒的作用在整体感染的叶片中非常明显，在这类叶片中由番茄无籽病毒产生的花叶和叶片畸形是由于缺乏产生转录随体RNA的植株。将番茄无籽病毒接种到转化植株或未转化植株并在感染后4周照相。a）未经处理的植株;b）整体感染的叶片。如上所述，104和105是表达随体的转化植株。30K是表示烟草脆裂病毒顺序的转化植株并且控制说明转化本身对症状产生毫无作用。NT是未转化植株。
用番茄无籽病毒减轻症状的这种作用与接种物的强度和至多可在最后一次接种试验后6周的感染长度无关。这种作用在进行试验的所有产生转录随体的植株中都能观察到其高度再现性。
获得随体RNA的黄瓜花叶病毒或番茄无籽病毒培养物，当其流经产生转录随体RNA的植株时也证明它改变了性质。参照上述图5b，将流经多种烟草植株的黄瓜花叶病毒或番茄无籽病毒接种到烟草时，这种作用就显示出来。当接种物流经产生转录随体RNA的植株时，病症明显减轻。
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Claims (18)

1、一种改变植物病毒或其作用的方法，包括将遗传物质引入植株内并用植物病毒感染所述植株，使引入的遗传物质的表达改变植物病毒或其作用。
2、根据权利要求1的方法，其中有待引入的遗传物质通过任意的改变由植物病毒产生，该植物广毒可以是与感染植物的植物病毒相同，也可以不相同。
3、根据权利要求1或2的方法，其中在已引入遗传物质的植株内的表达能够减轻由植物病毒侵染植物引起的症状。
4、根据权利要求1至3的任何一项方法，其中遗传物质是对应于植物病毒随体RNA的cDNA，该cDNA和/或随体RNA可作任意改变。
5、根据权利要求3或4的方法，其中遗传物质来自于病状轻缓的随体RNA。
6、根据权利要求3～5的任何一项方法，其中遗传物质来自于能够处理多体结构的RNA。
7、根据权利要求1～6的任何一项方法，其中遗传物质来自于选自黄瓜病毒，nepo病毒，番茄病毒，sobem病毒，以及与他们有关的其他病毒中的病毒随体RNA。
8、根据权利要求7的方法，其中病毒是黄瓜花叶病毒，烟草环斑病毒或番茄丛矮病毒，芜菁叶丛生病毒，以及与他们有关的任何病毒。
9、根据权利要求1～8的任何一项方法，其中病毒是黄瓜花叶病毒（CMV），用于转化的遗传物质是对应于CMV随体RNA的cDNA。
10、根据权利要求4～9的任何一项方法，其中用可以将DNA转移到受体植株核基因组内的表达载体把cDNA转移到植株内。
11、根据权利要求10的方法，其中表达载体是以根癌土壤杆菌（Agrobacterium  tumeqaciens）的Ti质粒系统为基础的。
12、根据权利要求11的方法，其中表达载体是包括根癌土壤杆菌Ti质粒的T-DNA边缘顺序，转录启动子，对应于植物病毒随体RNA的cDNA，和转录终止区的质粒。
13、根据权利要求11和12的方法，其中待转化的植物细胞受带有表达载体的根癌土壤杆菌株感染的，整个植株可从已转化的感染细胞中再生。
14、将DNA转移到受体植株核基因组的表达载体，其特征在于把要表达的可转移的DNA引入受体植株，能够通过植物病毒解决植物问题，改变所述植物病毒或其作用。
15、根据权利要求14的表达载体，其中可转移的DNA是对应于植物病毒随体RNA的cDNA，该cDNA和/或随体RNA可被任意改变。
16、根据权利要求14或15的表达载体是以根癌土壤杆菌Ti质粒系统为基础的。
17、一种遗传控制植物的方法，包括引入植物DNA的核基因组，其能在植株内表达，并能通过植物病毒解决植物问题，改变所述植物病毒或其作用。
18、用权利要求17的方法，遗传控制植物或其后代。
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