CN101284875B - x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体及其应用。本发明的x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.2456的杂交瘤细胞分泌的。本发明利用所制备的x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体采用间接ELISA方法并结合SPSS软件分析，可以对小麦及其近源种中x型高分子量谷蛋白亚基进行高效、准确的鉴定，通过标准曲线对待测谷蛋白亚基进行定量，可以用于小麦的品质预测。

Description

x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体及其应用。

背景技术

小麦籽粒中的贮藏蛋白是影响小麦加工品质的主要因素。在所有的禾谷类作物中，仅有小麦可以加工成各种各样的烘烤和蒸煮食品，这主要是由于小麦胚乳中的贮藏蛋白可以使面粉做成具有延展性和弹性的面团。小麦的贮藏蛋白分为醇溶蛋白和谷蛋白两种，其中醇溶蛋白主要决定小麦面团的延展性和粘性，而谷蛋白主要决定了面团的弹性。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)的多肽分子研究表明，麦谷蛋白按分子量的大小可以分成两部分：高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS，分子量为90-147kD，占谷蛋白的10％左右)和低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS，分子量为12-60kD，占谷蛋白的90％以上)。研究表明HMW-GS与小麦面包的烘烤品质和面粉的加工品质密切相关，并且不受环境条件的影响，是优质遗传特性的生化标记。普通小麦染色体为六倍体(AABBDD)，从遗传角度讲，高分子量谷蛋白亚基分别被染色体1A、1B和1D长臂上Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点上的基因编码，这些位点分别被命名为Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点。每一位点含有两个基因，一个编码较高分子量的x-型亚基，另一个编码较小分子量的y-型亚基，每一个HMW亚基位点有许多变异(等位亚基)。大量研究表明，同属于x-型亚基的5亚基和2亚基与烘烤品质的相关性并不相同，其中5亚基与烘烤品质呈正相关，而2亚基则呈负相关。

目前，对小麦胚乳贮藏蛋白的研究方法主要有电泳法、色谱法、流变学特性测定法、沉淀值测定法等。相比较而言，这些方法各具优势，但不足之处在于或者效率太低、操作费时；或者需要很多比较昂贵的仪器、难以普及。而且利用上述方法进行分析时，往往需要较大的样品量，这在育种的早代难以达到。随着免疫学技术的发展，抗体检测技术已经成为小麦蛋白和品质分析等领域的重要检测技术之一，越来越多的受到国内外研究者的重视。最近，酶联免疫吸附测定法(ELISA)因其具有成本低、耗费少、所需样品量少以及样品处理简单等优点，已经开始应用于品质预测和筛选。利用这种方法测定小麦品质，关键是要制备适宜的抗体，尤其是单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体。

本发明所提供的x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体是由保藏号为CGMCCNo.2456的杂交瘤细胞所分泌的。

分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞已于2008年04月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.2456。

本发明以斯卑尔脱小麦Somiedo为材料，采用电泳法分离纯化x-型高分子量谷蛋白亚基，并以此为抗原免疫BALB/C小鼠，采用杂交瘤技术制备了x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体。

本发明所提供的x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体还可用于制备试剂盒。含有所述x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明利用所制备的x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体采用间接ELISA方法并结合SPSS软件分析，可以对小麦及其近源种中x-型高分子量谷蛋白亚基进行高效、准确的鉴定，通过标准曲线对待测x型高分子量谷蛋白亚基进行定量，可以用于小麦的品质预测。

附图说明

图1为纯化后抗原的SDS-PAGE结果

图2为单克隆抗体同多个小麦品种的SDS-PAGE及免疫印迹结果

具体实施方式

实施例1、抗原的制备

1、小麦谷蛋白亚基的提取

(1)称取20mg斯卑尔脱小麦Somiedo(中国国家种质资源库)种子，研碎成粉末，加入70％乙醇涡旋30min。

(2)室温12,000rpm离心5min。

(3)弃去上清，在沉淀中加入600μl蛋白提取液(50％体积百分含量的正丙醇，5％体积百分含量的β-巯基乙醇)，50℃水浴1小时，其间摇2-3次。

(4)12,000rpm离心10min，取上清。

(5)加入等体积样品缓冲液(终浓度为0.125M pH6.8的Tris-HCl，8％(质量百分含量)SDS，20％(体积百分含量)甘油，0.002％(质量百分含量)溴酚蓝)，混合均匀，即得到小麦谷蛋白亚基提取液，4℃保存备用。

2、HMW-GS的分离纯化

(1)将步骤1得到的小麦谷蛋白亚基提取液经SDS-PAGE(浓缩胶浓度为3.75％，分离胶浓度为10％，20mA稳流电泳18hr)分离后，用考马斯亮蓝染色。

(2)切下82KDa的目的条带，用蛋白脱色液(含终浓度25mM碳酸氢铵，50％体积百分含量的乙腈)脱色过夜。

(3)将目的条带装入透析袋中，以8-10mA的电流稳流进行水平电泳6-8h。

(4)取出条带凝胶，溶液经聚乙二醇6000浓缩过夜。

(5)蒸馏水透析24小时，其间换透析液3次。

(6)PBS缓冲液透析24小时，其间换透析液3次。

(7)收集透析后的HMW-GS。

紫外分光光度计测定上述收集到的HMW-GS在260nm和280nm的吸光值，利用下述公式计算蛋白质的浓度：蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。

经计算，HMW-GS的浓度为0.321mg/ml，最后获得的HMW-GS的总量为28.9mg。再利用SDS-PAGE，检测纯化效果。

具体检测结果如图1所示。其中，1为纯化后的HMW-GS的SDS-PAGE电泳结果；2为斯卑尔脱小麦Somiedo蛋白提取物的SDS-PAGE电泳结果(图其中箭头所示为纯化的亚基)。结果表明，经纯化的HMW-GS中无其它杂蛋白，蛋白的纯度较高。

实施例2、阳性单克隆杂交瘤细胞系的建立

1、动物免疫

选取8-10周龄的健康雌性BALB/c小鼠，初次免疫时，将100μl实施例1纯化的HMW-GS作为抗原(100μg实施例1纯化的HMW-GS溶解于100μl无菌的PBS溶液中)与等体积的弗式完全佐剂均匀混合后，背部皮下多点注射免疫小鼠。3周后取相同体积、相同浓度的纯化的x-型高分子量谷蛋白亚基与等体积的弗式不完全佐剂混合均匀，免疫方法同上。此后，每隔两周加强免疫一次，共免疫四次。最后一次取50μl抗原原液(浓度为0.321mg/ml)，腹腔注射，加强免疫。

2、检测方法的建立

(1)用0.05mol/L碳酸盐缓冲液将抗原倍比稀释成200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml和12.5μg/ml。

(2)用含1％(质量百分含量)BSA的PBS缓冲液将四免后的小鼠血清按1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，1∶32000，1∶64000，1∶128000的体积比稀释。

(3)间接ELISA检测方法的建立

将稀释好不同浓度的抗原分别加至酶标板中，100μl/孔，4℃过夜，PBST洗3遍，每次3分钟。每孔加入200μl封闭液，37℃温育30-60分钟，洗涤同上。再加入已经稀释好的不同浓度的抗血清，100μl/孔，37℃温育60分钟，洗涤同上。加入HRP标记的羊抗鼠IgG(按推荐浓度稀释)100μl/孔，37℃温育60分钟，洗涤同上。加入新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，室温避光放置10分钟。加入2M H₂SO₄(50μl)，终止反应。测定各孔在450nm处的OD值。实验设三次重复。

3、采用已经建立好的间接ELISA方法测定效价

结果表明，抗原包被浓度为100μg/ml时，所测得的四免后血清效价为1∶8000。

4、细胞融合

(1)骨髓瘤细胞的复苏与培养

于融合前10天左右从液氮罐中取出待复苏的SP2/0细胞，37℃水浴融化后，1000rpm离心10min。用含20％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM培养液将沉淀细胞转移至100ml细胞培养瓶中。将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，24-36小时后改用含10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM培养液扩大培养，并于融合前24-48小时内再次分瓶培养。融合当天，选择处于对数生长期的SP2/0细胞，用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹下，于50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，然后将细胞重悬于10ml DMEM培养液中，计数后备用。

(2)制备饲养细胞

融合前1-2天，将未免疫的BALB/C小鼠，眼球放血处死，浸泡于75％酒精中5分钟。用注射器吸取DMEM培养液5ml注入小鼠腹腔。持消毒小镊子轻胺腹部1-2分钟，在小鼠腹腔内反复抽吸注射器，然后轻轻吸出腹内DMEM液，1000rpm离心10分钟，弃上清，用20ml 1％HAT选择培养基悬浮细胞，混匀后，100μl/孔加入到96孔细胞培养板中。

(3)制备免疫脾细胞

步骤1中，加强免疫后第三天，选取在100μg/ml抗原浓度下，效价为1∶8000的免疫小鼠，摘除眼球放血处死，并分离血清作为抗体阳性对照。将小鼠置75％酒精中浸泡5分钟。打开腹腔，取出小鼠脾脏，放入盛有5-10ml DMEM液的平皿中，轻轻漂洗，并小心剥除脾脏周围的结缔组织。将脾脏移入另一个盛有约10ml DMEM液的平皿中，用无菌注射器吸取10ml DMEM液，一只手用镊子将脾脏固定，另一只手将针头插入脾脏的一端，并用力推注DMEM液，将脾脏内的细胞冲洗出来，反复冲洗数次，直至脾脏颜色变淡白为止。将冲洗下来的脾细胞转移入50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清，然后将细胞重悬至10mlDMEM液中，计数后备用。

(4)细胞融合

将1.0×10⁸个脾细胞和2.0×10⁷个骨髓瘤细胞混合置于一支50ml离心管中，轻轻混匀。1000rpm离心7min，尽量弃去上清。轻弹管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。将1g冷冻的灭菌PEG2000于37℃融解，并加入1ml DMEM培养液，用7％NaHCO₃调pH值至7.5左右。一手均匀转动装有脾细胞和骨髓瘤细胞的离心管，另一只手吸取1ml上述调好的PEG2000溶液，沿转动的离心管壁缓缓加入，然后静置30秒，再加入25ml DMEM液终止PEG2000的作用。将融合细胞于800rpm离心7min，弃上清，加入20ml 1％HAT培养液轻轻吹吸，使沉淀细胞混合均匀。将上述细胞悬液加入到有饲养细胞的96孔板中，每孔100μl，置CO₂培养箱中培养。融合后第4天，用1％HAT选择培养液半量换液，第8天改用1％HT选择培养液半量换液。

5、阳性杂交瘤细胞的筛选

待融合后的细胞生长到覆盖细胞板底部1/4-1/3的面积时，用上述建立好的间接ELISA方法对细胞培养上清进行抗体检测，检测结果为阳性的细胞迅速扩大培养或选择强阳性孔进行克隆，阴性孔两天后再测一次，如仍为阴性则弃去。

6、阳性杂交瘤细胞的克隆

将检测结果为强阳性的细胞吸至1ml含20％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM液中进行细胞计数。用1％HT选择培养液将阳性杂交瘤细胞稀释至50个/ml，然后，再梯度稀释至20个/ml、10个/ml、5个/ml。将稀释好的细胞悬液加到有饲养细胞的96孔细胞培养板中，100μl/孔，每个稀释度加48个孔。每天观察细胞生长情况，第4天开始用1％HT选择培养液进行半量换液，每3天一次，待细胞克隆长至覆盖培养孔面积的1/4-1/3时，取上清液进行抗体检测。选择只有一个克隆的阳性孔再次进行克隆，获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。

该杂交瘤细胞已于2008年04月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.2456。

实施例3、单克隆抗体的制备

1、体外培养法

将已获得的单克隆阳性杂交瘤细胞株CGMCC No.2456在培养瓶中扩大培养，并持续培养直至细胞全部死亡。收集细胞培养上清，1000rpm离心10min，收集上清，即得到单克隆抗体，将得到的单克隆抗体-20℃保存备用。

2、体内诱生腹水法

选取8-10周龄的健康雌性Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0.5ml/只。10-14天后，每只小鼠接种1×10⁶个实施例2制备的杂交瘤细胞。7-10天后，采集腹水，5000rpm离心10min，收集上清，即得到单克隆抗体，将得到的单克隆抗体-20℃保存备用。

实施例4、单克隆抗体的效价检测

将实施例3制备的腹水单抗进行10倍梯度稀释，按上述实施例2步骤2建立的ELISA方法测定其效价，其中，抗原包被浓度为100μg/ml时，该单克隆抗体的效价为1∶8000。

实施例5、单克隆抗体的IgG亚类及轻链种类鉴定

使用美国SouthernBiotech公司的SBA型亚型鉴定试剂盒，对实施例3的单克隆抗体的免疫球蛋白亚型及轻链类型进行鉴定。经鉴定，免疫球蛋白类型为IgM型，轻链类型为κ链。

实施例6、单克隆抗体的特异性鉴定

1、小麦谷蛋白亚基的提取方法同实施例1中步骤1，选取的小麦品种为ChineseSpring、中优9507、晋麦45、PI 294892、Hope、pH82-2-2、Hartog、小偃6号、Somiedo、云麦42、烟农15、临优1583和TRI4610/75(均购自中国国家种质资源库)

2、电泳和电转移

将上述步骤1中得到的各品种小麦的谷蛋白亚基进行SDS-PAGE电泳，具体电泳过程同实施例1中步骤2。电转移用Bio-Rad湿式电转仪。

SDS-PAGE电泳结果如图2中I所示。其中，泳道1为Chinese Spring的SDS-PAGE电泳结果、泳道2为中优9507的SDS-PAGE电泳结果、泳道3为晋麦45的SDS-PAGE电泳结果、泳道4为PI 294892的SDS-PAGE电泳结果、泳道5为Hope的SDS-PAGE电泳结果、泳道6为pH82-2-2的SDS-PAGE电泳结果、泳道7为Hartog的SDS-PAGE电泳结果、泳道8为小偃6号的SDS-PAGE电泳结果、泳道9为斯卑尔脱小麦Somiedo的SDS-PAGE电泳结果、泳道10为云麦42的SDS-PAGE电泳结果、泳道11为烟农15的SDS-PAGE电泳结果、泳道12为临优1583的SDS-PAGE电泳结果、泳道13为TRI4610/75的SDS-PAGE电泳结果。从图2I中可以看出，提取得到的蛋白经SDS-PAGE电泳后明显分为两大部分：上方的条带为高分子量的谷蛋白，下方的条带为低分子量的谷蛋白；其中高分子量谷蛋白也分为两部分，上方为分子量大的x-型亚基，下方为分子量较小的y-型亚基。

电泳结束后，取下凝胶，浸泡于转移缓冲液中30min。将滤纸、NC膜和转印用的支持膜浸泡在转移缓冲液中10分钟。将滤纸、NC膜、凝胶和支持膜按照顺序安装成转印装置，放入转印槽中。4℃，400mA稳流转印9个小时。

3、免疫检测

将上述转印后的NC膜用含5％(质量百分含量)脱脂奶粉的PBS缓冲液封闭液孵育1.5hr。用TBST(10mM Tris HCl(PH7.5)，150mM NaCl)溶液洗膜3次，每次5分钟。用抗体稀释液(5g脱脂奶粉溶于100ml PBS)以1∶2000稀释实施例3制备的效价为1∶8000的腹水单抗，孵育上述NC膜1.5hr。用TBST(10mM TrisHCl(PH7.5)，150mM NaCl)溶液洗膜3次，每次5分钟。把膜转移到含有以1∶1000稀释的二抗反应液(碱性磷酸酶偶联羊抗鼠抗体稀释在终浓度10mM TrisHCl(PH7.5)，150mM NaCl溶液中)中，室温孵育1.5hr。用TBST溶液洗膜3次，每次5分钟。把膜转移到新鲜配制的显色液NBT/BCIP中，显色5分钟。然后用蒸馏水略洗，终止显色。

实验结果如图2中II所示。其中，1为Chinese Spring的western blot检测结果、2为中优9507的western blot检测结果、3为晋麦45的western blot检测结果、4为PI 294892的western blot检测结果、5为Hope的western blot检测结果、6为pH82-2-2的western blot检测结果、7为Hartog的western blot检测结果、8为小偃6号的western blot检测结果、9为斯卑尔脱小麦Somiedo的western blot检测结果、10为云麦42的western blot检测结果、11为烟农15的western blot检测结果、12为临优1583的western blot检测结果、13为TRI4610/75的western blot检测结果。

结果表明，实施例3所制备的腹水单抗与x-型高分子量谷蛋白亚基有强烈的反应，而与其他谷蛋白亚基发应微弱，或没有发应；该抗体对小麦及其近源种中的x-型高分子量谷蛋白亚基有特异的识别性。可利用该抗体鉴定小麦及其近源种中的x-型高分子量谷蛋白亚基。

实施例7、单克隆抗体在小麦亚基鉴定中的应用

1、样品和提取方法

选取T130、T87(中国国家种质资源库)等分别含有2亚基和5亚基的小麦近缘属粗山羊草(Aegilops tauschii，DD，2n＝2x＝14)品种，称取样品15mg，于2mlEppendorf管中，加入500μl 70％乙醇，涡旋30min，10000rpm离心10min；弃上清，沉淀分别加入蛋白提取液(10mM HCl，40mMDTT)300μl，65℃，作用30min；10000rpm离心10min，取上清，用紫外分光光度计法测蛋白含量。

2、ELISA分析

用0.05mol/L的碳酸钠缓冲液将上述蛋白稀释到200μg/ml，100μl/孔，加至酶标板中，4℃过夜，PBST洗3次，每次3分钟。每孔加入200μl封闭液，37℃温育1.5hr，洗涤同上。加入经1∶8000倍稀释的实施例3制备的效价为1∶8000的腹水单抗，100μl/孔，37℃温育60分钟，洗涤同上。加入HRP羊抗鼠IgG(按推荐浓度稀释)100μl/孔，37℃温育60分钟，洗涤同上。加入新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，室温避光放置10分钟。加入2M H₂SO₄(50μl)，终止反应。测定各孔450nm的OD值。结果如表1所示。

                  表1ELISA测定结果

3、数据分析

用SPSS软件进行相关性及差异显著性分析，分析结果见表2和表3。

                    表2分组统计量表

                  表3成组资料t检验结果

A：假设方差相等；B：假设方差不等

经分析比较，因为t＞t_0.05(双侧)，即P＜0.05，两组ELISA吸收值具有显著性差异。因此，应用上述小麦谷蛋白提取方法及ELISA检测方法，所制备的单克隆抗体可以用于鉴定小麦近缘种粗山羊草中含有5亚基或2亚基的材料，当OD₄₅₀＞6.50时可以认定所检测材料中含有2亚基，而当OD₄₅₀＜6.50时可以认定所检测材料中含有5亚基。为小麦品质改良与遗传育种提供更好、更便捷的检测方法，有较强的实际应用意义。

Claims (5)

1.一种x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.2456的杂交瘤细胞所分泌的。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在鉴定小麦及其近缘种的x-型高分子量谷蛋白亚基中的应用。

3.含有权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。

4.权利要求3所述的试剂盒在鉴定小麦及其近缘种的x-型高分子量谷蛋白亚基中的应用。

5.分泌权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCCNo.2456。

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