CN1443848A - 一种改良小麦烘烤品质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的名称为一种改良小麦烘烤品质的方法。本发明的目的是提供一种利用基因工程手段改良小麦烘烤品质的方法。本发明的技术方案是：一种改良小麦烘烤品质的方法，是将面包小麦的高分子量谷蛋白亚基5与10的基因Dx5和Dy10导入栽培小麦中。与所述Dx5和Dy10基因一同导入栽培小麦中的还有编码抗除草剂PPT与Bialaphos的bar基因。用本发明的方法将HMW－GS优质亚基基因导入并整合到小麦基因组，改良小麦的烘烤品质，目标单一，无不利基因的连锁问题，无种属的限制，已经获得的转基因植株蛋白质含量明显提高，面粉烘烤品质性状和质量得到了较大改善。
Description
技术领域
本发明涉及一种改良小麦品质的方法，特别是涉及一种改良小麦烘烤品质的方法。
背景技术
小麦作为全球最重要的粮食作物之一，产品的市场潜力十分广阔，伴随人民生活水平的提高，对于多种用途优质面粉与特粉的需求与日俱增。小麦品质性状的改良包括磨粉品质、食品加工品质和营养品质三个方面。磨粉品质主要与籽粒硬度、筛理特性和出粉率相关；食品加工品质的改良以面包烘烤为主；营养品质的改良以提高小麦面粉中的赖氨酸、苏氨酸等限制性必需氨基酸的含量为主。利用常规的育种手段在一定程度上可以实现对小麦品质性状的改良，但由于其明显的局限性而远远不能适应和满足现代育种的要求。
小麦面粉由胚乳加工而成，胚乳主要由淀粉粒和种子贮藏蛋白组成。种子贮藏蛋白是决定面粉品质的主要因素，根据其在不同溶剂的溶解度与在离解剂中分子大小主要分为醇溶蛋白(Gliadin)和麦谷蛋白(Glutenin)两类。另外，还有麦清蛋白(Albumin)及麦球蛋白(Globulin)等，但含量较少。
醇溶蛋白约占总面筋蛋白的60％左右，分子量较小，为分子内二硫键形成的单链蛋白单体，它决定面团的延展性(extensibility)。醇溶蛋白的氨基酸组成极不平衡，它含有约一半的脯氨酸和谷氨酰胺，却只有很少量的赖氨酸和色氨酸，从而导致谷物的赖氨酸和色氨酸含量偏低。醇溶蛋白又可分为三类：高分子量(HMW)醇溶蛋白、贫硫醇溶蛋白和富硫醇溶蛋白。根据氨基酸组成不同，可分为α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白。α-、β-、γ-醇溶蛋白，含有2-3％的含硫氨基酸，即为富硫醇溶蛋白；ω-醇溶蛋白含硫极少即为贫硫醇溶蛋白。编码醇溶蛋白的基因分别位于第一部分同源群(1A、1B、1C)染色体的短臂上，定名为Gli-1位点，编码γ-和ω-醇溶蛋白的基因分别位于第六部分同源群(6A、6B、6C)染色体的短臂上，定名为Gli-2位点，编码α-、β醇溶蛋白。
麦谷蛋白约占总面筋蛋白的40％，分子量较大，从数十万到数百万KD，由多肽链通过分子间二硫键和非共价键等分子间作用力连接形成异质聚合体，它决定面团的弹性(elasticity)。麦谷蛋白经SDS处理后，可分成两类亚基：分子量为60-150KD的高分子量谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)和分子量为30-51KD的低分子量谷蛋白亚基(low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS)。编码LMW-GS的基因位于第一部分同源群(1A、1B、1C)染色体的短臂上，与编码醇溶蛋白的Gli-1位点紧密连锁，分别定名为：Glu-A3、Glu-B3、Glu-D3。特定的LMW-GS与特定的醇溶蛋白之间紧密连锁。编码HMW-GS的基因位于1A，1B和1D染色体长臂着丝点远端，分别用Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1表示在1A、1B和1D上的三个位点。其中，亚基1的基因在1A上；亚基2-5，10和12的基因在1D上；亚基6-9的基因在1B上。每个基因位点由2个紧密连锁的基因组成，分别编码蛋白质分子量较高的x型亚基和分子量较低的y型亚基(Payne，PI，et al，Correlation between theinheritance of certain high molecular weight subunits of glutenin and bread making in progenies ofsix crosses of bread wheat.J.Sci.Food Agric.32：51-60，1981。Payne，PI，et al，Structural andgenetical studies on the high molecular weight subunits of wheat glutenin.Theor.Appl.Genet.63：129-138，1982)。据此推论，六倍体普通小麦品种应有6个不同的HMW-GS组成，但实际上一般小麦品种中仅有3-5个亚基。主要是由于在特定位点上的基因不表达或处于沉默状态，不编码y型亚基，如Glu-A1只编码x型亚基，而Glu-B1位点有时编码y型亚基的基因也不表达。这些HMW-GS基因之间存在着高度的同源性。它们的共同特点为：①无内含子结构；②5’和3’端序列具很强的保守性；③5’和3’之间的结构基因区的重复序列占66％-81％。
研究表明，HMW-GS在F1代表现为共显性遗传，但各亚基的量具有剂量效应，呈倾母现象。这与谷类作物的胚乳性状是由双受精产生的三倍体(3n)直接相关，来自父母本的基因分别占1/3和2/3。HMW-GS开花后10天开始在小麦籽粒中形成，开花后15天可由电泳检测到。
研究表明，HMW-GS蛋白质分子的大部分几乎都有PGQGQQ六肽和GYYPTSP(L)QQ九肽为重复单元组成的大段重复序列，这些肽段在空间的走向形成β转角(β-turn)，有规则的β-转角是HMW谷蛋白产生适宜弹性所必需的。HMW-GS在蛋白质分子的N端和C端具有非重复的氨基酸序列，而中间的大部分是上述六肽和九肽重复单位。N端和C端含有Cys残基，从而形成分子间二硫键，产生高分子量的线形聚合物，这些聚合物使得面团具有良好的弹性。即面团的弹性主要来自HMW-GS的六肽和九肽重复单位所形成的β-转角和分子间的二硫键。
Payne等发现单个HMW-GS亚基1与面包烘烤品质呈高度相关，并提出HMW-GS等位基因之间的影响具有加性效应(Payne，PI，et al，Genetic of wheat storage proteins and theeffect of allelic variation on bread making quality.Ann.Rev.Plant Physiol.38：141-153，1987.)。随后又发现1D染色体编码的Dx5和Dy10亚基与面包烘烤品质呈显著正相关，在HMW-GS中Glu-D1位点控制的亚基对烘烤品质影响最大；Glu-B1位点编码的亚基影响最小；Glu-A1位点(Ax1)控制的亚基(亚基1)的影响介于二者之间(Payne，PI，et al，Correlationbetween the inheritance of certain high molecular weight subunits of glutenin and bread making inprogenies of six crosses of bread wheat.J.Sci.Food Agric.32：51-60，1981.)。Pogna等(Pogna，N，et al，Evidence for a direct caual effect of low molecur weight subunits og glutenin on glutenviscoelaticity in durum wheat.JCereal Sci.7：211-214，1988)研究认为优质基因Dx5+Dy10中的Dy10亚基是决定优质面包烘烤特性的亚基。而Rogers等(Rogers，WJ，et al，Effectionbread making quality of x-type and y-type high molecular weight subunits of glutenin.J.Cereal Sci.14：209-221，1991)则认为Dx5亚基和Dy10亚基一样，在面包烘烤品质中具有同样重要的作用，但同样证明Glu-D1位点对品质的影响较Glu-B1大。众多的研究表明，一般小麦品种含3-5个亚基，不同的亚基构成方式直接关系到烘烤品质质量。HMW-GS 1Dx5和1Dy10基因与面包烘烤品质呈显著的正相关，具有Dx5+Dy10的品种明显优于具有其等位变异型亚基Dx2+Dy12或Dx3+Dy12的品种(Shewry，PR，etal High molecular weightsubunits of wheat glutenin.JCereal Sci.15：105-120，1992。赵和等，小麦高分子量麦谷蛋白亚基的研究动态。国外农学——麦类作物，4：43-45，1993)。
我国小麦面粉的烘烤品质普遍较差，其主要原因是面筋含量低，面筋质量差。从国外引进的面包小麦虽然面筋质量优良，但由于地域差异，不仅产量低，而且病害严重。
目前，常规的杂交育种方法仍是最为有效的获得新品种的方法。近代发展起来的其它育种方法如远缘杂交育种、辐射育种，单倍体育种等等在小麦的种质与品种改良中起了一定的推动作用。但这些方法由于自身的局限性，因而作用范围十分有限。
利用远缘杂交方法可能开发和利用来自小麦近源野生种属中的优良野生基因，通过染色体的附加，削减和代换以及进一步的染色体易位从而大大丰富小麦的种质与基因库。但由于远缘杂交的不亲和性，种子无生命力不育，后代性状分离大、时间长、极不易稳定等致命弱点，即使成功易位，由于易位染色体片段长度大小无法控制，在通过染色体工程方法转移获得优良目的性状与基因的同时，也会将许多不良的野生基因与性状带给小麦，很难在生产上直接推广利用。
随着分子生物学的飞速发展以及基因克隆技术和重组DNA技术的建立与渐趋完善，利用植物基因工程方法和以多种分子标记方法为主体的分子标记辅助选择育种为手段，直接在分子水平开展植物的品种改良已逐步成为现实和可能，称为“分子育种”，它是以微观水平的核酸、蛋白质、酶、乃至单个基因等的差异作为“性状”来考察研究与改良。与“传统育种”方法相比，“分子育种”来得更为直接、准确、可靠，展示在育种家面前的是植物种质或育种后代材料更深层次分子水平性状的差异。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用基因工程手段改良小麦烘烤品质的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种改良小麦烘烤品质的方法，是将面包小麦的高分子量谷蛋白亚基5与10的基因Dx5和Dy10导入栽培小麦中。
与所述Dx5和Dy10基因一同导入栽培小麦中的还有编码抗除草剂PPT与Bialaphos的bar基因。
除草剂草丁膦(又称为膦化麦黄酮，商品名，Basta，主要成分为PPT)是一种非选择性灭生除草剂，为谷氨酰胺类似物，它可有效阻断与抑制植物谷氨酰氨合成酶(GS)的作用，从而造成NH4 +的大量积累，使植物细胞氨中毒死亡。Bialaphos是含PPT的三肽(2个丙氨酸残基和1个PPT残基)，它的作用与PPT类似，但更为有效，用量可大大降低。从潮湿链霉菌分离出来的bar基因所编码的PPT乙酰转移酶(PAT)，可以乙酰辅酶A为辅助因子，使PPT和Bialaphos乙酰化而失去抑制GS活性的作用。
本发明以bar基因为选择基因，将其导入小麦可使小麦具有PPT抗性而免受伤害。
上述的bar基因可以以包括其内含子的玉米Ubi1启动子来驱动bar基因的表达，也可以以包括其内含子的水稻Actin启动子来驱动bar基因的表达。
所述导入基因Dx5和Dy10的外植体为栽培小麦的幼胚、幼穗、花药或胚性愈伤组织。
在导入Dx5和Dy10时以编码葡萄糖苷酸酶的GUS基因为报告基因。
被导入的Dx5和Dy10优选取自面包小麦Cheyenne。
导入Dx5和Dy10的栽培小麦优选为京花1号、京冬6号、京411、丰抗8号、京单2097或京单1744。
基因Dx5和Dy10在Genbank中的登记号分别为X12928，X12929。
植物基因工程技术与方法的发展为小麦面包烘烤品质性状的改良提供了其它方法所无法比拟的全新途径，通过基因工程方法将来自面包小麦与近缘野生种的优质HMW-GS导入小麦优良品种，在不影响小麦产量和抗病性的前题下，可使小麦品种性状大大改善，具有巨大的经济效益和社会效益。
用本发明的方法将HMW-GS优质亚基基因导入并整合到小麦基因组，改良小麦的烘烤品质，目标单一，无不利基因的连锁问题，无种属的限制，已经获得的转基因植株蛋白质含量明显提高，面粉烘烤品质性状和质量得到了较大改善。用于导入的目的基因可来自任何生物种，同时可利用当前农业生产中推广的优良品种为受体，转基因植物能够直接在生产上利用。
下面结合附图对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为PCR扩增的1Dx5和1Dy10。
图2为蓝白斑筛选图谱。
图3为重组质粒构建与pBPC24示意图。
图4为HMW-GS Dx5和Dy10基因表达载体重组质粒pBPC30。
图5为HMW-GS Dx5和Dy10基因表达载体重组质粒pBPC31。
图6显示基因枪转化小麦幼穗的筛选与抗性愈伤组织的分化。
图7显示自小麦幼穗筛选分化获得的转基因小麦植株。
图8为基因枪转化小麦花药GUS基因的瞬时表达结果。
图9为转基因植株bar基因PCR鉴定结果。
图10为bar基因的Southern杂交分析。
图11为HMW-GS基因的Southern杂交分析。
图12为转基因小麦植株的点杂交分析结果。
图13 SDS-PAGE分析HMW-GS亚基基因的表达。
图14为转基因株系面粉的粉质图。
具体实施方式
在下面实施例中所要用到的材料为：
1、品种：京花1号，京411，丰抗8号，京冬6号，京单2097，京单1744，中优6号，中优9507，Cheyenne。
2、外植体：幼穗(二棱末期—小花原基分化)；花药(单核靠边期)；幼胚(开花后12-15天)；胚性愈伤组织。
3、质粒：pSP72(Promega)；pBluescript(Stratagene)；pAHC25；pBARGUS。
4、大肠杆菌菌株：DH5α；JM109(Promega)。
5、试剂：酶类(国产，华美公司；进口，Promega，BM，Biolabs)；地高辛标记与检测试剂盒(BM)；地高辛化学发光检测试剂盒(BM)。
6、基因枪：JQ700火药基因枪；高压放电基因枪；PDS-1000/He(BioRad)。
7、培养基：
A.幼穗接种培养基：MS基本培养基，加2，4-D 2mg/L，NAA 0.5mg/L，KT 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L；pH5.8。
B.花药接种培养基：W14培养基，加2，4-D 2mg/L，NAA 0.5mg/L，KT 0.5mg/L，蔗糖100g/L，琼脂粉7g/L；pH5.5。
C.幼胚接种培养基：MS基本培养基，加2，4-D 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L；pH5.8。
D.筛选继代培养基：据不同接种外植体和过程，在上述培养基中添加Basta2-25mg/L或Bialaphos 0.5-8mg/L。
E.分化筛选培养基I：MS基本培养基，添加玉米素10mg/L，IAA 1mg/L，Basta0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L；pH5.8。
F.分化筛选培养基II：MS基本培养基，添加玉米素1mg/L，IAA 1mg/L，Basta0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L；pH5.8。
G.壮苗培养基：MS培养基，加IAA 10mg/L，蔗糖80g/L，琼脂粉7g/L；pH5.8。
8、GUS基因表达的检测：
标记基因GUS(编码葡萄糖苷酸酶)用作报告基因，通过其瞬时表达结果推测转化体系的效率。起作用底物为X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖苷酸)。GUS基因检测染色溶液组成成分为：0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)，10mMEDTA-Na2，5mM K3[Fe(CN)6]，5mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，0.1％Triton X-100，0.1％(W/V) X-Gluc，过滤灭菌，-20℃保存。将转化后3-7天的材料进行GUS染色以检测瞬时表达效率，或将转基因植株叶片进行GUS染色以检测其是否稳定表达。染色方法是，将材料置于GUS检测染色液中，37℃黑暗下24小时，然后用70％乙醇或FAA固定液脱色。
实施例1、HMW-GS亚基基因的克隆与质粒载体的构建
1、克隆基因引物的设计
根据HMW-GS基因序列设计1Dx5基因上游引物为：5’CTA
CTCGAGA TGCTTAGAAGCTTTGAG3’(27bp)；下游引物为：5’CAT
GAGCTCA TTATTACTGG GCTTTAC3’(27bp)。1Dy10基因上游引物为：5’TCC
TCTAGAC GACATGCTTA GAAGCTTTTA G3’(31bp)；下游引物为： 5’CTT
GAGCTCT ATTATTGGGT TTTACTCTAG3’(30bp)。
2、PCR反应与克隆
以面包小麦品种Cheyenne的总DNA为模板，分别用1Dx5和1Dy10基因的引物进行PCR反应克隆目的基因的启动子和编码区域，反应体系50ul：10xbuffer 5ul；2mMdNPT 5ul；25mMMgCl2 4ul；50uM上下游引物各1ul；模板DNA(1ug/ul)1ul；Taq DNA聚合酶2.5U；加ddH2O补至50ul。PCR反应条件为：95℃5分钟，95℃1分钟，55℃30秒，72℃3分钟，35个循环。PCR产物上样电泳(0.8％琼脂糖)，分别回收1Dx5 3.1kb和1Dy10 2.5kb的目的片段条带，如图1所示，带A，B为1Dx5基因，带C为1Dy10基因，带M为Gibco公司1kb DNA marker。用Promega DNA纯化试剂盒(A7280)纯化并溶于50ul ddH2O。
纯化的目的片段由于Taq酶特性而带有3’dA，可直接插入pGEM-T载体，筛选白斑(如图2所示)获得的克隆经酶切分析鉴定，并进行逐步分段测序，获得序列正确无误目的基因的克隆，分别定名为pT1Dx和pT1Dy。
3、表达载体的克隆与构建
质粒提取，纯化，酶切，琼脂糖电泳，转化，感受态细胞制备，基因连接与筛选等方法参见《分子克隆》(Maniatis等，1989)。
农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS 3`末端终止子(0.26kb)序列由pBI221用SacI和EcoRI双酶切回收，插入pSP72(Promega)的SacI和EcoRI位点，用蓝白斑筛选法获得质粒pBPC18(2.7kb)(如图2所示)。HMW-GS 1Dx5基因从pT1Dx用XhoI和SacI双酶切分离回收，插入质粒pBPC18(S)的XhoI和SacI位点，获得质粒pBPC21(5.8kb)；HMW-GS基因1Dy10从质粒pT1Dy用XbaI和SacI双酶切插入pBPC18的XbaI和SacI位点，获得质粒pBPC22(5.3kb)。1Dx5-NOS片段(3.3kb)从pBPC21用XhoI/EcoRI切下插入pBlueKS(Stratagene)的XhoI/EcoRI位点，获得重组质粒pBPC23(6.3kb)。质粒pBPC22用XbaI/EcoRI酶切回收2.7kb片段，插入pBPC23的XbaI/EcoRI位点，即获得编码HMW谷蛋白亚基5和10的重组质粒pBPC24(9.0kb)(如图3所示)。
以编码抗除草剂PPT与Bialaphos的bar基因为标志基因，质粒pBARGUS用HindIII酶切，Klenow酶补平2bp(dG，dA)，回收2.0kb片段，该片段含CaMV35S启动子+玉米Adh1内含子(0.55kb)+bar基因+NOS3`终止子(0.26kb)，插入pBPC24经XbaI酶切并补平2bp(dC，dT)的位点，获得正向、反向插入的重组质粒pBPC30f(11kb)和pBPC30r(如图4所示)。
组成型表达启动子玉米Ubi1(Christensen，A.H.，et al，Plant Molec.Biol.18：675-689，1992)和内含子片段(2.0kb)从pAHC25分离，并构建分离回收得到2.86kb片段，含Ubi启动子+bar基因+NOS3`终止子序列，插入pBPC24获得重组质粒pBPC31(如图5所示)。
同时选择玉米Ubi1启动子与内含子(pBPC30)和CaMV35S启动子与Adh1内含子(pBPC31)来驱动编码除草剂PPT抗性的bar基因，将有助于提高bar基因在小麦中的表达，提高转化选择效果。
玉米Ubi1启动子水稻Actin启动子CaMV 35S启动子
实施例2、基因枪转化不同的外植体及植株再生
1、微粒子弹的准备
称取60mg金粉(BioRad，1μm直径)或钨粉(M10)于1.5ml离心管中，加1ml70％乙醇，用旋涡混合器或超声波充分震荡混合，10000rpm离心5分钟，去上清，用无菌重蒸水重复洗3次，加入1ml50％的无菌甘油，并用涡旋混匀。取50μl上述制备的金粉或钨粉颗粒至一无菌离心管中，顺序加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 2.5MCaCl2和50μl 0.1M亚精胺(现配)；将混合物涡旋10分钟，10000rpm离心5分钟，去上清液。用70％乙醇和100％乙醇各洗沉淀1次，最后用48μl100％乙醇重新悬浮颗粒并用超声波粉碎仪处理5秒，分散颗粒。
2、转化幼穗
第一年度，先将京花1号与京411两个品种的幼穗接种于诱导培养基上，经过一个月，形成愈伤组织，挑选愈伤组织进行转化，在含2mg/L Bialaphos的筛选培养基上进行5次继代抗性筛选(20天继代1次)和分化。结果从品种京花1号转化的254块愈伤组织中，有2块愈伤组织经胚胎发生途径而分化，最终获得了14棵转基因植株，其中11棵转基因植株已种植到T5代。品种京411转化后经过抗性筛选，未得到分化的抗性再生植株(见表1)。
第二年度，转化了京花1号、京411和2097三个品种的幼穗，质粒为pBPC30；经过除草剂抗性筛选和抗性愈伤组织分化(Bialaphos，2-5mg/L)，分别获得了26、1和5棵抗性植株如表2及图6、图7所示，频率分别为2.8％，0.16％，0.68％(株/丛)。
表1：基因枪转化小麦幼穗愈伤组织的结果
| 品 种 | 转化愈伤数 | 褐化死亡 | 分化根 | 分化绿点 | 分化胚状体数 |
| 京花1号 | 254 | 195 | 8 | 19 | 2 |
| 京411 | 178 | 121 | 1 | 19 | 0 |
| 合计 | 432 | 316 | 9 | 38 | 2 |
表2：基因枪转化小麦幼穗的结果
| 品种 | 接种丛数 | 形成愈伤数 | 分化根数 | 绿色株数 | 比率(株数/丛 |
| 京花1号 | 920 | 568 | 100 | 26 | 2.80％ |
| 京411 | 610 | 92 | 21 | 1 | 0.16％ |
| 京2097 | 730 | 168 | 64 | 5 | 0.68％ |
| 合计 | 2260 | 829 | 185 | 32 | 1.42％ |
从实验结果可看出，不同基因型之间，转化效率有较大的区别。要提高小麦幼穗的转化频率，需要选择较易转化的品种。
3、转化小麦花药
由于花粉母细胞为单细胞，转化体存在嵌合性的可能性小，因而，具有其它组织不可比拟的优越性。实验选用京花1号和京411两个品种，取单核靠边期的花药接种3天后进行转化，质粒为pAHC25和pPBC30。诱导培养基中附加Bialaphos 2mg/L；分化培养基中附加Bialaphos 0.5mg/L。用pAHC25质粒转化的花药，7天后用X-gluc检测，瞬时表达极强(如图8所示)。用质粒p5B10A/35I转化后在30-32℃进行诱导筛选培养1个月，然后在26-28℃下培养，分化在25℃下进行，最终从京花1号获得了白苗和绿苗各1株(如表3所示)。从研究结果可以看出，不同基因型之间的花药培养再生频率差异相当大，是以花药作为转化受体的弱点。
表3：基因枪转化小麦花药的结果
| 品种 | 接种花药数 | 形成愈伤数 | 分化根数 | 白苗数 | 绿苗数 |
| 京花1号 | 1200 | 8 | 3 | 1 | 1 |
| 京411 | 1535 | 2 | 0 | 0 | 0 |
4、转化小麦幼胚
用质粒pBPC30和pBPC31转化京花1号、京411、丰抗8号、京1744、京冬6号和京411等5个品种的幼胚共6780个，经过筛选和分化，共获得了334株转基因植株，占总接种数的4.9％(如表4所示)。从表4中可以看出：不同品种幼胚的愈伤形成率和绿苗分化率差异均很大，变化幅度分别为0.2％-80.4％和0％-12.8％。其中丰抗8号最差，接种860个幼胚，仅形成2块愈伤组织，没有根与绿苗的分化；京1744次之，接种850个幼胚，形成192块愈伤组织，诱导率为22.4％，不过最终仅分化出1棵抗性绿苗。京411和京冬6号的愈伤形成率与抗性绿苗分化率均较高，分别为80.4％、34.7％与12.8％、11.9％。
表4：基因枪转化小麦幼胚的筛选与愈伤组织的分化
| 品种 | 接种幼胚数 | 形成愈伤数(％) | 分化根数 | 绿苗数 | 分化绿苗％ |
| 京花1号 | 1980 | 1490(75.3) | 199 | 90 | 6 |
| 京1744 | 850 | 92(22.6) | 3 | 2 | 1 |
| 丰抗8号 | 860 | 2(0.2) | 0 | 0 | 0 |
| 京冬6号 | 1240 | 430(34.7) | 14 | 51 | 11.9 |
| 京411 | 1850 | 1487(80.4) | 75 | 191 | 12.8 |
| 合计 | 6780 | 3603(53.1) | 271 | 334 | 9.3 |
实施例3、转基因小麦植株的PCR鉴定
根据目的基因DNA序列设计如下引物：
1、1Dx5基因的上游引物Dx55：5’GCC TAG CAA CCT TCA CAA TC3’；下游引物Dx53：5’GAA ACC TGC TGC GGA CAA GT3’；阳性转基因植株可扩增出452bp片段。
2、1Dy10基因的上游引物Dy105：5’GTT GGC CGG TCG GCT GCC ATG3’；下游引物Dy103：5’TGG AGA AGT TGG ATA GTA CC3’；阳性转基因植株可克隆出567bp和1348bp两条带。
3、bar基因上游引物：5’CCATCGTCAA CCACTACATC GAG3’(23bp)；下游引物：5’CTGAAGTCCA GCTGCCAGAA AC3’(22bp)；阳性植株可克隆出440bp片段。
采用bar基因，1Dx5和1Dy10基因进行PCR反应，如图9所示，最终从587棵转基因植株鉴定出328株为阳性，阳性率为55％，图中M：1kb plus DNA marker；P：pBPC30质粒DNA；N：非转化阴性CK；1-9：转基因植株。
实施例4、转基因植物的Southern杂交鉴定分析
1、bar基因为探针的鉴定分析
10μg植物DNA用BamHI和HindIII酶切消化，以λDNA/HindIII/EcoRI为标样；未转化的正常株(京花1号，京411)为阴性对照；质粒pBPC30被HindIII酶切的样品为阳性对照，用地高辛DIG标记的bar基因作探针，用1％Agarose胶电泳(EB 0.5μg/ml，电压1V/cm)；将胶置于0.25N HCl中脱嘌呤15分钟，重蒸水洗2次；立即用785型真空吸印仪(BioRad)转印到尼龙膜上，转移液为0.5N NaOH，0.6N NaCl，真空吸压5英寸Hg柱，转印90分钟。2xSSC洗膜5分钟，80℃真空烤膜2小时。如图
预杂交液为：5xSSC；2％封闭剂；0.02％SDS；0.1％(W/V)肌酸钠；50％甲酰胺；100μg/ml经变性与超声波打断的鲱鱼精DNA，杂交温度42℃。预杂交1-2小时，杂交液的探针浓度20-200ng/ml，杂交时间6-24小时。信号检测用化学发光试剂盒(DIG-抗体，CSPD，BM)方法，X光片曝光。
结果如图10所示，其中带1：pBPC30；带2：京花1号CK；带3-7：转基因植株。
2、HMW-GS Dx5基因片段为探针的鉴定分析
转基因植株与CK的总DNA经XbaI/EcoRI酶切后进行电泳，并以DIG标记的λDNA/HindIII/EcoRI为标样；未转化的正常株(京花1号，京411)为阴性对照；质粒pBPC30经XbaI/EcoRI酶切的样品为阳性对照。用地高辛DIG标记的HMW谷蛋白亚基5基因为探针，进行电泳，结果如图11所示，其中带1为阳性的DNA分子标记λDNA/HindIII/EcoRI，较为清晰；带2为质粒pBPC30经XbaI/EcoRI酶切的样品，为阳性对照；带3为京花1号非转化的阴性CK，仅有紧相邻的2条带，片段大小为3.5Kb左右，这2条带推断为内源HMW-GS亚基基因的条带。用于检测的17棵转基因植株(带4-带20)中14棵有4条带，两两紧密相连，在3.5Kb左右的两条带应为HMW-GS内源亚基，分布在4.5Kb和5.0Kb左右的两条带应为导入的新亚基。转基因植株中额外多出的2条带，可确定是1Dx5和1Dy10亚基基因插入的结果。表明外源HMW-GS亚基5和10已整合到了基因组上。
实施例5、转基因植物的点杂交鉴定分析
将用质粒pAHC25转化幼穗、幼胚获得的16株转基因植株与用质粒pBPC30转化得到的21株转基因植株分别提取总DNA。取植物DNA5μl(5μg)，加5μl 0.4N NaOH，10μl20xSSC，混匀变性5分钟，点样于尼龙膜上，80℃烤膜2小时。用地高辛(DIG，BM)标记0.5kb的bar基因作为探针进行点杂交，杂交结果如图12所示，其中A1：pBSK质粒(1ug)；D6-D10：pBPC30 100pg-0.1pg；A2-A7：京411(A2为CK，A3-A7为转基因植株，各5ug)；A8-D5：京花1号(A8为CK，A9-D5为转基因植株，各5ug)点杂交结果表明，对照植株为阴性，转基因植株之中阳性率达75％。
实施例6、SDS-PAGE电泳鉴定HMW-GS基因的表达
1、小麦种子蛋白的提取
样品提取缓冲液成分，66mM Tris，pH6.8，3％(W/V)SDS，3％(V/V)甘油，0.05％(W/V)溴酚兰，2％(V/V)β巯基乙醇。取2粒种子压磨碎后，加0.8ml样品提取缓冲液，充分震荡混匀。室温静置1小时，100℃水浴中提取5-10分钟(或在70℃下保温5-8小时)。样品以5000rpm离心2分钟，将上清液吸取至另一1.5ml离心管，供点样用。
2、SDS-PAGE蛋白电泳
配制丙烯酰胺浓度为10％的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶，
1)分离胶缓冲母液(4x)：pH8.8，1.5mol/L Tris-HCl，0.4％SDS。
2)浓缩胶缓冲母液(4x)：pH6.8，0.5mol/L Tris-HCl，0.4％SDS。
3)SDS-PAGE电极缓冲液：pH8.3，192mmol/L甘氨酸，25mmol/LTris，0.1％SDS。
4)染色液：45％甲醇，10％乙酸，0.25％考马斯亮蓝R-250。
5)脱色液：20％甲醇，6％乙酸。
6)10％分离胶：4.0ml分离胶缓冲母液，5.3ml Arc/Bis(29.2：0.8)，6.7ml H2O，0.1ml 10％过硫酸氨，0.008ml TEMED。
7)5.4％浓缩胶：1.25ml浓缩胶缓冲母液，0.9ml Arc/Bis(29.2：0.8)，3.0ml H2O，0.015ml 10％过硫酸氨，0.005ml TEMED。
用美国BioRad公司产的ProteanIIxi型16cm长电泳槽，制0.75cm厚胶，上点样40ul，先用100V预电泳0.5小时，再用20V电压电泳24-36小时。取出凝胶用5％三氯乙酸固定30分钟，考马斯亮蓝染色0.5-2小时，脱色处理5-12小时。
对60个用本发明方法得到的T2代单株的种子蛋白进行了分析。结果如图13所示，8株种子蛋白中有1Dy10基因的表达，4个株系同时有1Dy10和1Dx5亚基基因的表达，图中，M：蛋白质分子量标准；1：面包小麦Cheyenne；2：中国春；3：京冬TG4-13；4：京花TG3-74；5：京花TG1-35；6：京花1号；7：加麦。
实施例7、转基因小麦后代种子品质性状分析
用Brabender型Experimental Mill Quadrumat Junior磨磨碎20g转基因小麦植株和对照植株的种子，磨出面粉，再过100目筛，筛动90秒，速度200转/分。称取面粉重，并计算出粉率：出粉率％＝面粉重/籽粒重×100；同时，用蛋白质分析仪测定籽粒总蛋白含量与面粉蛋白含量。采用Zeleny微量法测定面粉的沉降值(Sedimentation Value)。
对102个用本发明方法得到的转基因后代株系小麦种子蛋白品质性状进行分析，结果如表5所示
表5：部分转基因小麦T4代种子品质分析结果
| 株系品种 | 籽粒总蛋白％ | 面粉蛋白％ | 出粉率％ | 5分钟沉降值 | 20分钟沉值 |
| Cheyenne | 14.0 | 12.3 | 54.7 | 48.0 | 31.4 |
| 京花1号 | 11.6 | 9.7 | 54.7 | 26.9 | 22.4 |
| 京花TG1-46b | 15.1 | 14.4 | 41.4 | 46.1 | 33.6 |
| 京花TG3-74 | 14.5 | 12.9 | 43.9 | 44.2 | 32.0 |
| 25个京花转化系平均 | 12.9 | 11.0 | 47.7 | 29.2 | 23.4 |
| 京冬6号 | 13.6 | 12.1 | 57.4 | 30.7 | 23.4 |
| 京冬TG5-23 | 14.8 | 14.1 | 52.8 | 49.0 | 32.0 |
| 26个京冬转化系平均 | 14.4 | 13.2 | 51.8 | 35.5 | 25.3 |
| 34个京411转化系平均 | 12.6 | 10.6 | 48.0 | 28.8 | 22.6 |
从表中的结果可以看出，有5个株系的沉降值与对照面包小麦品种Cheyenne(48.0)相当或略优(44.2-49.0)，有3个株系的20分钟沉降值(32-33.6)高于Cheyenne(31.4)。25个京花1号的转基因后代株系中，有9个株系的5分钟沉降值变幅为29.4-46.1，与对照京花1号的26.9相比，提高了9.3-74.3％；7个株系的20分钟沉降值变幅为26.2-33.6，与对照京花1号的22.4相比，提高了17-50％，同时籽粒总蛋白含量由11.6％提高为12.8％-15.1％，总蛋白增加10.3-30.2％；面粉蛋白含量由9.7％升高至10.7％-14.4％，增加26.3-48.5％。另有5个株系的面粉沉降值显著低于对照。26个京冬6号的转基因后代株系中，有10个株系的5分钟沉降值和20分钟沉降值变幅分别为：37.1-49和25.9-32，分别比对照京冬6号的30.7和23.4提高20.9-59.6％和10.7-36.8％。因此可以得出结论，转化株系的面包烘烤品质改善效果十分显著。
实施例8、转基因株系面粉的粉质图分析
对部分转基因小麦株系T5种子的面粉品质进行测定，具体方法是用Brabender公司的粉质仪(Farinograph)测定转基因小麦株系面粉的面团柔和性能，测定方法采用国家标准GB/T14614-93和国际标准IS05530-1-1988。结果如图14所示，图中a：京花1号(阴性对照)；b：京411(北京地区当前区试对照)；c：京冬8号(阴性对照)；d：TG1-28d(来自京花1号)；e：TG3-76b(来自京花1号)；f：TG5-99(来自京冬8号)。实验结果表明，非转基因的阴性对照京花1号，京411的面团稳定时间仅为3分钟左右。而转基因株系TG5-23b的面团稳定维持时间为16分钟，TG1-28d，TG3-76b，TG5-98，和TG5-99的面团稳定维持时间高达30分钟以上，达到了优质面包小麦的要求标准。
实施例9、转基因小麦后代的遗传与变异
采用幼叶叶片涂抹除草剂的方法，鉴定除草剂抗性bar基因在转基因植株T1和T2代75个转基因后代株系的表达。田间播种40天，取单株的叶片用10mg/L的Bialaphos进行涂抹处理，处理10-15天后观察植株叶片对除草剂抗性的反应，确定bar基因抗性的分离规律。结果表明，bar基因的遗传基本符合孟德尔3∶1分离比例。T1代检测的抗性与非抗性的比例为61∶14。T2代植株中，来自14个无抗性的株系，仍无抗性；来自具有抗性部分的后代，23个株系，抗性能稳定遗传，另外38株系出现了分离现象。
Claims (8)
1、一种改良小麦烘烤品质的方法，是将面包小麦的高分子量谷蛋白亚基5与10的基因Dx5和Dy10导入栽培小麦中。
2、根据权利要求1所述的一种改良小麦烘烤品质的方法，其特征在于：与所述Dx5和Dy10基因一同导入栽培小麦中的还有编码抗除草剂PPT与Bialaphos的bar基因。
3、根据权利要求2所述的一种改良小麦烘烤品质的方法，其特征在于：以包括其内含子的玉米Ubi1启动子来驱动bar基因的表达。
4、根据权利要求2所述的一种改良小麦烘烤品质的方法，其特征在于：以包括其内含子的水稻Actin启动子来驱动bar基因的表达。
5、根据权利要求1所述的一种改良小麦烘烤品质的方法，其特征在于：所述导入基因Dx5和Dy10的外植体为栽培小麦的幼胚、幼穗、花药或胚性愈伤组织。
6、根据权利要求1所述的一种改良小麦烘烤品质的方法，其特征在于：以编码葡萄糖苷酸酶的GUS基因为报告基因。
7、根据权利要求1所述的一种改良小麦烘烤品质的方法，其特征在于：所述面包小麦为Cheyenne。
8、根据权利要求1所述的一种改良小麦烘烤品质的方法，其特征在于：所述栽培小麦为京花1号、京冬6号、京411、丰抗8号、京单2097或京单1744。
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2002
- 2002-03-08 CN CN02104080A patent/CN1443848A/zh active Pending
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