CN105693835A - 一种水稻粒型相关蛋白gif1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水稻粒型相关蛋白GIF1及其编码基因与应用，该GIF1蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的氨基酸序列；该编码基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或在严格条件下与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明GIF1编码基因重组在表达载体并转化水稻后，过表达GIF1能够增加水稻籽粒粒长、粒宽，提高水稻产量。

Description

一种水稻粒型相关蛋白GIF1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻籽粒粒型相关的蛋白GIF1及其编码基因与应用。

背景技术

水稻作为重要的粮食作物，在我国的粮食安全保障中具有重要的作用，不断提高稻谷单位面积产量是关系国计民生的大事。粒型对胚乳结构、米粒外观、千粒重、结实率、穗粒数等性状均有巨大的影响，不仅是水稻品质的重要指标，同时也是产量增加的关键因素。伴随基因定位群体的不断发展，以及新型分子标记的进一步开发，陆续有更多的水稻关键性状基因被定位以及克隆。关于这些新基因的研究大大的加强了人们对水稻籽粒性状遗传特性和分子机理的认知，同时这些基因的合理利用指导并促进了水稻单产的增加和品质的提高。

至今，GrameneQTL(http://www.gramene.org/QTL)数据库已收录栽培稻QTL8646个，其中产量相关性状QTL2064个，粒型相关QTL219个，包含控制粒长位点26个，控制粒宽、粒厚、长宽比位点分别31、3、9个，控制粒重位点22个。粒重性状QTL较少可能由于粒重基因与环境互作较强，遗传特性相对复杂，及性状鉴定相对困难造成的。粒型相关QTL主要分布在第1、第2、第3及第5染色体上。在不同定位结果中，不同性状的QTL汇集可能在同一染色体区段，这可能代表了基因连锁或一因多效的情况，解释了群体中粒型多个性状同步出现的现象；另一方面，同一性状的QTL也可能定位到不同染色体上，这则从染色体水平上解释了粒型数量性状的来源。

近年来，在全世界特别是中国科学家的积极努力下，水稻粒型和产量性状相关基因的克隆取得了长足的进展，但是由于数量性状QTL克隆的复杂性，导致了现在已克隆的水稻粒型和产量性状相关基因还很少，水稻中调控粒型的机理任然不清楚，不完善。因此，水稻籽粒粒型相关基因GIF1的克隆和功能研究，对于明确水稻中调控籽粒粒型的分子机制和其在杂交育种中的应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种水稻粒型相关蛋白GIF1。

本发明的再一目的在于提供上述水稻粒型相关蛋白GIF1的编码基因。

本发明的另一目的在于提供上述水稻粒型相关蛋白GIF1或编码基因在控制水稻籽粒粒型(长、宽)、提高水稻粒重及产量方面的应用。

本发明是这样实现的，一种水稻粒型相关蛋白GIF1，具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

本发明水稻粒型相关蛋白GIF1还包括多肽，可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或是使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明水稻粒型相关蛋白GIF1还包括GIF1蛋白的片段、衍生物和类似物。本文中，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的GIF1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(1)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守型氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(3)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域技术人员公知的范围。

在本发明中，GIF1蛋白指具有SEQIDNO.2序列的多肽。本发明还包括与SEQIDNO.2序列的蛋白相同功能的、SEQIDNO.2序列的变异形式，即本发明水稻粒型相关蛋白GIF1为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的氨基酸序列。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个或更少1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域内，用性能相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个统称也不会改变蛋白质的功能。还包括GIF1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与GIF1蛋白编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用GIF1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。所述的同源序列是指具有与SEQIDNO.2序列有至少50％，较佳地至少60％，70％，80％，更佳地至少85％，90％，95％相同性的多肽。本发明还提供了其他的多肽，如包含GIF1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GIF1蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有GIF1蛋白的至少约20个连续的氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约100个连续的氨基酸，最佳地至少约150个连续氨基酸。

本发明还提供GIF1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然的GIF1蛋白的差异可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生的随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他的已知的分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中还包括GIF1蛋白保守性变异蛋白(多肽)，与SEQIDNO.2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替代而形成的多肽，且保留与SEQIDNO.2序列的蛋白相同的功能。

本发明进一步提供了上述水稻粒型相关蛋白GIF1的编码基因，即GIF1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明的多聚核苷酸(稻粒型相关蛋白GIF1的编码基因)可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO.2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO.2的蛋白质，但与SEQIDNO.2所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。

编码SEQIDNO.2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，他可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，进一步较佳地至少80％，更佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低的离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(V/V)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在70％以上，较佳地至少80％以上，更佳地90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含有15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好地是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核算片段可用于核算的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码GIF1蛋白的多聚核苷酸。

本发明的GIF1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关的序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确的次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增值和的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可以利用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，先合成多个小片段，然后在进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可同过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸载体，以及用本发明的载体或GIF1蛋白编码序列经基因工程产生宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的DNA重组技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的GIF1蛋白。一般说来有以下步骤：

用本发明得的编码GIF1蛋白的多核苷酸或变异体，或用该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

在合适的培养基中培养宿主细胞；

从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明进一步提供了含有上述编码基因的载体。在本发明中，GIF1蛋白多聚核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GIF1蛋白编码DNA序列和合适的转录、翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中适当的启动子上，以指导mRNA的合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用二氢叶酸还原酶、新霉素抗性及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当的DNA序列以及适当启动子或者控制序列载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性的例子有：大肠杆菌，链霉菌属，农杆菌；真核细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的提供的蛋白或其编码基因的用途，用于：

GIF1基因分子克隆

控制水稻籽粒粒长、粒宽；

提高水稻产量的方法。

本发明可通过调节所述植物中GIF1基因的表达或活性，调节水稻的籽粒粒长、粒宽，从而增加籽粒粒重。促进还是抑制GIF1的表达活性主要取决于水稻所需改良的性状而定。当需要增加水稻的籽粒粒重时，可以通过提高所述水稻中GIF1基因的表达或活性来实现；当需要降低水稻的籽粒粒重，可以通过降低所述植物中GIF1基因的表达或活性来实现。

增加GIF1基因的表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带GIF1编码基因的表达载体使植株过量表达GIF1；或可以通过强启动子驱动从而增强GIF1基因或其同源基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子)来增强该GIF1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子、水稻的Actin1、Actin2启动子、玉米的Ubi启动子等。

抑制GIF1基因表达的方法也是本领域周知的，例如，可通过反义或RNA干扰(RNAi)或基因敲出来实现。

作为本发明的一种优选方式，获得GIF1基因高表达的植株的方法如下：

提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的GIF1蛋白的编码序列；

将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述GIF1蛋白编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

选择出转入所述GIF1蛋白编码序列的植物细胞、组织或器官；

将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件来实施此方法。

根据本发明的一个具体实施方式，提供了一种GIF1蛋白，其全长的开放阅读框(ORF)序列如SEQIDNO.1所示，编码一个含有394个氨基酸的蛋白质(SEQIDNO.2)。

本发明的具体实施方式中，构建了GIF1基因过量表达载体PHB-GIF1，通过转基因的方法，将正常的野生型基因GIF1导入到水稻材料日本晴中可使其籽粒粒长、粒宽增加，从而千粒重增加。

附图说明

图1是本发明实施例中GIF1基因的电泳结构图；

图2是本发明实施例中水稻在GIF1过量表达后植株籽粒表型；

图3是本发明实施例中水稻在GIF1过量表达后GIF1表达量检测结果；

图4是本发明实施例中水稻在GIF1过量表达后株籽粒千粒重统计；

图5是本发明实施例中水稻在GIF1过量表达后株籽粒粒长统计；

图6是本发明实施例中水稻在GIF1过量表达后株籽粒粒宽统计。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1GIF1基因水稻转基因试验

1、GIF1基因过量表达载体构建

本实施例采用表达载体PHB(Mao等，2005，PNAS102:12270-12275，可商购)作为水稻转基因的载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kan^r)、潮霉素抗性基因(Hyg^r)、除草剂抗性基因(Bar^r)、2×35S启动子、NOS基因终止信号序列以及用于连接目的片段的多克隆位点(MCS)。在限制性内切酶位点可插入GIF1基因或其片段构建成转基因质粒。

以正常野生型日本晴的RNA为模板，合成第一链cDNA，用该GIF1基因ORF序列的5’和3’端的寡核苷酸作为PCR引物(SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)，用高保真酶进行扩增，获得GIF1基因的全长cDNA(SEQIDNO:1)扩增产物，该扩增产物的电泳结果，如图1所示，GIF1基因cDNA大小为684bp。

将该扩增产物通过重组克隆方法重组进载体pHB中，并对重组子进行测序验证，测序结果如序列SEQIDNO.1所示。该重组的过渡质粒载体称为PHB-GIF1。其中，GIF1基因的表达由自身启动子驱动。

5’端的寡核苷酸序列3为(SEQIDNO.3)：

5’-gtctctctctcaagcttggatccATGCAGCAGCAACACCTGAT-3’

3’端的寡核苷酸序列4为(SEQIDNO.4)：

5’-tctagaggatcaattcgagctcCTAGCTGCCTTCCTCCTCGGT-3’

2、转化

将上述PHB-GIF1通过冻融法导入农杆菌EHA105。农杆菌EHA105平板(4℃保存)挑取单菌落于YEP液体培养基(Km和Rif各50mg/L)中，28℃振荡培养12～18h，然后取1～5mL菌液接到100mLYEP液体培养基(含乙酰丁香酮100μmol/L)中，振荡培养4h后测OD值稀至相应浓度(OD＝0.5)。将新鲜菌液于8000rpm、4℃、5min收集菌体，并重悬于三分之一提及的AAM培养基中。加入放有生长旺盛的胚性愈伤组织的灭菌三角瓶中浸泡25min，再吹干表面菌液，将愈伤组织转接于共培养基上，28℃暗培养2～3d。共培养愈伤组织经无菌水和含Cef500mg/L的无菌水漂洗后，在工作台上吹4h左右，转接于预培养基中28℃暗培养5～7d。将预培养的愈伤组织转接于含Hyg和Cef的筛选培养基上继续培养3～4周，再将抗性愈伤组织转接于仅含Hyg的筛选培养基上，筛选1～2次。取抗性愈伤组织转接于分化培养基上，28℃光照分化。分化小苗转接于生根培养基，28℃光照培养3～4周，开放培养炼苗7d左右，最后移栽到大田。

获得的再生植株移栽成活后用除草剂或潮霉素筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T1代调查育性表型，验证GIF1基因功能。

实施例2GIF1基因功能分析

如实施例1所述的方法获得水稻GIF1过量表达的转基因植株，分为5组，分别命名为OE1-1、OE1-6、OE2-5、OE4-1、OE4-5，以及正常对照组control，用转基因T1代植株观察水稻籽粒表型。结果如图2-6所示，图3中bar＝1cm，图3-6中，**为在0.01水平上显著。从图中可以看出，与对照组control相比，转GIF1过量表达基因的植株OE1-1、OE1-6、OE2-5、OE4-1、OE4-5籽粒粒长、粒宽和千粒重较对照有显著增加。表明GIF1过量表达会增加籽粒粒长、粒宽，进而导致千粒重增加。

从上述分析可以看出，GIF1可以控制水稻籽粒粒长、粒宽，进而影响水稻产量，上调该基因表达有利于植株籽粒粒长、粒宽增加。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明水稻粒型控制基因(GIF1)为水稻等植物的籽粒粒型调控提供新的技术途径；GIF1基因在去除转基因成分影响方面具有广泛的应用前景；该基因可以显著提高水稻产量，在水稻杂种优势利用中具有广泛的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种水稻粒型相关蛋白GIF1，其特征在于，具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；或为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的水稻粒型相关蛋白GIF1的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列为：具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或，在严格条件下与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的水稻粒型相关蛋白GIF1的编码基因，其特征在于，所述严格条件为0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或50％(V/V)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1Ficoll，42℃。

4.含有权利要求3所述的编码基因的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，该表达载体包括PHB。

6.含有权利要求2或3所述的编码基因，或含有权利要求4或5所述的表达载体的宿主细胞。

7.权利要求1所述的水稻粒型相关蛋白GIF1在控制水稻籽粒粒长、粒宽的改良、提高水稻产量中的应用。

8.权利要求2或3所述的编码基因在控制水稻籽粒粒长、粒宽的改良、提高水稻产量中的应用。

9.权利要求1所述的水稻粒型相关蛋白GIF1在制备转基因植株中的应用。

10.权利要求2所述的编码基因在制备转基因植株中的应用。