CN101932596B - 调控植物株高的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因技术和植物学领域，公开了一种作物株高调节基因，其表达调控序列及其应用，所述作物株高调节基因可用于调节作物株高、体积、分蘖、产量、花器大小或种子大小。本发明还公开了一种改良作物的方法。本发明的基因是一个在作物改良上有重要应用价值的基因。

Description

调控植物株高的基因及其应用
技术领域
本发明属于基因技术和植物学领域；更特别的，本发明涉及调控植物株高的基因及其应用。
背景技术
当前，对于农作物高产育种的选育主要集中在株型和穗部性状的改良。由于品种的改良，目前已经培育出多种高产农作物品种。
然而，当前的许多高产作物如水稻高产栽培品种尤其超级杂交稻存在一定的株高过高问题，导致容易倒伏、产量潜力受到限制的问题。这在很大程度上影响了作物产量的进一步提高和高产品种的推广。
因此，本领域有必要研究可调节农作物株高的方法，从而进一步改良农作物的性状，提高农作物的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供调控植物株高的基因及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种分离的作物株高调节多肽，该多肽选自下组：
(a)具有SEQIDNO：3所示氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQIDNO：3所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调节作物株高功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，该多肽是具有SEQIDNO：3所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：
(a)编码所述多肽的多核苷酸；或
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQIDNO：3所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，该多核苷酸的序列具有SEQIDNO：2所示核苷酸序列；或具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。
在本发明的第五方面，提供一种植物，其包含所述的多核苷酸。
在本发明的第六方面，提供一种制备所述植物的方法，其包括将所述的多核苷酸转入植物中。
在另一优选例中，所述方法包括：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的多核苷酸；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞或组织或器官；和
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。
在本发明的第七方面，提供一种制备植物的方法，将转入了所述的多核苷酸的植物与非转基因植物杂交，获得包含所述的多核苷酸的杂交后代。
在本发明的第八方面，提供一种所述多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出所述的多肽。
在本发明的第九方面，提供所述的多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于
调节作物的株高、体积、分蘖、产量、花器大小或种子大小；或
制备调节作物的株高、体积、分蘖、产量、花器大小或种子大小的物质。
在本发明的第十方面，提供一种调节作物株高、体积、分蘖、产量、花器大小或种子大小的方法，所述方法包括：调节作物中作物株高调节基因的表达或活性。
在另一优选例中，通过提高作物中作物株高调节基因的表达或活性，降低作物株高、体积，增加作物分蘖、产量；通过抑制作物中作物株高调节基因的表达或活性，增加作物花器大小，增加种子大小，提高作物株高或体积。
在本发明的第十一方面，提供一种所述作物株高调节多肽或其编码基因的激动剂或拮抗剂。
在本发明的第十二方面，提供一种植物茎叶特异性表达启动子，所述的启动子选自下组：
(1)具有SEQIDNO：13所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物茎叶中特异性表达功能的多核苷酸；或
(3)与SEQIDNO：13所示的核苷酸序列具有70％(优选80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上，如98％，99％)以上相同性且具有指导目的基因在在植物茎叶中特异性表达功能的多核苷酸。
在本发明的第十三方面，提供所述的启动子用于指导目的基因在植物茎叶中特异性表达。
在本发明的第十四方面，提供一种构建物，所述的构建物含有所述的植物茎叶特异性表达启动子。
在另一优选例中，所述构建物中，植物茎叶特异性表达启动子的下游含有至少一个多克隆位点(如酶切位点)，其与所述的植物茎叶特异性表达启动子可操作性连接，用于插入目的基因。
在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。
在另一优选例中，所述的构建物含有以下可操作性连接的元件：所述的启动子和目的基因。
在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。
在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。
在另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。
在另一优选例中，所述的目的基因位于所述启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了野生型拟南芥(WT)和ELb(Eui-likeb)过表达转基因拟南芥植株(ELb-OE)的俯视图。其中，ELa(Eui-likea)过表达转基因拟南芥植株(ELa-OE)和水稻OsEui过表达转基因拟南芥植株(OsEui-OE)植株作为对照。
图2显示了野生型拟南芥(WT)和ELbRNAi/ela拟南芥植株的生长状况比较图。
图3显示了ELbRNAi/ela拟南芥植株与野生型拟南芥植株(WT)的花器官和种子生长状况比较图。
图4显示了ELb启动子启动GUS报告基因的组织特异性表达。其中，箭头所指处区域为显示蓝色的区域。
图5显示了野生型水稻植株(TP309)和ELb过表达水稻植株(ELb-OE)的生长状况比较。
图6显示了野生型水稻植株(TP309)和ELb过表达水稻植株(ELb-OE)的株高的统计值。
图7显示了野生型水稻植株(TP309)和ELb过表达水稻植株(ELb-OE)的有效分蘖数的统计值。
图8显示了野生型水稻植株(TP309)和ELb过表达水稻植株(ELb-OE)的单株粒重的比较。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，揭示了一种对于调节作物株高、体积、分蘖、产量、花器官大小或种子大小有用的基因ELb。提高该基因的表达可降低作物的株高、体积，增加作物的有效分蘖和产量；降低该基因的表达可增大作物的花器和种子。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，所述的“作物”包括但不限于：禾本科植物、十字花科植物、木本科植物等。更优选的，所述的禾本科植物包括但不限于：水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等；或所述的十字花科植物包括但不限于：拟南芥。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的作物株高调节多肽”、“分离的ELb蛋白”或“分离的ELb多肽”是指ELb蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化ELb蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
ELb多肽及其用途
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括ELb蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的ELb蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“ELb蛋白”指具有ELb蛋白活性的SEQIDNO：3序列的多肽。该术语还包括具有与ELb蛋白相同功能的、SEQIDNO：3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括ELb蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与ELb蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗ELb蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含ELb蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了ELb蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有ELb蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明还提供ELb蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然ELb蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“ELb蛋白保守性变异多肽”指与SEQIDNO：3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
氨基酸残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码本发明ELb蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO：3的蛋白质，但与SEQIDNO：2所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQIDNO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码ELb蛋白的多聚核苷酸。
应理解，虽然本发明的ELb基因优选获自拟南芥，但是获自其它植物的与拟南芥ELb基因高度同源(如具有60％以上，如70％、80％、85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
本发明的ELb蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ELb蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的ELb蛋白。一股来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码ELb蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，ELb蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ELb蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一股技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的ELb蛋白有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗ELb蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组ELb蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激ELb蛋白功能的多肽分子。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用ELb蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测ELb蛋白的转录产物。
本发明还涉及一种改良作物的方法，该方法包括调节所述植物中ELb基因或其同源基因的表达或活性。促进还是抑制ELb的表达或活性主要取决于作物所需改良的性状而定。当需要降低作物株高、体积，增加作物分蘖、产量时，可通过提高作物中ELb的表达或活性来实现；当需要增加作物花器大小，增加种子大小，或提高作物株高或体积时，可通过抑制作物中作物株高调节基因的表达或活性来实现。
增加ELb基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带ELb编码基因的表达构建物使植株过表达ELb；或可通过用强启动子驱动从而增强ELb基因或其同源基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该ELb基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。
抑制ELb基因或其同源基因表达的方法也是本领域周知的。例如，可通过RNA干扰(RNAi)或基因沉默(敲除)的技术来实现。
作为本发明的一种优选方式，获得ELb高表达的植株的方法如下：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有ELb蛋白的DNA编码序列；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该ELb蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入所述ELb蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。
其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。
本发明还包括ELb蛋白或其编码基因的拮抗剂或激动剂。由于ELb的拮抗剂或激动剂可调节ELb的活性或表达，因此，所述的ELb的拮抗剂或激动剂也可通过对ELb的影响来调节作物株高、体积、分蘖、产量、花器大小或种子大小等，从而达到性状改良的目的。
所述的ELb的拮抗剂是指任何可降低ELb的活性、降低ELb的稳定性、下调ELb的表达、减少ELb有效作用时间、或抑制ELb的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为增加作物花器大小，增加种子大小，或提高作物株高或体积有用的物质。
所述的ELb的激动剂是指任何可提高ELb的活性、维持ELb的稳定性、促进ELb表达、延长ELb有效作用时间、或促进ELb的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为降低作物株高、体积，增加作物分蘖、产量有用的物质。
在本发明的一个实例中，提供了一种ELb基因，其基因组序列如SEQIDNO：1所示，其中开放阅读框(ORF)位于第61-353，1363-1585，1690-1943，2028-2414，2559-2979位，全长cDNA(SEQIDNO：1)为1578bp，编码一个含有525个氨基酸的蛋白质(SEQIDNO：3)。所述的ELb基因可以为作物的株高、体积、产量、分蘖等方面的改良提供新的途径，因而具有巨大的应用前景。
植物茎叶特异性表达启动子及其指导的基因表达
如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一股地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
如本文所用，“组织特异性启动子”又称“器官特异性启动子”，在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达。
如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少2倍，优选至少高5倍，更优选至少高10倍，更优选至少高25倍，更优选至少50倍，更优选至少高100倍水平被表达，更优选至少高1000倍水平被表达，则该启动子被认为是组织或器官特异性的。
本发明提供一种启动子，所述的启动子选自下组：
(1)具有SEQIDNO：13所示的核苷酸序列的多核苷酸；或
(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物茎叶中特异性表达功能的多核苷酸。
在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在植物茎叶中特异性表达的功能。
多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQIDNO：13所示的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少60％，更佳地至少70％，更佳地至少80％，更佳地至少85％，更佳地至少90％(例如95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的多核苷酸。
本发明的启动子是植物组织或器官特异性的，更特别的，其是植物茎叶特异性的。在本发明的实例中，本发明人发现，在本发明的启动子的指导下，可以使ELb基因或GUS基因特异地在植物茎叶中表达，而在其它组织、器官中基本上不表达。
本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(优选结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些对于控制植物茎叶生长的蛋白，更具体地如本发明的植物株高相关蛋白。
本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加表达量，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。
此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一股是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。
任何一种前述的启动子和目的基因序列可被包含在构建物中，更具体地如重组载体中。
所述的重组载体一股包括可操作性连接的(通常从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。
通常，所述的目的基因位于所述植物茎叶特异性表达启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。
重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。
包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明的主要优点在于：
(1)首次分离得到一种新的作物株高调节基因，该基因具有调节作物株高、体积、分蘖、产量、花器大小或种子大小的作用，因而可极好地应用于作物品种的改良。
(2)适当的矮杆和有效分蘖的增加是高产品种育种的理想株型，本发明的基因转入作物后可降低作物株高，用于矮化育种；例如在禾本科作物上通过不同的表达水平，对品种进行不同程度株高的降低、增加有效分蘖、提高产量。
(3)首次分离得到所述的作物株高调节基因的启动子，该启动子是植物茎叶特异性表达的，从而可良好地用于调控目的蛋白在植物茎叶中特异性表达。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)或PCR引物：实验室指南(CarlW.Dieffenbach和GabrielaS.Devkslereds.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1995)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料
1.1植物材料
拟南芥(Arabidopsisthaliana)，生态型为Columbia(Col-0)。
T-DNA插入突变体：ELa(SALK_016089)。
水稻品种：台北309(OryzasativaL.sspJaponica.cvTaipei309，TP309)。
1.2菌种和质粒载体
农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)：GV3101(参见Narasimhulu，S.B等，Gelvin.1996.EarlytranscriptionofAgrobacteriumt-DNAgenesintobaccoandmaize.PlantCell8：873-886)、EHA105(参见Hood，E.E.等，1993，NewAgrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants.Transgen.Res.2：208-218)。
质粒载体：
pBluescriptSK(pSK)：购自Invitrogen公司。
pCambia1300S：pCambia1300RS购自CAMBIA公司。
pBI101.1：购自Invitrogen公司。
pGEM-TEasy载体：购自Promega公司。
RNAi载体1300RS：购自美国Arkansas州立大学。
1.3试剂和酶
T4DNA连接酶、各种核酸限制性内切酶和TaqDNA聚合酶购自MBIFerment，TaKaRa、NewEnglandBiolabs、Promega。DNA片段的割胶回收试剂盒购自Omega。ReverseTranscriptionSystem购自GIBCOBRL。核酸分子量标准为MBI产品。pGEM-Teasy载体购自Promega(Madison，USA)。(α-32P)dCTP购自亚辉生物工程公司(北京)。反转录试剂盒采用SuperScriptFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR(#11904-018，Invitrogen)系统。其它常规化学试剂均为进口原装、进口分装或国产分析纯。各种脱氧核苷酸引物由上海Sangon合成。DNA序列由上海基康，上海英俊公司测定，序列分析用Genedoc，DNAStar等软件完成。
方法
1.拟南芥种植、转化
拟南芥无菌培养时，种子经表面(70％乙醇，30秒；无菌水冲洗4次)和深层(7％次氯酸钠，10分钟；无菌水冲洗3次)消毒后，播于1/2MS(1/2×MurashigeandSkoogbasalmedium，0.8％琼脂粉，pH5.8)固体培养基上，4℃放置72h，然后转入22℃培养。一周后，将幼苗移栽于浸透营养液(3g/10L花无缺，上海永通化工有限公司)的人工土壤(蛭石、黑土和珍珠岩为3∶1∶0.5)中，然后转入人工气候室在光周期为14/10(L/D)中培养。
拟南芥转化采用喷洒法，取生长状况良好的4-5周龄植株(转化前一周剪去主苔，利于侧苔抽出产生更多的花苞，提高转化效率)。将含有转基因载体的农杆菌于28℃培养至OD600≈2.0，4,000rpm离心10min，菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液(1/2MS液体培养基含5％蔗糖，0.02％SilwetL-77)中，至终浓度OD600≈0.6-0.8。转化前，将已授粉花以及果荚去除，并使土壤吸足水。转化时将菌液均匀喷洒拟南芥，至叶片上有液滴落下，将植物用黑色的塑料袋覆盖保持湿度，避光过夜。24小时候后将植物转移到正常条件下生长。7天(d)后按上述方法重复转化1次。待种子成熟后将植株混合采收于纸袋中，在干燥器中放置7d后脱粒。T1代种子消毒后播种在含有50μg/mlKan或者潮霉素的1/2×MS培养基上，4℃放置72h，然后正常光照培养。
2农杆菌介导的水稻成熟胚愈伤的基因转化
(1)水稻成熟胚愈伤的诱导
水稻307T种子去壳，70％乙醇浸泡1分钟，20％(v/v)，次氯酸钠浸泡20-30分钟，并不停摇晃，用无菌水漂洗5-6次。无菌滤纸吸干，播于MSD培养基诱导愈伤，26℃暗培养。一周后，剔去胚乳、胚芽、胚根等，剥取愈伤组织，并继代于MSD上暗培养。每2-3周继代一次。如用TP309种子剥取愈伤，培养基用NBD。
(2)准备转化用菌液
第一天上午：从-70℃保存的菌种中挑少许于5mlYEB(Rif20mg/L+Kan50mg/L)液体培养基，28℃振荡培养过夜。
第二天上午：从含有农杆菌的YEB培养液中吸取1-2ml，转入25-50mlAB(20mg/LRif+50mg/LKan)液体培养基中培养，28℃培养4小时左右至OD600＝0.5左右。
(3)共培养
第二天下午：测OD600值，菌液离心5,000rpm，15分钟，菌体沉淀悬浮于AAM(含AS100)至菌液OD600＝0.4-0.6。将菌液倒入装有水稻愈伤的三角瓶中，使愈伤浸泡其中20分钟，并不时摇晃；用无菌纸吸干菌液(或用吸管吸干菌液)，把已浸泡过的愈伤组织转移到垫有一层无菌滤纸的含2.5％Phytagel的NBD(AS100)培养基上共培养2-3天。每皿再加1mlAAM(+AS100)培养液充分湿润无菌滤纸。
(4)筛选
将愈伤组织用无菌滤纸吸干(换一次滤纸)，转至含潮霉素(hygromycin，Hyg)的筛选培养基上筛选抗性愈伤(暗培养30天左右，中间换一次筛选培养基)。
筛选培养基：
第一次筛选用：含0.26％PhytagelMS+Timentin100mg/L+Hyg30mg/L；
第二次筛选用：含0.26％PhytagelNBD+Timentin100mg/L+Hyg50mg/L；
第三次筛选用：含0.26％PhytagelMS+Timentin100mg/L+Hyg50mg/L。
(5)预分化
将筛选的水稻愈伤转至预分化培养基，培养10天。
预分化培养基：含0.45％Phytagel的MS+BAP2mg/L+NAA1mg/L+ABA5mg/L+Hyg50mg/L，pH5.7，无2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。
(6)分化
将经过预分化的水稻愈伤转至分化培养基上分化成苗(光照，15-30天)。
分化培养基：含0.45％Phytagel的NB+BAP3mg/L+NAA0.5mg/L，pH5.7，无2，4-D。
(7)生根
将绿色小苗转至生根培养基上长根。
生根培养基：含0.45％Phytagel的1/2MS+Hyg50mg/L，pH5.7，无2，4-D。
3.载体构建
p35S::ELb载体构建
利用RT-PCR的方法扩增ELb的cDNA编码区序列。具体步骤如下：使用RNeasyPlantMinikit(Qiagen)，按照说明书提供的方法分离拟南芥的总RNA，分离到的总RNA使用M-MLVreversetranscriptase(Promega)进行反转录产生ELb的cDNA。使用TakaraperobestDNA聚合酶以cDNA作为模板进行PCR反应扩增ELb的cDNA编码区序列。所用引物：
上游(SEQIDNO：7)：5’TGAGGATCCAAATAAAATAAAAAG-3’(划线部分分别为BamHI位点)；
下游(SEQIDNO：8)：5’AAAGTCGACCACACACAAAGCAAA-3’(划线部分分别为ClaI位点)。
PCR条件：94℃变性3min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸2min扩增35个循环；72℃保温10min。16℃保温。
PCR产物回收，然后用BamHI和ClaI进行双酶切，回收并与进行了同样双酶切与回收过程的pSK载体连接，转化大肠杆菌DH5α，选酶切正确的克隆测序。测序正确后，再用BamHI和ClaI切下ELb的cDNA编码区序列，连入同样经BamHI和ClaI双酶切的双元表达载体pCambia1300S构建转基因克隆，转大肠杆菌DH5α。提质粒，酶切鉴定正确的质粒转入农杆菌GV3101和EHA105。从农杆菌中提取质粒再转入DH5α中，提取质粒并且酶切验证，确定正确的质粒已经转入农杆菌中。分别采用喷洒法转化拟南芥产生转基因植株和农杆菌介导的水稻成熟胚愈伤的基因转化获得水稻转基因植株。
pELbpromoter::GUS载体构建
根据Genbank上检索到的序列(GeneID：832559)，在ELb基因翻译起始位点上游1.4kb范围内设计上下游引物，以拟南芥Columbia野生型7天小苗提取的基因组DNA为模板进行PCR。引物如下：
上游(SEQIDNO：9)：5’CTGCTGCAGACTCTATTTCCA-3’(下划线处为酶切位点PstI)；
下游(SEQIDNO：10)：5’TTCAGGATCCTTTACTTTTTATTTT-3’(下划线为酶切位点BamHI)。
扩增条件为94℃变性3min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min扩增35个循环；72℃保温10min。16℃保温。
PCR产物PstI/BamHI酶切后连入pSK载体的PstI/BamHI相应位点。选酶切正确的克隆测序，测序正确的克隆再用PstI/BamHI切下ELb启动子区域(序列如SEQIDNO：13所示)，连入同样经PstI/BamHI双酶切的双元表达载体pBI101.1，转大肠杆菌DH5α。提质粒，酶切鉴定正确的质粒转入农杆菌GV3101。从农杆菌中提取质粒再转入DH5α中，提取质粒并且酶切验证，确定正确的质粒已经转入农杆菌中。同时将pBI101.1载体转入GV3101分别作为阴性和阳性对照。
ELb在ELa的T-DNA插入突变体背景下的RNAi转基因植株构建
使用RNAi载体1300RS构建转基因克隆，在ELb基因的第四外显子上扩增约500bp的序列，以拟南芥Columbia野生型7天小苗提取的基因组DNA为模板进行PCR。引物如下：
上游(SEQIDNO：11)：5’AATGGTACCACAAGAAACAA-3’(下划线处为酶切位点KpnI)；
下游(SEQIDNO：12)：5’TCTAGATTTGAGCTGAAAAAA-3’(下划线为酶切位点XbaI)。
扩增条件为94℃变性3min；然后94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s扩增35个循环；72℃保温10min。16℃保温。
PCR产物KpnI/XbaI酶切后连入pSK载体KpnI/XbaI相应位点。选酶切正确的克隆测序，测序正确的克隆再用KpnI/XbaI切下ELb部分片断，同样经KpnI/XbaI双酶切的双元表达载体1300RS，转大肠杆菌DH5α。提质粒，酶切鉴定正确的质粒转入农杆菌GV3101。从农杆菌中提取质粒再转入DH5α中，提取质粒并且酶切验证，确定正确的质粒已经转入农杆菌中。
采用喷洒法转化ELa的T-DNA插入突变体，从而获得在ELa的T-DNA插入突变体背景下ELbRNAi转基因拟南芥植株(ELbRNAi/eLa)。
实施例1ELb基因的克隆
本发明人通过拟南芥基因组序列的搜索和生物信息学的研究，发现2个P450单加氧酶714A1与714A2基因，初步预计它们参与赤霉素控制的植物生长发育，本发明人将它们命名为ELa(也可称为AtEuila)和ELb(也可称为AtEuilb)。
其中，ELb基因编码区基因组序列(genomicDNA)如SEQIDNO：1所示；ELb基因编码区cDNA序列如SEQIDNO：2所示；ELb蛋白序列如SEQIDNO：3所示。ELa基因编码区基因组序列如SEQIDNO：4所示；ELa基因编码区cDNA序列如SEQIDNO：5所示；ELa蛋白序列如SEQIDNO：6所示。
实施例2ELb过表达转基因拟南芥降低株高与体积
本实施例中，本发明人分别制备了可过表达拟南芥ELb、ELa和水稻OsEui的转基因拟南芥植株。以野生型(wt)、过表达拟南芥ELa(ELa-OE)和水稻OsEui的转基因植株为对照。
在培养各植株约4周后，检测植株的生长状况，结果见图1。由该图可见，野生型的拟南芥生长得最大；过表达拟南芥ELb的植株比野生型明显小；而过表达拟南芥ELa和水稻OsEui的植株生长得最小。
本发明人在培养各植株约7周后分别测量了野生型、过表达拟南芥ELb、ELa和水稻OsEui的转基因拟南芥植株的株高，它们的株高平均值依次是26.2cm，14.2cm，9.63cm，3.7cm，因此，ELb过表达转基因拟南芥的株高明显低于野生型。
实施例3ELbRNAi/ela增加植株高度或体积
本实施例中，本发明人制备了在ELa的T-DNA插入突变体背景下ELbRNAi转基因拟南芥植株(ELbRNAi/ela)。培养植株约10天后，观察ELbRNAi/ela对于株高或体积的影响，以相同培养条件的野生型植株为对照。
ELbRNAi/ela的植株与野生型植株的生长状况见图2所示，与野生型植株相比，ELbRNAi/ela的植株的叶片面积明显增加，株高明显增加，体积明显增加。
由此可见，在ELa的T-DNA插入突变体背景下降低或沉默ELb的表达可增加植株高度和体积。也即ELb是一种与降低植株高度和体积相关的基因。
实施例4ELbRNAi/ela增加花器与种子大小
本实施例中，本发明人观察了ELbRNAi/ela的拟南芥植株的花器和种子的生长状况，以野生型拟南芥的花器和种子为对照。
ELbRNAi/ela的拟南芥植株与野生型拟南芥植株的花器和种子生长状况如图3所示，与野生型相比，ELbRNAi/ela的拟南芥植株的花器明显增大，种子明显增大。
由此可见，在ELa的T-DNA插入突变体背景下降低或沉默ELb的表达可增大植株的花器和种子。也即ELb是一种与减小花器和种子大小相关的基因。
实施例5ELb启动子启动GUS报告基因的组织特异性表达
本实施例中，本发明人构建了pELbpromoter::GUS载体，转入农杆菌后制备拟南芥基因植株。利用常规的GUS报告基因检测法观察植株中GUS报告基因的表达情况。
结果如图4所示，可见GUS报告基因可在植株的茎、叶生长旺盛的部位表达，在植株的根部基本上没有表达。因此，ELb基因是一种组织特异性基因。
实施例6ELb过表达转基因水稻降低株高
本实施例中，本发明人制备了ELb过表达的转基因水稻植株(ELb-OE)，观察ELb过表达对于水稻植株的影响，以相同条件下培养的野生型水稻植株TP309作为对照。
在培养植株约110天后，植株的生长情况如图5所示，可见ELb过表达的转基因水稻植株的株高明显低于野生型。对于过表达ELb植株和野生型植株的株高的统计图见图6所示。
实施例7ELb过表达转基因水稻增加有效分蘖与产量
本实施例中，本发明人检测了ELb过表达的转基因水稻植株(ELb-OE)和野生型植株TP309的分蘖数与产量，以论证ELb过表达对于水稻分蘖与产量的影响。
在培养植株抽穗后对有效分蘖进行分蘖数计数，统计结果如图7所示。野生型植株的分蘖数约10个，而ELb过表达植株的分蘖数为约20-22个。可见ELb过表达可明显增加植株的有效分蘖数。
在植株成熟后，本发明人还统计了ELb过表达植株和野生型植株的产量情况。结果如图8所示，可见ELb过表达的转基因水稻植株的单株粒重明显增加。
实施例8ELb蛋白变异体的功能
用一编码序列替换p35S::ELb载体中的ELbcDNA编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQIDNO：3类似的序列，不同处仅在于第522位为Leu的(ELb野生型蛋白中为Ile)。同前述方法将该载体转化农杆菌，制备转基因植物。结果显示，该转基因植株的株高比野生型降低。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.作物株高调节多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，其特征在于，用于
调节作物的株高、体积、分蘖、产量、花器大小或种子大小；或
制备调节作物的株高、体积、分蘖、产量、花器大小或种子大小的物质；
所述的作物株高调节多肽选自下组：
(a)SEQIDNO:3所示氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQIDNO:3所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调节作物株高功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的作物株高调节多肽是氨基酸序列如SEQIDNO:3所示的多肽。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，编码所述作物株高调节多肽的多核苷酸选自：
(i)核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；或
(ii)核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
4.一种调节作物株高、体积、分蘖、产量、花器大小或种子大小的方法，其特征在于，所述方法包括：调节作物中作物株高调节基因的表达或活性；
所述的作物株高调节基因编码：
(a)SEQIDNO:3所示氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQIDNO:3所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调节作物株高功能的由(a)衍生的多肽。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述作物株高调节基因选自：
(i)核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；或
(ii)核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，(1)通过提高作物中作物株高调节基因的表达或活性，降低作物株高、体积，增加作物分蘖、产量；或
(2)通过抑制作物中作物株高调节基因的表达或活性，增加作物花器大小，增加种子大小，提高作物株高或体积。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，(1)包括：将所述的作物株高调节基因转入作物中。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的作物株高调节基因；
(2)将作物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述的作物株高调节基因转入作物细胞，并且整合到作物细胞的染色体上；
(3)选择出转入了所述的作物株高调节基因的作物细胞或组织或器官；和
(4)将步骤(3)中的作物细胞或组织或器官再生成作物。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，(2)包括：通过RNA干扰抑制作物中作物株高调节基因的表达或活性。
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