KR101246085B1 - 식물 초장 조절 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물 초장 조절 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 유래된 작물 초장 조절 유전자, 이의 발현 조절 서열 및 이의 용도를 제공한다. 상기 작물 조절 유전자는 작물의 식물 초장, 부피, 분얼, 수확량, 꽃 기관 크기, 또는 종자 크기를 조절하는데 사용될 수 있다.

Description

식물 초장 조절 유전자 및 이의 용도{A plant height regulatory gene and uses thereof}
본 발명은 유전학 기술 및 식물학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 식물 초장 조절 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
현재, 고수확량 작물 육종에 대한 연구는 식물 형태 및 원추화서 형질(panicle traits)을 개선하는 것에 주로 초점을 맞추었다. 지금까지 많은 고수확량 작물 품종들이 품종개량 기술의 진전으로 인해 개발되어 졌다.
그러나, 고수확량 벼 품종(특히, 수퍼 잡종 벼 품종)과 같은 많은 고수확량 작물에 존재하는 하나의 주된 문제점은 식물의 과도한 초장(over-height)이다. 상기 과도한 초장은 더 높은 경향의 도복(땅으로 쓰러져 편평해진 것) 및 더 높은 수확량에 대한 잠재성의 제한을 초래할 수 있다. 이러한 이슈는 작물 수확량의 추가의 증가 및 고수확량 품종의 폭넓은 채택에 현저하게 영향을 미친다.
따라서, 작물 형질의 추가의 개선 및 작물 수확량의 증가를 위해, 작물의 식물 초장을 조절하는 방법을 개발하는 것이 당업계에서 필요하다.
본 발명의 목적은 식물 초장 조절 유전자 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
제1양태에서, 본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 분리된 식물 초장 조절 폴리펩티드를 제공한다:
(a) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및
(b) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 또는 부가를 포함하고, 식물 초장 조절 기능을 가지는 상기 (a)로부터 유래한 폴리펩티드.
바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이다.
제2양태에서, 본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 각각 가지는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
(a) 상기 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
(b) 상기 (a)의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드.
바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열; 또는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가진다.
제3양태에서, 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 벡터를 제공한다.
제4양태에서, 본 발명은 상기 기재된 벡터를 각각 포함하는 유전자 조작된 숙주세포를 제공한다.
제5양태에서, 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 식물을 제공한다.
제6양태에서, 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 상기 기재된 식물을 생산하기 위한 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium) 세포를 제공하는 단계;
(2) 상기 폴리뉴클레오티드를 식물세포에 도입하여, 이를 식물세포의 염색체에 통합시키기 위해, 상기 (1) 단계에 기재된 아그로박테리움 세포를 식물의 세포, 조직, 또는 기관에 접촉하는 단계;
(3) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포, 조직, 또는 기관을 선발하는 단계; 및
(4) 상기 (3) 단계에 기재된 식물 세포, 조직, 또는 기관을 신규 식물로 재분화를 허용하는 단계.
제7양태에서, 본 발명은 식물을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 각 방법은 상기 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물과 비형질전환 식물을 이종교배 하여, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 잡종 후대를 획득하는 단계를 포함한다.
제8양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 상기 기재된 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 발현에 적합한 조건하에 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 분리하는 단계.
제9양태에서, 본 발명은 작물의 식물 초장, 부피, 분얼(tillering), 수확량, 꽃 기관 크기, 또는 종자 크기를 조절; 또는
작물의 식물 초장, 부피, 분얼, 수확량, 꽃 기관 크기, 또는 종자 크기의 조절을 위한 재료의 제조에 대한 상기 기재된 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
제10양태에서, 본 발명은 작물에서 식물 초장 조절 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 단계를 포함하는, 작물의 식물 초장, 부피, 분얼, 수확량, 꽃 기관 크기, 또는 종자 크기를 조절하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 식물 초장 및 부피의 감소, 및 분얼 및 수확량의 증가는 작물에서 식물 초장 조절 유전자의 발현 또는 활성의 증가에 의해 달성될 수 있으며; 꽃 기관 크기, 종자 크기, 식물 초장, 또는 부피의 증가는 작물에서 식물 초장 조절 유전자의 발현 또는 활성의 억제에 의해 달성될 수 있다;
제11양태에서, 본 발명은 상기 기재된 식물 초장 조절 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 유전자에 대한 작용제(agonist) 또는 길항제를 제공한다.
제12양태에서, 본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 식물 줄기 또는 잎에서 특이적 발현을 위한 프로모터를 제공한다:
(1) 서열번호 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드;
(2) 스트린전트 조건하에서 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있고, 식물 줄기 또는 잎에서 표적 유전자의 특이적 발현을 이끌 수 있는 폴리뉴클레오티드; 및
(3) 서열번호 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 70% 이상(바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 98%, 99%와 같은 95% 이상)의 동일성을 가지고, 식물 줄기 또는 잎에서 표적 유전자의 특이적 발현을 이끌 수 있는 폴리뉴클레오티드.
제13양태에서, 본 발명은 식물 줄기 또는 잎에서 표적 유전자의 특이적 발현을 이끌기 위한 상기 프로모터의 용도에 관한 것이다.
제14양태에서, 본 발명은 식물 줄기 또는 잎에서 특이적 발현을 위한 상기 기재된 프로모터를 각각 포함하는 구축물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 기재된 구축물은 식물 줄기 또는 잎에서 특이적 발현을 위한 프로모터의 다운스트림에 작동가능하게 연결된, 표적 유전자의 삽입을 위한 적어도 하나의 다클론성 부위(예를 들면, 제한효소부위)를 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 구축물은 발현 벡터이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 구축물은 서로 작동가능하게 연결된 하기의 요소들을 포함한다: 상기 프로모터 및 표적 유전자.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 표적 유전자는 외래 유전자이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 표적 유전자는 구조 유전자이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 표적 유전자는 특정 기능을 가지는 단백질을 암호화할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 표적 유전자는 상기 프로모터의 2000 bp 이하(바람직하게는 1000 bp 이하, 더욱 바람직하게는 500 bp 이하, 가장 바람직하게는 300 bp 이하) 다운스트림에 위치한다.
본원에 제공된 명세서의 면에서, 본 발명의 다른 양태는 당업자에게 명백할 것이다.
도 1은 야생형(Wt) 애기장대 식물 및 ELb(Eui-like b) 과발현 형질전환 애기장대(ELb-OE) 식물의 상단 사진을 보여준다. ELa(Eui-like a) 과발현 형질전환 애기장대(ELa-OE) 식물 및 벼 OsEui 과발현 형질전환 애기장대 (OsEui-OE) 식물은 대조군이다.
도 2는 야생형(WT) 애기장대 식물 및 ELb RNAi / ela 애기장대 식물 사이에 생장 프로파일의 비교를 보여준다.
도 3은 Elb RNAi / ela 애기장대 식물 및 야생형(WT) 애기장대 식물 사이에 꽃 기관 및 종자의 생장 프로파일의 비교를 보여준다.
도 4는 ELb 프로모터에 의해 개시된 리포터 유전자 GUS의 조직-특이적 발현을 보여준다. 화살표는 파란색으로 보이는 영역을 보여준다.
도 5는 야생형 벼(TP309) 식물 및 Elb 과발현 벼(ELb-OE) 식물 사이에 생장 프로파일의 비교를 보여준다.
도 6은 야생형 벼(TP309) 식물 및 Elb 과발현 벼(ELb-OE) 식물의 식물 초장의 통계적 분석 결과를 보여준다.
도 7은 야생형 벼(TP309) 식물 및 Elb 과발현 벼(ELb-OE) 식물의 효과적인 분얼수의 통계적 분석 결과를 보여준다.
도 8은 야생형 벼(TP309) 식물 및 Elb 과발현 벼(ELb-OE) 식물 사이에 하나의 식물로부터 유래한 곡물 무게의 비교 결과를 보여준다.
광대한 연구에 의해, 작물에서 식물 초장, 부피, 분얼, 수확량, 꽃 기관 크기 및 종자 크기를 조절하는데 유용한 ELb 유전자를 발견하였다. ELb 유전자의 발현을 증가시킴으로써 식물 초장 및 부피는 감소시키고, 효과적인 분얼수 및 작물의 수확량은 증가시키는 것이 가능하다. 또한 ELb 유전자의 발현을 감소시킴으로써 꽃 기관 크기 및 종자 크기를 증가시키는 것이 가능하다. 본 발명은 상기 발견에 기초한다.
본원에 사용된, 용어 "작물" 또는 "작물들"은 벼과(Gramineae ), 십자화과(Cruciferae ), 및 자일로파이타(xylophyta) 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 더욱 바람직하게는, 벼과는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 수수 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않으며; 또는 십자화과는 애기장대를 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된, "분리된(isolated)"은 본래의 환경(본래의 환경은 천연물질에 대한 천연 환경을 말한다)으로부터 분리된 물질을 말한다. 예를 들면, 살아있는 세포에 존재하는 천연 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 비분리된(non-isolated) 또는 비정제된(non-purified) 것이나, 천연 상태에서 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 흔히 수반하는 다른 물질들로부터 분리(separation)되었을 때, 분리된 또는 정제된 이라는 용어를 사용한다.
본원에 사용된, "분리된 식물 초장 조절 폴리펩티드", "분리된 ELb 단백질" 또는 "분리된 ELb 폴리펩티드"는 천연 상태에서 ELb 단백질을 수반하는 다른 단백질, 지질, 당류 또는 다른 물질들로부터 실질적으로 자유로운 ELb 단백질을 말한다. 당업자는 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 ELb 단백질을 정제할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 비환원 폴리아크릴아미드 겔에서 단일 주요 밴드를 형성한다.
본원에 사용된, 용어 "함유하다", "가지는" 또는 "포함하다"는 "포함하는", "주로 구성되는", "실질적으로 구성되는" 및 "구성되는"의 의미를 포함하며; "주로 구성되는", "실질적으로 구성되는" 및 "구성되는"은 "함유하다", "가지는" 또는 "포함하다"의 특정한 용어들이다.
ELb 폴리펩티드 및 이의 용도
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드이다. 본 발명의 폴리펩티드는 정제된 천연 산물, 화학적으로 합성된 산물 또는, 재조합 기술을 이용하여 원핵생물 또는 진핵생물 숙주(예를 들면, 세균, 효모, 고등식물, 곤충 및 포유동물 세포)로부터 정제된 산물일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 재조합 생산에 사용된 숙주세포에 따라 글리코실화(glycosylated) 또는 비글리코실화(non-glycosylated)될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 개시 부위(initiating site)에서 메티오닌 잔기를 포함할 수도, 포함하지 않을 수도 있다.
본 발명은 또한 ELb 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 ELb 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.
본 발명에서, 용어 "ELb 단백질"은 ELb 단백질의 활성을 가지는 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드를 의미한다. 또한 상기 용어는 ELb 단백질과 동일한 기능을 가지는 서열번호 3의 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 C-말단 및/또는 N-말단에 하나 이상의 아미노산(일반적으로 20개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하)의 부가뿐만 아니라 몇몇 아미노산(일반적으로 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 30, 더욱 바람직하게는 1 내지 20, 가장 바람직하게는 1 내지 10, 더더욱 바람직하게는 1 내지 8 또는 1 내지 5)의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, 하나의 아미노산의 동일하거나 유사한 특성을 가지는 또 다른 아미노산으로의 치환에 의해 단백질의 기능은 전형적으로 변화되지 않는다. 또 다른 예로, C-말단 및/또는 N-말단에 하나 또는 몇몇 아미노산의 부가에 의해서도 단백질의 기능은 전형적으로 변화되지 않는다. 또한 상기 ELb 단백질은 ELb 단백질의 활성 단편 및 유도체를 포함할 수 있다.
폴리펩티드의 변이체는 상동(homologous) 서열, 보존적 변이체, 대립유전자(allelic) 변이체, 천연 돌연변이체, 유도 돌연변이체, 높거나 낮은 스트린전트 조건하에서 ELb-단백질을 암호화하는 DNA 서열과 혼성화하는 DNA 서열에 의해 암호화된 단백질, 및 ELb 단백질에 대한 항체를 사용하여 획득된 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 또한, 본 발명은 ELb 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합된 단백질과 같은 다른 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 거의 전장(full-length) 폴리펩티드 외에, ELb 단백질의 가용성 단편을 포함한다. 상기 단편은 ELb 단백질의 서열에서 적어도 약 20개의 인접 아미노산, 보통은 적어도 약 30개의 인접 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 50개의 인접 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80개의 인접 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 약 100개의 인접 아미노산을 일반적으로 포함한다.
또한, 본 발명은 ELb 단백질 또는 폴리펩티드의 유사체를 제공한다. 상기 유사체 및 천연 ELb 단백질 사이의 차이는 아미노산 서열에서의 차이, 임의의 서열 변화를 초래하지 않는 변형 패턴에서의 차이, 또는 둘 다일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 천연 또는 유도된 유전적 변이체를 포함할 수 있다. 상기 유도 변이체는 방사선 노출 또는 돌연변이원(mutagen)에 의한 무작위 돌연변이법(random mutagenesis) 뿐만 아니라, 자리지정 돌연변이유발법(site-directed mutagenesis) 또는 다른 알려진 분자생물학적 기술과 같은 다양한 기술에 의해 획득될 수 있다. 또한, 상기 유사체는 천연의 L-아미노산 잔기와는 다른 잔기(예를 들면, D-아미노산)를 포함하는 유사체, 및 비자연적으로 생기거나 합성된 아미노산(예를 들면, β, γ-아미노산)을 함유하는 유사체를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 상기 기재된 대표적인 폴리펩티드에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
상기 변형된 형태(일반적으로 주된 구조적 변화가 초래되는 것이 아닌)들은 아세틸화 또는 카르복실화 형태와 같은, 생체내 또는 시험관내에서 화학적으로 유래된 펩티드의 형태를 포함한다. 또한, 상기 변형은 글리코실화를 포함한다. 또한, 상기 변형된 형태는 인산화된 아미노산(예를 들면, 포스포타이로신, 포스포세린, 포스포트레오닌)을 함유하는 서열 또는 단백질분해에 대한 저항성 향상 또는 용해도를 최적화시키기 위해 변형된 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명에서, "ELb 단백질의 보존된 변이체 폴리펩티드"는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 비교했을 때, 유사하거나 또는 비교할만한 특성을 갖는 다른 아미노산에 의해 치환된 20개 이하, 바람직하게는 기껏해야 10개, 더욱 바람직하게는 기껏해야 5개, 가장 바람직하게는 기껏해야 3개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 바람직하게는, 상기 보존된 변이체 펩티드는 표 1에 따른 아미노산의 치환에 의해 생성된다.
아미노산 잔기 대표적 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro; Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe Leu
Leu (L) Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Leu
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala Leu
또한 본 발명은, 본 발명의 ELb 단백질 또는 이의 보존적 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다. 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 영역 서열은 서열번호 2로 표시되는 코딩 영역 서열 또는 이의 축퇴(degenerate) 변이체와 동일할 수 있다. 본원에 사용된, "축퇴 변이체"는 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 단백질을 암호화하지만, 서열번호 2로 표시되는 코딩 영역 서열과는 다른 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
서열번호 3으로 표시되는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.
용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 서열 및 상기 기재된 서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 3으로 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 단편에 관한 것이다. 본원에 사용된 "폴리뉴클레오티드 단편"은 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 30개, 더욱 바람직하게는 적어도 50개, 가장 바람직하게는 적어도 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드 단편은 ELb 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 결정 및/또는 분리하기 위해, 핵산 증폭 기술(예를 들면, PCR)에 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따라, ELb 유전자는 바람직하게는 애기장대 유래라는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명의 구현예는 애기장대 ELb 유전자와 높은 상동성(예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.
본 발명의 ELb 단백질을 암호화하는 전장 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편은 PCR 증폭, 재조합 기술 또는 화학적 합성 방법을 사용하여 생산될 수 있다. PCR 증폭을 위한 프라이머는 관련된 뉴클레오티드 서열, 특히 오픈 리딩 프레임(open reading frames)의 서열에 따라 고안될 수 있으며, 이미 밝혀진 상업적으로 이용가능한 cDNA 라이브러리 또는 당업자에게 알려진 통상의 방법에 의해 만들어진 cDNA 라이브러리는 주형으로서 사용될 수 있다. PCR 증폭은 바람직한 서열을 얻기 위해 상기 프라이머 및 라이브러리를 사용하여 수행될 수 있다. 얻고자 하는 서열의 길이가 길면, 2번 또는 여러 번의 PCR을 수행하여, 올바른 순서대로 증폭된 단편들을 연결(ligation)하는 것이 일반적으로 필요하다.
일단 바람직한 서열이 획득되면, 많은 양의 바람직한 서열이 재조합 기술에 의해 획득될 수 있다. 보통, 바람직한 서열은 벡터내로 클로닝되고, 벡터는 세포내로 도입되며, 그 다음에 바람직한 서열은 통상의 방법에 의해 증식된 숙주세포로부터 분리된다.
게다가, 상기 바람직한 서열, 특히 더 짧은 단편은 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 일반적으로, 다수의 작은 단편들은 맨 처음 합성되어 질 수 있으며, 그 다음에 긴 단편을 만들기 위해 연결될 수 있다.
현재로, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 서열(또는 이의 단편 또는 유도체)을 화학적 합성에 의해 획득하는 것은 전적으로 가능하다. 그 다음에, 이 DNA는 당업계에 알려진 다양한 존재하는 DNA 분자(예를 들면, 벡터) 및 세포 내로 도입될 수 있다. 게다가, 몇몇 돌연변이가 또한 화학적 합성에 의해 본 발명의 단백질 내로 도입될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터 또는 ELb 단백질-암호화 서열을 이용한 유전자 조작으로부터 생성된 숙주세포뿐만 아니라 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 준비하기 위한 방법에 관한 것이다.
통상의 DNA 재조합 기술(Science, 1984; 224:1431)을 사용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 ELb 단백질을 발현 또는 생산하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 일반적으로 하기 단계를 포함한다:
(1) ELb 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(또는 이의 변이체), 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 형질전환 또는 형질도입하는 단계;
(2) 상기 숙주 세포를 적당한 배지에서 배양하는 단계;
(3) 배지 또는 세포로부터 상기 단백질을 분리 및 정제하는 단계.
본 발명에서, ELb 단백질을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
ELb 단백질-암호화 DNA 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
게다가, 발현 벡터는 형질전환된 숙주세포를 선별하는데 유용한 표현형을 제공하기 위해, 바람직하게는, 진핵세포 배양에 유용한 디히드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase) 유전자, 네오마이신 저항성 유전자, 또는 녹색형광단백질(GFP) 유전자, 또는 대장균 배양에 유용한 카나마이신 저항성 또는 암피실린 저항성 유전자와 같은 하나 이상의 선택성 마커 유전자를 포함한다.
상기 기재된 적절한 DNA 서열, 및 적절한 프로모터 또는 조절 서열을 포함하는 벡터는 단백질의 발현을 위해 적당한 숙주세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다.
상기 숙주세포는 세균세포와 같은 원핵세포; 또는 효모세포와 같은 하등 진핵세포; 또는 식물세포와 같은 고등 진핵세포일 수 있다. 대표적인 예는 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 아그로박테리움(Agrobacterium); 효모와 같은 곰팡이 세포; 식물 세포 등일 수 있다.
벡터 내에 삽입된 인핸서(enhancer) 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 고등 진핵세포에서 발현될 때 전사를 촉진할 것이다. DNA 시스-액팅(cis-acting) 인자인 인핸서는 일반적으로 약 10 내지 300 bp를 포함하고, 유전자의 전사를 촉진하기 위해 프로모터에 작용한다.
당업자는 적당한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 숙주 세포를 어떻게 선별하는 방법을 이해할 것이다.
재조합 DNA를 이용한 숙주세포의 형질전환은 당업자에게 주지된 통상의 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 대장균과 같은 원핵세포 숙주에 대해, DNA를 받아들일 수 있는 적격(competent) 세포는 지수생장기 후의 세포를 수확하고, 상기 세포를 CaCl2 로 처리하여 획득할 수 있다. 상기 제조 방법은 당업계에 주지되어 있다. 또 다른 방법으로는 MgCl2 처리를 사용한다. 만약 필요하다면, 형질전환은 또한 전기천공법(electroporation)에 의해 수행될 수 있다. 진핵세포 숙주에 대해, 임의의 적당한 DNA 트랜스펙션 방법, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 공침전법, 또는 미세주입법(microinjection), 전기천공법, 리포좀-캡슐화법 등과 같은 통상의 기계적 방법을 사용할 수 있다. 상기 식물세포는 아그로박테리움 형질전환법 또는 유전자 총 형질전환법, 및 립디쉬(leaf dish) 방법, 미성숙 벼 배아의 형질전환법 등과 같은 방법을 사용하여 형질전환될 수 있다. 상기 형질전환된 식물 세포, 조직, 또는 기관은 변화된 형질을 갖는 식물을 획득하기 위해 통상의 방법에 의해 새로운 식물로 재분화된다.
상기 생성된 형질전환체는 본 발명의 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현하기 위해 통상의 방법으로 배양될 수 있다. 배양 배지는 사용되는 숙주세포에 따라 다양한 통상의 배지로부터 선택될 수 있다. 상기 배양은 숙주세포의 생장에 적합한 조건하에서 수행된다. 상기 선택된 프로모터는 숙주 세포가 적당한 밀도에서 생장하고, 그 후 추가 기간 동안 배양될 때, 적당한 방법(예를 들면, 온도 변화 또는 화학적 유도)을 사용하여 유도될 수 있다.
상기 기재된 재조합 폴리펩티드는 세포 내로 또는 세포막에 발현될 수 있거나, 또는 세포에 의해 분비될 수도 있다. 만약 필요하다면, 상기 재조합 단백질은 물리적, 화학적 및 그 밖에 다른 특성을 이용하는 다양한 분리 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 상기 방법은 당업자에 주지되어 있다. 상기 방법의 예는 제한 없이, 통상의 재생 처리법(renaturation treatments), 단백질 침전제로 처리(염석), 원심분리, 삼투현상에 의한 세균 파괴, ultratreatment, 초원심분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC), 및 다른 액체크로마토그래피, 및 이의 조합을 포함한다.
상기 재조합 ELb 단백질은, 예를 들면, 항체, 폴리펩티드 또는 ELb 단백질의 기능을 억제하거나 향상시킬 수 있는 다른 리간드를 선별하는데 사용될 수 있다. 발현된 재조합 ELb 단백질을 이용한 폴리펩티드 라이브러리의 선별은 ELb 단백질의 기능을 억제 또는 촉진하는 중요한 폴리펩티드 분자를 탐색하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 부분 또는 전체 폴리뉴클레오티드는 조직에서 차별적(differential) 유전자 발현의 분석을 위한 프로브로서 마이크로어레이 또는 DNA 칩("유전자 칩")에 고정될 수 있다. 상기 ELb 단백질의 전사체는 RNA-중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 ELb 단백질에 대한 특이 프라이머를 사용하여 시험관내 증폭에 의해 검출될 수 있다.
또한, 본 발명은 식물에서 ELb 유전자 또는 이의 상동성 유전자의 발현 또는 활성의 조절을 포함하는, 작물의 개량 방법에 관한 것이다. ELb 발현 또는 활성이 촉진되거나 억제되는 것은 개량된 식물의 형질에 달려 있다. 식물 초장 및 부피의 감소, 또는 식물 분얼 및 수확량의 증가에 대한 요구는 작물에서 ELb의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써 충족될 수 있으며; 대안적으로, 꽃 기관 크기, 종자 크기, 식물 초장, 또는 부피의 증가에 대한 요구는 작물에서 식물 초장 조절 유전자의 발현 또는 활성을 억제함으로써 충족될 수 있다.
ELb 유전자 또는 이의 상동성 유전자의 발현을 증가시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들면, ELb-암호화 유전자를 포함하는 발현 구축물은 ELb를 과발현시키기 위해 식물 내로 도입될 수 있거나; 또는 ELb 유전자 또는 이의 상동성 유전자의 발현 촉진은 강력한 프로모터에 의해 추진될 수 있거나; 또는 ELb 유전자의 발현은 인핸서(예를 들면, 벼 왁스(waxy) 유전자의 첫 번째 인트론, 액틴 유전자의 첫 번째 인트론 등)에 의해 촉진될 수 있다. 상기 방법에 적합한 강력한 프로모터는 35s 프로모터, 벼 및 옥수수의 Ubi 프로모터 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
ELb 유전자 또는 이의 상동성 유전자의 발현을 억제하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들면, 억제는 RNA 간섭(RNAi) 또는 유전자 침묵(넉아웃) 기술에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, ELb의 높은 발현을 나타내는 식물을 획득하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) ELb 단백질의 DNA 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 운반하는 아그로박테리움 세포를 제공하는 단계;
(2) 상기 ELb 단백질의 DNA 코딩 서열을 식물 세포, 조직 또는 기관으로 도입하여 식물세포의 염색체 내로 통합시키기 위해, 상기 (1) 단계에 기재된 아그로박테리움 세포를 식물의 세포, 조직, 또는 기관에 접촉시키는 단계;
(3) 상기 ELb 단백질의 DNA 코딩 서열을 포함하는 식물 세포, 조직 또는 기관을 선발하는 단계; 및
(4) 상기 (3) 단계에 기재된 식물 세포, 조직 또는 기관을 새로운 식물로 재분화를 허용하는 단계.
시약, 온도, 압력 등을 포함하는 임의의 적당한 통상의 수단들은 상기 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 ELb 단백질 또는 이의 코딩 유전자의 작용제 또는 길항제에 관한 것이다. 상기 작용제 또는 길항제는 ELb의 활성 또는 발현을 조절할 수 있으므로, 형질개량의 목표를 이루기 위해, ELb 기능에 대한 이들의 효과에 의해 작물에서, 식물 초장, 부피, 분얼, 수확량, 꽃 기관 크기, 또는 종자 크기 등을 조절하는데 사용될 수 있다.
ELb 길항제는 ELb의 활성 및 안정성의 감소, ELb 발현의 하향조절, ELb의 효과적인 작용 시간의 감소, 또는 ELb의 전사 또는 번역을 억제할 수 있는 물질을 말한다. 본 발명에 따르면, 상기 물질은 작물의 꽃 기관 크기, 종자 크기, 식물 초장, 또는 부피의 증가를 위한 유용한 물질로서 사용될 수 있다.
ELb 작용제는 ELb의 활성 증가, ELb의 안정성 유지, ELb 발현의 촉진, ELb의 효과적인 작용 시간의 증가, 또는 ELb의 전사 또는 번역을 촉진할 수 있는 물질을 말한다. 본 발명에 따르면, 상기 물질은 작물의 식물 초장 및 부피의 감소, 및 분얼 및 수확량의 증가를 위한 유용한 물질로서 사용될 수 있다. .
하나의 구현예에서, 본 발명은 오픈 리딩 프레임(ORF)이 61-353, 1363-1585, 1690-1943, 2028-2414, 2559-2979 영역에 위치하고, 전장 cDNA (서열번호 1)가 525개 아미노산(서열번호 3)을 포함하는 단백질을 암호화하는 1578 bp를 가지는, 서열번호 1로 표시되는 게놈 서열을 가지는 ELb 유전자에 관한 것이다. 상기 ELb 유전자는 식물 초장, 부피, 수확량, 분얼 등의 개량을 위한 새로운 수단을 제공하므로, 매우 유망하다.
식물 줄기 또는 잎에서 특이적 발현 및 유전자 발현을 이끌기 위한 프로모 터
본원에 사용된, "프로모터" 또는 "프로모터 영역"은 일반적으로 표적 유전자 코딩 서열의 업스트림 (5')에 위치한 뉴클레오티드 서열을 말하며, 이는 mRNA로 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 개시한다. 일반적으로, 프로모터 또는 프로모터 영역은 올바른 전사의 개시를 위해 필요한 RNA 중합효소 및 다른 인자들의 인지부위를 제공할 수 있다. 본원에 사용된 프로모터 또는 프로모터 영역은 프로모터 변이체, 즉, 치환 변이체, 결실 변이체 및 삽입 변이체를 포함하는, 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체를 포함한다.
본원에 사용된, "조직-특이적 프로모터" 또는 "기관-특이적 프로모터특이적 프로모터 상기 프로모터의 조절하에 임의의 특정 기관 또는 조직에서만 유전자 발현이 일어나는 것을 의미한다.
본원에 사용된, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 2개 이상의 핵산 영역 또는 핵산 서열의 기능적 공간 배열을 의미한다. 예를 들면, 프로모터 영역이 표적 유전자의 핵산 서열에 대해 특정 위치에 존재하므로, 핵산 서열의 전사가 프로모터 영역의 조절하에 있으며, 따라서, 프로모터 영역은 핵산 서열에 대해 "작동가능하게 연결된" 것일 수 있다.
일반적으로, 만약 조직 또는 기관에서 mRNA 발현이 다른 조직 또는 기관보다 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배, 더욱 바람직하게는 적어도 10배, 더욱 바람직하게는 적어도 25배, 더욱 바람직하게는 적어도 50배, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 100배, 가장 바람직하게는 적어도 1000배 더 높다면, 프로모터가 조직-특이 또는 기관-특이적이라고 생각된다.
본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터에 관한 것이다:
(1) 서열번호 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드; 또는
(2) 스트린전트 조건하에서 상기 (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화하고, 식물 줄기 또는 잎에서 표적 유전자의 특이적 발현을 이끄는 폴리뉴클레오티드.
본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 및 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll, 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드는 식물 줄기 또는 잎에서 표적 유전자의 특이적 발현을 이끌 수 있다.
폴리뉴클레오티드 혼성화 기술은 당업자에게 주지되어 있으며, 한 쌍의 특정 폴리뉴클레오티드에 대한 혼성화 프로파일은 이들의 유사성 또는 동일성을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 또한, 서열번호 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고, 서열번호 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 80%, 더더욱 훨씬 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)의 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 프로모터는 식물 조직 또는 기관, 특히 식물 줄기 또는 잎에 특이적이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명자들은 본 발명의 프로모터의 조절하에 ELb 유전자 또는 GUS 유전자가 식물 줄기 및 잎에서는 특이적으로 발현되지만, 다른 조직 또는 기관에서는 실질적으로 발현되지 않는다는 것을 발견하였다.
본 발명의 프로모터는, 프로모터에 대해 외인성(이종성)일 수 있는 표적 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 표적 유전자는 일반적으로 뉴클레오티드 서열(바람직하게는 구조적 뉴클레오티드 서열)이며, 본 발명의 구현예에 따르면, 바람직하게는 식물 줄기 및 잎의 생장을 조절하는 특정 단백질, 특히, 식물 초장 관련 단백질과 같은 특정 기능을 가지는 단백질을 암호화한다.
또한, 본 발명의 프로모터는 프로모터에 대해 외인성(이종성)인 개량된 표적 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 표적 유전자는 촉진된 발현, 변경된 번역 후 변형(예를 들면, 인산화 부위), 번역 산물의 세포외 수송, 향상된 안정성, 세포 신호의 삽입 또는 결실 등과 같은 다양한 바람직한 특성을 갖도록 개량될 수 있다.
게다가, 프로모터 및 표적 유전자는 특정 유전자를 하향조절하도록 고안될 수 있으며, 이는 일반적으로 표적 유전자 서열에 프로모터를 연결하고; 역방향 및 안티센스 방법으로 상기 서열을 개시함으로써 달성된다. 상기 안티센스 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 임의의 뉴클레오티드 서열은 상기 방법으로 조절될 수 있다.
상기 기재된 임의의 프로모터 및 표적 유전자 서열은 구축물, 특히, 재조합 벡터에 포함될 수 있다.
재조합 벡터는 일반적으로 표적 유전자의 전사 개시를 위해 작동가능하게 연결된(일반적으로 5'→3') 프로모터 및 상기 표적 유전자를 포함한다. 만약 필요하다면, 재조합 벡터는 또한 3' 전사 터미네이터, 3' 폴리아데닐화 신호, 다른 비번역 뉴클레오티드 서열, 수송 또는 표적화 뉴클레오티드 서열, 저항성 선별 마커, 인핸서 또는 오페론을 포함할 수 있다.
일반적으로, 표적 유전자는 식물 줄기 또는 잎에서의 특이적 발현을 위한 프로모터의 2000bp 이하(바람직하게는 1000bp 이하, 더욱 바람직하게는 500bp 이하, 가장 바람직하게는 300bp 이하) 다운스트림에 위치한다.
본 발명의 프로모터 외에, 상기 재조합 벡터는 조직-특이적, 구성적, 또는 유도성 프로모터와 같은 하나 이상의 다른 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 기재된 적당한 프로모터 및 표적 유전자를 포함하는 벡터는 단백질 발현에 적합한 숙주세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 장점은 하기와 같다:
(1) 작물의 식물 초장, 부피, 분얼, 수확량, 꽃 기관 크기, 또는 종자 크기를 조절할 수 있는 새로운 분리된 식물 초장 조절 유전자를 제공하므로, 작물 품종을 개량하기 위해 사용될 수 있다.
(2) 본 발명의 조절 유전자는 식물 초장을 감소시키기 위해 작물 내로 형질전환될 수 있으며, 적당히 감소된 식물 초장 및 증가된 효과적인 분얼수는 고수확량 육종의 이상형(ideotypes)이기 때문에, 이는 난쟁이 식물 형태를 위한 육종에 유용할 수 있다. 예를 들면, 벼과 작물에서 다른 발현 수준은 효과적인 분얼수 및 수확량의 증가를 위해 각각 다른 정도로 식물 초장을 감소시키는데 사용될 수 있다.
(3) 식물 줄기 또는 잎에서 특이적인 발현을 이끄는 식물 초장 조절 유전자의 프로모터가 처음으로 분리되었고, 이는 식물 줄기 또는 잎에서 표적 유전자의 특이적 발현을 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 지금 하기 실시예의 조합에서 더욱 상세히 기재된다. 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않고, 단지 예시를 위해 제공된다는 것을 이해해야 한다. 하기 실시예에 특별히 기재되지 않은 분석법은 Sambrook 등 (Molecular Cloning: Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001) 또는 PCR 프라이머: Laboratory Manual (Carl W. Dieffenbach and Gabriela S. Devksler eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)에 기재된 것, 또는 제조자에 의해 추천된 것과 같은 통상의 절차에 따라 수행될 수 있다.
재료
1.1 식물 재료
애기장대(Arabidopsis thaliana), 생태형은 Columbia(Col-0)이다.
T-DNA 삽입된 돌연변이체: ELa (SALK_016089)
벼 품종: 타이페이 309 (Oryza sativa L.ssp Japonica. cv Taipei309, TP309).
1.2 세균 균주 및 플라스미드 벡터
아그로박테리움 튜메파시엔스：GV3101 (Narasimhulu, S.B, et al, Gelvin. 1996. Early transcription of Agrobacterium t-DNA genes in tobacco and maize. Plant Cell 8:873-886 참조), EHA105 (Hood, E.E. et al, 1993, New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgen. Res. 2:208-218 참조).
플라스미드 벡터:
pBluescript SK (pSK): Invitrogen Inc.로부터 구입.
pCambia1300S: pCambia1300RS, CAMBIA로부터 구입.
pBI101.1: Invitrogen Inc.로부터 구입.
pGEM-T Easy 벡터: Promega Inc.로부터 구입.
RNAi 벡터 1300RS: Arkansas State University(USA)로부터 이용가능.
1.3 시약 및 효소
T4 DNA 리가제, 다양한 제한적 엔도뉴클리아제, 및 Taq DNA 중합효소는 MBI Ferment, TaKaRa, New England Biolabs, 또는 Promega로부터 구입되었다. 겔에서 DNA 단편의 회수(Recovery) 키트는 Omega Inc.로부터 구입되었다. 역전사 시스템은 GIBCOBRL로부터 구입되었다. 핵산의 분자량 마커는 MBI 제품이다. pGEM-Teasy 벡터는 Promega Inc.(Madison, USA)로부터 구입되었다. (α-32P)dCTP 는 YaHui Bioengineering Inc.(Beijing, China)로부터 구입되었다. RT-PCR을 위해 SuperScript First-Strand Synthesis System을 사용하는 역전사 키트(#11904-018, Invitrogen)가 사용되었다. 다른 통상의 화학 시약들은 중국에서 수입되거나 생산된 분석학적으로 순수한 제품들이다. 다양한 데옥시뉴클레오티드 프라이머는 Sangon Inc.(Shanghai, China)에 의해 합성되어졌다. DNA 서열은 JiKang Inc.(Shanghai) 또는 Invitrogen Inc.(Shanghai)에 의해 결정되었다. 서열 분석은 Genedoc, DNAStar 소프트웨어 등을 사용하여 완성되었다.
방법
1. 애기장대의 배양 및 형질전환
애기장대의 무균 배양을 위해, 종자는 표면적으로(30초 동안 70% 에탄올 처리 후, 멸균수로 4번 세척) 및 내부적으로(10분 동안 7% 소듐 하이포클로라이트 처리 후, 멸균수로 3번 세척) 멸균처리되었다. 그 후 1/2 MS(1/2 Murashige and Skoog 기본 배지, 0.8% 한천, pH 5.8) 고체배지에 파종하여, 4℃에서 72시간 동안 위치하고 이어서 22℃로 옮겼다. 1주일 후, 상기 유묘는 영양액(HuaWuQue 3g/10L, YongTong Chemical Ltd, Shanghai, China)에 담궈진 인공토양(질석: 흑토(black soil): 펄라이트 = 3:1:0.5)에 이식되었고, 이어서 14/10(L/D)의 일일 주기를 가지는 인공 기후 챔버로 옮겨졌다.
애기장대의 형질전환을 위해, 바람직한 생장 상태의 4 내지 5주 된 식물(더 많은 측생 꽃줄기 및 더 많은 꽃의 발달을 촉진하기 위해, 형질전환 1주일 전에 주요 꽃줄기를 자름으로써 형질전환 효율이 증가된다)이 스프링클(sprinkle)에 의해 처리되었다. 형질전환 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포를 28℃, OD600 ~2.0 에서 배양하여, 4,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후, 형성된 펠릿을 새로 제조한 형질전환 용액(5% 수크로스 및 0.02% Silwet L-77를 포함하는 1/2 MS 액체배지)에 재현탁하고, 최종 농도가 OD600 ~0.6 내지 0.8 가 되도록 배양하였다. 수분된 꽃 및 열매는 형질전환 전에 제거되었고, 토양은 충분한 물을 흡수하도록 하였다. 형질전환 동안, 세균의 현탁액은 몇 방울의 현탁액이 잎에서 떨어질 때까지 애기장대 식물에 뿌려졌다. 밤사이 어둠 속에서 습도를 유지하기 위해, 상기 애기장대는 검은 봉투에 의해 덮어졌다. 24시간 후, 상기 식물은 정상적인 조건으로 옮겨졌다. 7일 후, 형질전환은 상기한 절차에 따라 1번 더 반복되었다. 상기 식물은 종자가 성숙해진 후, 종이 봉투에 수집 및 혼합되었다. 상기 수집된 식물은 7일 동안 데시케이터(dessicator)에 위치시킨 후, 탈곡되었다. 상기 멸균처리된 T1 세대의 종자는 50 ㎍/mL Kan 또는 하이그로마이신을 포함하는 1/2 × MS 배지에 파종되었고, 4℃에서 72시간 동안 위치 후, 정상적인 광 조건하에 위치하였다.
2. 아그로박테리움 튜메파시엔스에 의해 매개된 성숙한 벼 배아 캘러스의 유전자 형질전환
(1) 성숙한 벼 배아의 캘러스 유도
벼 307T의 종자 껍질을 벗기고, 지속적인 진탕(shaking)을 해주면서 70% 에탄올에 1분, 20%(v/v) 소듐 하이포클로라이트에 20 내지 30분 동안 담가두었다. 상기 종자는 멸균수로 5 내지 6번 헹구었다. 멸균한 여과지로 수분을 흡수하여 말린 후, 상기 벼 종자는 MSD 배지에 파종되었고, 캘러스를 유도하기 위해 26℃에서 암배양되었다. 1주일 후, 배유, 어린 싹 및 어린 뿌리는 캘러스를 얻기 위해 제거되었고, 획득된 캘러스는 암조건하에 MSD 배지에서 계대배양되었다. 상기 캘러스는 2 내지 3주마다 계대배양되었다. TP309 종자의 캘러스에 대해, 배지는 NBD가 사용되었다.
(2) 형질전환에 유용한 세균 현탁액의 제조
1일 아침: -70℃에 보관된 소량의 세균이 5 mL YEB(Rif 20 mg/L+ Kan 50mg/L) 액체 배지에 접종되었고, 28℃에서 밤새 진탕 배양되었다.
2일 아침: 상기 세균을 포함하는 1 내지 2 mL YEB 배지가 수집되었고, 25 내지 50 mL AB(20mg/L Rif + 50mg/L Kan) 액체 배지에 옮겨진 후, OD600 ~ 0.5 가 될 때까지 28℃에서 약 4시간 동안 배양되었다.
(3) 공배양
2일 오후: OD600 값의 검출 후, 상기 세균 현탁액은 5,000rpm 에서 15분 동안 원심분리되었고, 형성된 펠릿은 AAM(AS100 포함)에 재현탁되었고, OD600=0.4 내지 0.6이 될 때까지 배양되었다. 상기 세균 현탁액은 벼 캘러스를 포함하는 삼각플라스크에 쏟았고, 상기 캘러스는 가끔 진탕을 하면서 20분 동안 담궈졌으며; 상기 세균 현탁액은 멸균 여과지(또는 피펫)로 수분을 흡수하여 말려진 뒤, 상기 담궈진 캘러스는 그 위에 멸균 여과지의 층을 갖는 2.5% Phytagel을 포함하는 NBD(AS100 포함) 배지에 옮겨졌고, 2 내지 3일 동안 공배양된 후, 각 디쉬에 멸균 여과지가 충분히 촉촉해지도록 1 mL AAM (+AS100) 배지가 첨가되었다.
(4) 스크리닝
멸균 여과지(또 다른 여과지)로 수분을 흡수하여 말린 후, 상기 캘러스는 저항성 캘러스를 선별하기 위해 하이그로마이신(Hyg)을 포함하는 스크리닝 배지에 옮겨졌다. 상기 캘러스는 상기 스크리닝 배지가 1번 교환되는 기간인, 약 30일 동안 암배양되었다.
사용된 스크리닝 배지는 하기와 같다:
0.26% Phytagel MS + 티멘틴(Timentin) 100 mg/L + Hyg 30mg/L를 포함하는 첫 번째 스크리닝 배지;
0.26% Phytagel NBD + 티멘틴 100 mg/L + Hyg 50mg/L를 포함하는 두 번째 스크리닝 배지;
0.26% Phytagel MS + 티멘틴 100 mg/L + Hyg 50mg/L를 포함하는 세 번째 스크리닝 배지.
(5) 전분화(Predifferentiation)
상기 선별된 벼 캘러스는 전분화 배지에 옮겨졌고, 10일 동안 배양되었다.
전분화 배지: 0.45% Phytagel MS + BAP 2 mg/L + NAA 1 mg/L + ABA 5mg/L + Hyg 50mg/L를 포함, pH 5.7, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)은 미포함.
(6) 분화
상기 전분화된 벼 캘러스는 분화배지에 옮겨졌고, 어린 식물로 분화시키기 위해 배양(광, 15 내지 30일)되었다.
분화배지: 0.45% Phytagel NB + BAP 3 mg/L + NAA 0.5mg/L를 포함, pH 5.7, 2,4-D는 미포함.
(7) 발근
상기 녹색의 어린 식물은 발근을 위해 발근 배지에 옮겨졌다.
발근 배지: 0.45% Phytagel 1/2 MS + Hyg 50mg/L를 포함, pH 5.7, 2,4-D는 미포함.
3. 벡터 구축
p35S :: ELb 벡터 구축
ELb 단백질의 cDNA 코딩 영역 서열은 RT-PCR에 의해 증폭되었다. 상기 증폭 단계는 하기와 같다: 애기장대 식물의 총 RNA는 제조자에 의해 제공되는 설명서에 따라 RNeasy 식물 미니 키트(Qiagen)에 의해 추출되었고, 상기 추출된 총 RNA는 ELb cDNA를 제조하기 위해 M-MLV 역전사효소(Promega)를 이용하여 역전사되었다. 상기 ELb 단백질의 cDNA 코딩 영역 서열은 Takara perobest DNA 중합효소 및 주형으로서 사용된 상기 cDNA를 이용하여 PCR 반응에 의해 증폭되었다. 상기 반응에 사용된 프라이머는 하기와 같다:
업스트림 프라이머(서열번호 7): 5'-TGAGGATCCAAATAAAATAAAAAG-3' (밑줄친 부분: BamHI 부위)；
다운스트림 프라이머(서열번호 8): 5'-AAAGTCGACCACACACAAAGCAAA-3' (밑줄친 부분: ClaI 부위).
PCR 조건: 94℃에서 3분; 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 및 72℃에서 2분으로 35 사이클; 72℃에서 10분. 상기 PCR 산물은 16℃에 보관되었다.
상기 PCR 산물은 회수되어 BamH1 및 ClaI 에 의해 절단되었다. 상기 산물은 회수되었고, 그 다음에 pSK 벡터에 연결되었으며, 또한, 상기와 같이 절단되고 회수되었다. 상기 회수된 벡터는 DH5α 세포를 형질전환하는데 사용되었다. 제한효소 절단(restriction cleavage)에 의해 확인된 올바른 클론이 시퀀싱을 위해 선별되었다. 시퀀싱에 의해 확인된 올바른 서열을 가지는 클론에 대해, 상기 ELb cDNA 코딩 영역은 BamHI/ClaI로 절단되어, BamHI/ClaI에 의해 절단된 이중 발현 벡터인 pCambia1300S에 연결되었고, 형질전환 클론을 얻기 위해 DH5α 세포로 형질전환되었다. 추출 후, 제한효소 절단에 의해 확인된 올바른 플라스미드는 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101 및 EHA105 세포에 형질전환되었다. 상기 플라스미드는 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포로부터 추출되어 DH5α 세포로 다시 형질전환되었다. 상기 플라스미드는 DH5α로부터 추출되어, 상기 올바른 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포를 확인하기 위해, 제한효소에 의해 절단되었다. 상기 형질전환된 애기장대 식물은 스프링클 방법에 의해 애기장대 세포의 형질전환에 의해 획득되었고, 상기 형질전환된 벼 식물은 성숙한 벼 배아 캘러스의 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전적 형질전환에 의해 획득되었다.
pELb 프로모터 :: GUS 벡터 구축
업스트림 및 다운스트림 프라이머는 GenBank로부터 유용한 서열(GeneID: 832559)을 기초로 고안되었고, 상기 프라이머는 ELb 유전자의 번역 개시부위의 1.4kb 업스트림의 범위 내에 있다. 야생형 애기장대 Columbia의 어린 식물(7일된)로부터 추출된 게놈 DNA는 PCR을 수행하기 위한 주형으로 사용되었다. 상기 프라이머 하기와 같다:
업스트림 프라이머(서열번호 9): 5'-CTGCTGCAGACTCTATTTCCA-3' (밑줄친 부분: PstI 부위)；
다운스트림 프라이머(서열번호 10): 5'-TTCAGGATCCTTTACTTTTTATTTT-3' (밑줄친 부분: BamHI 부위);
증폭 조건: 94℃에서 3분; 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분으로 35 사이클; 72℃에서 10분. 상기 산물은 16℃에서 보관되었다.
상기 PCR 산물은 PstI/BamHI 효소에 의해 절단되었고, 그 후 pSK 벡터의 해당하는 PstI/BamHI 부위에 연결되었다. 제한효소 절단에 의해 확인된 올바른 클론이 시퀀싱을 위해 선발되었다. 시퀀싱에 의해 확인된 올바른 서열을 가지는 클론에 대해, 상기 ELb 프로모터 영역(서열번호 13로 표시됨)은 PstI/BamHI에 의해 절단되어, PstI/BamHI에 의해 절단된 이중 발현 벡터인 pBI101.1에 연결되었고, 대장균 DH5α 세포에 형질전환되었다. 추출 후, 제한효소 절단에 의해 확인된 올바른 플라스미드는 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101 세포로 형질전환되었다. 상기 플라스미드는 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포로부터 추출되었고, DH5α 세포로 다시 형질전환되었다. 상기 플라스미드는 DH5α로부터 추출되었고, 상기 올바른 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포를 확인하기 위해, 제한효소에 의해 절단되었다. 한편, 상기 pBI101.1 벡터는 음성대조군 및 양성대조군으로서 GV3101 세포에 각각 형질전환되었다.
ELa T- DNA 삽입 돌연변이체의 백그라운드하에서 ELb 형질전환 RNAi 식물 구축
형질전환 클론은 하기와 같은 RNAi 벡터 1300RS를 사용하여 구축되었다: 야생형 애기장대 Columbia의 어린 식물(7일된)의 게놈 DNA가 ELb 유전자의 4번째 엑손에서 약 500bp의 서열을 증폭하기 위해 PCR을 수행하기 위한 주형으로서 사용되었다. 상기 프라이머는 하기와 같다:
업스트림 프라이머(서열번호 11): 5'-AATGGTACCACAAGAAACAA-3' (밑줄친 부분: KpnI 부위);
다운스트림 프라이머 (서열번호 12): 5'-TCTAGATTTGAGCTGAAAAAA-3' (밑줄친 부분: XbaI 부위).
증폭 조건: 94℃에서 3분; 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 30초로 35 사이클; 72℃에서 10분. 상기 산물은 16℃에 보관되었다.
상기 PCR 산물은 KpnI/XbaI 효소로 절단되었고, 그 후 pSK 벡터의 해당하는 KpnI/XbaI 부위에 연결되었다. 제한효소 절단에 의해 확인된 올바른 클론은 시퀀싱을 위해 선발되었다. 시퀀싱에 의해 확인된 올바른 서열을 가지는 클론에 대해, ELb의 부분 단편이 KpnI/XbaI에 의해 절단되어, KpnI/XbaI에 의해 절단된 이중 발현 벡터 1300RS 에 연결되었고, 대장균 DH5α 세포에 형질전환되었다. 추출 후, 제한효소 절단에 의해 확인된 올바른 플라스미드는 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101 세포에 형질전환되었다. 상기 플라스미드 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포로부터 추출되었고, DH5α 세포로 다시 형질전환되었다. 상기 플라스미드는 DH5α로부터 추출되었고, 상기 올바른 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포를 확인하기 위해, 제한효소에 의해 절단되었다.
ELa T-DNA 삽입 돌연변이체는 ELa T-DNA 삽입 돌연변이체의 백그라운드하에 애기장대의 ELb RNAi 형질전환 식물(ELb RNAi / eLa)을 획득하기 위해, 스프링클 방법에 의해 형질전환되었다.
실시예 1: ELb 유전자의 클로닝
본 발명의 발명자는 애기장대의 게놈 서열을 검색하고 생물정보학적 연구를 수행함으로써, 2개의 p450 모노옥시게나제(monooxygenase) 유전자 즉, 714A1 및 714A2를 발견하였다. 상기 유전자들은 지베렐린의 조절하에 식물 생장 및 발달에 관여하는 것으로 처음에 예측되었고, 발명자에 의해 ELa(또는 AtEuila) 및 ELb(또는 AtEui1b)로서 명명되었다.
ELb 유전자 코딩 영역의 게놈 DNA 서열은 서열번호 1로 표시되었으며; ELb 유전자 코딩 영역의 cDNA 서열은 서열번호 2로 표시되었으며; ELb 단백질 서열은 서열번호 3으로 표시되었다. ELa 유전자 코딩 영역의 게놈 서열은 서열번호 4로 표시되었으며; ELa 유전자 코딩 영역의 cDNA 서열은 서열번호 5로 표시되었으며; ELa 단백질 서열은 서열번호 6으로 표시되었다.
실시예 2: ELb 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대 식물에서 감소된 식물 초장 및 부피
본 실시예에서, 발명자는 ELb, ELa, 또는 OsEui를 과발현하는 형질전환 애기장대 식물을 각각 제조하였다. 야생형 (WT) 식물, 애기장대 ELa(ELa-OE)를 과발현하는 형질전환 식물, 및 벼 OsEui를 과발현하는 형질전환 식물이 대조군으로서 사용되었다.
생장 프로파일은 생장 4주 후에 관찰되었고, 그 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 야생형 애기장대 식물은 가장 컸고, ELb 과발현 식물은 야생형 식물보다 실질적으로 더 작았으며, ELa 과발현 식물 및 OsEui 과발현 식물은 가장 작았다.
생장 7주 후, 발명자는 야생형 식물 및 ELb, ELa, 및 벼 OsEui를 과발현하는 식물의 초장을 결정하였고, 그 식물 초장의 평균값은 각각 26.2cm, 14.2cm, 9.63cm, 및 3.7cm 였다. 따라서, ELb를 과발현하는 상기 형질전환 애기장대 식물의 초장은 야생형 식물보다 현저하게 낮았다.
실시예 3: ELb RNAi 또는 넉아웃 돌연변이는 식물 초장 및 부피를 증가시킨다
본 실시예에서, 발명자는 ELa T-DNA 삽입 돌연변이체, ELb RNAi 형질전환 애기장대 식물(ELb RNAi / eLa) 및 ELb 유전자가 넉아웃된 애기장대 변이체 식물을 준비하였다. 두 식물의 생장 10일 후, 식물 초장 및 부피에 대한 ELb RNAi 또는 넉아웃 돌연변이의 효과가 관찰되었고, 대조군으로서 동일한 조건하에 배양된 야생형 식물과 비교되었다.
ELb RNAi/eLa 식물 및 야생형 식물의 생장 프로파일은 도 2에 나타내었다. 야생형 식물과 비교했을 때, ELb RNAi/eLa 식물 잎의 면적, 식물 초장 및 부피는 현저하게 증가되었다.
게다가, 야생형 식물과 비교했을 때, ELb 넉아웃 돌연변이체(ELa T-DNA 삽입의 백그라운드에서)의 잎의 면적, 식물 초장, 및 부피 또한 현저하게 증가되었다.
따라서, 감소 또는 침묵된 ELb 발현은 식물 초장 및 부피의 증가를 야기한다는, 즉, ELb는 유전자 식물 초장 및 부피의 감소와 관계된 유전자라는 결론에 도달할 수 있다.
실시예 4: ELb RNAi / ela 또는 넉아웃 돌연변이는 꽃 기관 크기 및 종자 크기를 증가시킨다
본 실시예에서, 발명자는 ELb RNAi/eLa 애기장대 식물 또는 ELb 넉아웃 애기장대 식물(실시예 3에서 생성됨)의 꽃 기관 및 종자에 대한 생장 프로파일을 관찰하였고, 대조군인 야생형 애기장대 식물의 꽃 기관 및 종자와 비교하였다.
ELb RNAi/eLa 애기장대 식물 및 야생형 애기장대 식물의 꽃 기관 및 종자에 대한 생장 프로파일은 도 3에 나타내었다. ELb RNAi/eLa 애기장대 식물의 꽃 기관 및 종자는 야생형 식물의 꽃 기관 및 종자보다 현저하게 컸다.
게다가, ELb 넉아웃 돌연변이체의 꽃 기관 및 종자 또한 야생형 식물의 꽃 기관 및 종자보다 실질적으로 더 컸다.
따라서, 감소 또는 침묵된 ELb 발현은 식물의 꽃 기관 크기 및 종자 크기의 증가를 야기한다는, 즉, ELb는 꽃 기관 크기 및 종자 크기의 감소와 관련된 유전자라는 결론에 도달할 수 있다.
실시예 5: ELb 프로모터에 의해 개시된 GUS 리포터 유전자의 조직-특이적 발현
본 실시예에서, 발명자는 형질전환 애기장대 식물을 제조하기 위해 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포로 형질전환될 수 있는 pELb 프로모터:: GUS 벡터를 구축하였다. 식물에서 GUS 리포터 유전자의 발현은 GUS 리포터 유전자를 검출하기 위한 통상의 분석법에 의해 관찰되었다.
상기 결과는 도 4에 나타내었다. GUS 리포터 유전자는 식물 줄기 및 잎의 발육양호 부위에서 발현되었지만, 뿌리에서는 본질적으로 발현되지 않았다. 따라서, ELb 유전자는 조직-특이적 유전자이다.
실시예 6: ELb 과발현 형질전환 벼의 식물 초장 감소
본 실시예에서, 발명자는 ELb 과발현 형질전환 벼 식물(ELb-OE)을 제조하였고, 벼 식물에 대한 ELb 과발현의 효과를 관찰하였다. 동일한 생장조건에서 배양된 야생형 벼 식물 TP309 가 대조군으로서 사용되었다.
생장 110일 후, 상기 식물들의 생장 프로파일은 도 5에 나타내었다. ELb 과발현 형질전환 벼 식물의 초장은 야생형 식물보다 현저하게 낮다는 것을 보여주었다. 도 6은 ELb 과발현 식물 및 야생형 식물의 초장을 보여주는 통계적 히스토그램이다.
실시예 7: ELb 과발현 형질전환 벼의 효과적인 분얼수 및 수확량의 증가
본 실시예에서, 발명자는 벼 식물의 분얼 및 수확량에 대한 ELb 과발현의 효과를 증명하기 위해, ELb 과발현 형질전환 벼 식물(ELb-OE) 및 야생형 벼 식물 TP309의 분얼수 및 수확량을 검출하였다.
효과적인 분얼은 배양된 식물이 수염을 낸(tasseled) 후에 그 수를 측정하였고, 통계적 결과는 도 7에 나타내었다. 야생형 식물의 분얼수는 약 10개인 반면에, ELb 과발현 식물의 분얼수는 약 20 내지 22개였다. 따라서, ELb 과발현은 상기 식물의 효과적인 분얼수를 현저하게 증가시킬 수 있다는 결론에 도달할 수 있다.
ELb 과발현 식물 및 야생형 식물의 수확량은 식물의 성숙 후에 분석되었다. 상기 결과는 도 8에 나타내었다. ELb 과발현 형질전환 벼 식물에 대한 하나의 단일 식물의 곡물 무게는 현저하게 증가하였다는 결론에 도달할 수 있다.
실시예 8: ELb 변이체의 기능
p35S :: ELb 벡터에서 ELb cDNA 코딩 영역은 서열번호 3과 유사한 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 코딩 서열에 의해 대체되었고, 단지 차이는 야생형 ELb 단백질의 동일한 위치에 있는 Ile 과 비교했을 때, 서열의 522 위치에 있는 Leu 이다. 상기 벡터는 형질전환 식물을 제조하기 위해, 상기한 바와 같이 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포에 형질전환되었다. 그 결과, 형질전환 식물의 초장은 야생형 식물보다 더 낮았다.
본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원들은 각각의 공개문헌, 특허, 또는 특허출원이 참조에 의해 원용되어 개별적으로 나타내어진 것처럼, 모두 참조에 의해 원용된다. 게다가, 다양한 변형 또는 변화는 본원에 기재된 내용 면에서 당업자에 의해 만들어질 수 있으며, 상기 등가물은 또한 본원에서 하기의 청구항에 의해 한정된 범위에 포함되어야 한다는 것을 이해해야 한다.
<110> SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CAS <120> A PLANT HEIGHT REGULATORY GENE AND USES THEREOF <130> 074112PCWO <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3040 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 aagaagtgaa gatgcaaata aaataaaaag taaaagatcc tgaatagaca aaaagttaaa 60 atggagagtt tggttgttca tacggtaaat gcaatttggt gcatagttat tgtcggaatc 120 ttcagcgtag gttatcatgt gtatggaaga gcggtggtgg agcagtggag gatgcggagg 180 agtttaaagt tgcaaggcgt gaagggtcct ccaccgtcga tctttaacgg caatgtgtcg 240 gagatgcaac ggattcagtc ggaggctaaa cactgttccg gcgataacat catttctcat 300 gactattctt cttctctatt tcctcatttc gatcactggc gaaaacaata cggtttgttt 360 tttaaatctc gtttagtaca aaatgcatac atataacaat atcaaaaaat tcatttaaat 420 cgtaaactag aacaacattt ataaatctat taactacata tgaagtttca tttacacagt 480 ttttaagttt atgggtttga tattcgagcc atatcatcgc attaaaaaca aaaaaatccc 540 aaatgcacta gtggttaaaa gattaaaaaa aatatattgt tttttgatag agttcaaact 600 ttttcattat gatttcaatt atcttggctt ctcatacatt ttaaataata aatccttcaa 660 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Lys Leu Gln Gly Val Lys 35 40 45 Gly Pro Pro Pro Ser Ile Phe Asn Gly Asn Val Ser Glu Met Gln Arg 50 55 60 Ile Gln Ser Glu Ala Lys His Cys Ser Gly Asp Asn Ile Ile Ser His 65 70 75 80 Asp Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro His Phe Asp His Trp Arg Lys Gln 85 90 95 Tyr Gly Arg Ile Tyr Thr Tyr Ser Thr Gly Leu Lys Gln His Leu Tyr 100 105 110 Ile Asn His Pro Glu Met Val Lys Glu Leu Ser Gln Thr Asn Thr Leu 115 120 125 Asn Leu Gly Arg Ile Thr His Ile Thr Lys Arg Leu Asn Pro Ile Leu 130 135 140 Gly Asn Gly Ile Ile Thr Ser Asn Gly Pro His Trp Ala His Gln Arg 145 150 155 160 Arg Ile Ile Ala Tyr Glu Phe Thr His Asp Lys Ile Lys Gly Met Val 165 170 175 Gly Leu Met Val Glu Ser Ala Met Pro Met Leu Asn Lys Trp Glu Glu 180 185 190 Met Val Lys Arg Gly Gly Glu Met Gly Cys Asp Ile Arg Val Asp Glu 195 200 205 Asp Leu Lys Asp Val Ser Ala Asp Val Ile Ala Lys Ala Cys Phe Gly 210 215 220 Ser Ser Phe Ser Lys Gly Lys Ala Ile Phe Ser Met Ile Arg Asp Leu 225 230 235 240 Leu Thr Ala Ile Thr Lys Arg Ser Val Leu Phe Arg Phe Asn Gly Phe 245 250 255 Thr Asp Met Val Phe Gly Ser Lys Lys His Gly Asp Val Asp Ile Asp 260 265 270 Ala Leu Glu Met Glu Leu Glu Ser Ser Ile Trp Glu Thr Val Lys Glu 275 280 285 Arg Glu Ile Glu Cys Lys Asp Thr His Lys Lys Asp Leu Met Gln Leu 290 295 300 Ile Leu Glu Gly Ala Met Arg Ser Cys Asp Gly Asn Leu Trp Asp Lys 305 310 315 320 Ser Ala Tyr Arg Arg Phe Val Val Asp Asn Cys Lys Ser Ile Tyr Phe 325 330 335 Ala Gly His Asp Ser Thr Ala Val Ser Val Ser Trp Cys Leu Met Leu 340 345 350 Leu Ala Leu Asn Pro Ser Trp Gln Val Lys Ile Arg Asp Glu Ile Leu 355 360 365 Ser Ser Cys Lys Asn Gly Ile Pro Asp Ala Glu Ser Ile Pro Asn Leu 370 375 380 Lys Thr Val Thr Met Val Ile Gln Glu Thr Met Arg Leu Tyr Pro Pro 385 390 395 400 Ala Pro Ile Val Gly Arg Glu Ala Ser Lys Asp Ile Arg Leu Gly Asp 405 410 415 Leu Val Val Pro Lys Gly Val Cys Ile Trp Thr Leu Ile Pro Ala Leu 420 425 430 His Arg Asp Pro Glu Ile Trp Gly Pro Asp Ala Asn Asp Phe Lys Pro 435 440 445 Glu Arg Phe Ser Glu Gly Ile Ser Lys Ala Cys Lys Tyr Pro Gln Ser 450 455 460 Tyr Ile Pro Phe Gly Leu Gly Pro Arg Thr Cys Val Gly Lys Asn Phe 465 470 475 480 Gly Met Met Glu Val Lys Val Leu Val Ser Leu Ile Val Ser Lys Phe 485 490 495 Ser Phe Thr Leu Ser Pro Thr Tyr Gln His Ser Pro Ser His Lys Leu 500 505 510 Leu Val Glu Pro Gln His Gly Val Val Ile Arg Val Val 515 520 525 <210> 4 <211> 2778 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 agtgctcgac tatacatata gccaaagaag agcagaaaaa tcaaagtcgt gagttcagaa 60 gctataacaa aatttctaag aaaaagaaag ataagaaaat ggagaatttt atggtagaga 120 tggccaagac catttcgtgg atagttgtaa taggagtgtt aggtttaggg attcgtgttt 180 acggtaaagt gatggcggag caatggagga tgcggaggaa gctgacgatg cagggcgtga 240 agggtcctcc gccgtcgcta tttcgtggaa acgtgccgga gatgcaaaaa atccagtcac 300 aaataatgag taactctaaa cactactccg gtgataatat catcgcccat gactacactt 360 cttctctctt tccatatctc gaccactggc gaaaacaata cggtaagctt tcaataatct 420 gataatttca acaatttttg agactcttaa ttttgggatc tgtggcaaat gtttttttgt 480 caacaaagta gatacgcctc tgaatttgaa taatgatagc acacaaggca 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Asn Ser Lys His Tyr Ser Gly Asp Asn 65 70 75 80 Ile Ile Ala His Asp Tyr Thr Ser Ser Leu Phe Pro Tyr Leu Asp His 85 90 95 Trp Arg Lys Gln Tyr Gly Arg Val Tyr Thr Tyr Ser Thr Gly Val Lys 100 105 110 Gln His Leu Tyr Met Asn His Pro Glu Leu Val Lys Glu Leu Asn Gln 115 120 125 Ala Asn Thr Leu Asn Leu Gly Lys Val Ser Tyr Val Thr Lys Arg Leu 130 135 140 Lys Ser Ile Leu Gly Arg Gly Val Ile Thr Ser Asn Gly Pro His Trp 145 150 155 160 Ala His Gln Arg Arg Ile Ile Ala Pro Glu Phe Phe Leu Asp Lys Val 165 170 175 Lys Gly Met Val Gly Leu Val Val Glu Ser Ala Met Pro Met Leu Ser 180 185 190 Lys Trp Glu Glu Met Met Lys Arg Glu Gly Glu Met Val Cys Asp Ile 195 200 205 Ile Val Asp Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ser Ala Asp Val Ile Ser Arg 210 215 220 Ala Cys Phe Gly Ser Ser Phe Ser Lys Gly Lys Glu Ile Phe Ser Lys 225 230 235 240 Leu Arg Cys Leu Gln Lys Ala Ile Thr His Asn Asn Ile Leu Phe Ser 245 250 255 Leu Asn Gly Phe Thr Asp Val Val Phe Gly Thr Lys Lys His Gly Asn 260 265 270 Gly Lys Ile Asp Glu Leu Glu Arg His Ile Glu Ser Leu Ile Trp Glu 275 280 285 Thr Val Lys Glu Arg Glu Arg Glu Cys Val Gly Asp His Lys Lys Asp 290 295 300 Leu Met Gln Leu Ile Leu Glu Gly Ala Arg Ser Ser Cys Asp Gly Asn 305 310 315 320 Leu Glu Asp Lys Thr Gln Ser Tyr Lys Ser Phe Val Val Asp Asn Cys 325 330 335 Lys Ser Ile Tyr Phe Ala Gly His Glu Thr Ser Ala Val Ala Val Ser 340 345 350 Trp Cys Leu Met Leu Leu Ala Leu Asn Pro Ser Trp Gln Thr Arg Ile 355 360 365 Arg Asp Glu Val Phe Leu His Cys Lys Asn Gly Ile Pro Asp Ala Asp 370 375 380 Ser Ile Ser Asn Leu Lys Thr Val Thr Met Val Ile Gln Glu Thr Leu 385 390 395 400 Arg Leu Tyr Pro Pro Ala Ala Phe Val Ser Arg Glu Ala Leu Glu Asp 405 410 415 Thr Lys Leu Gly Asn Leu Val Val Pro Lys Gly Val Cys Ile Trp Thr 420 425 430 Leu Ile Pro Thr Leu His Arg Asp Pro Glu Ile Trp Gly Ala Asp Ala 435 440 445 Asn Glu Phe Asn Pro Glu Arg Phe Ser Glu Gly Val Ser Lys Ala Cys 450 455 460 Lys His Pro Gln Ser Phe Val Pro Phe Gly Leu Gly Thr Arg Leu Cys 465 470 475 480 Leu Gly Lys Asn Phe Gly Met Met Glu Leu Lys Val Leu Val Ser Leu 485 490 495 Ile Val Ser Arg Phe Ser Phe Thr Leu Ser Pro Thr Tyr Gln His Ser 500 505 510 Pro Val Phe Arg Met Leu Val Glu Pro Gln His Gly Val Val Ile Arg 515 520 525 Val Leu Arg Gln 530 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> artifitial sequence <220> <221> misc_feature <223> primer <400> 7 tgaggatcca aataaaataa aaag 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> artifitial sequence <220> <221> misc_feature <223> primer <400> 8 aaagtcgacc acacacaaag caaa 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <221> misc_feature <223> primer <400> 9 ctgctgcaga ctctatttcc a 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <221> misc_feature <223> primer <400> 10 ttcaggatcc tttacttttt atttt 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <221> misc_feature <223> primer <400> 11 aatggtacca caagaaacaa 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <221> misc_feature <223> primer <400> 12 tctagatttg agctgaaaaa a 21 <210> 13 <211> 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  9. 식물 초장(height) 조절 유전자를 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된(modified) 식물 초장, 부피, 분얼, 수확량, 꽃 기관 크기, 또는 종자 크기를 갖는 식물의 생산 방법으로서, 상기 식물 초장 조절 유전자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 식물 초장 조절 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및
    (b) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 보존적(conservative) 치환을 가지고, 식물 초장 조절 기능을 가지는 상기 (a)의 변이체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (1) 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 식물 초장 조절 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 운반하는 아그로박테리움을 제공하는 단계:
    (a) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및
    (b) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 보존적(conservative) 치환을 가지고, 식물 초장 조절 기능을 가지는 상기 (a)의 변이체;
    (2) 상기 폴리뉴클레오티드를 식물의 세포, 조직, 또는 기관에 도입하고 상기 폴리뉴클레오티드를 식물세포의 염색체에 통합시키기 위해, 상기 단계 (1)에 기재된 아그로박테리움을 식물의 세포, 조직, 또는 기관에 접촉하는 단계;
    (3) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물의 세포, 조직, 또는 기관을 선발하는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)에 기재된 식물의 세포, 조직, 또는 기관을 신규 식물로 재분화를 허용하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 식물과 상기 재분화된 신규 식물을 이종교배하여, 잡종 후대를 획득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 십자화과(Cruciferae) 또는 벼과(Gramineae) 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 옥수수, 벼, 밀, 보리, 수수 및 애기장대로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 식물 초장 조절 유전자를 작물에 도입함으로써 작물에서 식물 초장 조절 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 단계를 포함하는, 작물의 식물 초장, 부피, 분얼, 수확량, 꽃 기관 크기, 또는 종자 크기를 조절하는 방법으로서,
    상기 식물 초장 조절 유전자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 식물 초장 조절 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및
    (b) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 보존적(conservative) 치환을 가지고, 식물 초장 조절 기능을 가지는 상기 (a)의 변이체.
  15. 작물에서 식물 초장 조절 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 단계를 포함하는, 작물의 식물 초장, 부피, 분얼, 수확량, 꽃 기관 크기, 또는 종자 크기를 조절하는 방법으로서,
    상기 조절은 상기 식물 초장 조절 유전자를 녹아웃시키거나 또는 상기 식물 초장 조절 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 RNAi 벡터를 작물에 도입함으로써 수행되며,
    상기 식물 초장 조절 유전자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 식물 초장 조절 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및
    (b) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 보존적(conservative) 치환을 가지고, 식물 초장 조절 기능을 가지는 상기 (a)의 변이체.
  16. 서열번호 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 식물 줄기 및 잎에서 특이적 발현을 위한 프로모터.
  17. 제16항의 프로모터를 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 식물 줄기 또는 잎에서 표적 유전자의 특이적 발현을 이끄는 방법.
  18. 삭제
  19. 서로 작동가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 구축물:
    제16항의 프로모터, 및
    표적 유전자.
  20. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된, 변형된(modified) 식물 초장, 부피, 분얼, 수확량, 꽃 기관 크기, 또는 종자 크기를 갖는 식물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 식물은 십자화과(Cruciferae) 또는 벼과(Gramineae) 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 식물은 옥수수, 벼, 밀, 보리, 수수 및 애기장대로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물.
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