CN102199600A

CN102199600A - 调节植物叶脉颜色的基因及其用途

Info

Publication number: CN102199600A
Application number: CN 201010133097
Authority: CN
Inventors: 黄继荣; 孙毅
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2011-09-28

Abstract

本发明涉及调节植物叶脉颜色的基因及其用途。本发明提供一种调控植物叶脉颜色的基因，并且将之与植物的叶脉颜色相关联，其还与调节植物组织中镁元素的含量有关。并且，本发明还提供了导致植物叶脉颜色变黄的AtMGT10基因的突变体或片段。本发明为运用生物技术快速改良园艺植物叶脉颜色提供了非常重要基因资源；另外也为改良农作物矿质营养成分提供了有效途径。

Description

调节植物叶脉颜色的基因及其用途

技术领域

本发明属于植物学和生物技术领域，更具体地，本发明涉及调节植物叶脉颜色的基因及其用途。

背景技术

叶片是植物进行光合作用的重要器官，影响农作物的生物产量和经济产量。人工控制植物叶片颜色变化对快速改良或者培育新的园艺植物品种具有重要意义。

在园艺观赏植物中，叶脉颜色突变体植株为观叶植物增添了一抹新意。通过对它的选育，园艺工作者培育出多种广受人们喜爱的品系。目前，这些叶脉突变体植株都是从自然突变体植株或者通过人工诱变后筛选获得的突变体植株。然而，控制叶脉颜色发生变化的基因至今还没有发现。

因此，本领域还有必要进行深入的研究，以找到效果明显的可调控植物叶脉颜色变化的基因，从而为转基因技术改良农作物或者园艺植物提供良好的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调节植物叶脉颜色的方法以及与植物叶脉颜色的调节有关的基因。

在本发明的第一方面，提供一种调节植物叶脉颜色转黄或调节植物组织矿物质元素分布的方法，所述方法包括：抑制或下调植物中AtMGT10蛋白或其衍生蛋白的表达。

在一个优选例中，所述的AtMGT10蛋白选自下组：

(a)如SEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白；

(b)SEQ ID NO：3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％，更佳地98％，最佳地99％)以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述的蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2。

在另一优选例中，抑制植物中所述蛋白表达的方法是：将干扰所述的蛋白的编码基因表达(或转录)的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子。

在另一优选例中，所述的干扰分子是在植物体内形成microRNA的分子。

在另一优选例中，所述干扰分子含有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的方法包括：

(S 1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有以下结构：Seq_正向-X-Seq_反向，其中，Seq_正向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列(较佳地为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列)，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正 _向和Seq_反向不互补；和

(S2)将植物细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的核苷酸序列转入植物细胞、组织、器官或种子。

较佳地，所述方法还包括：

(S3)选择出转入了所述的核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子；和

(S4)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

在另一优选例中，抑制植物中所述蛋白表达的方法是：提高植物中截短型蛋白的表达，所述的截短型蛋白选自下组：

(1)如SEQ ID NO：3中第1-384位氨基酸序列的截短型蛋白；

(2)如SEQ ID NO：3中第1-431位氨基酸序列的截短型蛋白；

(3)(1)或(2)氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)或(2)截短型蛋白功能的由(1)或(2)衍生的蛋白；或

(4)与(1)或(2)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％，更佳地98％，最佳地99％)以上同源性且具有(1)或(2)截短型蛋白功能的由(1)或(2)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述的截短型蛋白不具有全长的SEQ ID NO：3序列。

在另一优选例中，所述方法包括：

(B1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码所述的截短型蛋白；和

(B2)将植物细胞、组织、器官或种子与步骤(B1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或种子。

较佳地，所述方法还包括：

(B3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子；和

(B4)将步骤(B3)中的细胞、组织、器官或种子再生成植物。

另一方面，提供一种采用以上任一方法获得的植物。

在另一优选例中，所述的调节植物组织矿物质元素分布是：提高植物地上部分的镁元素含量。

在本发明的另一方面，提供一种截短型蛋白，所述的截短型蛋白选自下组：

(1)如SEQ ID NO：3中第1-384位氨基酸序列的截短型蛋白；

(2)如SEQ ID NO：3中第1-431位氨基酸序列的截短型蛋白；

(3)(1)或(2)氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)或(2)蛋白功能的由(1)或(2)衍生的蛋白；或

(4)与(1)或(2)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％，更佳地98％，最佳地99％)以上同源性且具有(1)或(2)蛋白功能的由(1)或(2)衍生的蛋白。

在一个优选例中，所述的蛋白不具有全长的SEQ ID NO：3所示的序列。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码所述的蛋白。

在一个优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：1中第1-2953位或第1-2409位、或SEQ ID NO：2中第1-1296位或第1-1152所示的核苷酸序列；但不具有全长的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供所述的截短型蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物叶脉颜色转黄或调节植物组织矿物质元素分布。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，含有所述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的蛋白的方法，包括培养所述的宿主细胞，使之表达所述的蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种分离的干扰分子，所述的干扰分子是：

(i)一多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；或

(ii)一构建物，其能在植物体内形成microRNA，含有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，(ii)中，所述构建物含有以下结构：Seq_正向-X-Seq_反向，其中，Seq_正向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列(较佳地为SEQID NO：4所示的核苷酸序列)，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

在另一优选例中，所述结构在转入植物细胞后，形成以下二级结构：

其中，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

在另一优选例中，(ii)所述的构建物是表达载体。

在另一优选例中，(i)所述的多核苷酸在植物体内形成双链。

在本发明的另一方面，提供所述的干扰分子的用途，用于调节植物叶脉颜色转黄或调节植物组织矿物质元素分布。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了拟南芥Atmgt10突变体植株(右图)、野生型拟南芥(左图)的表型对比。

图2显示了遗传互补分析证实叶脉黄化表型确由AtMGT10基因突变引起。转入野生型AtMGT10基因的Atmgt10突变体植株的叶脉不呈现黄色(图2左)；而未转入该AtMGT10基因的Atmgt10突变体植株叶脉呈现黄色(图2右)。

图3显示了在野生型拟南芥中表达针对AtMGT10基因序列的miRNA序列，能产生与突变体植株同样的表型(右图)，左图为野生型对照。

图4显示了在野生型拟南芥中表达AtMGT10中的1～1152的DNA片段，能产生与突变体植株一样的表型(右图)，左图为野生型对照。

图5显示了AtMGT10基因的启动子驱动GUS报告基因的组织特异性表达。

图6显示了AtMGT10亚细胞表达模式。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，找到一种调控植物叶脉颜色的基因——AtMGT10基因，并且将之与植物的叶脉颜色相关联，发现AtMGT10基因的低表达或缺失表达使得植物叶脉颜色变黄，但对于植物生长无影响。并且，本发明人还发现该基因与调节植物组织中矿物质元素(如镁元素)的含量有关。并且，本发明人还找到了导致植物叶脉颜色变黄的AtMGT10基因的突变体或片段(AtMGT10-M)。因此，利用本发明的AtMGT10基因可调节植物叶脉颜色性状，从而为运用生物技术快速改良园艺植物叶脉颜色提供了非常重要基因资源；也为改良农作物矿质营养成分提供了有效途径。

如本文所用，所述的“植物”包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科等。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科芸薹属的拟南芥(Arabidopsisthaliana)、禾本科的水稻、玉米、蔷薇科的樱桃，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的AtMGT10蛋白”或“分离的AtMGT10多肽”是指AtMGT10蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化AtMGT10蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多20个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多5个不匹配的核苷酸1，如具有0、1、2、3、4个不匹配的核苷酸。如本文所用，“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3’-5’方向的序列(如5’ATCG 3’→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5’CGAT 3’)。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

AtMGT10及其用途

在本发明中，所用的AtMGT10蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自植物。此外，所述的AtMGT10蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组AtMGT10蛋白。

优选的，所述的AtMGT10蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：3所示的序列基本上相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的AtMGT10蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中，只要其保留其原有的功能。AtMGT10蛋白或保留其功能的生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。

任何与所述的AtMGT10蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO：3所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有AtMGT10蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

本发明提供了AtMGT10蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物叶脉颜色或调节植物组织的矿物质元素含量。

作为本发明的一种优选方式，提供一种调节植物叶脉颜色转黄或调节植物组织的矿物质元素含量的方法，包括步骤：降低植物中AtMGT10蛋白的表达。可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低AtMGT10蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义AtMGT10基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达AtMGT10蛋白。其它降低植物中AtMGT10蛋白的表达(包括使AtMGT10蛋白不表达或低表达)的方法是本领域周知的，可以用的材料例如是一些干扰分子。

干扰分子及用途

基于AtMGT10基因的核苷酸序列，可以设计出在导入植物体后可形成特异性干扰AtMGT10基因表达的分子的多核苷酸。设计时要考虑到特异性以及干扰的效率。

作为本发明的优选方式，所述调节植物叶脉颜色转黄或调节植物组织的矿物质元素含量的方法包括：(1)将干扰AtMGT10基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；和(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

本发明对干扰分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了AtMGT10基因与植物叶脉颜色相关性以后，可以以各种途径制备出所述的干扰分子，从而用于调节植物叶脉颜色。所述的干扰分子可通过转基因技术被输送到植物体内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到植物体内。

作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果优异的干扰分子，所述的干扰分子可特异性的干扰AtMGT10基因的表达，与其它的核酸序列没有显著的同源性；并且经验证，其具有良好的干扰AtMGT10基因表达的效果。所述的干扰分子是含有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的分子。较佳地，所述的干扰分子可以是如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的miRNA分子；或是表达载体，其含有如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，当其被转入到植物体内后可形成具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的干扰分子。

作为本发明的优选方式，提供了一种构建物，所述构建物含有以下结构：Seq_正 _向-X-Seq_反向，其中，Seq_正向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列(较佳地为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列)，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

所述的构建物在导入到植物体内后，可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。也即，形成如下所示的二级结构：

其中，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的基本上互补的关系。

所述的茎环结构可被植物体内的各种物质进一步作用、加工或剪切，并且形成双链RNA(dsRNA)。

通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当多核苷酸序列或构建物以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体或构建物并能够将它们传递给植物细胞的宿主。优选的，所述的宿主为农杆菌。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施以上的方法。

本发明还包括利用前述方法获得的植物，所述的植物包括：AtMGT10蛋白表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。

截短体蛋白及用途

本发明还提供了一种对于调节植物叶脉颜色转黄或调节植物组织矿物质含量分布(如提高植物地上部分的镁元素含量)有用的蛋白。其是AtMGT10蛋白的变异体(截短体蛋白)，其是(1)如SEQ ID NO：3中第1-384位氨基酸序列的蛋白；或(2)如SEQ ID NO：3中第1-431位氨基酸序列的蛋白；或(3)将(1)或(2)氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)或(2)蛋白功能的由(1)或(2)衍生的蛋白。其可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明人将该蛋白命名为AtMGT10-M。

本发明还包括AtMGT10-M蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的AtMGT10-M蛋白相同的生物学功能或活性(即：调节物叶脉颜色转黄，或调节植物组织矿物质含量分布)的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种AtMGT10-M蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，AtMGT10-M蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的AtMGT10-M蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长AtMGT10-M蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长AtMGT10-M蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

任何与所述的AtMGT10-M蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO：3中第1-384位或第1-431位所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有AtMGT10-M蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

本发明还包括AtMGT10-M蛋白保守性变异多肽，所述“AtMGT10-M蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg

Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明AtMGT10-M蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。较佳地，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：1中第1-2953位或第1-2409位、或SEQ ID NO：2中第1-1296位或第1-1152所示的核苷酸序列；但不具有全长的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1中第1-2953位或第1-2409位、或SEQ ID NO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码SEQ ID NO：3中第1-384位或第1-431位所示的序列的蛋白质，但与SEQ ID NO：1中第1-2953位或第1-2409位、或SEQ ID NO：2中第1-1296位或第1-1152所示的编码区序列有差别的核酸序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码AtMGT10-M的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述编码AtMGT10-M的多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的编码AtMGT10-M的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：3中第1-384位或第1-431位所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的编码AtMGT10-M的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码AtMGT10-M蛋白的多聚核苷酸。

应理解，虽然本发明的AtMGT10-M基因优选获自拟南芥，但是获自其它植物的与拟南芥AtMGT10-M基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的AtMGT10-M蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含编码AtMGT10-M蛋白的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或AtMGT10-M蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生AtMGT10-M的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的AtMGT10-M蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码AtMGT10-M蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码AtMGT10-M蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含AtMGT10-M蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本发明提供了所述的AtMGT10-M蛋白的用途，用于调节植物叶脉的颜色性状(促进植物叶脉转黄)，或调节植物矿质营养。所述的AtMGT10-M蛋白还可用于制备促进植物叶脉转黄或调节植物组织矿物质含量分布的组合物。

本发明还提供了一种促进植物叶脉转黄或调节植物组织矿物质含量分布的方法，所述的方法包括：使所述植物表达AtMGT10-M蛋白。

另一方面，本发明还提供了一种制备叶片具有黄化性状的植物的方法，所述的方法包括：使所述植物表达AtMGT10-M蛋白。

在得知了所述的AtMGT10-M蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的AtMGT10-M蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带AtMGT10-M基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的AtMGT10-M蛋白。

作为本发明的一种实施方式，将编码AtMGT10-M蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述AtMGT10-M蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达AtMGT10-M蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得表达AtMGT10-M蛋白的植物。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的AtMGT10-M蛋白的编码基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入AtMGT10-M蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源AtMGT10-M蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的基因调节植物叶脉颜色性状的效果明显，为转基因技术改良农作物或者园艺植物提供了很好的基因资源。

(2)使用本发明的基因可以通过转基因技术提高作物的产量或者快速培育出植物叶片颜色性状改变(如叶脉颜色变绿或黄化)的新品种。

(3)本发明为运用生物技术快速改良园艺植物叶脉颜色提供了非常重要基因资源；另外也为改良农作物矿质营养成分提供了有效途径。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、基因的克隆及功能研究

本发明人用0.2％(V/V)的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变拟南芥野生型Col-0生态，经M2代筛选与M3代鉴定，获得一个稳定的叶脉黄化株系(突变体)。与Col-0相比，该叶脉黄化株系子叶黄绿，在长日照(16h光/8h暗，光强90μmolm-2s-1)条件下，第三对真叶之后的叶片均叶脉黄化，黄化叶脉呈网格状，即初级至三级叶脉均黄化，植株大小没有差异。在短日照(8h光/16h暗，光强90μmolm-2s-1)条件下，6周之后该叶脉黄化株系的叶片会稍大于Col-0的叶片。

将野生型Col-0作为父本、以上突变体作为母本杂交得到的F1代或将突变体作为父本、野生型Col-0作为母本杂交得到的F1代，植株均同野生型一样，无叶脉黄化表型，表明该基因为细胞核编码的隐性基因。播种从F1代植株上收获的种子得到F2代植株，在随机取的植株中，叶脉黄化植株与正常植株的比例为1比3，表明该基因为单位点隐性突变。

将该叶脉黄化突变体与拟南芥野生型Ler生态型杂交得到F1代，F1代自交获得F2代图位克隆群体，利用基于拟南芥DNA多态性数据库中简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，SSLP)的InDel标记对突变基因进行定位。随机选取60个突变植株抽提DNA，每30个突变体DNA混成一个DNA池，进行基因的BSA(分群分析法，Bulk segregate analysis)分析。用覆盖基因组的20对分子标记进行PCR扩增，同时扩增Col-0、Ler、F1的DNA作为对照，将突变基因定位在5号染色体上臂。通过分析1014株重组个体单株的基因型，把突变基因定位在5号染色体At5g22830位置，该基因编码一个被推测具有镁离子转运能力的蛋白(AtMGT10)，定位于叶绿体。突变基因在At5g22830的第一个外显子起始密码子下游的2874bp处由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，导致第432位的氨基酸由色氨酸(W)变为终止密码子(stop codon)。本发明人将突变的AtMGT10命名为AtMGT10-M。

AtMGT10基因编码区基因组(genomic DNA)序列(SEQ ID NO：1)：

(注：斜体字为5’UTR，内含子和3’UTR，大写正体字为外显子)

agttttttggtaaaattatccttaaagctaaaaatctccataaccaaagcttcttcgttccaccagcaccaaaccaaca

atgGCGTTAACTCCAATTCCTTCAACATTCACTTCTCTCTTCAACTTCTCCG

ATCACTCTCCATATCCATCTCCATCTCTCCATTATCTTCTTCCTGGATCTTC

TCCTTCCTTTTCTCTCCAGTTATCTGCGTTGAGTAGAACTCCGATCTACTT

CGAGGCACTTAAAGTTTTATCGAGATCGAAATGTTTCGCCAAGTCTCCGA

CAACCGCCGAGGATTTCGTCGGCGATTACGAATCCCTTAACGTTAGCGAC

GACGACGATGGTAGTGACAGTAATAGTAGTGATGGAGATAACGGAGGAG

GAAGAGATGATTCAAAGAAGATCGATTCTTCTTCTTCTTCTTCATCAAGT

GACTCTACGTCTCTGGGAATTCGTGAACCGGTTTATGAGgtttcttctggatataatg

aactattgaattgcatgttcatatagtcaattagtcatatatttaggattctgtttgaattgattagctttggatgaaactgt

cacttgttgtatctcatcaaagtttgtaactttatgaagGTTGTGGAAGTGAAGGCGACTGGAGC

AATATCTACAAGGAAGATTAACAGACGACAGCTGCTTAAATCCAGTGgtga

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GTCTTCGTCCAAGAGATATACGAAGCGTTGATCCTTCGTTGTTTATGACA

AACTCAGTGCCATCTCTATTGgtatatatatagctcaaacttatcatttctctacagttatgtgtatgat

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aaagattataaatattatctcttcagccctgcataacttgagtttgttataattccaatcattttggtgttaacctttcatta

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GAGCAAAGGCTTATGGACATTGAACCCCGTgtgagtatgaaaagctagtgagtatatttca

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GGTTTTACCCAACCGCTTAACTGCCGATATATTGGAGGAACTTCGTATTA

GCAAACAAAGACTGgtaaactttatttagttgtttatgtatgtatattcttgttagttgttcgcttcagagaact

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AGCTCTTAGACAAATGCTCCTGGATCTTTTAGAGGATCCCCATGAAATAC

GCCGCATATGCATCATGGGAAGAAATTGCACACTTAGAAGAGGAGACGA

TGATTTGGAGTGTACATTACCCTCAGATAAGCTGATTGCTGAGGgtaagactg

caaacatttcctccatgataatcaccacaaacagatgaatttaacgagattcattttctttttctggttccgtgcagAA

GAAGAGGAGGAAATCGAAATGCTCTTGGAGAACTATCTGCAAAGgtcttgact

tttgctcttgaagcactctgatatgtttcattgttatgtagtgaaactctatggcttcgtatgtgcagATGTGAGTC

ATGCCATGGACAAGCAGAAAGACTTCTGGATTCTGCAAAGGAAATGGAA

GACTCAATTGCTGTCAATCTAAGgtactgaagataacaaaatactcctttctcttaaattcttaggc

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CATTCTGGCTAACAACGGGTGGAATCATCATAGGCGCTGCAGTCGCCTTC

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caatgtatcatttaataaactggttcgaaagcaaatgaaaattcaaatatagggtttatcaaaact

编码区(CDS)序列(1380bp)(SEQ ID NO：2)：

atgGCGTTAACTCCAATTCCTTCAACATTCACTTCTCTCTTCAACTTCTCCG

ATCACTCTCCATATCCATCTCCATCTCTCCATTATCTTCTTCCTGGATCTTC

TCCTTCCTTTTCTCTCCAGTTATCTGCGTTGAGTAGAACTCCGATCTACTT

CGAGGCACTTAAAGTTTTATCGAGATCGAAATGTTTCGCCAAGTCTCCGA

CAACCGCCGAGGATTTCGTCGGCGATTACGAATCCCTTAACGTTAGCGAC

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CAGAAAGACTTCTGGATTCTGCAAAGGAAATGGAAGACTCAATTGCTGT

CAATCTAAGTTCTCGGAGGCTTGAGGTCAGCAGGTTCGAGTTGCTTCTTC

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GGCATGAACTTGAGGTCCTATCTTGAAGAACAAGCTTCTGCATTCTGGCT

AACAACGGGTGGAATCATCATAGGCGCTGCAGTCGCCTTCTTTCTCATGT

ATTCCTATCTCAGTAGACGCAAAATCTTTTGA

AtMGT10蛋白序列(459aa)(SEQ ID NO：3)：

MALTPIPSTFTSLFNFSDHSPYPSPSLHYLLPGSSPSFSLQLSALSRTPIYFEAL

KVLSRSKCFAKSPTTAEDFVGDYESLNVSDDDDGSDSNSSDGDNGGGRDD

SKKIDSSSSSSSSDSTSLGIREPVYEVVEVKATGAISTRKINRRQLLKSSGLRP

RDIRSVDPSLFMTNSVPSLLVREHAILLNLGSLRAIAMRDRVLIFDYNRRGG

RAFVDTLMPRLNPRSMNGGPSMPFELEAVESALISRIQRLEQRLMDIEPRVQ

ALLEVLPNRLTADILEELRISKQRLVELGSRAGALRQMLLDLLEDPHEIRRI

CIMGRNCTLRRGDDDLECTLPSDKLIAEEEEEEIEMLLENYLQRCESCHGQ

AERLLDSAKEMEDSIAVNLSSRRLEVSRFELLLQVGTFCVAVGALIAGIFG

MNLRSYLEEQASAFWLTTGGIIIGAAVAFFLMYSYLSRRKIF

拟南芥Atmgt10突变体植株的表型见图1中右图；而图1中左图为对照野生型拟南芥。

实施例2、遗传互补分析

(1)采用AtMGT10基因

为证实叶脉黄化表型确由AtMGT10基因突变引起，进行了遗传互补分析。以AtMGT10 topo clone-F：CACCATGGCGTTAACTCCAATTCC(SEQ ID NO：5)和AtMGT10 topo clone-R’：TCAAAAGATTTTGCGTCTACTGAG(SEQ ID NO：6)为引物，通过PCR扩增克隆了AtMGT10全长的编码区(CDS)，构建入质粒载体pENTR/SD/D-TOPO(购自Invitrogen公司)中，测序验证插入了正确的序列。用Gateway LR Clonase Enzyme Mix体系将上述AtMGT10全长的编码区(CDS)插入到花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的表达载体pGWB2(购自ResearchInstitute of Molecular Genetics，Shimane University，Japan)中，获得重组载体。

将前述获得的重组载体(带有35S::AtMGT10)转入农杆菌(GV3101，购自Invitrogen)中，通过农杆菌转化法转化前述获得的拟南芥突变体植株，采用冻融法转化农杆菌。加质粒于融化的农杆菌GV3101感受态细胞中，混匀，冰上放置30min。液氮速冻60s，37℃水浴3min。加1mL的LB液体培养基，28℃复苏培养1h。12000rpm离心30s，去上清，剩100μL，吸打均匀，涂于选择平板(Rif 50μg/mL+Gm 50μg/mL+Kan 50μg/mL+Hyg 50μg/mL)，28℃培养2天。

拟南芥植株转化采用农杆菌侵染的方法。取生长一个月左右，生长状况良好的植株，去除已经授粉花朵和结实的果荚，转化前一天浇足水。将含有转基因载体的农杆菌GV3101于28℃培养过夜，OD600在1.2至1.6之间，5000rpm离心15min，菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液(即渗透培养基)中，至终浓度OD600在0.8左右。转化时将拟南芥地上部分浸泡于菌液中大约5min，确保全部花苞都被浸没。将植物平放并保持湿度，避光过夜。第二天将植物取出，竖直并转移到正常条件下生长收获种子。

转基因植株种子消毒后，春化3天。处理好的种子用琼脂悬浮后均匀涂布在固体筛选培养基(含卡那霉素)表面。卡那霉素筛选能够直观的通过黄绿苗来判断，而且一般萌发后5天左右即可判断出来。

渗透培养基(1L)：2.2g Murashige-Skoog培养基(购自Sigma公司)，5％蔗糖，0.5g MES(购自Sigma公司)，用KOH调至pH5.7，200μL Silwet L-77(参见CN101186926)。

结果，至少获得了25个黄脉表型恢复的转基因株系。如图2中左图所示，该种株系的叶脉不呈现黄色；而未转入该AtMGT10基因的突变体植株叶脉呈现黄色，见图2中右图。

(2)采用AtMGT10基因的变体基因

采用AtMGT10基因的变体基因，该基因序列如SEQ ID NO：2，不同点在于第1372位由A变为C；从而其编码的蛋白相应位置由Ile变为Leu。同前述(1)的方法将该编码基因插入到表达载体，转化拟南芥突变体植株，结果，也获得多个黄脉表型恢复的转基因株系，即这些株系叶脉不呈现黄色。

实施例3、miRNA干扰法分析

针对AtMGT10的基因序列，设计miRNA，序列如下：

(a)TTAATACGAAGTTCCTCCGAT(SEQ ID NO：4)；

根据(WMD 2-Web MicroRNA Designer)设计了产生人工microRNA(AmiRNA)的PCR引物，序列如下：

I、miR-s：gaTTAATACGAAGTTCCTCCGATtctctcttttgtattcc(SEQ ID NO：7)，

II、miR-a：gaATCGGAGGAACTTCGTATTAAtcaaagagaatcaatga(SEQ IDNO：8)；

III、miR*s：gaATAGGAGGAACTTGGTATTATtcacaggtcgtgatatg(SEQ IDNO：9)，

IV、miR*a：gaATAATACCAAGTTCCTCCTATtctacatatatattcct(SEQ ID NO：10)。

通过对出发质粒pRS300(Tübingen University，Germany)片段的PCR突变，获得了含针对AtMGT10的人工回文序列的质粒。具体方法是：引物A(A序列：CACCCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC(SEQ ID NO：11))与引物IV搭配、引物II与引物III搭配、引物I与引物B(B序列：GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG(SEQ ID NO：12))搭配，以pRS300为模板，分别得到PCR产物a，b，c；以a，b，c的混合物为模板，以A和B为引物，分别扩增得到PCR产物d。

将PCR产物d构建入质粒载体pENTR/SD/D-TOPO(购自Invitrogen公司)中，测序验证插入了正确的序列。用Gateway LR Clonase Enzyme Mix体系将d片段插入到花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的载体pGWB2中，通过农杆菌转化野生型拟南芥植株，具体方法如下：拟南芥植株转化采用农杆菌侵染的方法。取生长一个月左右，生长状况良好的植株，去除已经授粉花朵和结实的果荚，转化前一天浇足水。将含有转基因载体的农杆菌GV3101于28℃培养过夜，OD600在1.2至1.6之间，5000rpm离心15min，菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液中，至终浓度OD600在0.8左右。转化时将拟南芥地上部分浸泡于菌液中大约5min，确保全部花苞都被浸没。将植物平放并保持湿度，避光过夜。第二天将植物取出，竖直并转移到正常条件下生长收获种子。

渗透培养基(1L)：2.2g Murashige-Skoog培养基，5％蔗糖，0.5g MES，用KOH调至pH5.7，200μL Silwet L-77。

结果，利用以上序列进行干扰，至少获得了14个叶脉黄化的转基因T2株系。如图3中左图所示，野生型的叶脉不呈现黄色；而转入针对AtMGT10基因的miRNA人工回文序列的植株叶脉呈现黄色，见图3中右图。可见以上序列的干扰效率高，对于改变叶脉颜色是有用的。

实施例4、AtMGT10基因片段的功能分析

以AtMGT10 topo clone-F：CACCATGGCGTTAACTCCAATTCC(SEQ IDNO：5)和AtMGT10 1-384AA R：TCAATTGACAGCAATTGAGTCTTCCATTTC(SEQ ID NO：13)为引物，通过PCR扩增，克隆了AtMGT10编码区(CDS)的1～1152位碱基(对应第1-384位氨基酸)并将其构建到质粒载体pENTR/SD/D-TOPO的相应位点中，测序验证插入了正确的序列；用Gateway LRClonase Enzyme Mix体系将上述片段构建入花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的表达载体pGWB2，通过农杆菌(GV3101)转化野生型拟南芥后，获得了有黄脉表型的稳定转基因株系，见图4中右图；而图4中左图为野生型对照。

因此，在野生型拟南芥中表达AtMGT10中的1～1152的DNA片段也能产生与突变体植株一样的表型。

为证实转基因株系的黄脉表型确由转基因引起，以pGWB2载体的一段序列设计正向引物、以AtMGT10编码区(CDS)的1～1152位碱基序列设计反向引物，引物序列如下：

pGWB2F：

ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT(SEQ ID NO：14)；

AtMGT10 1-384AA R：

TCAATTGACAGCAATTGAGTCTTCCATTTC(SEQ ID NO：13)。

以上述引物，通过PCR扩增转基因株系与野生型植株基因组DNA，以转基因株系基因组DNA为模板，能够得到大小合适的特异性扩增产物，而野生型植株基因组DNA为模板，不能得到扩增产物。

实施例5、AtMGT10基因表达模式分析

以AtMGT10 promoter clone-F’：CACCGCCCTTATTTCTCTTCTTCTC(SEQ ID NO：15)和AtMGT10 promoter clone-R’：TGTTGGTTTGGTGCTGGTGGAACG(SEQ ID NO：16)为引物，扩增获得AtMGT10起始密码子上游基因间区700bp序列。

将AtMGT10起始密码子上游基因间区700bp构建到质粒载体pENTR/SD/D-TOPO的相应位点中，测序验证插入了正确的序列；用Gateway LRClonase Enzyme Mix体系将上述片段构建入带有GUS报告基因的表达载体pGWB3中，通过农杆菌转化野生型拟南芥植株。

结果，至少获得了26个有GUS活性的转基因T2株系，在子叶中检测到GUS活性，真叶叶脉区域有较强表达，同时叶肉细胞也有表达，见图5。

实施例6、AtMGT10蛋白的亚细胞定位

以AtMGT10 topo clone-F：CACCATGGCGTTAACTCCAATTCC(SEQ IDNO：5)和AtMGT10 topo clone-nsR’：AAAGATTTTGCGTCTACTGAGATAGG(SEQ ID NO：17)为引物，通过PCR扩增克隆了AtMGT10除终止密码子外的编码区，构建入质粒载体pENTR/SD/D-TOPO(购自Invitrogen公司)中，测序验证插入了正确的序列。用Gateway LR Clonase Enzyme Mix体系将上述AtMGT10除终止密码子外的编码区插入到花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的、带有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体pGWB5(购自Research Institute of MolecularGenetics，Shimane University，Japan)中，获得重组载体。

将前述获得的重组载体(带有35S::AtMGT10)转入农杆菌(GV3101，购自Invitrogen)中，通过农杆菌转化法转化前述获得的拟南芥野生型植株。

结果，至少获得了16个有GFP表达的转基因植株，GFP荧光通过激光共聚焦扫描显微镜(FITC488，Zeiss LSM500)观察。GFP荧光检测激发波长为488nm，发射波长为505至545nm。叶绿素自发荧光检测激发波长为488nm，发射波长为585nm，拟南芥AtMGT10-GFP融合蛋白定位于叶绿体被膜上，如图6所示。

实施例7、植物组织元素含量测定

利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)仪对野生型Col-0与突变体植株Atmgt10根、茎、叶中元素含量进行测定。结果显示，所有含量有变化的元素中，野生型Col-0根中镁、硫、钙、铜、铁、铬、硼元素含量高于突变体植株Atmgt10中的含量，锌低于突变体植株Atmgt10中的含量；野生型Col-0茎中铜、铅、铬元素含量高于突变体植株Atmgt10中的含量，镁、钙、钴元素含量低于突变体植株Atmgt10中的含量；野生型Col-0叶中锂、钠、镁、铝、硅、磷、硫、钙、铜、锌、铅、铬的含量均低于突变体植株Atmgt10中的含量。可见突变体植物地上部分的镁元素含量显著提高，其中叶的镁元素含量提高21％；茎的镁元素含量提高30％。提示该基因突变可导致叶绿体中镁的含量变化进而引起各元素在不同细胞区室的分配产生紊乱，打破了离子浓度的动态平衡，进而引起器官水平的元素含量改变。

表2、突变体植株Atmgt10对植株矿质元素含量的影响

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>调节植物叶脉颜色的基因及其用途

<130>097185

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3343

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>1

agttttttgg taaaattatc cttaaagcta aaaatctcca taaccaaagc ttcttcgttc 60

caccagcacc aaaccaacaa tggcgttaac tccaattcct tcaacattca cttctctctt 120

caacttctcc gatcactctc catatccatc tccatctctc cattatcttc ttcctggatc 180

ttctccttcc ttttctctcc agttatctgc gttgagtaga actccgatct acttcgaggc 240

acttaaagtt ttatcgagat cgaaatgttt cgccaagtct ccgacaaccg ccgaggattt 300

cgtcggcgat tacgaatccc ttaacgttag cgacgacgac gatggtagtg acagtaatag 360

tagtgatgga gataacggag gaggaagaga tgattcaaag aagatcgatt cttcttcttc 420

ttcttcatca agtgactcta cgtctctggg aattcgtgaa ccggtttatg aggtttcttc 480

tggatataat gaactattga attgcatgtt catatagtca attagtcata tatttaggat 540

tctgtttgaa ttgattagct ttggatgaaa ctgtcacttg ttgtatctca tcaaagtttg 600

taactttatg aaggttgtgg aagtgaaggc gactggagca atatctacaa ggaagattaa 660

cagacgacag ctgcttaaat ccagtggtga ctgaaacaat agttaactat tttatacatt 720

tgatgatcgt catgttggta gttctctatg ataagtctaa tattttaatc aggtcttcgt 780

ccaagagata tacgaagcgt tgatccttcg ttgtttatga caaactcagt gccatctcta 840

ttggtatata tatagctcaa acttatcatt tctctacagt tatgtgtatg atgaaccatc 900

tatatgacaa tgttgagacc ttttcttaca tgttatttag gtccgtgaac atgcgattct 960

gctaaatttg ggctccctga gagcaatagc catgcgagac cgtgtcctta tatttgatta 1020

taaccggtaa tcttggtcgc agtatatctc tttttcttca gatcaatttc tctagtatcg 1080

ctggtgtaag tccaaaatat tttcaggaga ggaggaagag cttttgtaga tacattgatg 1140

cctcggctta acccaagaag tatgaatgga ggaccctcta tgccatttga actagaggtt 1200

ggtttggccc ataaataatt tgattggatg atgatttgtt tatgtagaaa tatatgtttt 1260

gtacacagat aaaagattat aaatattatc tcttcagccc tgcataactt gagtttgtta 1320

taattccaat cattttggtg ttaacctttc attactctgg ctttattgaa ggctgttgaa 1380

tcggcgctaa tctcaaggat acaacgatta gagcaaaggc ttatggacat tgaaccccgt 1440

gtgagtatga aaagctagtg agtatatttc agttagatct tcttcacttt gactgctaga 1500

ctaggacttc tccatgacta agttagatct taaaaggaac ggattcgtgc tatagaggat 1560

gaaactgcca ttttcgacac acaaagcatt tccttttgct ataagtttaa gtttgaactg 1620

agcataggat aaaagagctg aggcgttaaa atgaaatcct ttatatgttc tgacatgaaa 1680

ccctgtagtt ttttccaaac attggcttat ggcttttaaa gatcattctt tttgctctta 1740

atgtttatat tacttccatt tggttcaggt ccaagctcta cttgaggttt tacccaaccg 1800

cttaactgcc gatatattgg aggaacttcg tattagcaaa caaagactgg taaactttat 1860

ttagttgttt atgtatgtat attcttgtta gttgttcgct tcagagaact caatgttcgg 1920

ttttttgtat tgaatttttc tttatacact ttttaaaggt tgaattgggc tcccgagctg 1980

gagctcttag acaaatgctc ctggatcttt tagaggatcc ccatgaaata cgccgcatat 2040

gcatcatggg aagaaattgc acacttagaa gaggagacga tgatttggag tgtacattac 2100

cctcagataa gctgattgct gagggtaaga ctgcaaacat ttcctccatg ataatcacca 2160

caaacagatg aatttaacga gattcatttt ctttttctgg ttccgtgcag aagaagagga 2220

ggaaatcgaa atgctcttgg agaactatct gcaaaggtct tgacttttgc tcttgaagca 2280

ctctgatatg tttcattgtt atgtagtgaa actctatggc ttcgtatgtg cagatgtgag 2340

tcatgccatg gacaagcaga aagacttctg gattctgcaa aggaaatgga agactcaatt 2400

gctgtcaatc taaggtactg aagataacaa aatactcctt tctcttaaat tcttaggcac 2460

tcttaccatg gtccattgtt tgtttccagt tctcggaggc ttgaggtcag caggttcgag 2520

ttgcttcttc aggtcggtac attttgtgtt gcagttggtg ctctcatcgc aggtatattc 2580

acaaactttt gatgatttgt atccgctttc tctgaaacct ttgaactata gtagagcctt 2640

tgcatttaaa ctaccaacta ccaagattga acggagtgtc cacattctcc attacatatg 2700

tgctatttga atttgactac aaagaaccat ttccctatga acatgatctc aaagccaaca 2760

aatcctattt ttcccctgtt cattgtaaat ggcttatacc ttttgttttg ggtacctgca 2820

ggtatattcg gcatgaactt gaggtcctat cttgaagaac aagctgtaag tcctcatcaa 2880

gcaaccacat atttacaact attgtgccat cattttacca ttaacatctc gggttttgca 2940

gtctgcattc tggctaacaa cgggtggaat catcataggc gctgcagtcg ccttctttct 3000

catgtattcc tatctcagta gacgcaaaat cttttgaacc ttcaatccta aaagacgaaa 3060

gaagaggtaa acctgtttct tcttcttccc atttccatat cccctttaaa tttgataaag 3120

agcgctcaaa atatacgtaa atattacagg tttaaaatcc gtgaagaaag tgaatttcat 3180

tcatcacagt tacattatgg cattaggccc ctactagtag ttagagcgag gtgagttcat 3240

caaatgtctg ataaatattt attgttgtgg tctccattga accccagtga cttgtgtgct 3300

atgtcctcat tgcttggtaa tgttgtaaga tcaatgtatc atttaataaa ctggttcgaa 3360

agcaaatgaa aattcaaata tagggtttat caaaact 3397

<210>2

<211>1380

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>2

atggcgttaa ctccaattcc ttcaacattc acttctctct tcaacttctc cgatcactct 60

ccatatccat ctccatctct ccattatctt cttcctggat cttctccttc cttttctctc 120

cagttatctg cgttgagtag aactccgatc tacttcgagg cacttaaagt tttatcgaga 180

tcgaaatgtt tcgccaagtc tccgacaacc gccgaggatt tcgtcggcga ttacgaatcc 240

cttaacgtta gcgacgacga cgatggtagt gacagtaata gtagtgatgg agataacgga 300

ggaggaagag atgattcaaa gaagatcgat tcttcttctt cttcttcatc aagtgactct 360

acgtctctgg gaattcgtga accggtttat gaggttgtgg aagtgaaggc gactggagca 420

atatctacaa ggaagattaa cagacgacag ctgcttaaat ccagtggtct tcgtccaaga 480

gatatacgaa gcgttgatcc ttcgttgttt atgacaaact cagtgccatc tctattggtc 540

cgtgaacatg cgattctgct aaatttgggc tccctgagag caatagccat gcgagaccgt 600

gtccttatat ttgattataa ccggagagga ggaagagctt ttgtagatac attgatgcct 660

cggcttaacc caagaagtat gaatggagga ccctctatgc catttgaact agaggctgtt 720

gaatcggcgc taatctcaag gatacaacga ttagagcaaa ggcttatgga cattgaaccc 780

cgtgtccaag ctctacttga ggttttaccc aaccgcttaa ctgccgatat attggaggaa 840

cttcgtatta gcaaacaaag actggttgaa ttgggctccc gagctggagc tcttagacaa 900

atgctcctgg atcttttaga ggatccccat gaaatacgcc gcatatgcat catgggaaga 960

aattgcacac ttagaagagg agacgatgat ttggagtgta cattaccctc agataagctg 1020

attgctgagg aagaagagga ggaaatcgaa atgctcttgg agaactatct gcaaagatgt 1080

gagtcatgcc atggacaagc agaaagactt ctggattctg caaaggaaat ggaagactca 1140

attgctgtca atctaagttc tcggaggctt gaggtcagca ggttcgagtt gcttcttcag 1200

gtcggtacat tttgtgttgc agttggtgct ctcatcgcag gtatattcgg catgaacttg 1260

aggtcctatc ttgaagaaca agcttctgca ttctggctaa caacgggtgg aatcatcata 1320

ggcgctgcag tcgccttctt tctcatgtat tcctatctca gtagacgcaa aatcttttga 1380

<210>3

<211>459

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>3

Met Ala Leu Thr Pro Ile Pro Ser Thr Phe Thr Ser Leu Phe Asn Phe

1 5 10 15

Ser Asp His Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Ser Leu His Tyr Leu Leu Pro

20 25 30

Gly Ser Ser Pro Ser Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ala Leu Ser Arg Thr

35 40 45

Pro Ile Tyr Phe Glu Ala Leu Lys Val Leu Ser Arg Ser Lys Cys Phe

50 55 60

Ala Lys Ser Pro Thr Thr Ala Glu Asp Phe Val Gly Asp Tyr Glu Ser

65 70 75 80

Leu Asn Val Ser Asp Asp Asp Asp Gly Ser Asp Ser Asn Ser Ser Asp

85 90 95

Gly Asp Asn Gly Gly Gly Arg Asp Asp Ser Lys Lys Ile Asp Ser Ser

100 105 110

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Thr Ser Leu Gly Ile Arg Glu Pro

115 120 125

Val Tyr Glu Val Val Glu Val Lys Ala Thr Gly Ala Ile Ser Thr Arg

130 135 140

Lys Ile Asn Arg Arg Gln Leu Leu Lys Ser Ser Gly Leu Arg Pro Arg

145 150 155 160

Asp Ile Arg Ser Val Asp Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Ser Val Pro

165 170 175

Ser Leu Leu Val Arg Glu His Ala Ile Leu Leu Asn Leu Gly Ser Leu

180 185 190

Arg Ala Ile Ala Met Arg Asp Arg Val Leu Ile Phe Asp Tyr Asn Arg

195 200 205

Arg Gly Gly Arg Ala Phe Val Asp Thr Leu Met Pro Arg Leu Asn Pro

210 215 220

Arg Ser Met Asn Gly Gly Pro Ser Met Pro Phe Glu Leu Glu Ala Val

225 230 235 240

Glu Ser Ala Leu Ile Ser Arg Ile Gln Arg Leu Glu Gln Arg Leu Met

245 250 255

Asp Ile Glu Pro Arg Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Leu Pro Asn Arg

260 265 270

Leu Thr Ala Asp Ile Leu Glu Glu Leu Arg Ile Ser Lys Gln Arg Leu

275 280 285

Val Glu Leu Gly Ser Arg Ala Gly Ala Leu Arg Gln Met Leu Leu Asp

290 295 300

Leu Leu Glu Asp Pro His Glu Ile Arg Arg Ile Cys Ile Met Gly Arg

305 310 315 320

Asn Cys Thr Leu Arg Arg Gly Asp Asp Asp Leu Glu Cys Thr Leu Pro

325 330 335

Ser Asp Lys Leu Ile Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Glu Met Leu

340 345 350

Leu Glu Asn Tyr Leu Gln Arg Cys Glu Ser Cys His Gly Gln Ala Glu

355 360 365

Arg Leu Leu Asp Ser Ala Lys Glu Met Glu Asp Ser Ile Ala Val Asn

370 375 380

Leu Ser Ser Arg Arg Leu Glu Val Ser Arg Phe Glu Leu Leu Leu Gln

385 390 395 400

Val Gly Thr Phe Cys Val Ala Val Gly Ala Leu Ile Ala Gly Ile Phe

405 410 415

Gly Met Asn Leu Arg Ser Tyr Leu Glu Glu Gln Ala Ser Ala Phe Trp

420 425 430

Leu Thr Thr Gly Gly Ile Ile Ile Gly Ala Ala Val Ala Phe Phe Leu

435 440 445

Met Tyr Ser Tyr Leu Ser Arg Arg Lys Ile Phe

450 455

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>4

ttaatacgaa gttcctccga t 21

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>5

caccatggcg ttaactccaa ttcc 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>6

tcaaaagatt ttgcgtctac tgag 24

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>引物

<400>7

gattaatacg aagttcctcc gattctctct tttgtattcc 40

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>引物

<400>8

gaatcggagg aacttcgtat taatcaaaga gaatcaatga 40

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>引物

<400>9

gaataggagg aacttggtat tattcacagg tcgtgatatg 40

<210>10

<211>40

<212>DNA

<213>引物

<400>10

gaataatacc aagttcctcc tattctacat atatattcct 40

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>引物

<400>11

caccctgcaa ggcgattaag ttgggtaac 29

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>12

gcggataaca atttcacaca ggaaacag 28

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>引物

<400>13

tcaattgaca gcaattgagt cttccatttc 30

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>14

acaagtttgt acaaaaaagc aggct 25

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>15

caccgccctt atttctcttc ttctc 25

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>16

tgttggtttg gtgctggtgg aacg 24

<210>17

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>17

aaagattttg cgtctactga gatagg 26

Claims

1.一种调节植物叶脉颜色转黄或调节植物组织矿物质元素分布的方法，其特征在于，所述方法包括：抑制植物中AtMGT10蛋白的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，抑制植物中所述蛋白表达的方法是：将干扰所述的蛋白的编码基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的干扰分子是在植物体内形成microRNA的分子。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述干扰分子含有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括：

(S1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有以下结构：Seq_正向-X-Seq_反向，其中，Seq_正向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；和

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，抑制植物中所述蛋白表达的方法是：提高植物中截短型蛋白的表达，所述的截短型蛋白选自下组：

(1)如SEQ ID NO：3中第1-384位氨基酸序列的截短型蛋白；

(2)如SEQ ID NO：3中第1-431位氨基酸序列的截短型蛋白；

(3)(1)或(2)氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)或(2)截短型蛋白功能的由(1)或(2)衍生的蛋白；或

(4)与(1)或(2)限定的蛋白序列有90％以上同源性且具有(1)或(2)截短型蛋白功能的由(1)或(2)衍生的蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调节植物组织矿物质元素分布是：提高植物地上部分的镁元素含量。

9.一种截短型蛋白，其特征在于，所述的截短型蛋白选自下组：

(1)如SEQ ID NO：3中第1-384位氨基酸序列的截短型蛋白；

(2)如SEQ ID NO：3中第1-431位氨基酸序列的截短型蛋白；

(3)(1)或(2)氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)或(2)蛋白功能的由(1)或(2)衍生的蛋白；或

(4)与(1)或(2)限定的蛋白序列有90％以上同源性且具有(1)或(2)蛋白功能的由(1)或(2)衍生的蛋白。

10.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求9所述的蛋白。

11.权利要求9所述的蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物叶脉颜色转黄或调节植物组织矿物质元素分布。

12.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求10所述的多核苷酸。

13.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求12所述的表达载体或其基因组中整合有权利要求10所述的多核苷酸。

14.一种制备权利要求9所述的蛋白的方法，包括培养权利要求13所述的宿主细胞，使之表达所述的蛋白。

15.一种分离的干扰分子，其特征在于，所述的干扰分子是：

(i)一多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；或

16.如权利要求15所述的干扰分子，其特征在于，(ii)中，所述构建物含有以下结构：Seq_正向-X-Seq_反向，其中，Seq_正向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

17.权利要求15或16所述的干扰分子的用途，用于调节植物叶脉颜色转黄或调节植物组织矿物质元素分布。