JP2016500268A - トウモロコシにおける特定の遺伝子座に対する精密な遺伝子標的化 - Google Patents

Abstract

本発明は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用による、トウモロコシゲノム中の特定の遺伝子座、Ｅ３２への外因性ＤＮＡの安定な組込みのための方法を特許請求する。本発明の方法により形質転換されたトウモロコシ植物および植物の部分が特許請求される。本発明は、トウモロコシにおける除草剤抵抗性、除草剤耐性、昆虫抵抗性、昆虫耐性、疾患抵抗性、疾患耐性、ストレス耐性、およびストレス抵抗性などの所望の形質を作出するのに有用である。天然の農学的表現型がかき乱されないため、Ｅ３２遺伝子座は外来遺伝子を挿入するための優れた部位である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／７３６８５６号および２０１３年５月７日に出願された米国仮特許出願第６１／８２０２３１号の優先権を主張する。前記出願のそれぞれの全体の内容は、この参照によりその全体が本明細書に組込まれる。

技術分野
本開示は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によりトウモロコシゲノムの１つの特定の遺伝子座への外来ポリヌクレオチドの標的化された安定な組込みに関する。

電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式なコピーは、２０１３年１１月２６日に作成され、２３．７キロバイトのサイズを有し、本明細書と同時に出願される、ファイル名「７４３８１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」を有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組込まれる。

トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座は、米国特許第８，２７３，５３５号、ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＣＯＲＮ ＥＶＥＮＴ ＤＡＳ−５９１３２に記載されている。Ｂ７３トウモロコシゲノムの第８染色体に組込まれたトランスジーン発現カセットは、完全長Ｔストランド挿入物としてＨｉ−ＩＩトウモロコシ生殖質の領域を誘導した（D. D. Songstad, W. L. Petersen, C. L. Armstrong, American Journal of Botany, Vol. 79, pp. 761-764, 1992）。さらに、トランスジェニック遺伝子座の周囲のゲノムＤＮＡは、天然Ｂ７３配列と比較して大きい欠失を含まず、単一の小さい反復エレメントを除いて反復エレメントを一般に含まなかった。広範囲の実地調査により、イベントの存在は、イベントを担持する植物の正常な生長および発生に有害に作用しないことが示された。さらに、イベントを担持するトウモロコシ系列は、非形質転換アイソライン（isoline）と農業生産力において同等な農学的および育種的特徴を保持していた。従って、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２が組込まれたゲノム遺伝子座は、他のトランスジェニック構築物の標的化された組込みのためのトウモロコシにおける優れた内因性ゲノム遺伝子座であり、以後、Ｅ３２またはイベント３２遺伝子座と呼ばれる。

植物の標的化されたゲノム改変は、応用および基礎研究の両方の長年にわたる見つけにくい目標であった。部位特異的ヌクレアーゼによりゲノムＤＮＡを標的化し、切断する方法および組成物が、この目標を達成するために開発されている。部位特異的ヌクレアーゼとしては、限定されるものではないが、（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮＳおよびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡが操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、Burgess; et al; Nature Reviews Genetics 14, 80-81 (February 2013)を参照されたい）が挙げられる。ＺＦＮによるゲノム遺伝子座の部位特異的切断を用いて、例えば、標的化された突然変異誘発を誘導する、細胞ＤＮＡ配列の標的化された欠失を誘導する、および所定のゲノム遺伝子座内の外因性ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの標的化された組換えを容易にすることができる。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、第２００５０２０８４８９号、第２００５００２６１５７号、第２００５００６４４７４号、および第２００６０１８８９８７号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００７／０１４２７５号（これらの開示はあらゆる目的でその全体が参照により組込まれる）を参照されたい。米国特許公開第２００８０１８２３３２号は、植物ゲノムの標的化された改変のための非標準ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用を記載し、米国特許公開第２００９０２０５０８３号は植物ＥＰＳＰゲノム遺伝子座のＺＦＮ媒介性標的化改変を記載している。さらに、Moehle et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(9): 3055-3060は、特定のゲノム遺伝子座での標的化された遺伝子付加のための設計されたＺＦＮの使用を記載している。標的化の現在の方法は典型的には、少なくとも１つのトランスジーンおよび特定のゲノム遺伝子座に結合し、切断するように設計された部位特異的ヌクレアーゼを含有するドナーＤＮＡポリヌクレオチドを用いる植物組織の同時形質転換を含む。これにより、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドは、特定のゲノム遺伝子座での標的化された遺伝子付加をもたらす切断されたゲノム遺伝子座内に安定に挿入される。

今回特許請求される発明は、Ｅ３２遺伝子座を有するトウモロコシ細胞のゲノム中に、１つまたは複数の機能的外因性核酸配列を組込むための方法である。この方法は、表１Ｂに示される群から選択される標的部位に結合するジンクフィンガー結合ドメインを含む１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼを用いてＥ３２遺伝子座において二本鎖切断を行うことを含む。これにより、トウモロコシ細胞のゲノム中のＥ３２遺伝子座内に、１つまたは複数の外因性配列を含む機能的ポリヌクレオチドの組込みが得られる。この方法は場合により、１つまたは複数の外因性配列によりコードおよび制御される遺伝子産物を発現させることを含む。

Ｅ３２遺伝子座に結合するように設計されたＺＦＮの関係を記載する図である。６つのＺＦＮ（Ｅ３２ ＺＦＮ１〜６）が酵母アッセイから同定され、４つのＺＦＮを植物における評価のために進行させた。 ｐＤＡＢ１０５９０６のプラスミドマップである。 ｐＤＡＢ１１１８０９のプラスミドマップである。 ｐＤＡＢ１００６５５のプラスミドマップであり、限定されるものではないが、ＰＡＴを含む他の望ましいコード配列をＡＡＤ−１領域に置換することができる典型的なドナー構築物を表す。 破壊されたゲノム遺伝子座を示す矢印と共にＥ３２遺伝子座のＺＦＮ遺伝子座破壊グラフである。 ｐＤＡＢ１０８６８８（対照ベクター）のプラスミドマップである。 ｐＤＡＢ１０８６９０（標的化ベクター）のプラスミドマップである。 ＺＦＮ破壊ｑＰＣＲのためのプライマーおよびプローブ位置を示す図である。 ＺＦＮ破壊アッセイグラフ（上の括弧は非破壊イベントを示し、下の括弧は破壊イベントを示す）である。 ｐＤＡＢ１０４１７９のプラスミドマップである。 ＺＦＮ破壊ｑＰＣＲのためのプライマーおよびプローブ位置を示す図である。 ＺＦＮ破壊アッセイグラフ（上の括弧は非破壊イベント陰性を示し、下の括弧は破壊イベントを示す）である。 イン／アウトＰＣＲのためのプライマー位置を示す図である。 プローブ作成のための酵素切断部位およびプライマーの位置を示すサザン分析戦略である。 ｐＤＡＢ１０７８５５のプラスミドマップである。

トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２を形質転換するために用いられる完全長ＤＮＡ分子（ＰＨＩ１７６６２Ａ）、ゲノムフランキング配列の３’末端、およびＰＨＩ１７６６２Ａ／３’トウモロコシゲノム連結は、米国特許第８，２７３，５３５号の開示に記載されている。Ｅ３２遺伝子座は配列番号１により記載され、外因性遺伝子挿入のためのジンクフィンガータンパク質結合ドメインを設計するためのゲノム標的配列を同定するために用いられたトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノムフランキング領域に関する。これらの標的部位としては、限定されるものではないが、表１Ｂに記載のものが挙げられる。本発明の一実施形態である外因性遺伝子を挿入するための非常に望ましい位置としてＥ３２遺伝子座を同定した後、Ｅ３２遺伝子座内の他の標的部位を同定および使用することは、十分当業者が理解できる範囲内にある。

配列番号１は、以下の配列として提供される；

本開示は、ＺＦＮおよび遺伝子ドナー構築物を用いたトウモロコシＥ３２遺伝子座への標的化された組込みのための方法および組成物にさらに関する。本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、別途指摘しない限り、当業界の技術の範囲内にある分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、コンピュータ化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987およびその定期的アップデート; METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ, Academic Press, San Diego; Wolfe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304,「Chromatin」（P. M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.）, Academic Press, San Diego, 1999; ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, 「Chromatin Protocols」（P. B. Becker, ed.）Humana Press, Totowa, 1999を参照されたい。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に用いられる。この用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または改変誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合」とは、大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有的相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。そのような相互作用は一般に、１０^−６Ｍまたはそれ以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指す：結合親和性の増加は、結合定数（Ｋｄ）の低下と相関する。

「結合タンパク質」は、別の分子に非共有的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは自分自身に結合する（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）ことができる、および／またはそれは異なるタンパク質の１つもしくは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１より多い型の結合活性を有してもよい。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つまたは複数のジンクフィンガーにより配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略されることが多い。

ジンクフィンガー結合ドメインを「操作」して、所定のヌクレオチド配列に結合させることができる。ジンクフィンガータンパク質を操作するための方法の非限定例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、設計／組成が主に合理的基準に基づく自然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準としては、存在するＺＦＰ設計および結合データの情報を保存するデータベース中の情報をプロセッシングするための置換規則およびコンピュータアルゴリズムの適用が挙げられる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号、第６，５３４，２６１号、および第６，７９４，１３６号を参照されたい。また、ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。

「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有骨格の破壊を指す。限定されるものではないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解などの様々な方法により、切断を開始させることができる。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じてもよい。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態においては、融合ポリペプチドが、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために用いられる。「切断ドメイン」は、ＤＮＡ切断のための触媒活性を有する１つまたは複数のポリペプチド配列を含む。切断ドメインを単一ポリペプチド鎖中に含有させるか、または切断活性が２つ（またはそれ以上）のポリペプチドの会合の結果生じてもよい。

「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。

「外因性」分子は、細胞中に通常存在しない分子であるが、１つまたは複数の遺伝学的、生化学的またはその他の方法により細胞中に導入することができる。「細胞中での通常の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。かくして、例えば、熱ショックにより誘導される分子は、非熱ショック細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、任意のポリペプチドまたはその断片のコード配列、正常に機能しない内因性分子の機能する型または正常に機能する内因性分子の正常に機能しない型を含んでもよい。さらに、外因性分子は、別の種に由来するコード配列を含んでもよい。

核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく；線状、分枝状または環状であってもよく；任意の長さのものであってもよい。核酸は、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖を形成する核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。

「外因性核酸の産物」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）ならびに遺伝子発現の産物および遺伝子産物を含む。

「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、例えば、共有的に連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であってもよく、または異なる化学型の分子であってもよい。第１の型の融合分子の例としては、限定されるものではないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。第２の型の融合分子の例としては、限定されるものではないが、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの融合物、および副溝結合剤と核酸との融合物が挙げられる。

細胞中での融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達の結果起こるか、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によるものであってよく、ここでポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳され、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションを、タンパク質の細胞中での発現に関与させることもできる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達のための方法は、本開示の他の場所に提示される。

本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、ならびに遺伝子産物の生成を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するかどうかには関係がない。従って、遺伝子としては、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が挙げられる。

「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含有される情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡもしくは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳により生成されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスにより改変されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化（myristilation）、およびグリコシル化により改変されるタンパク質も含む。

開示される方法および組成物は、切断ドメインと、ＤＮＡ結合ドメインが、Ｅ３２遺伝子座中の配列に結合することによって、切断ドメインの活性をその配列の近くに指向させ、従って、Ｅ３２遺伝子座中の二本鎖の破壊を誘導するＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ）とを含む融合タンパク質を含む。本開示の他の場所に記載されるように、ジンクフィンガードメインを操作して、実質的に任意の所望の配列に結合させることができる。従って、１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインを操作して、Ｅ３２遺伝子座中の１つまたは複数の配列に結合させることができる。細胞中でのＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとを含む融合タンパク質の発現は、標的部位での、またはその近くでの切断に影響する。

ジンクフィンガードメインによる結合のためのＥ３２遺伝子座中の標的部位の選択を、例えば、選択された配列に結合するＺＦＰを設計するための方法も開示する米国特許第６，４５３，２４２号に開示された方法に従って達成することができる。ヌクレオチド配列の単純な視覚的検査を標的部位の選択のために用いることもできることが、当業者には明らかである。従って、標的部位選択のための任意の手段を、本明細書に記載の方法において用いることができる。

ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインについて、標的部位は一般に、複数の隣接する標的サブ部位から構成される。標的サブ部位とは、個々のジンクフィンガーにより結合される、隣接するクアドルプレットと１ヌクレオチド重複してもよい、通常はヌクレオチドトリプレットまたはヌクレオチドクアドルプレットの配列を指す。例えば、ＷＯ０２／０７７２２７を参照されたい。ジンクフィンガータンパク質が大部分の接触部を作る鎖は、標的鎖「一次認識鎖」または「一次接触鎖」と指定され、いくつかのジンクフィンガータンパク質は、標的鎖中の３塩基トリプレットおよび非標的鎖上の第４の塩基に結合する。標的部位は一般に、少なくとも９ヌクレオチドの長さを有し、従って、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインにより結合される。しかしながら、例えば、４フィンガー結合ドメインの１２ヌクレオチド標的部位への結合、５フィンガー結合ドメインの１５ヌクレオチド標的部位への結合または６フィンガー結合ドメインの１８ヌクレオチド標的部位への結合も可能である。明らかであるように、より大きい結合ドメイン（例えば、７、８、９フィンガー以上）の、より長い標的部位への結合も、本発明に合致する。

標的部位は複数の３ヌクレオチドである必要はない。交差鎖相互作用が生じる場合（例えば、米国特許第６，４５３，２４２号およびＷＯ０２／０７７２２７を参照されたい）、多フィンガー結合ドメインの１つまたは複数の個々のジンクフィンガーは、重複するクアドルプレットサブ部位に結合することができる。結果として、３フィンガータンパク質は、１０ヌクレオチド配列に結合することができ、ここで１０番目のヌクレオチドは末端フィンガーにより結合されるクアドルプレットの一部であり、４フィンガータンパク質は１３ヌクレオチド配列に結合することができ、ここで、１３番目のヌクレオチドは末端フィンガーにより結合されるクアドルプレットの一部である、などである。

多フィンガー結合ドメイン中の個々のジンクフィンガー間のアミノ酸リンカー配列の長さおよび性質もまた、標的配列への結合に影響する。例えば、多フィンガー結合ドメイン中の隣接するジンクフィンガー間のいわゆる「非標準リンカー」、「長いリンカー」または「構造化リンカー」の存在は、これらのフィンガーを直接隣接しないサブ部位に結合させることができる。そのようなリンカーの非限定例は、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号およびＷＯ０１／５３４８０に記載されている。従って、ジンクフィンガー結合ドメインのための標的部位中の１つまたは複数のサブ部位は、１、２、３、４、５ヌクレオチド以上、互いに離れていてもよい。ただ１つ例を挙げれば、４フィンガー結合ドメインは、配列中に、２つの連続する３ヌクレオチドサブ部位、介在ヌクレオチド、および２つの連続するトリプレットサブ部位を含む１３ヌクレオチドの標的部位に結合することができる。

標的部位間の距離は、互いに最も近い配列の端部から測定された場合に２つの標的部位間に介在するヌクレオチドまたはヌクレオチド対の数を指す。切断が標的部位を隔てる２つのジンクフィンガードメイン／切断半ドメイン融合分子の結合に依存するある特定の実施形態においては、２つの標的部位は反対のＤＮＡ鎖上にあってもよい。他の実施形態においては、両方の標的部位が同じＤＮＡ鎖上にある。

Ｅ３２遺伝子座への標的化された組込みのために、１つまたは複数のＺＦＰを操作して、所定の切断部位で、またはその近くで標的部位に結合させ、操作されたＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとを含む融合タンパク質を細胞中で発現させる。融合タンパク質のジンクフィンガー部分の標的部位への結合時に、ＤＮＡは、好ましくは切断ドメインにより標的部位の近くで二本鎖破壊により切断される。

イベント３２遺伝子座中の二本鎖破壊の存在は、相同組換えによるか、または非相同性指向的修復機構による外因性配列の組込みを容易にする。かくして、イベント３２遺伝子座中に挿入される外因性配列を含むポリヌクレオチドは、相同組換えを容易にするＥ３２との１つまたは複数の相同領域を含む。

本明細書に記載の融合分子に加えて、選択されるゲノム配列の標的化された置き換えはまた、ドナー配列の導入も含む。ドナー配列を、融合タンパク質の発現の前に、それと同時に、またはその後に細胞中に導入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、それと、それが相同性を担持するＥ３２ゲノム配列との間の相同組換えを支援するＥ３２に対する十分な相同性を含有する。ドナーとゲノム配列との間の、約２５、５０、１００、２００、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００ヌクレオチド以上の配列相同性、または１０〜２，０００の間またはそれ以上の任意の整数値のヌクレオチドが、相同組換えを支援する。ある特定の実施形態においては、相同性アームは１，０００塩基対未満の長さである。他の実施形態においては、相同性アームは、７５０塩基対未満の長さである。

ドナー配列は、１０〜５０，０００塩基対の長さまたはその間もしくはそれより長い任意の整数値のヌクレオチドの範囲にあってもよい。ドナー配列は典型的にはそれが置き換えるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかである。さらに、ドナー配列は、置き換えられる領域と相同ではない配列を含有するベクター分子を含んでもよい。一般に、ドナー配列の相同領域は、組換えが望ましいゲノム配列に対する少なくとも５０％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態においては、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％〜１００％の間の配列同一性の任意の値が存在してもよい。

ドナー分子は、細胞クロマチンと相同ないくつかの不連続領域を含有してもよい。例えば、対象の領域中に通常は存在しない配列の標的化された挿入のために、前記配列はドナー核酸分子中に存在し、対象の領域中の遺伝子配列と相同な領域に隣接していてもよい。

また、ドナー分子を、後の使用のためのリザーバとして働くようにＥ３２遺伝子座中に挿入することもできる。例えば、対象の突然変異を含有するドナー分子を、Ｅ３２遺伝子座中に挿入することができる。次に、対象の突然変異を含有するＥ３２遺伝子座中の内因性遺伝子座とドナー分子の両方を切断する対象の遺伝子に特異的なＺＦＮを導入することができる。次いで、ゲノム中の得られる二本鎖破壊は、Ｅ３２遺伝子座から遊離されるドナー分子のための組込み部位になることができる。このように、前記方法はＺＦＮをコードする核酸と、これらのドナー配列の両方の同時的取込みに依拠しないため、対象の任意の領域でのドナー配列の標的化された組込みの効率を大きく増加させることができる。

また、ドナー分子を、その後の挿入のための標的部位として働くようにＥ３２遺伝子座中に挿入することもできる。例えば、さらなるＺＦＮ設計のための認識部位を含有するＤＮＡ配列から構成されるドナー分子を、遺伝子座中に挿入することができる。次いで、さらなるＺＦＮ設計を作成し、元のドナー分子が切断され、修復または相同組換えにより改変されるように細胞中で発現させることができる。このように、ドナー分子の反復的組込みがＥ３２遺伝子座で起こってもよい。

本明細書に記載のように、任意の外因性配列をＥ３２遺伝子座中に導入することができる。例示的な外因性配列としては、限定されるものではないが、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列、例えば、干渉ＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ発現カセット、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位および様々な型の発現構築物が挙げられる。そのような配列は、標準的な分子生物学技術（クローニング、合成など）を用いて容易に取得することができる、および／または商業的に入手可能である。

ＺＦＮを発現させるために、典型的には、融合タンパク質をコードする配列を、転写を指令するプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングする。好適な細菌および真核生物プロモーターは当業界で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3.sup.rd ed., 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 上掲)に記載されている。ＺＦＮを発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス種（Bacillus sp.）およびサルモネラ菌（Salmonella）において利用可能である（Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)）。そのような発現系のためのキットは、商業的に入手可能である。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は当業者には周知であり、これも商業的に入手可能である。

遺伝子材料を細胞中に輸送するために用いられる特定の発現ベクターを、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現の融合タンパク質の意図される使用に関して選択する（以下に記載の発現ベクターを参照されたい）。標準的な細菌および動物発現ベクターは当業界で公知であり、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４Ａ１号ならびに国際特許公開ＷＯ０５／０８４１９０、ＷＯ０５／０１４７９１およびＷＯ０３／０８０８０９に詳細に記載されている。

標準的なトランスフェクション方法を用いて、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞系を生成した後、標準的な技術を用いて精製することができる（例えば、Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989)；Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)を参照されたい）。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施される（例えば、Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977)；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds., 1983)を参照されたい）。

そのような宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための任意の周知の手順を用いることができる。これらのものは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび組込みベクターの両方、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞に導入するための任意の他の周知の方法の使用を含む（例えば、Sambrook et al., 上掲を参照されたい）。用いられる特定の遺伝子操作手順は、選択されたタンパク質を発現することができる宿主細胞中に少なくとも１つの遺伝子を上手く導入することができることが唯一必要である。

上記のように、様々な従来の技術により、所望の植物種のゲノム中にＤＮＡ構築物を導入することができる。そのような技術の概説については、例えば、Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463；およびGrierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9を参照されたい。

植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡ中にＤＮＡ構築物を直接導入するか、またはＤＮＡ粒子ボンバードメント（例えば、Klein et al. (1987) Nature 327:70-73を参照されたい）などのビオリスティック方法を用いて植物組織にＤＮＡ構築物を直接導入することができる。あるいは、ＤＮＡ構築物を、ナノ粒子形質転換（例えば、その全体が参照により本明細書に組込まれる米国特許公開第２００９０１０４７００号を参照されたい）により植物細胞中に導入することができる。あるいは、ＤＮＡ構築物を、好適なＴ−ＤＮＡ境界／隣接領域と組み合わせ、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主ベクター中に導入することができる。バイナリーベクターのディスアーミング（disarming）および使用などの、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）媒介性形質転換技術が、科学文献によく記載されている。例えば、Horsch et al. (1984) Science 233:496-498、およびFraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803を参照されたい。

さらに、遺伝子導入を、非アグロバクテリウム（Agrobacterium)細菌またはリゾビウム種（Rhizobium sp.）ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロチ（Sinorhizoboium meliloti）、メソリゾビウム・ロチ（Mesorhizobium loti）、ジャガイモＸウイルス、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスおよび／またはタバコモザイクウイルスなどのウイルスを用いて達成することができる。例えば、Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4を参照されたい。

アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主のビルレンス機能は、細胞をバイナリーＴ ＤＮＡベクター（Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721）または同時培養手順（Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231）を用いて細菌により感染させた場合、構築物および隣接マーカーを含有するＴ鎖の、植物細胞ＤＮＡ中への挿入を指令する。一般に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換系を用いて、双子葉植物を操作する（Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet. 16:357-384；Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641）。また、アグロバクテリウム（Agrobacterium)形質転換系を用いて、単子葉植物および植物細胞にＤＮＡを形質転換、ならびに導入することもできる。米国特許第５，５９１，６１６号；Hernalsteen et al. (1984) EMBO J. 3:3039-3041；Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764；Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179；Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40；およびGould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434を参照されたい。

代替的な遺伝子導入および形質転換方法としては、限定されるものではないが、ネイキッドＤＮＡのカルシウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション媒介性取込みによるプロトプラスト形質転換（Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722、Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177；Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828；およびShimamoto (1989) Nature 338:274-276を参照されたい）ならびに植物組織のエレクトロポレーション（D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505）が挙げられる。植物細胞形質転換のためのさらなる方法としては、マイクロインジェクション、シリコンカーバイド媒介性ＤＮＡ取込み（Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418）、および微粒子銃（Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309；およびGordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618を参照されたい）が挙げられる。

開示される方法および組成物を用いて、Ｅ３２遺伝子座などの所定の位置に外因性配列を挿入することができる。トウモロコシゲノム中での導入されたトランスジーンの発現はその組込み部位に決定的に依存するため、これは有用である。従って、除草剤耐性、昆虫抵抗性、栄養素、抗生物質または治療分子をコードする遺伝子を、標的化された組換えによって挿入することができる。

上記の形質転換技術のいずれかにより生成された形質転換された植物細胞を培養して、形質転換された遺伝子型およびかくして、所望の表現型を有する全植物を再生することができる。そのような再生技術は、組織培養増殖培地中でのある特定の植物ホルモンの操作に依拠し、典型的には、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された殺生物剤および／または除草剤マーカーに依拠する。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evans, et al., 「Protoplasts Isolation and Culture」, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983；およびBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記載されている。また、再生体を、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚またはその一部から取得することもできる。そのような再生技術は、Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486に一般に記載されている。

当業者であれば、外因性配列をトランスジェニック植物中に安定に組込み、作動可能であることを確認した後、それを性的交配により他の植物中に導入することができることを理解されよう。いくつかの標準的な育種技術のいずれかを、交配しようとする種に応じて用いることができる。

形質転換するＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によりコードされる形質について、操作された植物材料を選択またはスクリーニングすることにより、形質転換されたトウモロコシ細胞、カルス、組織または植物を同定および単離することができる。例えば、形質転換する遺伝子構築物が抵抗性を付与する阻害量の抗生物質または除草剤を含有する培地上で、操作された植物材料を増殖させることにより、選択を実施することができる。さらに、組換え核酸構築物上に存在してもよい任意の可視的マーカー遺伝子（例えば、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることにより、形質転換された細胞を同定することもできる。そのような選択およびスクリーニング方法は、当業者には周知である。

また、物理学的および生化学的方法を用いて、挿入された遺伝子構築物を含有する植物または植物細胞形質転換体を同定することもできる。これらの方法としては、限定されるものではないが、１）組換えＤＮＡ挿入物の構造を検出および決定するためのサザン分析またはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出および検査するためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長または逆転写酵素−ＰＣＲ増幅；３）酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ（そのような遺伝子産物が遺伝子構築物によりコードされる場合）；４）タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット技術、免疫沈降、または酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（遺伝子構築物産物がタンパク質である場合）が挙げられる。また、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などのさらなる技術を用いて、特定の植物器官および組織における組換え構築物の存在または発現を検出することもできる。これらのアッセイの全部を行うための方法は、当業者には周知である。

本明細書に開示される方法を用いる遺伝子操作の効果を、例えば、対象の組織から単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットにより観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在するか、またはｍＲＮＡの量が増加した場合、対応するトランスジーンが発現されていると推測することができる。遺伝子および／またはコードされるポリペプチド活性を測定する他の方法を用いることができる。用いられる基質および反応産物または副産物の増加または減少を検出する方法に応じて、異なる型の酵素アッセイを用いることができる。さらに、発現されるポリペプチドのレベルを、免疫化学的に、すなわち、電気泳動検出アッセイ（染色またはウェスタンブロッティングのいずれかと共に）などによる、当業者には周知のＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の抗体に基づくアッセイにより測定することができる。１つの非限定例として、ＥＬＩＳＡアッセイを用いるＡＡＤ−１（アリールオキシアルカン酸ジオキシゲナーゼ；ＷＯ２００５／１０７４３７を参照されたい）およびＰＡＴ（ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ（ＰＡＴ）、ＥＣ２．３．１．１８３）タンパク質の検出が、その全体が参照により本明細書に組込まれる米国特許公開第２００９００９３３６６号に記載されている。トランスジーンを、植物のいくつかの組織中で、もしくはいくつかの発生段階で選択的に発現させることができるか、またはトランスジーンを、実質的に全ての植物組織中で、実質的にその全生活環に沿って発現させることができる。しかしながら、任意の組合せ発現様式も適用可能である。

本開示はまた、種子がトランスジーンまたは遺伝子構築物を有する、上記のトランスジェニック植物の種子も包含する。本開示はさらに、トランスジーンまたは遺伝子構築物を有する、上記のトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞系または細胞を包含する。

有効量の投与は、処置しようとする植物細胞との最終的な接触部に融合タンパク質を導入するために通常用いられる任意の経路による。ＺＦＰは、任意の好適な様式で、好ましくは、許容される担体と共に投与される。そのようなモジュレータを投与するための好適な方法が利用可能であり、当業者には周知であり、１より多い経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は別の経路よりも即時の、より有効な反応を提供することができることが多い。
［実施例］

トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座に結合するように設計されたジンクフィンガータンパク質の生成
トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座を含むＤＮＡ配列を指向するジンクフィンガータンパク質（図１を参照されたい）を、Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651に記載の方法に従って設計した。例示的な標的配列および認識ヘリックスを、表１Ａ（認識ヘリックス領域設計）および表１Ｂ（標的部位）に示す。表１Ｂにおいて、ＺＦＰ認識ヘリックスにより接触される標的部位中のヌクレオチドは大文字で示される；非接触ヌクレオチドは小文字で示される。

Ｅ３２ジンクフィンガータンパク質設計を、ＣＣＨＣ構造を有する少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするベクター中に組込んだ。米国特許公開第２００８／０１８２３３２号を参照されたい。特に、各タンパク質中の最後のフィンガーは、認識ヘリックスのためのＣＣＨＣ骨格を有していた。非標準ジンクフィンガーをコードする配列を、４アミノ酸ＺＣリンカーおよびトウモロコシ（Zea mays）由来ｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルを介してＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569の配列のアミノ酸３８４〜５７９）に融合させて、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成させた。活性ヌクレアーゼを同定することが以前に示された出芽酵母に基づく系を用いて、切断活性について最適なジンクフィンガーを検証した。例えば、米国特許公開第２００９０１１１１１９号；Doyon et al. (2008) Nat Biotechnol. 26:702-708；Geurts et al. (2009) Science 325:433を参照されたい。様々な機能的ドメインのためのジンクフィンガーを、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用のために選択した。推定トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２ゲノムポリヌクレオチド標的部位に結合させるために設計、生成および試験されたいくつかのＺＦＮのうち、６対のＺＦＮが高レベルのｉｎ ｖｉｖｏ活性を有するものとして同定され、さらなる実験のために選択された。表１Ａを参照されたい。Ｅ３２遺伝子座に最適に結合した選択されたＺＦＮ対を、一過的トウモロコシ形質転換アッセイにおける試験のために進行させた。

図１は、６つのＺＦＮ対のＺＦＮポリヌクレオチド結合／標的部位と関連するＥ３２遺伝子座のゲノム構造を示す。１番目の３つのＺＦＮ対（Ｅ３２ ＺＦＮ１、Ｅ３２ ＺＦＮ２、およびＥ３２ ＺＦＮ３）は、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２トランスジェニック挿入物の上流に結合し、２番目の３つのＺＦＮ対（Ｅ３２ ＺＦＮ４、Ｅ３２ ＺＦＮ５、およびＥ３２ ＺＦＮ６）はトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２トランスジェニック挿入物の下流に結合する。４つのＺＦＮが、ｉｎ ｐｌａｎｔａでトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２ゲノムポリヌクレオチド標的部位に効率的に結合し、これを切断することができると特徴付けられた。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物およびＡＡＤ−１遺伝子ドナー構築物
６つの例示的なジンクフィンガーヌクレアーゼのＺＦＮ発現構築物を含有するプラスミドベクターを、当業界で一般的に実行される技術を用いて設計および構築した。それぞれのジンクフィンガーをコードする配列を、ｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルをコードする配列（Maddaloni et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17(18):7532）に融合させ、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に配置した。

ｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列を、相補的なｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列と対形成させた。そのようなものとして、各構築物は、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス由来２Ａ配列により隔てられた、２つのｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列を含む単一のオープンリーディングフレームからなっていた（Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-8127）。ＺＦＮコード配列の発現を、高発現構成的トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18(4):675-89）により誘導し、トウモロコシ（Zea mays）Ｐｅｒ５ ３’ポリＡ非翻訳領域に隣接させた（米国特許第６，６９９，９８４号）。得られた６つのプラスミド構築物を、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により確認した。図２および図３は、完成されたプラスミド構築物を図示したものである。プラスミド構築物、ｐＤＡＢ１０５９０６（図２）中で発現されたＺＦＮは、野生型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである「Ｆｏｋ−Ｍｏｎｏ」を含有する。プラスミド構築物、ｐＤＡＢ１１１８０９（図３）中で発現されたＺＦＮは、改変型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである「Ｆｏｋ１−ＥＬＤ」を含有する。改変型Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼは、Doyon Y., Vo T., Mendel M., Greenberg S., Wang J., Xia D., Miller J., Urnov F., Gregory P., and Holmes M. (2010) Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architecture. Nature Methods, 8(1); 74-79に記載のような変化を含有する。

ドナー構築物を、Ｅ３２遺伝子座のＺＦＮ切断されたゲノムＤＮＡ中に組込むように設計した。図４は、単一の遺伝子発現カセットからなるドナー構築物、ｐＤＡＢ１００６５５を示す。この単一の遺伝子発現カセットは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１プロモーター）、ＡＡＤ−１コード配列（米国特許第７，８３８，７３３号）およびトウモロコシ（Zea mays）Ｐｅｒ５ ３’非翻訳領域（ＺｍＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ）から構成される。構築物は、ＡＡＤ−１遺伝子発現カセットの下流に含まれる一対の反復トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２ ＺＦＮ６結合配列を含有する。様々な遺伝子エレメントを、高コピー数のｐＵＣに基づくプラスミド中で集合させた。

ＺＦＮ効率を決定するためのトウモロコシＨｉ−ＩＩ培養物の一過的形質転換
ＺＦＮ遺伝子の形質転換
トウモロコシＨｉ−ＩＩ胚発生培養物を、米国特許第７，１７９，９０２号に記載のように生成し、異なるＺＦＮの効率を評価および試験するために用いた。ｐＤＡＢ１０５９０１、ｐＤＡＢ１０５９０２、ｐＤＡＢ１０５９０３、ｐＤＡＢ１０５９０４、ｐＤＡＢ１０５９０５およびｐＤＡＢ１０５９０６からなるプラスミドＤＮＡを、トウモロコシカルス細胞中に一過的に形質転換し、米国特許出願第２０１１／０１１９７８６号に記載のようにトウモロコシゲノム内のイノシトールポリリン酸２キナーゼ遺伝子座に設計された標準試験されたＺＦＮ、ｐＤＡＢ７４３０に対して異なるＺＦＮの切断頻度を比較した。

Ｈｉ−ＩＩ培養物から、予め凍結保存された細胞系に由来する１２ｍＬのパック細胞容積（ＰＣＶ）と、２８ｍＬの条件化培地とを、５００ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中、８０ｍＬのＧＮ６液体培地（Ｎ６培地（Chu et al., (1975) Sci Sin. 18:659-668）、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、ｐＨ６．０）中で二次培養し、２８℃で１２５ｒｐｍで振とう機上に置いた。このステップを、同じ細胞系を用いて２回繰り返し、合計３６ｍＬのＰＣＶを３つのフラスコに分配した。２４時間後、内容物を滅菌ＰＥＴＲＩ（商標）皿に注ぎ、ＧＮ６液体培地を除去した。わずかに湿ったカルスを、ＧＮ６ Ｓ／Ｍ固体培地（Ｎ６培地（Chu et al., (1975) Sci Sin. 18:659-668）、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、４５．５ｇ／Ｌのソルビトール、４５．５ｇ／Ｌのマンニトール、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ（商標）、ｐＨ６．０）を含有する濾紙上の２．５ｃｍ直径の円に転移させた。プレートを暗室中、２８℃で４時間インキュベートした。

微粒子金（０．６ミクロン、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、２１ｍｇを滅菌シリコン処理された１．７ｍＬマイクロ遠心チューブ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に計り取ることによりＤＮＡ沈降のために調製し、３５０μＬの氷冷１００％エタノールを添加し、１分間ボルテックスした。ＭＩＮＩＳＰＩＮ（商標）遠心チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）を用いる１０，０００ｒｐｍで１５秒間の遠心分離により、金を沈殿させた。上清を除去した後、３５０μＬの氷冷滅菌水を添加し、ピペットを用いて上下に混合し、１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。洗浄ステップをもう１回繰り返した後、金を３５０μＬの氷冷滅菌水中に懸濁した。次いで、洗浄された金を必要となるまで−２０℃で保存した。

それぞれのＤＮＡ沈降物について、５０μＬの水中の３ｍｇの金を、シリコン処理された１．７ｍＬマイクロ遠心チューブ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中にアリコートした。プラスミドＤＮＡ（プラスミドｐＤＡＢ１０５９０１、ｐＤＡＢ１０５９０２、ｐＤＡＢ１０５９０３、ｐＤＡＢ１０５９０４、ｐＤＡＢ１０５９０５またはｐＤＡＢ１０５９０６中の２．５μｇのＥ３２ ＺＦＮおよびプラスミドｐＤＡＢ７４３０中の２．５μｇのＩＰＫ１ ＺＦＮ）を、０．６ｍＬのマイクロ遠心チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｚａｒｅｔｈ、ＰＡ）中で予め混合し、金懸濁液に添加し、５〜１０回、上下に穏やかにピペッティングし、完全に混合した。次いで、２０μＬの冷０．１Ｍスペルミジンを添加し、５〜１０回、上下にピペッティングすることにより穏やかに混合した。５０μＬの氷冷２．５Ｍ塩化カルシウムをゆっくり添加し、５〜１０回、上下にピペッティングすることにより穏やかに混合した。次いで、チューブにキャップを付け、室温で１０分間インキュベートした。１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した後、上清を注意深く除去し、６０μＬの氷冷１００％エタノールを添加した。金ＤＮＡ混合物を、５〜１０回、穏やかに上下にピペッティングすることにより再懸濁した。

微粒子ボンバードメントのために、滅菌マクロキャリア（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、ステンレススチール製ホルダー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）中に固定し、オートクレーブした。９μＬの金／ＤＮＡ懸濁液を、マクロキャリアの中心に均一に拡散し、アリコート間で十分混合した懸濁液を保持するために確実に上下にピペッティングした。次いで、マクロキャリアを、１４０ｘ２５ｍｍのガラスＰＥＴＲＩ（商標）皿中、８メッシュのＤＲＩＥＲＩＴＥ（商標）（Ｗ．Ａ Ｈａｍｍｏｎｄ Ｄｒｉｅｒｉｔｅ Ｃｏ．、Ｘｅｎｉａ、ＯＨ）のベッド上の滅菌１２５ｍｍ Ｗｈａｔｍａｎ＃４濾紙（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）の小片上に置いた。金／ＤＮＡを、約５〜１０分間にわたって完全に乾燥させた。ラプチャーディスク（１，１００ｐｓｉ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、イソプロピルアルコール中に数秒間浸すことにより滅菌した後、微粒子ボンバードメントデバイス（ＰＤＳ−１０００、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）の保持キャップ中にロードした。オートクレーブした停止スクリーン（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）およびロードされたマクロキャリアを、ロンチアセンブリ中に入れ、フタをねじ込み、ノズルのちょうど下でボンバードメントチャンバに入れた。標的を含有するＰＥＴＲＩ（商標）皿のフタを取り、ノズルの６ｃｍ下でボンバードメントチャンバに入れた。真空を吸引し（−０．９ｂａｒ）、デバイスに点火した。上記のステップを、ブラスト（blast）されたそれぞれの標的について繰り返した。標的を、同じブラスト培地上で２４時間、２８℃の温度で暗室中でインキュベートした。ブラストされた細胞を、回収ＧＮ６固体回収培地（Ｎ６培地（Chu et al., (1975) Sci Sin. 18:659-668）、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ、ｐＨ６．０）に移し、暗室中、２８℃でさらに４８時間インキュベートした。ボンバードメントの７２時間後、細胞を２ｍＬのＥＰＰＥＮＤＯＲＦ ＭＩＣＲＯＦＵＧＥ ＳＡＦＥ ＬＯＣＫ ＴＵＢＥＳ（商標）中に収穫し、ＶＩＲＴＩＳ ＭＯＤＥＬ＃５０Ｌ ＶＩＲＴＵＡＬ ＸＬ−７０ ＬＹＯＰＨＩＬＩＺＥＲ（商標）（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ ＮＹ）中で４８時間凍結乾燥した。

一過的に形質転換されたトウモロコシの次世代配列決定（ＮＧＳ）分析
一過的に形質転換されたトウモロコシカルス組織を分析して、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の切断効率を決定した。

試料調製
ＺＦＮ構築物ならびに２つの対照ベクター、ｐＤＡＢ１００６６４およびｐＤＡＢ１００６６５で一過的に形質転換されたトウモロコシカルス組織を、２ｍＬのＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標）チューブ中に収集し、４８ｈ凍結乾燥した。製造業者の仕様書に従ってＱＩＡＧＥＮ ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、凍結乾燥組織からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。単離されたｇＤＮＡを２００μＬの水に再懸濁し、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて濃度を決定した。試料を０．８％アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動することにより、ＤＮＡの完全性を評価した。ｇＤＮＡ試料をＰＣＲ増幅のために正規化（２５ｎｇ／μＬ）し、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）配列決定（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により分析することができるアンプリコンを作成した。

それぞれの試験されるＺＦＮ切断部位に広がるゲノム領域と対照試料の増幅のためのＰＣＲプライマーを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。このプライマーのための最適な増幅条件を、２３．５μＬの反応液中の０．２μＭの適切なプライマー、ＡＣＣＵＰＲＩＭＥ ＰＦＸ ＳＵＰＥＲＭＩＸ（商標）（１．１Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００ｎｇの鋳型ゲノムＤＮＡを用いる温度勾配ＰＣＲにより同定した。サイクリングパラメータは、９５℃での初期変性（５分）、次いで、変性（９５℃、１５ｓｅｃ）、アニーリング（５５〜７２℃、３０ｓｅｃ）、伸長（６８℃、１分）の３５サイクル、および最後の伸長（７２℃、７分）であった。増幅産物を、３．５％ＴＡＥアガロースゲル上で分析した。最適なアニーリング温度を同定した後、各セットのＰＣＲプライマーを検証し、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）配列決定アンプリコンを作成するために、分取ＰＣＲ反応を実行した。

分取ＰＣＲのために、８つの個々の小規模ＰＣＲ反応を、上記の条件を用いて各鋳型について実施し、得られたＰＣＲ産物を一緒にプールし、製造業者の推奨に従ってＱＩＡＧＥＮ ＭＩＮＥＬＵＴＥ ＧＥＬ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ／ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）を用いて３．５％アガロースゲル上でゲル精製した。ゲル精製されたアンプリコンの濃度を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）により決定し、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）配列決定試料を、標的化されたＺＦＮおよび対応する野生型対照から約１００ｎｇのＰＣＲアンプリコンをプールすることにより調製した。ＰＣＲアンプリコン作成のために用いられたプライマーを、以下の表２に示す。

ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）配列決定および分析
ＺＦＮを、トランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座内の特定のＤＮＡ配列を認識し、これに結合し、これを改変するように設計した。６つのＺＦＮがゲノム遺伝子座を切断する効率をアッセイして、どのＺＦＮが最も効率的に切断したかを決定した。ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）配列決定を、Ｃｏｆａｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で実施し、配列分析スクリプトを用いて配列を分析した。低品質の配列をフィルタリング除去し、残存する配列をユニークなＤＮＡ配列識別子に従って解析した。次いで、ユニークなＤＮＡ配列識別子を参照配列と整列させ、挿入／欠失（インデル）についてスコア化した。切断活性のレベルを決定するために、ＺＦＮ切断部位の周囲の領域を、インデルの結果生じた配列バリアントの存在についてスコア化した。この試験におけるそれぞれのＺＦＮの切断活性を、インデル／１Ｍ高品質配列を有する配列の数として、またはインデルを含む高品質配列のパーセンテージとして算出した。切断効率のレベルを、米国特許公開第２０１１／０１１９７８６号に記載のようにＩＰＰ２−Ｋ遺伝子を指向するＺＦＮの活性を用いて切断活性のＺＦＮレベルを正規化することにより決定した。

２５７１６および２５７１７ジンクフィンガー結合ドメインを含有するＥ３２ ＺＦＮ６は、最も高い効率でトランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座を切断した。このＺＦＮは、対照ＩＰＰＫ２ジンクフィンガーヌクレアーゼの効率の３．８倍機能した。Ｅ３２ ＺＦＮ６の高レベルの切断活性を考慮して、非相同末端連結によるゲノム遺伝子座へのドナーＤＮＡ断片の組込みにおける使用のために、このＺＦＮを選択した。

Ｅ３２遺伝子座を標的とするＮＨＥＪを証明するためのトウモロコシプロトプラスト中でのＥ３２ ＺＦＮの一過的発現
トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２の内因性ゲノム遺伝子座を標的化し、トウモロコシにおけるドナー標的化パラメータを最適化するために、遺伝子標的化のための迅速な試験システムを確立した。トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２においてゲノム内で二本鎖破壊を作成し、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）または相同性依存的修復（ＨＤＲ）のいずれかにより修復した。

プロトプラスト単離
トウモロコシＨｉ−ＩＩ胚発生懸濁培養物を、３．５日のサブ培養スケジュールで維持した。滅菌６％（ｗ／ｖ）セルロースの１０ｍＬ溶液および滅菌０．６％（ｗ／ｖ）ペクトリアーゼ酵素溶液の１０ｍＬ溶液を、５０ｍＬの円錐チューブ中にピペットで取った。次に、４ｍＬのパック細胞容積（ＰＣＶ）のＨｉ−ＩＩ懸濁細胞を、消化溶液を含有する５０ｍＬのチューブに添加し、Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で包んだ。チューブを、室温で約１６〜１８ｈ、プラットフォームロッカー上に置いた。次に、細胞および酵素溶液を、５０ｍＬの円錐チューブ中に入れた１００μＭのセルストレーナーによりゆっくりと濾過した。次いで、ストレーナーを介して１０ｍＬのＷ５培地をピペッティングすることにより、１００μＭのセルストレーナーを用いて細胞をすすいだ。細胞および酵素溶液を、７０μＭのセルストレーナーによりゆっくりと濾過した。この濾過ステップの後、別の濾過ステップを行い、細胞および酵素溶液を、５０ｍＬの円錐チューブに入れた４０μＭのセルストレーナーによりゆっくりと濾過した。１０ｍＬのピペットチップを用いて、４０μＭのセルストレーナーを１０ｍＬのＷ５培地ですすぎ、４０ｍＬの最終容量を得て、チューブを反転させた。非常にゆっくりと、８ｍＬのスクロースクッション溶液を、プロトプラスト／酵素溶液の底部に添加した。スイングアームバケットローター付き遠心分離機を用いて、チューブを１，５００ｒｐｍで１５分間スピンした。プロトプラスト細胞を、５ｍＬの狭口径ピペットチップを用いて除去した。プロトプラストバンドとして観察されたこれらの細胞（７〜８ｍＬ）を、非常にゆっくりと取り出し、滅菌５０ｍＬの円錐チューブに入れた。次に、２５ｍＬのＷ５培地を用いて、チューブを洗浄した。Ｗ５洗浄培地をプロトプラストに添加し、チューブをゆっくりと反転させ、１，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、チューブをゆっくり反転させながら１０ｍＬのＭＭＧ溶液を添加して、プロトプラストペレットを再懸濁した。プロトプラストの密度を、血球計を用いて決定した。４ＰＣＶは、約３０００万個のプロトプラストをもたらす。

プロトプラスト形質転換
プロトプラスト細胞を、ＭＭＧ溶液を用いて１ｍＬあたり１６０万個のプロトプラストに希釈した。チューブをゆっくりと反転させることにより、プロトプラストを穏やかに再懸濁した。次に、３００μＬのプロトプラスト（約５００ｋのプロトプラスト）を滅菌２ｍＬチューブに添加し、チューブを反転させてプロトプラスト細胞を均一に分配した。ＴＥバッファー中の４０〜８０μｇの濃度のプラスミドＤＮＡを、プロトプラストに添加した。実験条件は表４に記載される。チューブをゆっくりと回転させて、プロトプラストと共にＤＮＡを懸濁し、チューブを室温で５〜１０分間インキュベートした。次に、３００μＬのＰＥＧ溶液をプロトプラスト／ＤＮＡ溶液に添加した。一度、全てのＰＥＧ溶液が添加されたら、チューブを穏やかに反転させることにより、ＰＥＧ溶液をプロトプラスト溶液と混合した。チューブを定期的に反転させながら、カクテルを室温で１５〜２０分間インキュベートした。インキュベーション後、１ｍＬのＷ５溶液をゆっくりとチューブに添加し、チューブを穏やかに反転させた。最後に、溶液を１，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を注意深く除去して、細胞ペレットをかき乱さないようにした。１ミリリットルの洗浄／インキュベーション溶液を添加した。チューブを穏やかに反転させて、細胞ペレットを再懸濁した。チューブをアルミホイルで覆い、光への露出を排除し、側面を上にしてラックに載せ、一晩インキュベートした。分子分析のために形質転換の２４時間後に細胞を収穫した。

ＮＧＳを用いる標的化の配列検証
トウモロコシプロトプラストにおけるＺＦＮ切断活性を、実施例３に記載の次世代配列決定法を用いて決定した。配列決定されたＰＣＲ増幅断片を、インデルの結果生じる配列バリアントの存在についてスコア化した。それぞれのＥ３２ ＺＦＮ６処理に由来するインデルの相対頻度は、アンプリコン中の約１．５％のＤＮＡ分子でトランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座を切断した。

イン−アウトＰＣＲを用いる標的化の証明
ＮＨＥＪによるＨｉ−ＩＩトウモロコシトランスジェニック細胞懸濁液中でのトランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座へのＡＡＤ−１遺伝子含有ドナーカセットの標的化を、イン−アウトＰＣＲ反応により確認した。イン−アウトＰＣＲ反応は、ＡＡＤ−１遺伝子ドナーと、トランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座との連結を含有する断片を増幅させた。得られたアンプリコンを第２のＰＣＲ反応にかけ、第１のアンプリコンの内部に結合するようにプライマーを設計した。２つの独立したＰＣＲ反応の組合せは、偽陽性であってよいバックグラウンド増幅の除去をもたらした。

プロトプラスト形質転換実験のイン−アウトＰＣＲの結果により、トランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座を、１：１０μｇの比のＤＮＡで５．３ｋｂ ＡＡＤ−１遺伝子プラスミドドナーとＥ３２−ＺＦＮ６ジンクフィンガーヌクレアーゼで再現可能に標的化することができることが示された。ＮＨＥＪ法による標的化を、両方の向きでのＡＡＤ−１遺伝子ドナーカセットの挿入により証明した。イン−アウトＰＣＲアンプリコンの配列により、３例のドナーＤＮＡの完全な組込みが示された。

トウモロコシＨｉ−ＩＩ培養物におけるＮＨＥＪによる標的化された組込みのためのＺＦＮおよびドナーのＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介性安定的形質転換
トランスジェニックイベントを、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２の内因性ゲノム遺伝子座に標的化した。実施例１に記載の構築物は、ドナー配列（ｐＤＡＢ１００６５５）およびイベント３２ ＺＦＮ６（Ｅ３２ ＺＦＮ６；ｐＤＡＢ１０５９０６）を含む。

予め凍結保存されたＨｉ−ＩＩ細胞系に由来する１２ｍＬのパック細胞容積（ＰＣＶ）と、２８ｍＬの条件化培地とからなるトウモロコシカルス細胞を、５００ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中、８０ｍＬのＧＮ６液体培地（Ｎ６培地（Chu et al., (1975) Sci Sin. 18:659-668）、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、ｐＨ５．８）中で二次培養し、２８℃で１２５ｒｐｍの振とう機上に置いた。このステップを、同じ細胞系を用いて２回繰り返し、合計３６ｍＬのＰＣＶを３つのフラスコに分配した。２４時間後、ＧＮ６液体培地を除去し、７２ｍＬのＧＮ６Ｓ／Ｍ浸透培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、４５．５ｇ／Ｌのソルビトール、４５．５ｇ／Ｌのマンニトール、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、ｐＨ６．０）と置き換えた。フラスコを中程度に撹拌（１２５ｒｐｍ）しながら、２８℃で３０〜３５分間、暗室中でインキュベートした。インキュベーション期間に、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、ＬＬＣ、Ｇｒｅｅｒ、ＳＣ）の５０ｍｇ／ｍＬ懸濁液を、８．１ｍＬのＧＮ６ Ｓ／Ｍ液体培地を４０５ｍｇの滅菌シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）に添加することにより調製した。

ＧＮ６ Ｓ／Ｍ浸透培地中でのインキュベーション後、各フラスコの内容物を、２５０ｍＬの遠心分離ボトル中にプールした。フラスコ中の全細胞が底部に沈殿した後、およそ１４ｍＬを超える内容量のＧＮ６ Ｓ／Ｍ液体を抜き取り、将来の使用のために滅菌１Ｌフラスコ中に収集した。ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）の予め湿らせた懸濁液をボルテックス上で６０秒間、最大速度で混合した後、遠心分離ボトルに添加した。

本実施例においては、１５９μｇのｐＤＡＢ１００６５５（ドナー配列）および１１μｇのｐＤＡＢ１０５０６（ＺＦＮ）プラスミドＤＮＡを、各ボトルに添加した。一度、プラスミドＤＮＡを添加したら、ボトルを改変型ＲＥＤ ＤＥＶＩＬ５４００（商標）商業用ペイントミキサー（Ｒｅｄ Ｄｅｖｉｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＮ）中にすぐに入れて、１０秒間撹拌した。撹拌後、細胞、培地、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）およびプラスミドＤＮＡのカクテルを、１２５ｍＬの新鮮なＧＮ６液体培地と共に１Ｌフラスコの内容物に添加し、浸透圧溶質（osmoticant）を減少させた。細胞を、１２５ｒｐｍに設定した振とう機上で２時間回収させた。約６ｍＬの分散懸濁液を、ボトルあたり６０のフィルターが得られるようにハウスバキュームラインに接続したガラスセルコレクターユニットを用いてＷｈａｔｍａｎ＃４濾紙（５．５ｃｍ）上で濾過した。フィルターをＧＮ６固体培地（２．５ｇ／Ｌのグルホシナートを含むことを除いてＧＮ６液体培地と同じ）の６０ｘ２０ｍｍプレート上に置いた。

推定標的化イベントの同定および単離
ＤＮＡ送達の１週間後、濾紙を、選択剤を含有するＧＮ６（１Ｈ）選択培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ、ｐＨ５．８）の６０ｘ２０ｍｍのプレートに移した。これらの選択プレートを、暗室中で１週間、２８℃でインキュベートした。暗室中で１週間の選択後、各プレートに由来する細胞の１／２を、３７〜３８℃に保持された３．０ｍＬのＧＮ６アガロース培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、７ｇ／ＬのＳＥＡＰＬＡＱＵＥ（登録商標）アガロース、ｐＨ５．８、１２１℃で１０分間オートクレーブしたもの）を含有するチューブ中に擦り取ることにより、新鮮な培地上に組織を埋込んだ。

アガロース／組織混合物を、スパーテルで破壊した後、３ｍＬのアガロース／組織混合物をＧＮ６（１Ｈ）培地を含有する１００ｘ２５ｍｍのＰＥＴＲＩ（商標）皿の表面上に均等に注ぎ入れた。このプロセスを各プレートの両方の半分について繰り返した。一度、全ての組織を埋込んだら、暗室条件下で最大１０週間、２８℃でプレートをインキュベートした。これらの選択条件下で増殖した推定形質転換単離物を、埋込んだプレートから取り出し、６０ｘ２０ｍｍのプレート中の新鮮な選択培地に移した。約２週間後に持続的増殖が明らかであった場合、イベントを、施用された除草剤（選択剤）に対して抵抗性であると見なし、次いで、細胞のアリコートを遺伝子型分析のために収穫した。本実施例では、２４のイベントが６つの処理されたボトルから回収された。これらのイベントを、組込みを確認するための分子分析に進行させた。

Ｅ３２遺伝子座へのＮＨＥＪ標的化の分子分析
上記のような、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介性形質転換から回収された２４のイベントを、いくつかの異なる分子的手段を用いて分析した。分析の結果として、Ｅ３２ゲノム遺伝子座内に組込まれた１コピーのＡＡＤ−１トランスジーンを含有するイベントが同定された。２４の様々なイベントは、１コピーのＡＡＤ−１トランスジーンを含有することが確認され、次いで、インデルによるまたはＡＡＤ−１カセットの挿入によるＥ３２部位の破壊が存在するかどうかが決定された。ＡＡＤ−１遺伝子および破壊されたＺＦＮ部位の存在について陽性であったイベントを、予想されるドナーおよび標的連結断片（イン−アウトＰＣＲによる）の存在について、ならびにＥ３３ゲノム遺伝子座内のドナーＤＮＡ領域の標的化された挿入を示したサザンブロットにおけるバンドサイズと一致する予想される分子量の断片についてさらに特性評価した。これらのアッセイにより、１コピーのＡＡＤ−１トランスジーンを含有するイベントがＮＨＥＪ機構を介してＥ３２ゲノム遺伝子座内に組込まれたことが確認された。

ＤＮＡ抽出
製造業者の推奨に従ってＱＩＡＧＥＮ ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６（商標）ＤＮＡ単離キットを用いて、凍結乾燥されたトウモロコシカルス組織からＤＮＡを抽出した。予め定義されたプログラムを、自動抽出のために使用し、ＤＮＡを２００μＬの１：１のＴＥバッファー／蒸留水中で溶出した。２μＬの各試料を、ＴＨＥＲＭＯＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮＡＮＯＤＲＯＰ８０００（商標）上で定量し、ＱＩＡＧＥＮ ＢＩＯＲＯＢＯＴ３０００ＴＭを用いて試料を１００ｎｇ／μＬに正規化した。正規化されたＤＮＡを、さらなる分析まで４℃で保存した。

コピー数評価
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイと同様の、加水分解プローブアッセイによるトランスジーンコピー数の決定を、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いるリアルタイムＰＣＲにより実施した。ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）プローブ設計ソフトウェア２．０を用いて、ＡＡＤ−１および内部参照遺伝子インベルターゼのためにアッセイを設計した。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ容量の多重反応液中、１Ｘの最終濃度で調製した（表５）。２ステップの増幅反応を、蛍光を獲得しながら４０秒間にわたる６０℃での伸長を用いて実施した。相対定量モジュールを使用し、ΔΔＣｔ法に基づくＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５を用いてリアルタイムＰＣＲコピー数データの分析を実施した。このために、単一コピーのキャリブレーターおよび既知の２コピーのチェックに由来するｇＤＮＡの試料を、各実行に含ませた。

トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２ゲノム遺伝子座破壊アッセイ
トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２に関するゲノム遺伝子座破壊アッセイを、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いるリアルタイムＰＣＲにより実施した。ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）プローブ設計ソフトウェア２．０を用いて、Ｅ３２ ＺＦＮ６（２５７１６／２５７１７）がＥ３２遺伝子座および内部参照遺伝子インベルターゼのゲノム配列に結合し、切断する特異性をモニタリングするためのアッセイを設計した。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ容量の多重反応液中、１Ｘの最終濃度で調製した（表６）。２ステップの増幅反応を、蛍光を獲得しながら３０秒間にわたる５５℃での伸長を用いて実施した。破壊アッセイのための分析を、参照比に対する標的を用いて実施した（図５）。８つのイベントのうちの４つが、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座中に組込まれたＡＡＤ−１トランスジーンを含有すると同定された。イベント１００６５５／１０５９０６［１］−００１、イベント１００６５５／１０５９０６［５］−０１３、イベント１００６５５／１０５９０６［５］−０１５、およびイベント１００６５５／１０５９０６［３］−０１８からなる以下のイベントを、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座内のＡＡＤ−１トランスジーンの組込みを確認するためのさらなる分子分析に進行させた。

イベント３２遺伝子座特異的イン−アウトｑＰＣＲ
ＮＨＥＪによるＥ３２のゲノム遺伝子座内へのＡＡＤ−１ドナーＤＮＡの挿入は、２つの向きのうちの１つにおいて起こり得る。ＡＡＤ−１トランスジーンの組込みおよび挿入の向きを、イン−アウトＰＣＲアッセイを用いて確認した。イン−アウトＰＣＲアッセイは、Ｅ３２のゲノム遺伝子座に結合するように設計された「アウト」プライマー；ＡＡＤ−１ドナー配列に結合するように設計された「イン」プライマーを用いる。これらのプライマーを用いる増幅反応は、標的部位に挿入されるドナー遺伝子のみを増幅する。得られるＰＣＲアンプリコンは、挿入物の５’または３’末端のいずれかのＥ３２標的部位およびドナーＤＮＡ配列の連結断片である。陽性および陰性対照を、アッセイに含ませた。２つの陽性対照プラスミド、ｐＤＡＢ１００６６４およびｐＤＡＢ１００６６５を、２つの異なる向きのそれぞれにおけるＥ３２のゲノム遺伝子座でのドナー挿入をシミュレートするように構築した。

イン−アウトＰＣＲのために、ＤＮＡ挿入染料ＳＹＴＯ−１３（登録商標）をＰＣＲミックス中で用いて、蛍光検出能力を有するサーモサイクラー上でリアルタイムに増幅を検出した。さらに、増幅産物をそのＴｍプロファイルについて分析することができるように、融点（Ｔｍ）分析プログラムを通常のＰＣＲプログラムに付属させた。未知の試料と陽性対照試料のＴｍプロファイル間の任意の類似性は、未知の試料が陽性対照のものと同じ増幅産物を有することを示す。ＰＣＲ反応を、１０ｎｇの鋳型ゲノムＤＮＡ、０．２μＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭフォワードおよびリバースプライマー、４μＭ ＳＹＴＯ−１３（登録商標）ならびに０．１５μＬのＥｘ Ｔａｑ ＨＳを用いて行った。反応を２ステップで完了させた：第１のステップは、９４℃（２分）で１サイクルならびに９８℃（１２秒）、６６℃（３０秒）および６８℃（１．３分）で３５サイクルからなっていた；第２のステップは、６０〜９５℃、次いで、６５℃（３０秒）および７２℃（１０分）を包含するＴｍプログラムであった（表６）。アンプリコンを配列決定して、ＡＡＤ−１遺伝子がＥ３２のゲノム遺伝子座内に組込まれたことを確認した。

リアルタイムのイン−アウトＰＣＲアンプリコンの結果を、ＡＢＩソフトウェアを用いて可視化した。これらの結果を、アンプリコンを１．２％ＴＡＥゲル上で泳動するゲルシフトアッセイを用いてさらに確認した。予想されるアンプリコンのサイズは、ｐＤＡＢ１００６６４に記載の向きについては約１．８ｋｂであり、ｐＤＡＢ１００６６５に記載の向きについては約２ｋｂであった。ゲルシフトアッセイの結果により、リアルタイムのイン−アウトＰＣＲデータを確認された。

遺伝子座破壊データおよびイン−アウトＰＣＲにより、２，４−Ｄ上での選択により回収されたいくつかのトウモロコシイベントにおいて、１コピーのＡＡＤ−１トランスジーンがＮＨＥＪを介してＥ３２遺伝子座に組込まれたことが示唆された。

サザンブロット分析
推定的に標的化されると上記で同定されたトウモロコシカルスイベントを、サザンブロットアッセイを用いてさらにスクリーニングして、ＡＡＤ−１トランスジーンがＮＨＥＪを介してＥ３２遺伝子座に組込まれたことを確認した。サザンブロット分析実験は、トウモロコシゲノム内へのＡＡＤ−１トランスジーンの組込みおよび完全性を示すデータを生成した。

ＤＮＡ抽出
ゲノムＤＮＡを、それぞれ個々のイベントから収穫されたカルス組織から抽出した。最初に、組織試料を２ｍＬチューブ中に収集し、２日間凍結乾燥した。組織浸軟を、ＫＬＥＣＯ ＴＩＳＳＵＥ ＰＵＬＶＥＲＩＺＥＲ（商標）およびタングステンビーズ（Ｋｌｅｃｏ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて実施した。組織浸軟後、ゲノムＤＮＡを、製造業者に提言されたプロトコールに従ってＤＮＥＡＳＹ ＰＬＡＮＴ ＭＩＮＩ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて単離した。

ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＱＵＡＮＴ−ＩＴ ＰＩＣＯ ＧＲＥＥＮ ＤＮＡ ＡＳＳＡＹ ＫＩＴ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて定量した。定量されたｇＤＮＡを、サザンブロット分析のために４μｇに調整した。次いで、ＤＮＡ試料を、ＮｃｏＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて３７℃で一晩消化し、製造業者に提言されたプロトコールに従ってＱＵＩＣＫ−ＰＲＥＣＩＰ（商標）（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて精製した。ＤＮＡを１Ｘ染料中に再懸濁し、０．８％ＳＥＡＫＥＭ ＬＥ ＡＧＡＲＯＳＥ（商標）（Ｌｏｎｚａ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）ゲル上で５時間電気泳動した。ゲルを変性させ、中和した後、ナイロン帯電膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に一晩移し、ＵＶ ＳＴＲＡＴＡ ＬＩＮＫＥＲ １８００（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いてＤＮＡを膜に架橋させ、２０ｍＬのＰＥＲＦＥＣＴＨＹＢ ＰＬＵＳ（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いてブロットを予備ハイブリダイズさせた。２２６ｂｐのプローブである配列番号３４

を、製造業者に提言されたプロトコールに従ってＰＲＩＭＥ−ＩＴ ＲＭＴ ＲＡＮＤＯＭ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて標識し、製造業者に提言されたプロトコールに従ってＰＲＯＢＥ ＱＵＡＮＴ Ｇ−５０ ＭＩＣＲＯ ＣＯＬＵＭＮＳ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて精製した。約２０ｘ１０^６ｃｐｍの標識されたプローブをブロットに添加し、一晩インキュベートした。ブロットを１回の洗浄あたり１５分間で２回洗浄し、蛍光イメージスクリーン上に２４時間置き、ＳＴＯＲＭ８６０ ＳＣＡＮＮＥＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により分析した。

サザンブロット分析からの結果により、いくつかのイベントからのＤＮＡがＮＨＥＪを介するＥ３２遺伝子座へのドナーＤＮＡの組込みから予想されたサイズ（２．９および５．５ｋｂ）のＮｃｏＩバンドを有することが示された。

形質転換されたトウモロコシ組織を、ドナーＤＮＡにより導入されるＡＡＤ−１遺伝子により付与される２，４−ジクロロフェノキシ酢酸除草剤に対する純粋種表現型抵抗性を担持する繁殖可能なトウモロコシ植物に再生させた。

トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｈｉ−ＩＩにおける相同性指向的修復によるイベント３２の標的化
プラスミドベクター
ＺＦＮ発現構築物を含有するプラスミドベクターを、実施例２に記載のように構築した。プラスミド構築物、ｐＤＡＢ１０５９０６（図２）中で発現されるＺＦＮは、野生型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである「Ｆｏｋ−Ｍｏｎｏ」を含有する。プラスミド構築物、ｐＤＡＢ１１１８０９（図３）中で発現されるＺＦＮは、改変型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである「Ｆｏｋ１−ＥＬＤ」を含有する。改変型Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼは、Doyon Y., Vo T., Mendel M., Greenberg S., Wang J., Xia D., Miller J., Urnov F., Gregory P., and Holmes M. (2010) Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architecture. Nature Methods, 8(1); 74-79に記載のような変化を含有する。

ドナー構築物、ｐＤＡＢ１０７８５５（図１５）を設計し、ＤＡＳ−５９１３２ゲノム遺伝子座のＺＦＮ切断されたゲノムＤＮＡに組込まれるように構築した。この単一の遺伝子発現カセットは、ＯｓＡｃｔ１プロモーター、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）コード配列、およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲから構成される。さらに、ドナープラスミドを、ＤＡＳ−５９１３２ゲノム遺伝子座中のＺＦＮ切断部位のいずれかの末端上の配列と相同である標的ＰＡＴ遺伝子のいずれかの末端上の１ｋｂの配列（相同性アーム）を用いて設計した。相同性アームは、トランスジーンをゲノムＺＦＮ切断部位に挿入するために用いられる相同組換え機構の基質として役立った。様々な遺伝子エレメントを、高コピー数のｐＵＣに基づくプラスミド中で集合させた。

植物の形質転換
ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）形質転換を、ｐＤＡＢ１０７８５５（ドナー配列）およびｐＤＡＢ１０５９０６（ＺＦＮ）プラスミドＤＮＡを用いて実施例５に記載のように行った。

Ｈｉ−ＩＩのＥ３２遺伝子座中へのｐａｔ遺伝子カセットの標的化された組込みを確認するための分子分析
ＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出を、実施例５に記載のように行った。

標的化された遺伝子座破壊アッセイ
ＤＡＳ−５９１３２およびドナープラスミドを用いるＨｉ−ＩＩカルス細胞のＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介性形質転換は、標的化された、および無作為なトランスジーン挿入をもたらした。標的化されたイベント集団から無作為挿入イベントを区別するために、作成された全部で８５４のイベントを、遺伝子座破壊アッセイ（表７中のプライマーを用いて実施例５に記載のように行われた）を用いて最初にスクリーニングした。このアッセイは、遺伝子座内のＺＦＮ結合部位がインタクトなままであるか、またはＺＦＮ切断もしくはドナー挿入により破壊されたかどうかを決定するものであった。ゲノム遺伝子座内の破壊の指示は、ＺＦＮが内因性ＤＡＳ−５９１３２標的遺伝子座を切断したことの初期の証拠であり、ドナーＤＮＡ分子の標的化された挿入を示す。ＺＦＮ認識部位を含有する内因性標的領域を増幅するためのプライマーを設計し、試料をｑＰＣＲにより分析されるように設定した。標的化されていないイベントを示す、インタクトな領域の増幅は、検出可能なｑＰＣＲシグナルとして測定された１４０塩基対のアンプリコンをもたらした。ドナー分子の標的化された組込みの成功は、検出可能なｑＰＣＲシグナルの破壊をもたらし、対照と比較して低い全体シグナルとして示される。

精密な形質転換から作成された８５４のイベントを、破壊アッセイを用いてスクリーニングし、参照シグナルへの標的における有意な低下に基づいて破壊とスコア化した。その結果、アッセイした８５４のイベントのうちの６３が、標的化された遺伝子座において破壊されたシグナルを有し、その部位での標的化された遺伝子挿入またはインデルを示すことが示された。

標的化された遺伝子座のイン−アウトＰＣＲアッセイ
挿入物の存在を、実施例５に記載のようにイン−アウトＰＣＲを用いて、および表８中のプライマーを用いてさらに確認した。リアルタイムシステム上で同定された陽性試料を、標準的なゲルシフトアッセイを用いてさらに確認した。

破壊アッセイおよび標的化された遺伝子座のイン−アウトＰＣＲアッセイの結果を、サザンブロッティングおよび配列決定（次世代配列決定の基準）によりさらに確認した。

本実施例では、提出された合計８５４の試料のうちの６３のイベントが、Ｅ３２遺伝子座の破壊を示した。これらのうち、８つの標的化されたイベントを、イン−アウトＰＣＲおよびサザン分析により同定した。

形質転換されたトウモロコシ組織を、ドナーＤＮＡの、グルホシナートおよびＬ−ホスフィノトリシン、除草剤に対する抵抗性の純粋種表現型を担持する繁殖可能なトウモロコシ植物に再生させた。

トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４におけるイベント３２遺伝子座破壊のためのプラスミドベクターのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性送達
形質転換
トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４を、スーパーバイナリー形質転換系（米国特許第５，５９１，６１６号）を用いてバイナリー構築物ｐＤＡＢ１０８６８８（対照ベクター、図６）およびｐＤＡＢ１０８６９０（標的化ベクター、図７）を用いて形質転換した。そのようなものとして、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を、Ｅ３２ゲノム遺伝子座へのＺＦＮの送達のために用いた。トランスジェニックトウモロコシカルスを取得し、分子的確認アッセイにより分析して、トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４のＥ３２ゲノム遺伝子座が破壊されたか否かを決定した。アッセイの結果により、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いてＺＦＮを送達し、Ｅ３２ゲノム遺伝子座を切断および破壊することができることが確認された。

バイナリーベクター
バイナリー構築物、ｐＤＡＢ１０８６９０（標的化ベクター、図７）を、ドナー遺伝子発現カセットおよびＺＦＮ遺伝子発現カセットを含有するように設計および構築した。このドナー遺伝子発現カセットは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１遺伝子プロモーター（ＺｍＵｂｉ１プロモーター）、ＡＡＤ−１コード配列から構成され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ）により終結していた。さらに、ＨＤＲによるドナー挿入を容易にするためにＥ３２ゲノム遺伝子座中のＺＦＮ切断部位のいずれかの末端上の配列と相同であるＡＡＤ−１遺伝子のいずれかの末端上の１ｋｂの配列（相同性アーム）を用いてドナープラスミドを設計した。ＺＦＮ遺伝子発現カセットは、コメアクチン１遺伝子プロモーター（ＯｓＡｃｔ１プロモーター）、２５７１６および２５７１７ ＺＦＮコード配列ならびにＺｍＰｅｒ５ ３’ＵＴＲから構成されていた。

さらに、第２の対照バイナリー構築物、ｐＤＡＢ１０８６８８（対照ベクター、図６）を、ＡＡＤ−１遺伝子と同じ遺伝子発現カセットを含有するように設計および構築した。さらに、Ｅ３２ゲノム遺伝子座中のＺＦＮ切断部位のいずれかの末端上の配列と相同である標的ａａｄ−１遺伝子のいずれかの末端上の１ｋｂの配列（相同性アーム）を用いてドナープラスミドを設計した。

トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４形質転換
構築物をアグロバクテリウム（Agrobacterium）に移し、それを用いてトウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４を形質転換した。用いられた形質転換手順は、米国特許公開第２０１３／０１５７３６９号に記載されている。形質転換の完了後、単離されたトウモロコシカルス組織を選択し、除草剤選択剤を含有する培地から取得した。表９は、実験における形質転換頻度を示す。得られたイベントを、分子分析により分析して、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換によるＺＦＮおよびドナーの送達後にトウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４のＥ３２遺伝子座のＺＦＮ媒介性切断を確認した。

カルス組織からのＰＣＲのためのゲノムＤＮＡ単離
ゲノムＤＮＡを、実施例５に記載のように単離した。

コピー数の決定
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイと類似する、加水分解プローブアッセイによるトランスジーン検出を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いるリアルタイムＰＣＲにより実施した。アッセイを、ＡＡＤ−１およびＺＦＮ破壊の検出のために設計し、内部参照アッセイ（インベルターゼ）を用いて多重化して、確実に適切な量のｇＤＮＡが各アッセイに存在するようにした。増幅のために、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（商標）（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ容量の多重反応液中、１Ｘの最終濃度で調製した（表１０）。２ステップの増幅反応を、６０℃で４０秒間（ＡＡＤ１反応について）または６０℃で３０秒間（ＺＦＮ破壊反応について）の伸長および蛍光獲得を用いて実施した。

蛍光シグナルが、適合点アルゴリズム（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５）および相対定量モジュール（ΔΔＣｔ法に基づく）を用いてバックグラウンド閾値と交差する点であるＣｐスコアを用いて、リアルタイムＰＣＲデータの分析を実施した。

ＺＦＮ破壊ｑＰＣＲアッセイは、ＺＦＮ標的部位がインタクトであるか、または実験中に改変された（ドナー挿入によるか、もしくはＮＨＥＪによる）かどうかを決定するものである。このアッセイは、ＺＦＮ切断部位およびプローブハイブリダイゼーション領域の外側にアニーリングするように設計されたプライマーを含むＲｏｃｈｅ ＵＰＬプローブを用いた（図８）。イベントが両対立遺伝子で破壊される場合、標的と参照との比は、対照と比較して減少する。標的化されない対照および破壊されないイベントの分析により、標的と参照との比が０．４〜０．６の範囲にあることが示された；破壊されたイベントにより、標的と参照との比が０．２〜０．３５の範囲にあることが示された（図９）。

このデータは、Ｅ３２遺伝子座をアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換を介するＺＦＮの導入により切断することができることを示している。

トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４における相同性指向的修復によるイベント３２遺伝子座の標的化
ベクター
ＺＦＮの発現のためのプラスミドベクターは、実施例２に記載されたものである。

Ｅ３２ゲノム遺伝子座のＺＦＮ切断されるゲノムＤＮＡに組込まれるように設計されたドナー構築物、ｐＤＡＢ１０４１７９（図１０、配列番号６１）は、ＯｓＡｃｔ１プロモーター、ＰＡＴコード配列およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲから構成される単一遺伝子発現カセットであった。さらに、ドナープラスミドを、ドナーＤＮＡ領域の組込みを容易にするためにＥ３２ゲノム遺伝子座中のＺＦＮ切断部位のいずれかの末端上の配列と同一である標的ＰＡＴ遺伝子のいずれかの末端上の１ｋｂの配列（相同性アーム）を用いて設計した。

微粒子銃を用いるＢ１０４への形質転換
近交系トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４の穂を自家受粉させ、未熟胚が約１．８〜２．２ｍｍの長さになった時に収穫した。皮を剥いた穂を、滅菌のために実験室に輸送した。＃４のステンレススチール製外科用メスハンドル（刃なし）の端部を、それぞれの穂の遠位部分に入れた。穂を、液体界面活性剤（Ｌｉｑｕｉ−Ｎｏｘ（登録商標）、ＡＬＣＯＮＯＸ、Ｉｎｃ．）を用いて爪ブラシでよく洗浄し、２０％の市販の漂白剤（Ｕｌｔｒａ Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）Ｇｅｒｍｉｃｉｄａｌ Ｂｌｅａｃｈ、６．１５％次亜塩素酸ナトリウム）中に２０分間浸すことにより表面を滅菌した後、層流フードの内側で滅菌脱イオン水で３回すすいだ。未熟接合胚を、それぞれの穂から無菌的に切出し、約２．０ｍＬの「ＬＳ−ｉｎｆ培地」（ＬＳ塩、Ｎ６ビタミン、６８．５ｇ／Ｌのスクロース、３６ｇ／ＬのＤ−グルコース、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリンおよび１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ）を含有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに入れた。チューブの内容物を「休止培地」（ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、１５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、１００ｍｇ／ＬのミオイノシトールならびにｐＨ５．８に調整し、２．３ｇ／ＬのＧｅｌｚａｎ（商標）で凝固させた３．３ｍｇ／Ｌジカンバ）のプレート上に注ぎ、過剰の液体を除去し、胚盤を上に向けて胚を置いた。プレートを５０μｍｏｌｅｓ／ｍ^２ｓで３日間、連続的に光を当てながら２４時間、２８℃に置いた。

ボンバードメントの４時間前に、３０の胚を、「オスモライシス培地」（４５．５ｇ／Ｌのソルビトールおよび４５．５ｇ／Ｌのマンニトールを添加した休止培地）のＰｅｔｒｉ皿の中心に、胚盤を上に向けて２．５ｃｍ直径のエリア内に配置した。胚を、ボンバードメントの前に２８℃、５０μｍｏｌｅｓ／ｍ^２ｓで４時間、この培地上でインキュベートした。

ボンバードメントのための金微粒子を調製するために、１５ｍｇの０．６ミクロンの金（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、シリコン処理されたマイクロ遠心チューブに計り取り、５００μＬの冷エタノール（１００％）を添加した。チューブを１５秒間、超音波水浴中で超音波処理して、室温で３０分間静置した後、３，０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離した。上清を除去し、１ｍＬの冷滅菌水を添加した。チューブを指でボルテックスし、３〜５分間沈降させた後、３，０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離した。上清を除去し、水による洗浄をさらに２回繰り返した。２回目の水による洗浄の後、金を５００μＬの冷水中に再懸濁し、１５秒間超音波処理し、１０本の滅菌シリコン処理されたマイクロ遠心チューブ中に、同時に２５μＬにアリコートした。個々のチューブを使用まで−２０℃で凍結した。

調製された金微粒子上へのＤＮＡの沈降のために、１本のチューブの金を、ボンバードメントしようとする１０のプレート毎に解凍した。チューブを１５秒間、超音波水浴中で超音波処理し、指でボルテックスした後、層流フード表面上でタップし、全ての液滴を底部に集めた。２０：１のドナーとジンクフィンガー構築物とのモル比を得るために、４．７５μｇのドナーＤＮＡ（ｐＤＡＢ１０４１８２）を０．２５μｇのジンクフィンガー（ｐＤＡＢ１０５９４１）と予め混合した後、上下にピペッティングしながら、金に添加した。５０μＬの２．５Ｍ塩化カルシウム（無水）を、上下にピペッティングしながら添加し、２０μＬの０．１Ｍスペルミジン（遊離塩基）を、上下にピペッティングしながら添加した。チューブを、２に設定されたＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ（登録商標）のためのＴｕｒｂｏｍｉｘ（商標）アタッチメント上に置き、室温で１０分間振とうさせた。チューブを振とう機から取り出し、３〜５分間沈降させた後、５，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。上清を除去し、２５０μＬの冷エタノール（１００％）を添加し、チューブを指でボルテックスし、ペレットを取り外し、均一な懸濁液を確保した。ＤＮＡ被覆微粒子を３〜５分間沈降させ、チューブを５，０００ｒｐｍで１５秒間再度遠心分離した。ペレットを１２０μＬの冷エタノール（１００％）中に再懸濁し、指でボルテックスして、分散を確保した。マクロキャリアをマクロキャリアホルダーに入れ、滅菌のためにオートクレーブし、１０μＬの調製された溶液で被覆し、ボンバードメントの前に完全に乾燥させた。

胚のボンバードメントを、停止スクリーンから６ｃｍの距離で２８インチのバキューム下、９００ｐｓｉで製造業者の仕様書に従ってＰＤＳ−１０００（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。各試料を１回ボンバードメントした後、２８℃で一晩、５０μｍｏｌｅｓ／ｍ^２ｓの２４時間の光に戻した。次の日、同じ温度および光条件下で胚を新鮮な「休止培地」に７日間移した。続いて、胚を「ｓｅｌ−５Ｂｉ培地」（５ｍｇ／Ｌのビアラホスを添加した休止培地）に７日間移し、同じ培地に１４日間、２回移した後、同じ温度および光条件下で「予備再生培地」（ｐＨ５．８に調整し、２．３ｇ／ＬのＧｅｌｚａｎで凝固させた、ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、１５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトールならびに３．３ｍｇ／Ｌのジカンバ、２．５ｍｇ／ＬのＡＢＡ、１ｍｇ／ＬのＢＡＰ、０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡおよび５ｍｇ／Ｌのビアラホス）に７日間移した。次いで、組織を、２８℃で１４日間、９０μｍｏｌｅｓ／ｍ^２ｓの光で１６／８の明／暗光周期下で、「再生培地」（ｐＨ５．８に調整し、２．３ｇ／ＬのＧｅｌｚａｎで凝固させた、ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトールおよび５ｍｇ／Ｌのビアラホス）に移した。苗を、同じ光周期を用いて２８℃で１５０〜２００μｍｏｌｅｓ／ｍ^２ｓの光の下で、「植物強化培地」（ｐＨ５．８に調整し、２．３ｇ／ＬのＧｅｌｚａｎで凝固させた、ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、５００ｍｇ／ＬのＭＥＳおよび１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール）に移した。一度、植物が少なくとも８ｃｍまで生長したら、葉組織の２ｃｍ切片を湿った氷上に収集し、分析のために４℃の涼しい部屋に送達した。次いで、苗を土壌中に移植し、温室に移し、分子分析により分析した。

ビアラホス選択イベントの分子分析
カルス組織からのｑＰＣＲのためのゲノムＤＮＡ単離
組織試料を９６穴収集プレート（Ｑｉａｇｅｎ）中に収集し、４８時間凍結乾燥した。組織破壊を、１つのステンレススチール製ビーズを用いてＢｉｏｓｐｒｉｎｔ９６ＲＬＴ溶解バッファー（商標）中のＫｌｅｃｏ（商標）組織粉砕器（Ｇａｒｃｉａ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて実施した。組織浸軟後、ゲノムＤＮＡを、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ９６Ｐｌａｎｔキット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）およびＢｉｏｓｐｒｉｎｔ９６抽出ロボット（商標）を用いてハイスループット形式で単離した。次いで、ゲノムＤＮＡを２ｎｇ／μＬに希釈した。

コピー数の決定
遺伝子コピー数および破壊アッセイを、実施例７に記載のように行った。標的化されていない対照および標的化または破壊されないイベントの分析により、標的と参照との比が０．４〜０．６の範囲にあることが示された；破壊された、または標的化されたイベントにより、標的と参照との比が０．２〜０．３５の範囲にあることが示された（図１２）。

遺伝子座特異的イン−アウトＰＣＲ
遺伝子座特異的イン−アウトＰＣＲを、実施例５に記載のように行った。

５’末端アンプリコンのための予想される増幅サイズは１，８７４ｂｐであり、３’末端は２，０８９ｂｐであった。ＰＣＲバンドを切出し、配列決定した。得られた配列データにより、アンプリコンが予想されるゲノムＥ３２遺伝子座ドナー染色体連結配列を含有することが確認された。

サザンブロット
陽性の破壊を示したイベントからのＤＮＡおよびイン−アウトＰＣＲを、サザンブロットにより分析して、標的におけるインタクトなドナー挿入を確認した。ＤＮＡをＮｃｏＩで消化し、相同性アームの外側の隣接するゲノムＤＮＡを用いてプローブ化した（図１４）。１，９５０ｂｐでのバンドが内因性の標的化されていない遺伝子座について予測され、４，３７０ｂｐのバンドが標的化された遺伝子座について予測された。

サザンのために、ゲノムＤＮＡ（１μｇ〜５μｇ）を、１２５μＬの最終容量中、５０ユニットのＮｃｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で１Ｘバッファー３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）中で消化した。試料を３７℃で一晩インキュベートした。消化したＤＮＡを、製造業者に提唱されたプロトコールに従ってＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる再沈降により濃縮した。回収された消化物を、３０μＬの１Ｘローディングバッファー中に再懸濁し、６５℃で３０分間インキュベートした。再懸濁した試料を、１Ｘ ＴＡＥ（０．８Ｍ Ｔｒｉｓ−酢酸［ｐＨ８．０］／０．０４ｍＭ ＥＤＴＡ）中で調製された０．８％アガロースゲル上にロードし、１Ｘ ＴＡＥバッファー中で電気泳動した。ゲルを連続的に変性（０．２Ｍ ＮａＯＨ／０．６Ｍ ＮａＣｌ）に３０分間、および中和（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］／１．５Ｍ ＮａＣｌ）に３０分間かけた。ゲルを通して一晩、２０Ｘ ＳＳＣ溶液を、処理されたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ ＮＹ＋（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に受動的にウィッキング（wicking）することにより、ＤＮＡ断片の転移を実施した。転移後、膜を２Ｘ ＳＳＣで簡単に洗浄し、ＳｔｒａｔａＬｉｎｋｅｒ １８００（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と架橋し、８０℃で１時間焼いた。

ブロットを、モデル４００ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（商標）（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いるガラスローラーボトル中、予備ハイブリダイゼーション溶液（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ ｐｌｕｓ（商標）、Ｓｉｇｍａ）と共に６５℃で１時間インキュベートした。プローブ調製のために、ドナー相同性領域の外側のゲノム配列を、プライマーを用いてＰＣＲ増幅し（表１３）、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースゲルから精製した。断片を、製造業者に提唱されたプロトコールに従ってＰｒｉｍｅ−ＩＴ（登録商標）ＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ標識キット（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌのα^３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ／ＢＬＵ５１３Ｈ）で標識した。ブロットを、１ｍＬあたり約２ｘ１０^６計数／ハイブリダイゼーションバッファーの変性プローブと６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ブロットを６５℃で０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４０分間洗浄した。ブロットを、蛍光イメージャスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて曝露し、Ｓｔｏｒｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｔｏｒｍ８６０（商標））を用いて画像化した。

合計９１２のイベントを、破壊およびイン−アウトＰＣＲによりスクリーニングし、サザン分析に基づいて１６が標的化されると確認された。Ｅ３２ゲノム遺伝子座内のドナー断片の標的化頻度は、１．８％であると算出された。

本開示は明確に理解するために例示および実施例によりいくらか詳細に提供されたが、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変を実行することができることが当業者には明らかである。従って、前記説明および実施例は、限定と解釈されるべきではない。

Claims (20)

1. １つまたは複数の外因性核酸配列を、Ｅ３２遺伝子座を有するトウモロコシ細胞のゲノム中に組込む方法であって、部位特異的ヌクレアーゼを用いてＥ３２遺伝子座中で二本鎖切断を行い、トウモロコシ細胞のゲノム中のＥ３２遺伝子座内に、１つまたは複数の外因性配列を含むポリヌクレオチドを切断部位にライゲートすることを含む、方法。
2. 部位特異的ヌクレアーゼが、表１Ａに示される群から選択される１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
3. １つまたは複数の外因性配列の産物を発現させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. １つまたは複数の外因性配列の産物を発現させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
5. １つまたは複数の外因性核酸配列が、コード配列、調節配列、またはＤＮＡ結合ドメインのための標的部位を含む、請求項１に記載の方法。
6. １つまたは複数の外因性核酸配列が、コード配列、調節配列、またはＤＮＡ結合ドメインのための標的部位を含む、請求項２に記載の方法。
7. １つまたは複数の外因性核酸配列が、コード配列、調節配列、またはＤＮＡ結合ドメインのための標的部位を含む、請求項３に記載の方法。
8. １つまたは複数の外因性核酸配列が、コード配列、調節配列、またはＤＮＡ結合ドメインのための標的部位を含む、請求項４に記載の方法。
9. コード配列が、除草剤抵抗性；除草剤耐性；昆虫抵抗性；昆虫耐性；疾患抵抗性；疾患耐性；ストレス耐性；ストレス抵抗性；酸化ストレスの変化；油収量の増加；食物含量および組成の変化；物理的外見の変化；雄性不稔性；ドライダウン（drydown）；立性（standability）；多産；デンプンの量もしくは品質の変化；油の品質の変化；タンパク質の量もしくは品質の変化；アミノ酸組成の変化またはその組合せを付与する産物をコードする、請求項５に記載の方法。
10. コード配列が、除草剤抵抗性；除草剤耐性；昆虫抵抗性；昆虫耐性；疾患抵抗性；疾患耐性；ストレス耐性；ストレス抵抗性；酸化ストレスの変化；油収量の増加；食物含量および組成の変化；物理的外見の変化；雄性不稔性；ドライダウン；立性；多産；デンプンの量もしくは品質の変化；油の品質の変化；タンパク質の量もしくは品質の変化；アミノ酸組成の変化またはその組合せを付与する産物をコードする、請求項６に記載の方法。
11. コード配列が、除草剤抵抗性；除草剤耐性；昆虫抵抗性；昆虫耐性；疾患抵抗性；疾患耐性；ストレス耐性；ストレス抵抗性；酸化ストレスの変化；油収量の増加；食物含量および組成の変化；物理的外見の変化；雄性不稔性；ドライダウン；立性；多産；デンプンの量もしくは品質の変化；油の品質の変化；タンパク質の量もしくは品質の変化；アミノ酸組成の変化またはその組合せを付与する産物をコードする、請求項７に記載の方法。
12. コード配列が、除草剤抵抗性；除草剤耐性；昆虫抵抗性；昆虫耐性；疾患抵抗性；疾患耐性；ストレス耐性；ストレス抵抗性；酸化ストレスの変化；油収量の増加；食物含量および組成の変化；物理的外見の変化；雄性不稔性；ドライダウン；立性；多産；デンプンの量もしくは品質の変化；油の品質の変化；タンパク質の量もしくは品質の変化；アミノ酸組成の変化またはその組合せを付与する産物をコードする、請求項８に記載の方法。
13. 外因性配列がＰＡＴ遺伝子およびＡＡＤ−１遺伝子からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
14. 外因性配列がＰＡＴ遺伝子およびＡＡＤ−１遺伝子からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
15. ポリヌクレオチドがＥ３２遺伝子座における配列と相同であるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
16. 相同ヌクレオチド配列が外因性配列に隣接する、請求項１５に記載の方法。
17. ポリヌクレオチドがプロモーターをさらに含む、請求項１に記載の方法。
18. １つまたは複数の組込まれた外因性核酸配列がその後の世代において子孫に伝えられる、請求項１に記載の方法。
19. 請求項１に記載の方法に従ってＥ３２遺伝子座に組込まれた１つまたは複数の外因性配列を含む、トウモロコシ植物またはトウモロコシ植物の部分。
20. 請求項１に記載の方法に従ってＥ３２遺伝子座に組込まれた１つまたは複数の外因性配列を含むトウモロコシ種子。