JP2021525541A - 変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ - Google Patents

変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ Download PDF

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Abstract

本発明は、野生型Ｃｐｆ１と比較して変更された活性を有する変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ、および核酸配列において一本鎖破損を導入するためのそれらの使用に関する。核酸配列の検出および定量のための方法もまた、開示される。感染性疾患の診断のための方法もまた、開示される。

Description

技術分野
本発明は、野生型Ｃｐｆ１と比較して変更された活性を有する変異体Ｃｐｆ１（別名Ｃａｓ１２ａ）エンドヌクレアーゼ、ならびに一本鎖または二本鎖のいずれかである核酸標的配列中に一本鎖破損または二本鎖破損を導入するため、および、一本鎖または二本鎖非特異的な様式によるＤＮＡ標的に対する結合（であるが切断ではない）の後に一本鎖ＤＮＡ破損を導入するための、それらの使用に関する。核酸配列の検出および定量のための方法もまた、開示される。感染性疾患の診断のための方法もまた、開示される。
背景
Ｃｐｆ１は、細菌および古細菌が潜在的に危険なＤＮＡ分子の侵入に対して細胞を保護するために用いるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats））クラス２・Ｖ−Ｂ型の適応免疫系に属するＤＮＡエンドヌクレアーゼである（Makarova et al., 2011；Makarova and Koonin, 2015；Vestergaard et al., 2014）。Ｃｐｆ１は、比較的小さな（４０〜４５塩基）のｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ）分子と共に、当該ｃｒＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ標的を、高い特異性により認識し、巻き戻し、これをカットすることができるリボ核タンパク質複合体形成する。Ｃｐｆ１のＤＮＡ標的配列は、細胞が先に遭遇した潜在的に危険なＤＮＡの記録であるユニークな配列（スペーサー）に隣接する反復配列を含むＤＮＡの領域である、ＣＲＩＳＰＲ−アレイにおいて保存される（Zetsche et al., 2015）。ＣＲＩＳＰＲアレイは、単一のプレ−ｃｒＲＮＡとして転写され、これは次いで、Ｃｐｆ１によりプロセッシングされて、成熟ｃｒＲＮＡｓを生成する（Fonfara et al., 2016。これらのＲＮＡは、したがって、Ｃｐｆ１により認識されるシュードノット構造に折りたたまれる全てのｃｒＲＮＡについて同一である保存された部分と、標的ＤＮＡに対して相補的な可変領域とを含む。ＣＲＩＳＰＲ−アレイの統合性を維持するために、ＤＮＡ標的の切断は、標的部位の上流の３または４ヌクレオチド長の短いＰＡＭ配列（プロトスペーサー隣接モチーフ）の認識に結びついている。Ｃｐｆ１により認識されるＰＡＭ配列は、侵入するＤＮＡ分子中に存在するがＣＲＩＳＰＲ−アレイ中には存在せず、したがってこのことが、このＤＮＡ領域を切断から保護している（Mojica et al., 2005）。
Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１およびＣａｓ１３などのいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、いくつかの生物のゲノムを改変するために、ならびに感染を同定するための診断分子として、およびまた遺伝子治療のための潜在的なツールとして用いられてきた（Chen et al., 2018；Gootenberg, 2018）。
しかし、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、これまでのところ、それらが天然で作用するのと同じ方法において用いられてきた。これらの酵素の完全な潜在能力を発見し、それらを既知の用途のみならず新たな用途において用いるために最適化する必要性が存在する。
要旨
本開示は、一本鎖または二本鎖のいずれかである核酸標的配列において一本鎖破損または二本鎖破損を導入することができる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼに関する。さらに、本開示の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡ標的に結合することができ（カットすることなく）、非特異的な様式において一本鎖ＤＮＡを切断することができる。さらに、ｃｒＲＮＡにより認識されてハイブリダイズされる核酸配列とは異なる核酸配列において１つ以上の一本鎖または二本鎖破損を導入することができる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ、およびそれらがｃｒＲＮＡと共に形成する複合体が開示される。
本明細書において開示される新規の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼに対していくつかの利点を提示し、非常に低い濃度において、ピコモル濃度範囲未満の濃度においてすら、特異的または非特異的な様式における標的核酸配列の検出および定量において、有利に用いることができる。
本明細書において開示される新規の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼに対していくつかの利点を提示し、二本鎖および一本鎖の両方の標的核酸配列を切断するために、有利に用いることができる。さらに、二本鎖標的において、切断は、両方の鎖に対して、または一方の鎖のみに対して、行うことができる。
最後に、本明細書において開示される新規の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼはまた、疾患を引き起こす感染性病原体に由来する遺伝子材料の検出による感染性疾患の診断のために用いることができる。
本開示の一側面は、以下：
ｉ） 配列番号２の残基１〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、
ａ． ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の変異、ここで、各々の変異は、独立して、アミノ酸の置換または欠失である；および／または
ｂ． Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ここで、位置９１７および１００６における残基のうちの少なくとも１つは、グルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）である；
をさらに含む；
ならびに／あるいは
ｉｉ） 配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の残基９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８に対応する位置から独立して選択される２つの位置において少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む、
を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログに関する。
本開示の別の側面は、本明細書において開示されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードするポリヌクレオチドに関する。
本開示の別の側面は、本明細書において開示されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列を含む組み換えベクターに関し、前記ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、任意に、プロモーターに作動的に連結されている。
本開示のさらなる側面は、本明細書において開示されるような変異体Ｃｐｆ１またはそのオルトログ、またはポリヌクレオチド、核酸または組み換えベクターを発現する細胞に関する。
本開示のまたさらなる側面は、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の発現のための系に関し、該系は、以下：
ａ． 本明細書において開示されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードするポリヌクレオチドまたは核酸を含む、ポリヌクレオチドまたは組み換えベクター；および
ｂ． プロモーターに作動的に連結されているガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドまたは組み換えベクター；
を含む。
本開示の別の側面は、第一の標的核酸において一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで：
ａ． Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ またはそのオルトログを、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と接触させ、それにより、第二の標的核酸を認識することができるｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を得ること、ここで第二の標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、および
ｂ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を、第一の標的核酸と接触させること；
これにより、第一の標的配列において一本鎖破損が行われる。
本開示の別の側面は、第一の標的核酸において一本鎖破損を導入する方法に関し、該方法は、以下のステップ：
ａ． プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む第二の標的核酸を認識することができるガイド−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を設計すること；
ｂ． ステップａ．のｃｒＲＮＡをＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログと接触させ、それにより、前記第二の標的核酸に結合することができるｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を得ること；および
ｃ． ｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１を前記第一の標的核酸と接触させること；
を含み、それにより、第一の標的核酸において１つ以上の一本鎖破損を導入する。
本開示のさらなる側面は、哺乳動物細胞において第二の標的核酸において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法に関し、該方法は、哺乳動物細胞中にｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を導入することを含み、ここで、Ｃｐｆ１は、本明細書において開示されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である。
本開示のさらなる側面は、試料中の第二の標的核酸の検出のための方法に関し、該方法は、以下：
ａ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を提供すること、ここで、Ｃｐｆ１は、本明細書において開示されるようなＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である；
ｂ． 標識されたｓｓＤＮＡを提供すること、ここで、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素および少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用的標識のセットで標識されている；
ｃ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体およびｓｓＤＮＡを試料と接触させること、ここで、試料は、少なくとも１つの第二の標的核酸を含む；ならびに
ｄ． フルオロフォアからの蛍光シグナルを検出することにより、ｓｓＤＮＡの切断を検出し、
を含み、それにより、試料中の第二の標的核酸の存在を検出する。
本開示の別の側面は、対象における感染性疾患の診断のためのin vitroでの方法に関し、該方法は、以下：
ａ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を提供すること、ここで、Ｃｐｆ１は、本明細書において開示されるようなＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である；
ｂ． 標識されたｓｓＤＮＡを提供すること、ここで、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素および少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用的標識のセットで標識されている；
ｃ． 対象からの試料を提供すること、ここで、前記試料は、第二の標的核酸を含むか、またはこれを含むことが疑われる；ならびに
ｄ． 本明細書において開示される方法により第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度を決定すること；
ここで、第二の標的核酸は、疾患を引き起こす感染性病原体のゲノムの核酸またはそのフラグメントである、
を含み、それにより、対象における感染性疾患を診断する。
ｃｒＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ標的の表示。
野生型Ｃｐｆ１および変異体１（配列番号３）を用いることにより得られた二本鎖ＤＮＡ標的の切断生成物。
左パネル：野生型Ｃｐｆ１および変異体１（配列番号４、９１８−１０１３変異体）（黒丸）を用いることにより得られた二本鎖ＤＮＡ標的の切断生成物。右パネル：野生型Ｃｐｆ１および変異体２（配列番号４、９１８−１０１３変異体）（黒丸）を用いることにより得られた非特異的なｓｓＤＮＡの切断生成物。
（Ａ）ＲＥＣ−リンカーの欠失および置換（配列番号３４および３６）、ｌｉｄ置換（配列番号３８）ならびにＱ１０２５Ｇ、Ｅ１０２８ＧおよびＱ１０２５Ｇ−Ｅ１０２８Ｇ変異体（配列番号３０および３２）についての、標的ＤＮＡ基質による切断活性アッセイ。 （Ｂ）ＲＥＣ−リンカーの欠失および置換、ｌｉｄ置換ならびにＱ１０２５Ｇ、Ｅ１０２８ＧおよびＱ１０２５Ｇ−Ｅ１０２８Ｇ変異体について、ｃｒＲＮＡに対して相補的なｔ鎖のカットをモニタリングする、切断活性アッセイ。 （Ｃ）ＲＥＣ−リンカーの欠失および置換、ｌｉｄ置換ならびにＱ１０２５Ｇ、Ｅ１０２８ＧおよびＱ１０２５Ｇ−Ｅ１０２８Ｇ変異体について、基質として非特異的なｓｓＤＮＡを用いる、ｃｒＲＮＡに対して相補的なｓｓＤＮＡによる活性化の後の切断活性アッセイ。 （Ｄ）ｄｓＤＮＡ基質のカットをモニタリングする切断活性アッセイ（野生型Ｃｐｆ１、（Ｄ９１７）Ｃｐｆ１、（Ｅ１００６−Ｄ９１７Ａ）Ｃｐｆ１および（Ｌｉｄ置換−Ｄ９１７Ａ）Ｃｐｆ１について、ｔ鎖、ｎｔ鎖および非特異的なｓｓＤＮＡ）。
タンパク質の発現および精製は、ＲＥＣ−リンカー、ｌｉｄおよびフィンガー領域における欠失または置換を有する変異体Ｃｐｆ１をプロファイリングする。
Ａ．切断活性の定量：Ｃａｓ１２ａ野生型（ｃａｓ１２ａＷＴ）のＮＴＳ（非標的鎖）、ＴＳ（標的鎖）およびｓｓＤＮＡ（非特異的な一本鎖）；Ｂ．Ｃｐｆ１ Ｑ１０２５Ｇ（配列番号３０）；Ｃ．Ｃｐｆ１ Ｑ１０２５Ｇ−Ｅ１０２８Ｇ（配列番号３２）；Ｄ．ニッカーゼＣｐｆ１ Ｋ１０１３Ｇ−Ｒ１０１４Ｇ（配列番号３）。各々のバーは、少なくとも３回の独立した複製の平均を表し、標準偏差を示す。
詳細な説明
本発明は、請求の範囲において定義されるとおりである。
本開示は、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ、および特異的または非特異的な様式において、一本鎖または二本鎖のいずれかである核酸標的配列において一本鎖破損または二本鎖破損を導入するためのそれらの使用に関する。本開示全体にわたり、「変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ」は、天然に存在する変異体、例えば、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を担持するＣｐｆ１遺伝子によりコードされる変異体、または天然に存在しない変異体、例えば、Ｃｐｆ１遺伝子の直接的な変異誘発またはランダム変異誘発により得られる変異体であってよい。
本発明者らは、改変された活性を有するＣｐｆ１の変異体を同定した。本明細書において開示される変異体のいくつかは、ニッカーゼとして機能することができ、したがって、特異的標的ＤＮＡ配列を認識して、これにおいて一本鎖破損を導入することができる。本発明者らはまた、標的ＤＮＡ配列を認識して、前記標的核酸に結合した後で、非標的ＤＮＡ配列において一本鎖破損を導入するＣｐｆ１の変異体を同定した。いくつかの変異体は一本鎖配列において、他のものは二本鎖配列において、ＤＮＡを切断することができる。切断は、特異的であっても非特異的であってもよい。切断は、二本鎖標的ＤＮＡにより、一本鎖標的ＤＮＡにより、または両方により、活性化されることができる。
本発明者らはまた、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを用いて標的ＤＮＡ配列を検出および定量するための方法を提供する。本発明者らはまた、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを用いて標的ＤＮＡ配列を検出および定量することにより、感染性疾患を診断するための方法を提供する。
定義
コドン 用語「コドン」とは、本明細書において用いられる場合、特異的アミノ酸をコードする隣接するヌクレオチドの三つ組みを指す。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系 当該用語は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓファミリーのメンバーを指す。原核生物の適応免疫系であるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートおよびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）は、ＲＮＡによりガイドされる認識を通して、標的ＤＮＡ配列に結合してこれを切断することができる。それらの分子構造に従って、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の異なるメンバーは、２つのクラスに分類されてきた：クラス１は、いくつかのエフェクタータンパク質を包含し、一方、クラス２系は、単一のエレメントを用いる（Makarova et al., 2015）。Ｃｐｆ１（「CRISPR from Prevotella and Francisella」）は、多くの細菌ゲノムにおいて存在するクラス２・Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼの新たなメンバーとして記載されてきた（Zetsche et al., 2015）。
エンドヌクレアーゼ 当該用語は、ポリヌクレオチド鎖中のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指す。いくつかのエンドヌクレアーゼは特異的であり、すなわち、それらは切断の部位を指示する所与のヌクレオチド配列を認識し、いくつかは非特異的である。本開示は、特異的なエンドヌクレアーゼおよび非特異的なエンドヌクレアーゼの両方に対して向けられている。エンドヌクレアーゼの一例は、ニッキングエンドヌクレアーゼである。ニッキングエンドヌクレアーゼは、本明細書において用いられる場合、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖をカットして、「切れ目のある（nicked）」ＤＮＡ分子を生成する酵素を指す。
ニッキングエンドヌクレアーゼは、本明細書において用いられる場合、また、一本鎖ＤＮＡの一本の鎖をカットするエンドヌクレアーゼをも指す。
フラグメント 当該用語は、核酸またはポリペプチドの非全長部分を示すために用いられる。したがって、フラグメントは、それ自体でもまた、それぞれ核酸またはポリペプチドである。ＤＮＡフラグメントは、本開示全体を通して、５’末端から開始することが指定される。
遺伝子編集 当該用語は、ヌクレオチド配列において１つ以上のヌクレオチドを挿入するか、欠失させるか、またはこれを置き換えるための、遺伝子工学の手法の使用を指す。
ガイドＲＮＡ 当該用語は、本明細書において「ｃｒＲＮＡ」と交換可能に用いられ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、特にＣｐｆ１による標的核酸配列の認識のために必要とされるＲＮＡ分子を指す。
ホモログ ホモログまたは機能的ホモログは、参照ポリペプチドと少なくとも何らかの配列同一性を示し、元の機能の少なくとも１つの側面を保持している、任意のポリペプチドであってよい。本明細書において、Ｃｐｆ１の機能的ホモログは、Ｃｐｆ１またはそのフラグメントと少なくとも何らかの配列同一性を共有するポリペプチドであって、Ｃｐｆ１と同様にエンドヌクレアーゼとして機能する能力を有するものであり、すなわち、それは、ｃｒＲＮＡに特異的に結合することができ、標的核酸を特異的に認識し、これに結合して切断することができる。
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ） 当該用語は、Ｃｐｆ１などのCRISPR-Cas系により標的とされるＤＮＡ配列のすぐ下流のＤＮＡ配列を指す。ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体のｃｒＲＮＡは、ＰＡＭを含む標的ＤＮＡ配列のみを認識して、これにハイブリダイズすることができる。
認識 用語「認識」とは、本明細書において理解される場合、分子がヌクレオチド配列を同定する能力を指す。例えば、酵素またはＤＮＡの結合ドメインは、核酸配列を潜在的な気質として認識して、それに結合することができる。好ましくは、認識は、特異的なものである。
配列同一性 本明細書において用いられる場合、当該用語は、比較のウィンドウにわたって同一である２つのポリヌクレオチド配列（すなわち、一つ一つのヌクレオチドごとに）を指す。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較のウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較し、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を、比較のウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で除算し、結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質に適用される場合、アミノ酸配列の同一性の程度は、アミノ酸配列により共有される位置における同一なアミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性の程度は、アミノ酸配列により共有される位置における、すなわち構造的に関連するアミノ酸の数の関数である。
配列同一性の包括的なパーセンテージは、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0におけるアルゴリズムGAP、BESTFITまたはFASTAにより、デフォルトのギャップ重みづけを用いて決定される。
用語「相互作用的標識」または「相互作用的標識のセット」とは、本明細書において用いられる場合、それらが隣接して配置された場合に相互作用することができる、少なくとも１つのフルオロフォアおよび少なくとも１つのクエンチャーを指す。相互作用的標識が隣接して配置された場合、クエンチャーは、フルオロフォアのシグナルをクエンチすることができる。相互作用は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により媒介され得る。
用語「隣接して配置される」とは、本明細書において用いられる場合、２つの物体の間の物理的距離を指す。フルオロフォアとクエンチャーとが隣接して配置された場合、クエンチャーは、フルオロフォアのシグナルを部分的にまたは完全にクエンチすることができる。ＦＲＥＴによるクエンチは、典型的には、約１００Åまでの距離にわたり起こり得る。隣接して配置されるとは、本明細書において用いられる場合、１００Å未満、および／または約１００Åの距離を指し得る。
用語「蛍光標識」または「フルオロフォア」は、本明細書において用いられる場合、光励起により光を再発光することができる蛍光の化学化合物を指す。フルオロフォアは、特異的波長の光エネルギーを吸収し、より長い波長における光を再発光する。吸収された波長、エネルギー移動高率、および発光までの時間は、フルオロフォアの構造および（分子がその励起状態において周囲の分子と相互作用するので）その化学的環境の両方に依存する。最大吸収（≒励起）および発光の波長（例えば、吸収／発光＝４８５ｎｍ／５１７ｎｍ）は、所与のフルオロフォアを指すために用いられる典型的な用語であるが、スペクトル全体が、考慮するために重要であり得る。
用語「クエンチする」または「クエンチ」とは、本明細書において用いられる場合、フルオロフォアなどの所与の物質の蛍光強度を低下させる任意のプロセスを指す。クエンチは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により媒介され得る。ＦＲＥＴは、ドナー（例えばフルオロフォア）およびアクセプター（例えばクエンチャー）の転移双極子の間での古典的な双極子−双極子相互作用に基づき、ドナー−アクセプターの距離に依存する。ＦＲＥＴは、典型的には、１００Åまでの距離にわたり起こり得る。ＦＲＥＴはまた、ドナー−アクセプターのスペクトルの重複、およびドナーとアクセプターとの転移双極子のモーメントの相対的な配向に依存する。フルオロフォアのクエンチはまた、フルオロフォアと別のフルオロフォアまたは非蛍光の分子との間での非蛍光の複合体の形成の結果としても起こり得る。この機構は、「接触クエンチ（contact quenching）」、「静的クエンチ（static quenching）」、または「基底状態複合体形成」として知られる。
用語「クエンチャー」は、本明細書において用いられる場合、フルオロフォアなどの所与の物質をクエンチすることができる化学化合物を指す。
標的鎖および非標的鎖 標的鎖とは、ｃｒＲＮＡと相互作用してｃｒＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成する核酸の鎖を指す。非標的鎖は、標的鎖に対して相補的であり、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのＲｕｖＣ／ＮｕＣポケットに移動される。
用語「オルトログ」は、本明細書において用いられる場合、種分化イベントにより分離された、同じ祖先配列に由来すると推測される遺伝子（および当該遺伝子によりコードされるタンパク質）を指す：ある種が２つの別々の種に分岐する場合、２つの生じた種における単一の遺伝子のコピーは、オルソロガスであると称される。オルトログ、またはオルソロガスな遺伝子とは、異なる種における遺伝子であって、直近の共通の祖先の単一の遺伝子からの垂直方向の系統に由来するものである。Ｃｐｆ１のオルトログを、野生型ＩＩ系が記載されるように、現在の系に対する配列類似性に基づいて同定し、特徴づけることができる。例えば、Ｃｐｆ１のオルトログとして、F. novicidaのU1 12、Prevotella albensis、アシダミノコッカス種BV3L6、Eubacterium eligensのCAG:72、Butyrivibrio fibrisolvens、Smithella sp.のSCADC、Flavobacterium sp. 316、Porphyromonas crevioricanis、バクテロイデス門細菌の口腔分類群（oral taxon）274、およびラクノスピラ科の細菌のND2006が挙げられる。
変異体Ｃｐｆ１
本発明者らは、Ｃｐｆ１の、酵素の異なる活性に関与すると考えられる３つのドメインを同定した。これら３つのドメインは：
・ＲＥＣドメイン
・Ｌｉｄドメイン
・フィンガードメイン
である。
ＦｎＣｐｆ１（配列番号２）において、これら３つのドメインは、以下のとおりに定義される：
・ＲＥＣドメイン：残基３２４〜残基３３６；
・Ｌｉｄドメイン：残基１００６〜１０１８；
・フィンガードメイン：残基２９８〜３０９。
これら３つのドメインのいずれかにおけるアミノ酸の置換または欠失は、本明細書において以下に詳述されるであろうとおり、変更された酵素活性をもたらす。加えて、酵素活性のために重要であると考えられる５つの残基を同定した。すなわち、これら３つの残基のいずれかの変異または欠失もまた、酵素活性を改変する。これらの残基は、位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８におけるものであり、このうち１０１３および１０１４は、Ｌｉｄ領域の一部である。本開示は、したがって、変更された活性を有する改変されたＣｐｆ１タンパク質に関する。
本開示の一側面は、したがって、以下：
ｉ） 配列番号２の残基１〜２９７、３１０〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、ここで、前記ポリペプチド配列は、フィンガードメイン（残基２９８〜３０９；配列番号１２）、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）またはＬｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失をさらに含む；および／または
ｉｉ） 配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８において、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む；
を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログに関する。
本開示の一側面は、したがって、以下：
ｉ） 配列番号２の残基１〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、
ａ． ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の変異、ここで、各々の変異は、独立して、アミノ酸の置換または欠失である；および／または
ｂ． Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ここで、位置９１７および１００６における残基のうちの少なくとも１つは、グルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）である；
をさらに含む；
ならびに／あるいは
ｉｉ） 配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の残基位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８に対応する位置から独立して選択される２つの位置において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む；
を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログに関する。
本開示の一側面は、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログに関し、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、または１０１４において、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。
本開示の一側面は、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログに関し、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の残基９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８に対応する位置から独立して選択される２つの位置において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
一態様において、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Francisella novicidaに由来する。
いくつかの態様において、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜３２３および３３７〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、フィンガードメイン（残基２９８〜３０９；配列番号１２）、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）またはＬｉｄフィンガードメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失をさらに含む。変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜３２３および３３７〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２と比較して、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）における少なくとも２つの変異（ここで、各々の変異は、独立してアミノ酸の置換または欠失である）、またはＬｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）における少なくとも２個のアミノ酸の置換をさらに含む。ＲＥＣおよび／またはＬｉｄドメインにおいて変異を含む変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
一態様において、変異体Ｃｐｆ１は、フィンガードメインにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失を有する。少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、配列番号２の残基２９８〜３０９として定義されるフィンガードメインの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の連続または不連続のアミノ酸の置換または欠失であってよい。したがって、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜２９７および３１０〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
別の態様において、変異体Ｃｐｆ１は、ＲＥＣドメインにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失を有する。少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、配列番号２の残基３２４〜３３６として定義されるＲＥＣドメインの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の連続または不連続のアミノ酸の置換または欠失であってよい。したがって、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜３２３および３３７〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
別の態様において、変異体Ｃｐｆ１は、ＲＥＣドメインにおいて、少なくとも２個のアミノ酸の変異を有し、ここで、各々の変異は、独立して、アミノ酸の置換または欠失である。少なくとも２個のアミノ酸の変異は、配列番号２の残基３２４〜３３６として定義されるＲＥＣドメインの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の連続または不連続のアミノ酸の置換および／または欠失であってよい。したがって、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜３２３および３３７〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。ＲＥＣドメインにおいて少なくとも２つの変異を含む変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
別の態様において、変異体Ｃｐｆ１は、ｌｉｄドメインにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失を有する。少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、配列番号２の残基１００６〜１０１３として定義されるＬｉｄドメインの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の連続または不連続のアミノ酸の置換または欠失であってよい。したがって、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜１００５および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
別の態様において、変異体Ｃｐｆ１は、Ｌｉｄドメインにおいて、少なくとも２個のアミノ酸の置換を有する。少なくとも２個のアミノ酸の置換は、配列番号２の残基１００６〜１０１３として定義されるＬｉｄドメインの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の連続または不連続のアミノ酸の置換であってよい。したがって、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜１００５および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。Ｌｉｄドメインにおいて少なくとも２つの置換を含む変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、フィンガードメインにおいて、およびＲＥＣドメインにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失を有し、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、上で定義されるとおりである。したがって、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜２９７、３１０〜３２３および３３７〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、Ｌｉｄドメインにおいて、およびＲＥＣドメインにおいて、少なくとも２個のアミノ酸の変異を有し、ここで、各々の変異は、独立して、上で定義されるとおりのアミノ酸の置換または欠失である。したがって、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜２９７、３１０〜３２３および３３７〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。Ｌｉｄドメインにおいて、およびＲＥＣドメインにおいて、少なくとも２個のアミノ酸の変異を含む、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、フィンガードメインにおいて、およびｌｉｄドメインにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失を有し、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、上で定義されるとおりである。したがって、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜２９７、３１０〜１００５および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、ＲＥＣドメインにおいて、およびｌｉｄドメインにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失を有し、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、上で定義されるとおりである。したがって、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜３２３、３３６〜１００５および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、フィンガードメインにおいて、ＲＥＣドメインにおいて、およびｌｉｄドメインにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失を有し、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、上で定義されるとおりである。したがって、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜２９７、３１０〜３２３、３３７〜１００５および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでもよい。変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含んでもよい。
特定の態様において、Ｃｐｆ１変異体は、配列番号４２において記載されるとおりであり、すなわち、フィンガードメインは、欠失している。別の態様において、Ｃｐｆ１変異体は、配列番号３４において記載されるとおりであり、すなわち、ＲＥＣドメインは、欠失している。別の態様において、Ｃｐｆ１変異体は、配列番号３６において記載されるとおりであり、すなわち、ＲＥＣドメインは、置換されている。別の態様において、Ｃｐｆ１変異体は、配列番号４０において記載されるとおりであり、すなわち、Ｌｉｄドメインは、欠失している。別の態様において、Ｃｐｆ１変異体は、配列番号３８において記載されるとおりであり、すなわち、Ｌｉｄドメインは、置換されている。
上で定義されるような少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、ドメイン中のいくつかのアミノ酸の欠失を指していてもよく、一方、他のアミノ酸は、置換されていてもよいことが、理解されるであろう。
上の変異体の全ては、本明細書において下でさらに詳述されるとおり、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちの１つ以上において、少なくとも１個のアミノ酸の置換および／または欠失をさらに含んでもよい。一態様において、変異体は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちの１つにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含み、他の位置は、未改変のままである。一態様において、変異体は、したがって、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちの１つにおいて、一置換をさらに含む。例えば、変異体は、位置９１８において、または位置１０１３において、または位置１０１４において、または位置１０２５において、または位置１０２８において、一置換をさらに含む。
別の態様において、変異体は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちの２つにおいて、アミノ酸の置換および／または欠失をさらに含む。例えば、変異体は、位置９１８および１０１３において；または位置９１８および１０１４において；または位置９１８および１０２５において；または位置９１８および１０２８において；または位置１０１３および１０１４において；または位置１０１３および１０２５において；または位置１０１３および１０２８において；または位置１０１４および１０２５において；または位置１０１４および１０２８において；または位置１０２５および１０２８において、置換をさらに含む。
別の態様において、変異体は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちの３つにおいて、アミノ酸の置換および／または欠失をさらに含む。例えば、変異体は、位置９１８、１０１３および１０１４において；または位置９１８、１０１３および１０２５において；または位置９１８、１０１３および１０２８において；または位置９１８、１０１４および１０２５において；または位置９１８、１０１４および１０２８において；または位置９１８および１０２５および１０２８において；または位置１０１３、１０１４および１０２５において；または位置１０１３、１０１４および１０２８において；または位置１０１４、１０２５および１０２８において、置換をさらに含む。
別の態様において、変異体は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちの４つにおいて、アミノ酸の置換および／または欠失をさらに含む。例えば、変異体は、位置９１８、１０１３、１０１４および１０２５において；または位置９１８、１０１３、１０２５および１０２８において；または位置１０１３、１０１４、１０２５および１０２８において；または位置９１８、１０１４、１０２５および１０２８において、置換をさらに含む。
別の態様において、変異体は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８の５つにおいて、アミノ酸の置換および／または欠失をさらに含む。
少なくとも１個のアミノ酸の置換は、フィンガー、ＲＥＣまたはＬｉｄドメインのいずれにあるものであっても、または配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちの１つ以上のいずれにあるものであっても、いくつかの態様において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖または非極性の側鎖を有するアミノ酸への置換であってよい。いくつかの態様において、アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている。いくつかの態様において、アミノ酸は、グリシンに置換されている。
少なくとも２個のアミノ酸の置換は、フィンガー、ＲＥＣまたはＬｉｄドメインのいずれにあるものであっても、または配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちの１つ以上のいずれにあるものであっても、いくつかの態様において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖または非極性の側鎖を有するアミノ酸への置換であってよい。いくつかの態様において、アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニン.からなる群より選択されるアミノ酸に置換されている。いくつかの態様において、アミノ酸は、グリシンに置換されている。
例えば、配列番号２のフィンガードメイン、ＫＧＩＮＥＹＩＮＬＹ ＳＱ（配列番号２０）は、ＧＧＧＡＧＡＡＧＧＡ ＳＧ（配列番号２２）に変異してもよい。配列番号２のＲＥＣドメイン、ＬＦＫＱＩＬＳＤＴＥ ＳＫＳ（配列番号１２）は、ＧＧＧＡＧＡＳＡＧＧ ＳＧＳ（配列番号１４）に変異してもよい。配列番号２のＬｉｄドメイン、ＥＤＬＮＦＧＦＫＲＧ ＲＦＫ（配列番号１６）は、ＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧ ＧＡＧ（配列番号１８）に変異してもよい。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、そのポリペプチド配列オルトログを含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、または１０１４において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸残基への、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、そのポリペプチド配列オルトログを含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の残基９１８、１０１３、または１０１４に対応する位置から独立して選択される２つの位置において、荷電した側鎖を有する２個のアミノ酸の、２個の荷電していない側鎖を有するアミノ酸残基への、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、そのポリペプチド配列オルトログを含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、または１０１４において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸残基への、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、そのポリペプチド配列オルトログを含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、または１０１４において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基への、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、そのポリペプチド配列オルトログを含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、または１０１４において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、そのポリペプチド配列オルトログを含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、Ｒ９１８Ｇ、Ｋ１０１３Ｇ、Ｒ１０１４Ｇ、Ｑ１０２５ＧまたはＥ１０２８Ｇから選択される少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、そのポリペプチド配列オルトログを含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、Ｒ９１８Ｇ、Ｋ１０１３Ｇ、Ｒ１０１４Ｇ、Ｑ１０２５ＧまたはＥ１０２８Ｇから選択される、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、残基Ｋ１０１３においてアミノ酸置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、残基Ｒ９１８およびＫ１０１３においてアミノ酸置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、残基Ｋ１０１３およびＲ１０１４においてアミノ酸置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、アミノ酸置換Ｋ１０１３Ｇを含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、アミノ酸置換Ｒ９１８ＧおよびＫ１０１３Ｇを含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、アミノ酸置換Ｋ１０１３ＧおよびＲ１０１４Ｇを含む。
本開示のいくつかの態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、上の態様において定義されるような残基Ｋ１０１３およびＲ１０１４においてアミノ酸置換を含み、標的核酸において、第一の標的核酸におけるもののような一本鎖破損を導入することができるニッカーゼであり、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一である。
本開示のいくつかの態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、上の態様において定義されるような残基Ｒ９１８およびＫ１０１３においてアミノ酸置換を含み、核酸の非特異的部位、例えば第一の標的核酸の非特異的部位において一本鎖破損を導入することができる非特異的エンドヌクレアーゼである。本開示のいくつかの態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、標的ＤＮＡ配列を認識するが、核酸配列の非特異的部位においてのみ一本鎖破損を導入する、非特異的エンドヌクレアーゼである。本開示のいくつかの態様において、変異した、非特異的なＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、より長期間にわたり活性であり続け、不活性な状態に戻る前に、いくつかの非特異的な一本鎖核酸配列において一本鎖破損を導入する。
いくつかの態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号３または配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号３または配列番号４に対して少なくとも９６％の配列同一性、例えば配列番号３または配列番号４に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば配列番号３または配列番号４に対して少なくとも９８％の配列同一性、例えば配列番号３または配列番号４に対して少なくとも９９％の配列同一性、例えば配列番号３または配列番号４に対して１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかの態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号３または配列番号４を含む。
いくつかの態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号３または配列番号４からなる。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、残基Ｑ１０２５において、アミノ酸置換を含む。
本開示の別の態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、残基Ｅ１０２８において、アミノ酸置換を含む。
本開示の一態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、残基Ｑ１０２５およびＥ１０２８において、アミノ酸置換を含む。
位置１０２５または１０２８における置換は、本明細書において記載されるとおりであってよい。いくつかの態様において、位置１０２５は、グリシンにより置換されている。いくつかの態様において、位置１０２８は、グリシンにより置換されている。いくつかの態様において、位置１０２５および１０２８は、いずれもグリシンにより置換されている。
Ｃｐｆ１は、ＲＮＡｓｅ活性部位を含み、これは、それ自体のプレ−ｃｒＲＮＡをプロセッシングして、干渉を達成するための活性なリボヌクレオタンパク質を組み立てるために用いられる。
Ｃｐｆ１のフィンガードメインの、ＲＥＣドメインの、およびＬｉｄドメインの改変は、Ｃｐｆ１の変更された特性をもたらす。変異体タンパク質は、したがって、野生型タンパク質と比較して変更された特性を有していてもよく、特に、変異体Ｃｐｆ１は、以下を行うことができてもよい：
・二本鎖標的核酸を切断する；
・二本鎖非標的核酸を切断する；
・一本鎖標的核酸を切断する；
・一本鎖非標的核酸を切断する；
・一本鎖ＤＮＡを、任意に二本鎖標的ＤＮＡにより増強された非特異的な様式において切断する；
・一本鎖ＤＮＡを、任意に一本鎖標的ＤＮＡにより増強された非特異的な様式において切断する；
・二本鎖核酸標的の一方の鎖飲みを切断する；
・標的二本鎖核酸のみを切断する；および／または
・標的一本鎖核酸のみを切断する。
変異体Ｃｐｆ１は、上の活性のうちの１つ以上を有していてもよい。いくつかの態様において、変異体Ｃｐｆ１は、野生型Ｃｐｆ１と比較して、改善された活性を示す。
本明細書において開示される変異体は、したがって、異なる用途を有していてもよい。例えば、標的および／または非標的核酸が一本鎖または二本鎖のいずれであっても、当該変異体が由来する野生型Ｃｐｆ１よりも効率的な様式においてこれを切断する変異体は、一般に、効率的な遺伝子編集のために、より有用であり得る。二本鎖の標的および／または非標的核酸を優先的に切断する変異体は、当該変異体が由来する野生型Ｃｐｆ１よりも高い特異性を示し得る。一本鎖ＤＮＡを非特異的に切断することができるが、標的または非標的鎖を切断することができない変異体は、野生型タンパク質よりも長くにわたり活性を保持し得る。
本明細書において開示される変異体は、したがって、異なる用途を有していてもよい。例えば、標的が一本鎖または二本鎖のいずれであっても、当該変異体が由来する野生型Ｃｐｆ１よりも効率的な様式において標的は切断するが、非標的一本鎖核酸は切断しない変異体は、一般に、効率的な遺伝子編集のために、より有用であり得る。二本鎖の標的および／または非標的核酸を優先的に切断する変異体は、当該変異体が由来する野生型Ｃｐｆ１よりも高い特異性を示し得る。一本鎖ＤＮＡを非特異的に切断することができるが、標的核酸を切断することができない変異体は、野生型タンパク質よりも長くにわたり活性を保持し得、標的の検出においてより有用であり得る。
一態様において、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ニッキングエンドヌクレアーゼである。
本明細書において開示される変異体Ｃｐｆ１をコードするポリヌクレオチドおよび核酸配列もまた、提供される。当業者は、所望されるＣｐｆ１変異体をコードするかかる核酸配列を設計する方法を知悉している。
いくつかの態様において、本開示は、以下：
ｉ） 配列番号２の残基１〜２９７、３１０〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、フィンガードメイン（残基２９８〜３０９；配列番号１２）、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）またはＬｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失をさらに含む；
ならびに／あるいは
ｉｉ） 配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８において、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む；
を含む変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードする核酸を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、以下：
ｉ） 配列番号２の残基１〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、以下：
ａ． ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の変異、ここで、各々の変異は、独立して、アミノ酸の置換または欠失である；および／または
ｂ． Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ここで、位置９１７および１００６における残基のうちの少なくとも１つは、グルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）である
をさらに含む；
ならびに／あるいは
ｉｉ） 配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の残基９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８に対応する位置から独立して選択される２つの位置において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む；
を含む変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードする核酸を提供する。
ＦｎＣｐｆ１をコードする核酸配列は、配列番号１において記載される。
いくつかの態様において、核酸配列は、フィンガードメインが欠失しているＣｐｆ１変異体をコードする。特定の態様において、核酸配列は、配列番号４１において記載され、配列番号４２の変異体Ｃｐｆ１をコードする。
他の態様において、核酸配列は、ＲＥＣドメインが欠失しているＣｐｆ１変異体をコードする。特定の態様において、核酸配列は、配列番号３３において記載され、配列番号３４の変異体Ｃｐｆ１をコードする。
他の態様において、核酸配列は、ＲＥＣドメインのアミノ酸残基が置換されているＣｐｆ１変異体をコードする。特定の態様において、核酸配列は、配列番号３５において記載され、配列番号３６の変異体Ｃｐｆ１をコードする。
他の態様において、核酸配列は、ｌｉｄドメインが欠失しているＣｐｆ１変異体をコードする。特定の態様において、核酸は、配列番号３９において記載され、配列番号４０の変異体Ｃｐｆ１をコードする。
他の態様において、核酸配列は、ｌｉｄドメインのアミノ酸残基が置換されているＣｐｆ１変異体をコードする。特定の態様において、核酸配列は、配列番号３７において記載され、配列番号３８の変異体Ｃｐｆ１をコードする。
いくつかの態様において、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、親Ｃｐｆ１をコードする配列、すなわち親配列に対して、少なくとも７０％同一、例えば少なくとも７５％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも８６％同一、例えば少なくとも８７％同一、例えば少なくとも８８％同一、例えば少なくとも８９％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９１％同一、例えば少なくとも９２％同一、例えば少なくとも９３％同一、例えば少なくとも９４％同一、例えば少なくとも９５％同一、例えば少なくとも９６％同一、例えば少なくとも９７％同一、例えば少なくとも９８％同一、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはこれからなる核酸配列によりコードされる。一態様において、親配列は、配列番号１において記載されるようなＦｎＣｐｆ１をコードする配列である。
本開示の一側面は、上で定義されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列を、作動可能な組み合わせにおいてプロモーターと共に含む、ベクターに関し、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有し、および前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、または１０１４において、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。
本開示の一側面は、上で定義されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列を、作動可能な組み合わせにおいてプロモーターと共に含む、ベクターに関し、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有し、および前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、または１０１４において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
本開示の一側面は、上で定義されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列を、作動可能な組み合わせにおいてプロモーターと共に含む、ベクターに関し、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有し、および前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置１０２５および１０２８において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
一態様において、ベクターは、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を、作動可能な組み合わせにおいてプロモーターと共にコードする核酸配列をさらに含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、コードされているＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび標的核酸にハイブリダイズするために十分な塩基対を有するセグメントに結合する。ｃｒＲＮＡは、下のセクション「ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）」においてさらに記載される。
本開示の一側面は、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の発現のための系に関し、該系は、以下を含む：
ａ． 変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書において開示されるようなポリヌクレオチド、または本明細書において開示されるような組み換えベクター；
ｂ． プロモーターに作動的に連結されているガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドまたは組み換えベクター。
本開示の一側面は、本明細書において上で記載されるようなポリヌクレオチドまたは組み換えベクターを発現する細胞に関する。Ｃｐｆ１は、細胞、特に、当業者に公知であるような好適な発現宿主から発現させることができる。一態様において、Ｃｐｆ１は、Escherichia coliから発現される。このことは、当該分野において公知であるとおり、例えば、本明細書において上で記載されるような所望されるＣｐｆ１エフェクタータンパク質またはホモログをコードする核酸配列を含むベクターをE. coli細胞中に導入することにより、行うことができる。タンパク質は、当該分野において公知であるように精製することができる。一態様において、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。
理論に拘束されることなく、フィンガードメイン、ＲＥＣドメインおよびＬｉｄドメインは、保存されると考えられる。したがって、Ｃｐｆ１変異体は、Francisella novicida、アシダミノコッカス種BV3L6、ラクノスピラ科の細菌COE1、スクシクラスチカム・ルミニス、Candidatus Methanoplasma termitum、未培養のクロストリジウム属の種またはButyrivibrio fibrisolvensからのＣｐｆ１の変異体であってよい。
一態様において、Ｃｐｆ１は、Francisella novicidaからのＦｎＣｐｆ１であってよく、ドメインは、本明細書において上で定義されるとおりである。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、配列番号２４において記載されるとおりのアシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６に由来する。フィンガードメインは、配列番号２４の残基２７５〜２８５により定義される。ＲＥＣドメインは、配列番号２４の残基３０５〜３１７により定義される。Ｌｉｄドメインは、配列番号２４の残基９９３〜１００５により定義される。配列番号２の位置９１８は、配列番号２４の位置９０９に対応する。配列番号２の位置１０１３は、配列番号２４の位置１０００に対応する。配列番号２の位置１０１４は、配列番号２４の位置１００１に対応する。配列番号２の位置１０２５は、配列番号２４の位置１０１３に対応する。配列番号２の位置１０２８は、配列番号２４の位置１０１６に対応する。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、配列番号２５において記載されるとおりのラクノスピラ科の細菌ＣＯＥ１に由来する。フィンガードメインは、配列番号２５の残基２６０〜２７０により定義される。ＲＥＣドメインは、配列番号２５の残基２８３〜２９５により定義される。Ｌｉｄドメインは、配列番号２５の残基９３６〜９４８により定義される。配列番号２の位置９１８は、配列番号２５の位置８４３に対応する。配列番号２の位置１０１３は、配列番号２５の位置９４３に対応する。配列番号２の位置１０１４は、配列番号２５の位置９４４に対応する。配列番号２の位置１０２５は、配列番号２５の位置９５５に対応する。配列番号２の位置１０２８は、配列番号２５の位置９５８に対応する。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、配列番号２６において記載されるとおりのスクシクラスチカム・ルミニス（Succiniclasticum ruminis）に由来する。フィンガードメインは、配列番号２６の残基２７９〜２８９により定義される。ＲＥＣドメインは、配列番号２６の残基３０９〜３２１により定義される。Ｌｉｄドメインは、配列番号２６の残基９９７〜１００９により定義される。配列番号２の位置９１８は、配列番号２６の位置９１３に対応する。配列番号２の位置１０１３は、配列番号２６の位置１００４に対応する。配列番号２の位置１０１４は、配列番号２６の位置１００５に対応する。配列番号２の位置１０２５は、配列番号２６の位置１０１７に対応する。配列番号２の位置１０２８は、配列番号２６の位置１０２０に対応する。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、配列番号４３において記載されるとおりのCandidatus Methanoplasma termitumに由来する。フィンガードメインは、配列番号４３の残基２５６〜２６６により定義される。ＲＥＣドメインは、配列番号４３の残基２８１〜２９３により定義される。Ｌｉｄドメインは、配列番号４３の残基９４４〜９５６により定義される。配列番号２の位置９１８は、配列番号４３の位置８６０に対応する。配列番号２の位置１０１３は、配列番号４３の位置９５１に対応する。配列番号２の位置１０１４は、配列番号４３の位置９５２に対応する。配列番号２の位置１０２５は、配列番号４３の位置９６３に対応する。配列番号２の位置１０２８は、配列番号４３の位置９６６に対応する。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、配列番号４４において記載されるとおりの未培養のクロストリジウム属の種に由来する。フィンガードメインは、配列番号４４の残基２６６〜２７０により定義される。ＲＥＣドメインは、配列番号４４の残基２８５〜２９７により定義される。Ｌｉｄドメインは、配列番号４４の残基９５９〜９７１により定義される。配列番号２の位置９１８は、配列番号４４の位置８７７６に対応する。配列番号２の位置１０１３は、配列番号４４の位置９６６に対応する。配列番号２の位置１０１４は、配列番号４４の位置９６７に対応する。配列番号２の位置１０２５は、配列番号４４の位置９７９に対応する。配列番号２の位置１０２８は、配列番号４４の位置９８２に対応する。
別の態様において、Ｃｐｆ１は、配列番号２７において記載されるとおりのButyrivibrio fibrisolvensに由来する。フィンガードメインは、配列番号２７の残基２３４〜２４２により定義される。ＲＥＣドメインは、配列番号２７の残基２６０〜２６４により定義される。Ｌｉｄドメインは、配列番号２７の残基９２５〜９３７により定義される。配列番号２の位置９１８は、配列番号２７の位置８３５に対応する。配列番号２の位置１０１３は、配列番号２７の位置９３２に対応する。配列番号２の位置１０１４は、配列番号２７の位置９３３に対応する。配列番号２の位置１０２５は、配列番号２７の位置９４４に対応する。配列番号２の位置１０２８は、配列番号２７の位置９４７に対応する。
ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）
エンドヌクレアーゼとして機能するために、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質のみならず、切断されるべき標的核酸の認識を担うガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）もまた必要とする。
ｃｒＲＮＡは、定常領域および可変領域を含むか、またはこれからなる。定常領域は、１９〜２０ヌクレオチドからなり、所与の生物に由来する全ての複合体について、一定である。ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の至適活性のために、Ｃｐｆ１またはそのホモログが由来する生物に対して特異的な定常領域に基づいてｃｒＲＮＡを設計することが重要となり得る。
定常領域は、Francisella novicidaに対して特異的であってもよく、配列番号５において記載される配列を有していてもよい。
可変領域は、１２〜２４ヌクレオチド、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の核酸からなる。可変領域は、標的認識を担うと考えられるｃｒＲＮＡの領域である。したがって、可変領域の配列を改変することを利用して、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体が様々な標的核酸を特異的に切断することができるようにすることができる。定常領域とは対照的に、可変領域は、生物特異的ではない。
したがって、一態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および１２ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３１ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および１２ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３２ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および１３ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３２ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および１３ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３３ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および１４ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３３ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および１４ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３４ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および１５ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３４ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および１５ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３５ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および１６ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３５ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および１６ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３６ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および１７ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３６ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および１７ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３７ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および１８ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３７ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および１８ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３８ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および１９ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３８ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および１９ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３９ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および２０ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３９ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および２０ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４０ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および２１ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４０ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および２１ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４１ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および２２ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４１ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および２２ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４２ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および２３ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４２ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および２３ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４３ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの定常領域および２４ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４３ヌクレオチドの全長を有する。別の態様において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチドの定常領域および２４ヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４４ヌクレオチドの全長を有する。
当業者は、所望される標的核酸に結合することができる可変領域を設計するうえで、困難を有さないであろう。可変領域は、標的核酸の逆相補体（reverse complement）である配列を有する。
したがって、ｃｒＲＮＡは、当該ｃｒＲＮＡが、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、３７ヌクレオチド長、３８ヌクレオチド長、３９ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長、４２ヌクレオチド長、４３ヌクレオチド長、４４ヌクレオチド長となるように、１９または２０ヌクレオチドの定常領域、および１２〜２４ヌクレオチドからなる可変領域からなり、ただし、５’末端のヌクレオチドは、セクション「第一の標的核酸」および「第二の標的核酸」において記載されるとおり、ＰＡＭからなる。
ガイドＲＮＡ配列を設計したら、ガイドＲＮＡを公知の方法により合成することができる。例えば、標的部位 の逆相補配列に対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、市販のオリゴヌクレオチドから注文してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、２４塩基長のＴ７プライミング配列を含んでいてもよい。これらのＤＮＡ二重鎖を、次いで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより行われる転写反応における鋳型として用いることができる。例えば、反応は、３７℃での少なくとも１時間にわたるインキュベーションからなっていてもよい。反応は、２×の停止溶液、例えば、５０ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および８Ｍの尿素を用いて停止させることができる。ＬｉＣｌ沈殿などの当該分野において公知の方法により、ＲＮＡを精製してもよい。
ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体
適切なｃｒＲＮＡと会合した場合、Ｃｐｆ１は、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を形成する。本開示のいくつかのＣｐｆ１変異体により形成されるｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体は、以下を行うことができる：
− 第一の標的核酸において一本鎖破損を導入すること、および
− 第二の標的核酸を特異的に認識すること。
このことは、野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼにより形成され、特異的核酸を認識して、前記特異的核酸の両方の鎖をねじれ型様式において切断することができるｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体とは、対照的である。
ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体が様々な標的核酸を認識することができるようにするために、ｃｒＲＮＡを改変してもよい。特に、ｃｒＲＮＡの可変領域は、様々な標的を認識させるために設計することができる。ｃｒＲＮＡの可変領域の配列は、標的核酸に対して相補的である必要がある。
所与の生物に由来するＣｐｆ１またはそのホモログは、好ましくは、同じ生物において天然で見いだされるような定常領域を有するｃｒＲＮＡと組み合わせて用いられるべきであることが、理解されるであろう。したがって、ＦｎＣｐｆ１またはそのホモログは、好ましくは、配列番号５において記載されるような定常領域を有するｃｒＲＮＡと共に組み立てられる。
ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体がエンドヌクレアーゼまたは制限酵素として効率的に機能するために、Ｃｐｆ１のｃｒＲＮＡに対する比は、好ましく調整される。好ましくは、Ｃｐｆ１のｃｒＲＮＡに対するモル濃度比は、０．５：３．０〜１．０：１．０、例えば０．７：２．５、例えば０．８：２．０、例えば０．９：１．７５、例えば０．９５：１．５、例えば１．０：１．４、例えば１．０：１．３、例えば１．１：１．２である。
いくつかの態様において、第一の標的核酸において一本鎖破損を導入し、本明細書において記載されるような第二の標的核酸を特異的に認識して任意にこれを切断する能力を有する、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を形成することができるＣｐｆ１変異体は、以下：
ｉ） 配列番号２の残基１〜２９７、３１０〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、フィンガードメイン（残基２９８〜３０９；配列番号１２）、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）またはＬｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失をさらに含む；
ならびに／あるいは
ｉｉ） 配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８において、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む；
を含む、Ｃｐｆ１変異体である。
いくつかの態様において、第二の標的核酸の切断は、一本鎖切断である。他の態様において、第二の標的核酸の切断は、二本鎖切断である。好ましくは、第二の標的核酸の切断は、一本鎖切断である。切断は、アクチベーターＤＮＡの存在により、さらに増強され得、これは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
例において観察され得るとおり、Ｑ１０２５Ｅ置換を有する変異体Ｃｐｆ１は、一本鎖ＤＮＡのかかる非特異的なＤＮＡ切断を行うことができる。切断は、一本鎖標的ＤＮＡまたは二本鎖標的ＤＮＡの存在により、増強される。同様に、配列番号３４において記載されるようなＲＥＣドメインについて欠失した変異体Ｃｐｆ１およびＲＥＣドメイン全体が置換されている変異体Ｃｐｆ１（配列番号３６）もまた、一本鎖ＤＮＡのかかる非特異的なＤＮＡ切断を行うことができる。切断は、一本鎖標的ＤＮＡまたは二本鎖標的ＤＮＡの存在により、増強される。Ｌｉｄドメイン全体が置換されているＣｐｆ１変異体は、上の変異体よりも低い程度までではあるが、一本鎖ＤＮＡのかかる非特異的なＤＮＡ切断を行うことができる；しかし、この場合において、切断は、一本鎖標的ＤＮＡのみの存在により増強されると考えられる。Ｋ１０１３Ｇ、Ｒ１０１４Ｇ変異体もまた、かかる非特異的な切断を行うことができる。
したがって、本明細書において、ｃｒＲＮＡとの複合体中にある場合、当該Ｃｐｆ１変異体が由来する野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼより効率的に核酸配列を切断するＣｐｆ１変異体が提供される。いくつかの態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、標的鎖および非標的鎖の両方を、野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼより効率的にカットする。他の態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、代替的にまたは付加的に、標的鎖および非標的鎖のうちの一方のみを、野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼより効率的にカットする。他の態様において、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、本明細書において下で詳述するとおり、代替的にまたは付加的に、非特異的な様式において、一本鎖破損を導入することができる。
例えば、配列番号２の位置１０２５において変異または置換を含むＣｐｆ１変異体は、配列番号２の野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼよりも効率的に、核酸配列を切断することができる。
配列番号２の位置１０２５および１０２８において変異または置換を含むＣｐｆ１変異体は、配列番号２の野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼよりも効率的に、核酸配列を切断することができる。
配列番号２の残基２９８〜３０９により定義されるフィンガードメインにおいて少なくとも１つの変異または置換を含むＣｐｆ１変異体は、配列番号２の野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼよりも効率的に、核酸配列を切断することができる。
配列番号２の残基３２４〜３３６により定義されるＲＥＣドメインにおいて少なくとも１つの変異または置換を含むＣｐｆ１変異体は、配列番号２の野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼよりも効率的に、核酸配列を切断することができる。
配列番号２の残基１００６〜１０１８により定義されるＬｉｄドメインにおいて変異または置換を含むＣｐｆ１変異体は、配列番号２の野生型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼよりも効率的に、核酸配列を切断することができる。
第一の標的核酸
本開示の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を形成した後、第一の標的核酸において一本鎖破損を導入することができる。第一の標的核酸とは、本開示のｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体により特異的に認識され得ないにもかかわらず、切断され得る核酸配列である。
いくつかの態様において、第一の標的核酸は、第二の標的核酸と同一であって、それは、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体により認識され、切断される。したがって、第一の標的核酸は、以下のセクション「第二の標的核酸」において定義されるものであってよい。
いくつかの態様において、第一の標的核酸は、第二の標的核酸とは異なっており、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の第二の標的核酸へのハイブリダイゼーションの後でのみ、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体により切断される。したがって、いくつかの態様において、第一の標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含まない。
第二の標的核酸
ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の第二の標的核酸への認識および結合は、ｃｒＲＮＡの第二の標的核酸への結合に依存する。これは、標的核酸におけるＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）の存在に依存する。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１はＦｎＣｐｆ１であり、ＰＡＭ配列は、５’−ＹＲＮ−３’または５’−ＲＹＮ−３’であり、ここで、Ｙは、ＡまたはＧなどのピリミジンであり、Ｒは、Ｔ、ＵまたはＣなどのプリンであり、Ｎは、任意のヌクレオチドである。好ましくは、ＲはＴまたはＣである。
一態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＴＴＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＣＣＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＴＡＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＴＣＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＴＧＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＣＴＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＣＡＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＣＧＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＡＴＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＡＡＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＡＣＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＡＧＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＴＴＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＴＡＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＴＣＮ−３’からなる。別の態様において、ＰＡＭは、配列５’−ＴＧＮ−３’からなる。
ｃｒＲＮＡは、好ましくはＰＡＭそのものにハイブリダイズする。ＰＡＭ配列の選択は、標的核酸を切断するために用いられるべきＣｐｆ１が由来する生物により決定され得る。
第二の標的核酸は、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１６個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１８個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１９個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２０個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２１個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２２個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２３個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２４個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２５個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２６個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２７個の連続したヌクレオチドの配列を含む認識配列を含むか、またはこれからなっていてもよく、ただし、５’末端の３個の核酸は、ＰＡＭ配列からなる。
第二の標的核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。第二の標的核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、クロマチン、ヌクレオソーム、プラスミドＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＤＮＡフラグメント、例えばＰＣＲ生成物からなる群より選択されるＤＮＡであってよい。
いくつかの態様において、第二の標的核酸は、ＲＮＡである。
いくつかの態様において、第二の標的核酸は、好ましくはＤＮＡである。
第二の標的核酸は、特異的に切断することが望ましい可能性がある任意の核酸であってよい。第二の標的核酸は、それをｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体と接触させる前に、当該分野において公知の方法により精製してもよい。
いくつかの態様において、第二の標的核酸は、in vivoで認識されて、ハイブリダイズされるものであってよい。
一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ複合体の使用
本開示の一側面は、第一の標的核酸において一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで：
ａ． Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログを、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と接触させ、それにより、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む第二の標的核酸を認識することができるｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を得ること、および
ｂ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を、第一の標的核酸と接触させること；
により、第一の標的配列において一本鎖破損が行われる。
ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体は、以下：
ｉ） 配列番号２の残基１〜２９７、３１０〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、フィンガードメイン（残基２９８〜３０９；配列番号１２）、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）またはＬｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失をさらに含む；
ならびに／あるいは
ｉｉ） 配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８において、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む；
を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログを含む。
ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体は、以下：
ｉ） 配列番号２の残基１〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、以下：
ａ． ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異、ここで、各々の変異は、独立して、アミノ酸の置換または欠失である；および／または
ｂ． Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ここで、位置９１７および１００６における残基のうちの少なくとも１つは、グルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）である；
をさらに含む；
ならびに／あるいは
ｉｉ） 配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８において、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む；
を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログを含む。
他の態様におけるｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体は、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログを含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、または１０１４において少なくとも１個のアミノ酸の置換を含み、前記変異体Ｃｐｆ１は、本明細書において上でセクション「変異体Ｃｐｆ１」において、詳細に記載される。
一態様において、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸にハイブリダイズし、Ｃｐｆ１は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入する。
一態様において、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸にハイブリダイズし、Ｃｐｆ１は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列中に一本鎖破損を導入し、ここで、第一および第二の標的核酸は、同一であるか、または重複している。例えば、第一および第二の標的核酸は、いずれも同じ認識配列および同じＰＡＭを含んでもよい。
一態様において、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸にハイブリダイズし、Ｃｐｆ１は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列中に一本鎖破損を導入し、ここで、第一および第二の標的核酸は、同じ核酸である。
ｃｒＲＮＡの特徴は、本明細書において上でセクション「ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）」において記載される。
したがって、第一の核酸と第二の核酸とは、同一であっても異なっていてもよい。一態様において、第一の核酸と第二の核酸とは同一である。例えば、第一の核酸と第二の核酸とは、同じ標的核酸である。
一態様において、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸にハイブリダイズし、Ｃｐｆ１は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入する。
一態様において、第一の核酸と第二の核酸は、異なっており、第一の標的核酸はＰＡＭ配列を含まず、したがってｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体により認識されないが、一方、第二の標的核酸はＰＡＭ配列を含み、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体により認識される。
核酸配列において一本鎖破損を導入するために有用なｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体中に含まれる変異体Ｃｐｆ１は、本明細書において記載される変異体のいずれかであってよい。しかし、いくつかの変異体が、特に有利である場合がある。例えば、Ｑ１０２５Ｇ置換を有する変異体Ｃｐｆ１、配列番号３４において記載されるようなＲＥＣドメインについて欠失した変異体Ｃｐｆ１、ＲＥＣドメイン全体が置換されている変異体Ｃｐｆ１（配列番号３６）、Ｌｉｄドメイン全体が置換されている変異体Ｃｐｆ１変異体は、全て、一本鎖ＤＮＡのかかる非特異的なＤＮＡ切断を行うことができ、第一の標的核酸とは異なる第二の標的核酸を切断するために特に有用である。位置１０１３および１０１４において、または位置９１８および１０１３において変異を有する変異体Ｃｐｆ１もまた、注目すべきものであり得る。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０２５において、アミノ酸置換を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基２９８〜３０９により定義されるＲＥＣドメインの１つ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基３２４〜３３６により定義されるＬｉｄドメインの１つ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基３２４〜３３６により定義されるＲＥＣドメインの２つ以上のアミノ酸残基の変異を含み、ここで、各々の変異は、独立して、アミノ酸の置換または欠失である。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号2の残基１００６〜１０１８により定義されるＬｉｄドメインの１つ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基１００６〜１０１８により定義されるＬｉｄドメインの２つ以上のアミノ酸残基の置換を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちの１つ以上において、アミノ酸置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、アミノ酸置換を含む。
置換は、いくつかの態様において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖または非極性の側鎖を有するアミノ酸への置換であってよい。いくつかの態様において、アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている。いくつかの態様において、アミノ酸は、グリシンに置換されている。
欠失は、いくつかの態様において、ＲＥＣドメイン、Ｌｉｄドメインまたはフィンガードメインの１つ、１つより多く、または全てのアミノ酸残基の欠失であってよい。いくつかの態様において、いくつかのアミノ酸は置換されており、一方で他のものは欠失している。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１変異体は、１つより多くのドメインにおいて、例えば、ＲＥＣドメインおよびＬｉｄドメインにおいて、ＲＥＣドメインおよびフィンガードメインにおいて、Ｌｉｄドメインおよびフィンガードメインにおいて、またはＲＥＣドメイン、Ｌｉｄドメインおよびフィンガードメインにおいて、アミノ酸欠失および／または置換を含む。Ｃｐｆ１変異体は、位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちの１つ以上において、アミノ酸の置換または欠失をさらに含んでもよい。
例えば、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するために用いられ、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、アミノ酸置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸への置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸への置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸への置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸への置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、鎖に対して荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、鎖に対して荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、鎖に対して荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、鎖に対して荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０１３および１０１４において、鎖に対して荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号2のＫ１０１３ＧおよびＲ１０１４Ｇの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号３に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、またはこれからなる。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号３に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、またはこれからなる。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号３を含むか、またはこれからなる。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号３を含むか、またはこれからなる。
本明細書において記載される変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのいくつかは、本明細書において第一の標的核酸として言及される標的核酸において、一本鎖破損を導入することができ、該標的核酸は、本明細書において第二の標的核酸として言及されるｃｒＲＮＡにより認識されてハイブリダイズされる核酸配列とは異なる。
いくつかの態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０２５において変異を有する。特定の態様において、変異は、Ｑ１０２５Ｇ変異である。
他の態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基３２４〜３３６に対応する、ＲＥＣドメインの少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失を有する。例えば、変異体Ｃｐｆ１は、ＲＥＣドメインの完全な欠失を有し、配列番号３４において記載される配列を有する。特定の態様において、ＲＥＣドメイン全体が置換されており、変異体Ｃｐｆ１は、例えば、配列番号３６において記載される配列を有する。
他の態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基３２４〜３３６に対応するＬｉｄドメインの少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失を有する。例えば、Ｌｉｄドメイン全体が置換されており、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号４２において記載される配列を有する。
他の態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基１００６〜１０１８に対応するＬｉｄドメインの少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失を有する。例えば、Ｌｉｄドメイン全体が置換されており、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号３８において記載される配列を有する。
いくつかの態様において、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体は、ＲＥＣ、Ｌｉｄまたはフィンガードメインのうちの１つより多くにおいて、例えば、ＲＥＣドメインにおいて、かつＬｉｄドメインにおいて：ＲＥＣドメインにおいて、かつフィンガードメインにおいて；Ｌｉｄドメインにおいて、かつフィンガードメインにおいて；またはＲＥＣドメイン、フィンガードメインおよびＬｉｄドメインにおいて、アミノ酸の置換または欠失を含む。変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちの１つ以上において、アミノ酸の置換または欠失をさらに含んでもよい。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８および１０１３において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸への置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８および１０１３において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸への置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８および１０１３において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸への置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８および１０１３において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸への置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８および１０１３において、鎖に対して荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８および１０１３において、鎖に対して荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８および１０１３において、鎖に対して荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８および１０１３において、鎖に対して荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８および１０１３において、は、鎖に対して荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの置換を含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の置換Ｒ９１８ＧおよびＫ１０１３Ｇを含む。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、またはこれからなる。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、またはこれからなる。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号４を含むか、またはこれからなる。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において、一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同じ核酸であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号４を含むか、またはこれからなる。
変異体は、本明細書において上でセクション「変異体Ｃｐｆ１」において記載されるようなさらなる変異または欠失を、さらに含んでもよい。
ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体は、ex-vivoの方法において第一の標的核酸において一本鎖破損を導入するために用いることができる。ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体はまた、in-vivoの方法において第一の標的核酸において一本鎖破損を導入するために用いることができる。
いくつかの態様において、上記のような一本鎖破損の導入の効率は、アクチベーターＤＮＡの存在により増強される。アクチベーターＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。いくつかの態様において、アクチベーターＤＮＡは、第二の標的核酸に対応する標的ＤＮＡである。
ゲノム編集のためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ複合体の使用
本開示の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのいくつかは、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体のｃｒＲＮＡによりハイブリダイズされる標的配列においてのみ、一本鎖破損を導入することができる。したがって、いくつかの態様において、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体のｃｒＲＮＡが第二の標的配列を認識してこれにハイブリダイズした場合、前記複合体のＣｐｆ１のＤＮＡｓｅ活性が活性化され、それが、第二の標的核酸配列の特異的部位において特異的に一本鎖破損を導入するであろう。さらに、非特異的な核酸配列は、変異体Ｃｐｆ１によって切断されることはない。このことは、かわりに非特異的なｓｓＤＮＡ活性を有する野生型Ｃｐｆ１に対して、多大な利点を構成する。実際に、一本鎖非特異的なＤＮＡ切断は、細胞にとって危険な活性である。なぜならば、それは、複製および転写などの正常な細胞の活動の間に開くＤＮＡを標的とするかである。この非特異的なｓｓＤＮＡ活性の主な帰結は、ランダムな破損の生成であり、これは、望ましくない変異誘発および細胞死までもをもたらし得る。
本開示の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、野生型Ｃｐｆ１と比較して、より安全な様式におけるゲノム編集のために有利に用いることができる。
したがって、本開示の一側面は、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法に関し、該方法は、哺乳動物細胞に、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を導入することを含み、ここで、Ｃｐｆ１は、本明細書において記載されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である。
いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、生殖細胞または胚性細胞ではない。
いくつかの態様において、本明細書において開示され、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであってよく、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置１０２５および１０２８において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
いくつかの態様において、本明細書において開示され、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであってよく、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置１０２５および１０２８において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸への、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
いくつかの態様において、本明細書において開示され、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであってよく、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置１０２５および１０２８において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸への、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
いくつかの態様において、本明細書において開示され、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであってよく、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置１０２５および１０２８において荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
いくつかの態様において、本明細書において開示され、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであってよく、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置１０２５および１０２８において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
例えば、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、アミノ酸置換Ｑ１０２５ＧおよびＥ１０２８Ｇを含む。
例えば、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号３２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログである。
変異体は、本明細書において上でセクション「変異体Ｃｐｆ１」において記載されるようなさらなる変異または欠失をさらに含んでもよい。
例えば、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、本明細書において定義されるようなＬｉｄドメインにおける少なくとも２個のアミノ酸の置換、および配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちのいずれか１つにおける１つ以上のアミノ酸置換を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであってよい。
例えば、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、本明細書において定義されるようなＲＥＣドメインにおける少なくとも２個のアミノ酸の変異（ここで、各々の変異は独立してアミノ酸の置換または欠失である）、および配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちのいずれか１つにおける１つ以上のアミノ酸置換を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであってよい。
例えば、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、本明細書において定義されるようなＲＥＣドメインにおける少なくとも２個のアミノ酸の置換、および配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちのいずれか１つにおける１つ以上のアミノ酸置換を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであってよい。
例えば、哺乳動物細胞における第二の標的ＤＮＡ配列において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法において用いられる、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、本明細書において定義されるようなＲＥＣドメインにおける少なくとも２つのアミノ酸欠失、および配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８のうちのいずれか１つにおける１つ以上のアミノ酸置換を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであってよい。
標的ＤＮＡ配列の検出および／または定量のためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ複合体の使用
本開示の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのいくつかは、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体のｃｒＲＮＡによりハイブリダイズされない一の標的配列においてのみ、一本鎖破損を導入することができる。したがって、いくつかの態様において、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体のｃｒＲＮＡが第二の標的配列を認識してこれにハイブリダイズした場合、前記複合体のＣｐｆ１のＤＮＡｓｅ活性が活性化され、それが、核酸配列のランダムな部位において、例えば第一の標的配列のランダムな部位において、非特異的に一本鎖破損を導入するであろう。さらに、第二の標的核酸は、Ｃｐｆ１によって切断されることはなく、これは、したがって、より長い期間にわたり活性状態に留まり、１つより多くの第一の標的配列を切断するであろう。第一の標的配列が、当該第一の標的配列の切断によりシグナルが放出されるような方法において標識されているのであれば、記載される方法は、したがって、第二の標的配列の検出を可能にするであろう。
これらの変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体中にある場合、提供された標識された第一の標的配列の補助により、第二の標的配列を検出してこれを定量するために用いることができる。
したがって、本開示の一側面は、試料中の第二の標的核酸の検出のための方法に関し、該方法は、以下：
ａ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を提供すること、ここで、Ｃｐｆ１は、本明細書において記載されるようなＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である；
ｂ． 標識されたｓｓＤＮＡを提供すること、ここで、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素および少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用的標識のセットで標識されている；
ｃ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体およびｓｓＤＮＡを試料と接触させること、ここで、試料は、少なくとも１つの第二の標的核酸を含む；ならびに
ｄ． 色素からのシグナルを検出することにより、ｓｓＤＮＡの切断を検出すること；
を含み、それにより、試料中の第二の標的核酸の存在を検出する。
ステップｃ．において、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体およびｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの第二の標的核酸と接触させられ、ｃｒＲＮＡの第二の標的核酸の認識およびこれとの結合は、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の活性化をもたらし、これが次いで、ｓｓＤＮＡに、一本鎖破損、例えば切断を導入することができる。
したがって、ステップｃ．は、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の活性化を含んでもよい。
方法は、第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度を決定するステップをさらに含んでもよく、ここで、第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度は、切断されたｓｓＤＮＡに相関する。
上で説明されるとおり、いくつかの態様において、本明細書において開示される変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、第二の標的核酸を切断せず、したがって、２つ以上の第一の標的核酸を切断するために十分な期間にわたり活性であり続けるであろう。第一の標的核酸は、本明細書において記載される方法においては、ｓｓＤＮＡまたはそのフラグメントであってよい。ｃｃＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の第二の標的核酸へのハイブリダイゼーションの後で、ｃｃＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体により切断される第一の標的核酸分子が多いほど、シグナルはより高く、したがって、方法の感受性がより高い。このことは、他のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼに対して、開示される変異体Ｃｐｆ１の利点である。
したがって、本明細書において開示される方法は、高い感受性を有し、ナノモル濃度範囲以下の濃度において、例えばピコモル濃度範囲以下の濃度において、例えばフェムトモル濃度範囲以下の濃度において、第二の標的核酸の検出を可能にし得、例えば、本明細書において開示される方法は、アトモル濃度範囲における濃度において、第二の標的核酸の検出を可能にする。
いくつかの態様において、本明細書において開示される変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、第二の標的核酸を切断し、したがって、切断された第二の標的核酸が放出されるまでの間のみ、活性であり続けるであろう。
ｓｓＤＮＡは、鎖に沿った任意の位置における少なくとも１つの塩基において標識されていてもよい。例えば、ｓｓＤＮＡは、鎖に沿った任意の位置における１つの塩基において、例えば鎖に沿った任意の位置における少なくとも２つの塩基において、例えば鎖に沿った任意の位置における少なくとも３つの塩基において、例えば鎖に沿った任意の位置における少なくとも４つの塩基において、標識される。
ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素および少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用的標識のセットにより、標識されていてもよい。
一態様において、少なくとも１つの色素は、フルオロフォアである。
したがって、方法のステップｄ．におけるｓｓＤＮＡの切断は、ｓｓＤＮＡの切断から生じる蛍光シグナルを検出することを含む。
一態様において、少なくとも１つのフルオロフォアは、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）１、ＢＨＱ２およびＢＨＱ３、Cosmic Quencher（例えばBiosearch Technologies、Novato, USA製）、Excellent Bioneer Quencher（EBQ)（例えば、Bioneer、Daejeon, Korea製）またはこれらの組み合わせを含む群より選択される。
一態様において、少なくとも１つのクエンチャーは、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）１、ＢＨＱ２およびＢＨＱ３（Biosearch Technologies、Novato, USA製）を含む群より選択される。
本発明において有用であり得るフルオロフォアとして、当該分野において公知の任意の蛍光分子が挙げられ得る。フルオロフォアの例は、以下である：Cy2（商標）Cfflfi）、YO-PRn（商標）−１（５０９）、YDYO（商標）-1（５０９）、Calrein（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、FluorX（商標）（５１９）、Alexa（商標）（５２０）、ローダミン１１０（５２０）、オレゴングリーン（商標）５００（５２２）、オレゴングリーン（商標）４８８（５２４）、RiboGreen（商標）（525）、ローダミングリーン（商標）（５２７）、ローダミン１２３（５２９）、マグネシウムグリーン（商標）（５３１）、カルシウムグリーン（商標）（５３３）、TO-PRO（商標）−ｌ（５３３）、TOTOl（５３３）、JOE（５４８）、30 BODIPY530/550（５５０）、Dil（565）、BODIPY TMR（５６８）、BODIPY558/568（５６８）、BODIPY564/570（５７０）、Cy3（商標）（５７０）、Alexa（商標）546（５７０）、TRITC（５７２）、マグネシウムオレンジ（商標）（５７５）、フィコエリトリンＲ＆Ｂ（５７５）、ローダミンファロイジン（５７５）、カルシウムオレンジ（商標）（５７６）、ピロニンＹ（５８０）、ローダミンＢ（５８０）、TAMRA（５８２）、ローダミンレッド（商標）（５９０）、Cy3.5（商標）（５９６）、ROX（608）、Calcium Crimson（商標）（６１５）、Alexa（商標）594 35（６１５）、Texas Red（６１５）、Nile Red（６２８）、YO-PRO（商標）−３（６３１）、YOYO（商標）−３（６３１）、RP3649PC00フィコシアニン（６４２）、Ｃ−フィコシアニン（６４８）、TO-PRO（商標）−３（６６０）、TOT03（６６０）、DiD DilC(5)（６６５）、Cy5（商標）（６７０）、チアジカルボシアニン（６７１）、Cy5.5（６９４）、HEX（５５６）、TET（５３６）、Biosearch Blue（４４７）、CAL Fluor Gold 540（５４４）、CAL Fluor Orange 560（５５９）、CAL Fluor Red 590（５９１）、CAL Fluor Red 610（６１０）、CAL Fluor Red 635（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、フルオレセイン（５２０）、フルオレセイン−Ｃ３（５２０）、Pulsar 650（５６６）、Quasar 570（６６７）、Quasar 670（７０５）およびQuasar 705（６１０）。括弧内の数は、最大は、ナノメートルにおける最大発光波長である。
広範囲の波長または特異的波長の蛍光をクエンチすることができる非蛍光の黒色のクエンチャー分子を本発明において用いることができることに、注目すべきである。
フルオロフォア／クエンチャーの好適なペアは、当該分野において公知である。
方法は、任意の核酸の存在およびレベルを検出するために用いることができ、したがって、試料は、核酸を含み、例えばプロテアーゼを除去するために、適切に処置された、任意の試料であってよい。試料は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含んでもよい。試料は、第二の標的核酸を含むことが疑われる試料であってよい。試料は、任意の原核生物または真核生物の細胞培養物の培養抽出物、ヒトなどの哺乳動物の体液であってよい。
第二の標的核酸は、ウイルスゲノム、微生物ゲノム、癌遺伝子などの遺伝子、または病原体のゲノムの核酸フラグメントであってよい。
第二の標的核酸はまた、変異した核酸配列、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）であってもよい。
試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、本明細書において上で、特にセクション「変異体Ｃｐｆ１」において、記載される変異体のいずれかであってよい。
試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであってもよく、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８および１０１３において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
例えば、試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸への、配列番号２の位置９１８および１０１３において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
例えば、試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸への、配列番号２の位置９１８および１０１３において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
例えば、試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８および１０１３において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、少なくとも２個のアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換を含む。
例えば、試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８および１０１３において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
例えば、試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、アミノ酸置換Ｒ９１８ＧおよびＫ１０１３Ｇを含む。
例えば、試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログである。
例えば、試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであるが、配列番号４を含むか、またはこれからなる。
試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼはまた、他のアミノ酸修飾を含んでもよい。
疾患の診断のためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ複合体の使用
本開示はまた、増大／減少した遺伝子発現に、および／または外来遺伝子材料の存在に関連する任意の疾患の診断のための方法に関する。
本開示の一側面は、対象における疾患の診断のためのin vitroでの方法に関し、該方法は、以下：
ａ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を提供すること、ここで、Ｃｐｆ１は、本明細書において定義されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である；
ｂ． 標識されたｓｓＤＮＡを提供すること、ここで、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つのフルオロフォアおよび少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用的標識のセットにより標識されている；
ｃ． 対象からの試料を提供すること、ここで、前記試料は、第二の標的核酸を含むか、またはこれを含むことが疑われる；ならびに
ｄ． 本明細書において記載される検出の方法に従って第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度を決定すること、
ここで、第二の標的核酸は、疾患に相関する核酸フラグメントである；
を含み、それにより、対象における疾患を診断する。
対象における疾患の診断のための方法は、前記疾患を処置するステップをさらに含んでもよい。例えば、方法は、治療的に有効な剤を投与することにより前記疾患を処置することをさらに含んでもよい。
試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、本明細書において上で、特にセクション「変異体Ｃｐｆ１」において、記載される変異体のいずれかであってよい。
感染性疾患の診断のためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ複合体の使用
本開示の一側面は、対象における感染性疾患の診断のためのin vitroでの方法に関し、該方法は、以下：
ａ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を提供すること、ここで、Ｃｐｆ１は、本明細書において定義されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である；
ｂ． 標識されたｓｓＤＮＡを提供すること、ここで、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの相互作用的標識のセットにより標識されており、ここで、前記相互作用的な標識は、ｓｓＤＮＡの切断によりシグナルを生じる；
ｃ． 対象からの試料を提供すること、ここで、前記試料は、第二の標的核酸を含むか、またはこれを含むことが疑われる；ならびに
ｄ． 本明細書において記載される検出の方法に従って第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度を決定すること、
ここで、第二の標的核酸は、疾患を引き起こす感染性病原体のゲノムの核酸フラグメントである；
を含み、それにより、対象における感染性疾患を診断する。
本開示の一側面は、対象における感染性疾患の診断のためのin vitroでの方法に関し、該方法は、以下：
ａ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を提供すること、ここで、Ｃｐｆ１は、本明細書において定義されるような変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である；
ｂ． 標識されたｓｓＤＮＡを提供すること、ここで、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つのフルオロフォアおよび少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用的標識のセットにより標識されている；
ｃ． 対象からの試料を提供すること、ここで、前記試料は、第二の標的核酸を含むか、またはこれを含むことが疑われる；ならびに
ｄ． 本明細書において記載される検出の方法に従って第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度を決定すること、
ここで、第二の標的核酸は、疾患を引き起こす感染性病原体のゲノムの核酸フラグメントである；
を含み、それにより、対象における感染性疾患を診断する。
相互作用的な標識は、例えば、発光標識を含んでもよい。
対象における感染性疾患の診断のための方法は、前記感染性疾患を処置するステップをさらに含んでもよい。例えば、方法は、治療的に有効な剤を投与することにより前記感染性疾患を処置することをさらに含んでもよい。
対象における感染性疾患の診断のための方法は、前記第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度をカットオフ値と比較するステップをさらに含んでもよく、
ここで、前記カットオフ値は、健康な対象、例えば感染性疾患を呈しない対象における、前記第二の標的核酸の濃度範囲から決定され、
ここで、カットオフ値よりも高いレベルおよび／または濃度は、感染性疾患の存在を示す。
感染性疾患は、ウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、線虫、寄生回虫、蟯虫、節足動物、真菌、白癬および大寄生虫などの感染性病原体により引き起こされる任意の疾患である。
したがって、第二の標的核酸は、ウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、線虫、寄生回虫、蟯虫、節足動物、真菌、白癬および大寄生虫からなる群より選択される感染性病原体のゲノムまたはそのフラグメントであってよい。
本明細書において開示される方法は、ヒトにおける感染性疾患を診断するために用いることができる。
したがって、第二の標的核酸を含む試料は、ヒトの身体から採取された試料であってもよい。例えば、試料は、血液、全血、血漿、血清、尿、唾液、涙液、脳脊髄液および精液からなる群より選択されるヒトの体液であってもよい。
試料中の第二の標的核酸の検出のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、本明細書において上で、特にセクション「変異体Ｃｐｆ１」において、記載される変異体のいずれかであってよい。
一態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１０２５においてアミノ酸置換を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基２９８〜３０９により定義されるＲＥＣドメインの１つ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基３２４〜３３６により定義されるＬｉｄドメインの１つ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基１００６〜１０１８により定義されるＬｉｄドメインの１つ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の残基１００６〜１０１８により定義されるＬｉｄドメインの２つ以上のアミノ酸残基の置換を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換を含む。
別の態様において、本開示は、第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損を導入するための、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用に関し、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とは、同一であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちの２つ以上におけるアミノ酸置換を含む。
感染性疾患の診断のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８および１０１３において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
例えば、感染性疾患の診断のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸への、配列番号２の位置９１８および１０１３において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
例えば、感染性疾患の診断のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸への、配列番号２の位置９１８および１０１３において、少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
例えば、感染性疾患の診断のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、配列番号２の位置９１８および１０１３において、少なくとも２個のアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換を含む。
例えば、試料における感染性疾患の診断のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８および１０１３において、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、少なくとも２個のアミノ酸のグリシンへの置換を含む。
例えば、感染性疾患の診断のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号２に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記ポリペプチド配列は、アミノ酸置換Ｒ９１８ＧおよびＫ１０１３Ｇを含む。
例えば、感染性疾患の診断のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号４に対して、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログである。
例えば、感染性疾患の診断のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであるが、配列番号４を含むか、またはこれからなる。
感染性疾患の診断のための方法において用いられる変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼはまた、他のアミノ酸修飾を含んでもよい。
項目
１．以下：
ｉ） 配列番号２の残基１〜２９７、３１０〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、フィンガードメイン（残基２９８〜３０９；配列番号１２）、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）またはＬｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失をさらに含む；
ならびに／あるいは
ｉｉ） 配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８において、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む；
を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
２．以下：
ｉ） 配列番号２の残基１〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、
ａ． ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の変異、ここで、各々の変異は、独立して、アミノ酸の置換または欠失である；
および／または
ｂ． Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ここで、位置９１７および１００６における残基のうちの少なくとも１つは、グルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）である；
をさらに含む；
ならびに／あるいは
ｉｉ） 配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の残基９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８に対応する位置から独立して選択される２つの位置において少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む；
を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
３．Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、Francisella novicidaに由来する、項目１に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
４．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、
ａ． ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換または欠失；および／または
ｂ． Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ただし、配列番号２の位置９１７および１００６における残基のうちの少なくとも１つは、グルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）である；
をさらに含み、
ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含む。
５．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２個のアミノ酸の置換のうちの１つは、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸への置換である。
６．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換は、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸への置換である。
７．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換は、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸残基への置換である。
８．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２個のアミノ酸の置換のうちの１つは、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸残基への置換である。
９．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２個のアミノ酸の置換のうちの１つは、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換である。
１０．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換は、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換である。
１１．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２個のアミノ酸の置換のうちの１つは、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの置換である。
１２．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２個のアミノ酸の置換のうちの１つは、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの置換である。
１３．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、ＲＥＣドメインにおけるものである。
１４．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、ＲＥＣドメインにおける少なくとも１個の残基の置換または欠失、例えば、ＲＥＣドメインの、少なくとも２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも３個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも６個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも７個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも８個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも９個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１１個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１３個の残基の置換または欠失である。
１５．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２個のアミノ酸の置換または欠失は、ＲＥＣドメインにおける少なくとも２個の残基の置換または欠失、例えば、ＲＥＣドメインの、少なくとも３個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも６個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも７個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも８個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも９個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１１個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１３個の残基の置換または欠失である。
１６．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個の置換または欠失は、ＲＥＣドメインの全ての残基の置換または欠失である。
１７．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２個の置換または欠失は、ＲＥＣドメインの全ての残基の置換または欠失である。
１８．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、Ｌｉｄドメインにおけるものである。
１９．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２個のアミノ酸の置換は、Ｌｉｄドメインにおけるものである。
２０．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、Ｌｉｄドメインにおける少なくとも１個の残基の置換または欠失、例えば、Ｌｉｄドメインの、少なくとも２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも３個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも６個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも７個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも８個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも９個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１１個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１３個の残基の置換または欠失である。
２１．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２個のアミノ酸の置換は、Ｌｉｄドメインにおける少なくとも２個の残基の置換、例えば、Ｌｉｄドメインの、少なくとも３個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも６個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも７個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも８個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも９個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１１個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１３個の残基の置換または欠失である。
２２．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個の置換または欠失は、Ｌｉｄドメインの全ての残基の置換または欠失である。
２３．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２つの置換は、Ｌｉｄドメインの全ての残基の置換である。
２４．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、フィンガードメインにおけるものである。
２５．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換または欠失は、フィンガードメインにおける少なくとも１個の残基の置換または欠失、例えば、フィンガードメインの、少なくとも２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも３個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも６個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも７個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも８個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも９個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１１個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１２個の残基の置換または欠失である。
２６．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個の置換または欠失は、フィンガードメインの全ての残基の置換または欠失である。
２７．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも１個のアミノ酸の置換は、Ｒ９１８Ｇ、Ｋ１０１３Ｇ、Ｒ１０１４Ｇ、Ｑ１０２５ＧまたはＥ１０２８Ｇである。
２８．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、少なくとも２個のアミノ酸の置換は、独立して、Ｒ９１８Ｇ、Ｋ１０１３Ｇ、Ｒ１０１４Ｇ、Ｑ１０２５ＧおよびＥ１０２８Ｇから選択される。
２９．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ニッキングエンドヌクレアーゼである。
３０．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記アミノ酸置換は、位置Ｋ１０１３におけるものである。
３１．配列番号２のＫ１０１３に対応する位置における置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
３２．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記アミノ酸置換は、位置Ｒ９１８およびＫ１０１３におけるものである。
３３．配列番号２のＲ９１８およびＫ１０１３に対応する位置における置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
３４．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記アミノ酸置換は、位置Ｋ１０１３およびＲ１０１４におけるものである。
３５．配列番号２の１０１３およびＲ１０１４に対応する位置における置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
３６．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記アミノ酸置換は、Ｋ１０１３Ｇである。
３７．配列番号２のＫ１０１３Ｇに対応する置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
３８．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、アミノ酸置換Ｋ１０１３ＧおよびＲ１０１４Ｇを含む。
３９．配列番号２のＫ１０１３ＧおよびＲ１０１４Ｇに対応する置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
４０．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記アミノ酸置換は、位置Ｑ１０２５におけるものである。
４１．配列番号２のＱ１０２５に対応する位置における置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
４２．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記アミノ酸置換は、位置Ｅ１０２８におけるものである。
４３．配列番号２のＥ１０２８に対応する位置における置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
４４．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記アミノ酸置換は、位置Ｑ１０２５およびＥ１０２８におけるものである。
４５．配列番号２のＱ１０２５およびＥ１０２８に対応する位置における置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
４６．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記アミノ酸置換は、Ｑ１０２５Ｇである。
４７．配列番号２のＱ１０２５Ｇに対応する置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
４８．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、前記アミノ酸置換は、Ｅ１０２８Ｇである。
４９．配列番号２のＥ１０２８Ｇに対応する置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
５０．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、アミノ酸置換Ｑ１０２５ＧおよびＥ１０２８Ｇを含む。
５１．配列番号２のＱ１０２５ＧおよびＥ１０２８Ｇに対応する置換を含む、先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
５２．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換または欠失、ならびに配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちのいずれか１つにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。
５３．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ならびに配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちのいずれか１つにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。
５４．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換または欠失、ならびに配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちのいずれか１つにおける少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
５５．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ならびに配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちのいずれか１つにおける少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む。
５６．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号３または配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、またはこれからなる。
５７．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号３または配列番号４のポリペプチドを含むか、またはこれからなる。
５８．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのＲＥＣドメインは、配列番号１４を含むか、またはこれからなる。
５９．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのＬｉｄドメインは、配列番号１８を含むか、またはこれからなる。
６０．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのフィンガードメインは、配列番号２２を含むか、またはこれからなる。
６１．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、変異体Ｃｐｆ１は、野生型Ｃｐｆ１と比較して、１つ以上の変更された活性を有し、前記活性は、以下からなる群より選択される：標的または非標的核酸の二本鎖切断；鎖になった標的または非標的核酸の一本鎖切断；任意に一本鎖または二本鎖標的ＤＮＡにより増強される、非特異的な様式における核酸の一本鎖切断。
６２．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、配列番号２の位置９１７における残基は、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である。
６３．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、配列番号２の位置１００６における残基は、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である。
６４．先行する項目のうちのいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードする、ポリヌクレオチド。
６５．項目６４に記載のポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。
６６．項目１〜６４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは項目１〜６４のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードする核酸配列を含む、組み換えベクター
６７．前記ポリヌクレオチドまたは核酸配列が、プロモーターに作動的に連結されている、項目６６に記載の組み換えベクター。
６８．プロモーターに作動的に連結されているガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列をさらに含み、ここで、ｃｒＲＮＡが、コードされているＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび標的核酸にハイブリダイズするために十分な塩基対を有するフラグメントに結合する、項目６６〜６７のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
６９．ｃｒＲＮＡが、少なくとも４０ヌクレオチド長、例えば４１ヌクレオチド長、例えば４２ヌクレオチド長、例えば４３ヌクレオチド長、例えば４４ヌクレオチド長となるように、前記ｃｒＲＮＡが、１９または２０ヌクレオチドの定常領域、および１２〜２４ヌクレオチドからなる可変領域からなる、項目６６〜６８のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
７０．ｃｒＲＮＡの定常領域が、配列番号５において記載されるとおりである、項目６６〜６９のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
７１．項目１〜６３のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１またはそのオルトログ、項目６４または６５に記載のポリヌクレオチド、または項目６６〜７０のいずれか一項に記載の組み換えベクターを発現することができる、細胞。
７２．ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の発現のための系であって、以下：
ａ． 変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードするポリヌクレオチドを含む、項目６４または６５に記載のポリヌクレオチド、または項目６６〜７０のいずれか一項に記載の組み換えベクター；
ｂ． 任意にプロモーターに作動的に連結されている、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドまたは組み換えベクター；
を含む、前記系。
７３．ｃ． 上のａ．およびｂ．のポリヌクレオチドまたは組み換えベクターの発現のための細胞
をさらに含む、項目７２に記載の系。
７４．前記細胞が、原核または真核細胞である、項目７１に記載の細胞、または項目７２もしくは７３に記載の系。
７５．第一の標的核酸において一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用であって、ここで：
ａ． Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログを、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と接触させ、それにより、第二の標的核酸を認識することができるｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を得ること、第二の標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、および
ｂ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を、第一の標的核酸と接触させること；
これにより、第一の標的配列において一本鎖破損が行われる、
前記使用。
７６．Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、項目１〜６３のいずれか一項に記載されるか、または項目６４〜７０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドもしくはベクターによりコードされる、項目７５に記載の使用。
７７．ｃｒＲＮＡが、第二の標的核酸にハイブリダイズする、項目７５〜７６のいずれか一項に記載の使用。
７８．ｃｒＲＮＡの第二の標的核酸へのハイブリダイゼーションが、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を活性化する、項目７５〜７７のいずれか一項に記載の使用。
７９．第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損が行われる、項目７５〜７８のいずれか一項に記載の使用。
８０．第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において一本鎖破損が行われる、項目７５〜７９のいずれか一項に記載の使用。
８１．ｃｒＲＮＡが、先行する項目のうちのいずれか一項において定義されるとおりである、項目７５〜８０のいずれか一項に記載の使用。
８２．Ｃｐｆ１のｃｒＲＮＡに対するモル濃度比が、０．５：３．０〜１．０：１．０、例えば０．７：２．５、例えば０．８：２．０、例えば０．９：１．７５、例えば０．９５：１．５、例えば１．０：１．４、例えば１．０：１．３、例えば１．１：１．２である、項目７５〜８１のいずれか一項に記載の使用。
８３．Ｃｐｆ１：ｃｒＲＮＡ：第二の標的核酸のモル濃度比が、０．５：３．０：５．０、例えば０．７：２．５：４．０、例えば０．８：２．０：３．５、例えば０．９：１．７５：３．０、例えば０．９５：１．５：２．０、例えば１．０：１．４：１．９、例えば１．０：１．３：１．７である、項目７５〜８２のいずれか一項に記載の使用。
８４．第二の標的核酸が、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１６個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１８個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１９個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２０個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２１個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２２個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２３個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２４個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２５個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２６個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２７個の連続したヌクレオチドの配列を含む認識配列を含むか、またはこれからなり、ただし、５’末端の３個の核酸は、ＰＡＭ配列からなる、項目７５〜８３のいずれか一項に記載の使用。
８５．ＰＡＭが、配列５’−ＹＲＮ−３’または５’−ＲＹＮ−３’を含むか、またはこれからなる、項目７５〜８４のいずれか一項に記載の使用。
８６．ＰＡＭが、配列５’−ＴＴＮ−３’を含むか、またはこれからなる、項目７５〜８５のいずれか一項に記載の使用。
８７．第一の標的核酸および第二の標的核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、項目７５〜８６のいずれか一項に記載の使用。
８８．第二の標的核酸が、二本鎖ＤＮＡである、項目７５〜８７のいずれか一項に記載の使用。
８９．第二の標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、クロマチン、ヌクレオソーム、プラスミドＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＤＮＡフラグメントからなる群より選択されるＤＮＡである、項目７５〜８８のいずれか一項に記載の使用。
９０．第二の標的核酸が、ＲＮＡである、項目７５〜８９のいずれか一項に記載の使用。
９１．第一の標的核酸と第二の標的核酸とが、同一である、項目７５〜９０のいずれか一項に記載の使用。
９２．第一の標的核酸と第二の標的核酸とが、同じ分子であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置１０１３および１０１４においてアミノ酸置換を含む、項目７５〜９１のいずれか一項に記載の使用。
９３．第一の標的核酸と第二の標的核酸とが、同じ分子であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３を含むか、またはこれからなる、項目７５〜９２のいずれか一項に記載の使用。
９４．第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損が行われ、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置１０１３および１０１４においてアミノ酸置換を含む、項目７５〜９３のいずれか一項に記載の使用。
９５．Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３を含むか、またはこれからなる、項目７５〜９４のいずれか一項に記載の使用。
９６．第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置９１８および１０１３においてアミノ酸置換を含む、項目７５〜９５のいずれか一項に記載の使用。
９７．第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号４を含むか、またはこれからなる、項目７５〜９６のいずれか一項に記載の使用。
９８．Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置９１８および１０１３においてアミノ酸置換を含む、項目７５〜９７のいずれか一項に記載の使用。
９９．Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号４を含むか、またはこれからなる、項目７５〜９８のいずれか一項に記載の使用。
１００．項目７５〜９９のいずれか一項に記載の使用であって、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６のうちのいずれか１つにおいて２つ以上のアミノ酸の置換または欠失を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６に対応する残基の全てにおいてアミノ酸置換を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６に対応する残基の全てにおいてアミノ酸欠失を含む、前記使用。
１０１．第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３４または配列番号３６を含むか、またはこれからなる、項目７５〜１００のいずれか一項に記載の使用。
１０２．項目７５〜１０１のいずれか一項に記載の使用であって、ここで、Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置３２４〜３３６のうちのいずれか１つにおいて２つ以上のアミノ酸の置換または欠失を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６に対応する残基の全てにおいてアミノ酸置換を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６に対応する残基の全てにおいてアミノ酸欠失を含む、前記使用。
１０３．Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３４または配列番号３６を含むか、またはこれからなる、項目７５〜１０２のいずれか一項に記載の使用。
１０４．項目７５〜１０３のいずれか一項に記載の使用であって、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１００６〜１０１８のうちのいずれか１つにおいて２つ以上のアミノ酸置換を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置１００６〜１０１８に対応する残基の全てにおいてアミノ酸置換を含む、前記使用。
１０５．第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３８を含むか、またはこれからなる、項目７５〜１０４のいずれか一項に記載の使用。
１０６．項目７５〜１０５のいずれか一項に記載の使用であって、ここで、Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、配列番号２の位置１００６〜１０１８のうちのいずれか１つにおいて２つ以上のアミノ酸置換を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置１００６〜１０１８に対応する残基の全てにおいてアミノ酸置換を含む、前記使用。
１０７．Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３８を含むか、またはこれからなる、項目７５〜１０６のいずれか一項に記載の使用。
１０８．第一の標的核酸と第二の標的核酸とが、同一であるかまたは異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の１０２５および１０２８に対応する位置においてアミノ酸置換を含む、項目７５〜１０７のいずれか一項に記載の使用。
１０９．第一の標的核酸と第二の標的核酸とが、同一であるかまたは異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３２を含むか、またはこれからなる、項目７５〜１０８のいずれか一項に記載の使用。
１１０．Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的に一本鎖破損を行い、ここで、標的核酸が、二本鎖の形態であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の１０２５および１０２８に対応する位置において２つ以上のアミノ酸置換を含む、項目７５〜１０９のいずれか一項に記載の使用。
１１１．Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的に一本鎖破損を行い、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３２を含むか、またはこれからなる、項目７５〜１１０のいずれか一項に記載の使用。
１１２．前記方法がex-vivoで行われる、項目７５〜１１１のいずれか一項に記載の使用。
１１３．第一の標的核酸において一本鎖破損を導入する方法であって、以下のステップ：
ａ． プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む第二の標的核酸を認識することができるガイド−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を設計すること；
ｂ． ステップａ．のｃｒＲＮＡをＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログと接触させ、それにより、前記第二の標的核酸に結合することができるｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を得ること、および
ｃ． ｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１を前記第一の標的核酸と接触させ、
それにより、第一の標的核酸において１つ以上の一本鎖破損を導入すること
を含む、前記方法。
１１４．Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、項目１〜６３のいずれか一項に記載されるか、または項目６４〜７０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドもしくはベクターによりコードされる、項目１１３に記載の方法。
１１５．ステップｂ．とｃとが、同時に行われるか、または一方が他方の後に行われる、項目１１３または１１４に記載の方法。
１１６．in vitroで細胞において行われる、項目１１３〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
１１７．第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損が行われる、項目１１３〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
１１８．一本鎖破損が、第一の標的核酸において特異的にまたは非特異的に行われる、項目１１３〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
１１９．第一および第二の標的核酸が、先行する項目のうちのいずれか一項において定義されるとおりである、項目１１３〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
１２０．哺乳動物細胞において第二の標的核酸において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法であって、哺乳動物細胞中にｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を導入することを含み、ここで、Ｃｐｆ１が、項目１〜６３のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡが、第二の標的核酸に対して特異的である、前記方法。
１２１．試料中の第二の標的核酸の検出のための方法であって、以下：
ａ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を提供すること、ここで、Ｃｐｆ１は、項目１〜６３のいずれか一項に記載のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である；
ｂ． 標識されたｓｓＤＮＡを提供すること、ここで、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素および少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用的標識のセットで標識されている；
ｃ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体およびｓｓＤＮＡを試料と接触させること、ここで、試料は、少なくとも１つの第二の標的核酸を含む；ならびに
ｄ． フルオロフォアからの蛍光シグナルを検出することにより、ｓｓＤＮＡの切断を検出し、
それにより、試料中の第二の標的核酸の存在を検出すること
を含む、前記方法。
１２２．ステップｃ．が、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の活性化、例えば一本鎖または二本鎖標的ＤＮＡによる活性化を含む、項目１２１に記載の方法。
１２３． ｅ． 第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度を決定すること、
ここで、第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度は、切断されたｓｓＤＮＡに相関する、
をさらに含む、項目１２１または１２２に記載の方法。
１２４．ナノモル濃度以下の範囲における、例えばピコモル濃度以下の範囲における、例えばフェムトモル濃度以下の範囲における、例えばアトモル濃度以下の範囲における濃度で、第二の標的核酸を検出することができる、項目１２１〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
１２５．ｓｓＤＮＡが、鎖に沿った任意の位置における少なくとも１つの塩基において標識されている、項目１２１〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
１２６．少なくとも１つの色素が、フルオロフォアである、項目１２１〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
１２７．ステップｄ．が、ｓｓＤＮＡの切断から生じる蛍光シグナルを検出することを含む、項目１２１〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
１２８．試料が、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む、項目１２１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
１２９．試料が、第二の標的核酸を含むことが疑われる、項目１２１〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
１３０．第二の標的核酸が、ウイルスゲノム、微生物ゲノム、遺伝子、または病原体のゲノムの核酸フラグメントである、項目１２１〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
１３１．対象における感染性疾患の診断のためのin vitroでの方法であって、以下：
ａ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を提供すること、ここで、Ｃｐｆ１は、項目１〜６３のいずれか一項に記載のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である；
ｂ． 標識されたｓｓＤＮＡを提供すること、ここで、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素および少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用的標識のセットで標識されている；
ｃ． 対象からの試料を提供すること、ここで、前記試料は、第二の標的核酸を含むか、またはこれを含むことが疑われる；ならびに
ｄ． 先行する項目のうちのいずれか一項において定義されるように、第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度を決定すること、
ここで、第二の標的核酸は、疾患を引き起こす感染性病原体のゲノムの核酸またはそのフラグメントであり、
それにより、対象における感染性疾患を診断すること
を含む、前記方法。
１３２．前記感染性疾患を処置するステップをさらに含む、項目１３１に記載の方法。
１３３．治療有効化合物の投与により前記感染性疾患を処置することをさらに含む、項目１３２に記載の方法。
１３４．項目１３１〜１３３のいずれか一項に記載の方法であって、前記第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度をカットオフ値と比較するステップをさらに含み、
ここで、前記カットオフ値は、健康な対象、例えば感染性疾患を呈しない対象における、前記第二の標的核酸の濃度範囲から決定され、
ここで、カットオフ値よりも高いレベルおよび／または濃度は、感染性疾患の存在を示す、
前記方法。
１３５．項目１３１〜１３４のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、前記感染性疾患は、感染性病原体により引き起こされ、およびここで、感染性病原体は、ウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、線虫、寄生回虫、蟯虫、節足動物、真菌、白癬および大寄生虫を含む、前記方法。
１３６．対象が、ヒトである、項目１３１〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
１３７．試料体液が、血液、全血、血漿、血清、尿、唾液、涙液、脳脊髄液および精液からなる群より選択される、項目１３１〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
１３８．Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置９１８および１０１３においてアミノ酸置換を含む、項目１３１〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
１３９．Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号４を含むか、またはこれからなる、項目１３１〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
例
例１．切断アッセイ
以下をアニーリングすることにより、二本鎖ＤＮＡ標的を調製した：
標識されたＤＮＡについて、標的鎖（ｔ鎖）５’−ａｔｇｃａｇｔｇｇｃｃｔｔａｔｔａａａｔｇａｃｔｔｃｔｃＴＡＡ ＣＧ−３’−６ＦＡＭ（配列番号６）および
非標的鎖（ｎｔ鎖） ６ＦＡＭ−５’−ｃｇＴＴＡｇａｇａａｇｔｃａｔｔｔａａｔａａｇｇｃｃａｃｔｇｃａｔ−３’（配列番号７）、ならびに
未標識ＤＮＡ標的について、ｔ鎖５’−ａｔｇｃａｇｔｇｇｃｃｔｔａｔｔａａａｔｇａｃｔｔｃｔｃＴＡＡＣＧ−３’（配列番号８）および
ｎｔ−標的鎖５’−ｃｇＴＴＡｇａｇａａｇｔｃａｔｔｔａａｔａａｇｇｃｃａｃｔｇｃａｔ−３’（配列番号９）。
切断アッセイは、以下のとおり行った：
４ピコモルのＦｎＣｐｆ１タンパク質（野生型タンパク質を対照として用いた）および５．２ピコモルのｃｒＲＮＡ（ｒＡｒＡｒＵｒＵｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＵｒＧｒＵｒＵｒＧｒＵｒＡｒＧｒＡｒＵｒＣｒＡｒＣｒＣｒＧｒＡｒＧｒＵｒＧｒＣｒＡｒＧｒＣｒＣｒＡｒＣｒＵｒＣｒＧｒＧｒＣｒＧｒＣｒＵ）（配列番号１０）を、２０ｍＭビシン−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＰＥ（ｐＨ８）および５ｍＭのＭｇＣｌ中で、２５℃で３０分間にわたり混合した。次いで、６ピコモルの二本鎖の標識されたＤＮＡ標的を混合物に添加し、それをさらに３０分間にわたり２５℃でインキュベートした。等容積の停止溶液（ｐＨ８における８Ｍの尿素および１００ｍＭのＥＤＴＡ）を添加し、その後、９５℃で５分間にわたりインキュベートすることにより、反応を停止させた。試料を１５％のNovex ＴＢＥ−尿素ゲル（Invitrogen）上にロードし、Odyssey FC Imaging System（Li-Cor）を用いてゲルを可視化した。
非特異的なｓｓＤＮＡについて、切断アッセイを以下のとおり行った：
４ピコモルのＦｎＣｐｆ１タンパク質（野生型タンパク質を対照として用いた）および５．２ピコモルのｃｒＲＮＡを、２０ｍＭのビシン−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＰＥ（ｐＨ８）および５ｍＭのＭｇＣｌ中で、２５℃で３０分間にわたり混合した。次いで６ピコモルの二本鎖の標識されていないＤＮＡ標的を混合物に添加し、それをさらに３０分間にわたり２５℃でインキュベートした。次いで、標識された非特異的なｓｓＤＮＡ（／５’ ６−ＦＡＭ／ＡＧＣＡＴＧＣＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＴＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＴＡＣＧＡＣＧＧＴ）（配列番号２３）を添加し、混合物２５℃で３０分間にわたりインキュベートした。等容積の停止溶液（ｐＨ８における８Ｍの尿素および１００ｍＭのＥＤＴＡ）を添加し、その後、９５℃で５分間にわたりインキュベートすることにより、反応を停止させた。試料を１５％のNovex ＴＢＥ−尿素ゲル（Invitrogen）上にロードし、製造者の指示に従って流した。Odyssey FC Imaging System（Li-Cor）を用いてゲルを可視化した。
ＤＮＡバンドの強度（Ｉ）からエンドヌクレアーゼ活性を計算した。ImageStudioを用いて強度を定量した。未切断のＤＮＡ（Ｉｕｃ）の強度を、参照として用いた。ＮＴＳ（非標的鎖）、ＴＳ（標的鎖）およびＳＳＤＮＡ（非特異的な一本鎖）の切断の％を、以下の式を用いて計算した：（１００＊Ｉｎ）／Ｉｕｃ、ここでＩｎは、目的のバンドの強度である。少なくとも３回の独立した実験の平均を、プロットにおいて用い、標準偏差をエラーバーにおいて表す。
結果：
ＤＮＡ二重鎖において、ＰＡＭ配列（５’−ＴＴＡ−３’）およびｃｒＲＮＡの一部に対して相補的なｔ鎖における標的配列を含む（図１）。
ＦｎＣｐｆ１野生型タンパク質は、ｔ鎖およびｎｔ鎖の両方をカットすることができる（図２〜４および６）。 変異体１（配列番号３；Ｋ１０１３−Ｒ１０１４Ｃｐｆ１）は、ｔ鎖のみをカットすることができる（図２、４および６Ｄ）。この変異体は、ニッカーゼとして有用である。
ＦｎＣｐｆ１野生型タンパク質は、二本鎖ＤＮＡ標的（図３、４）による活性化の後で、非特異的なｓｓＤＮＡをカットすることができる。変異体２（配列番号４；Ｒ９１８Ｇ−Ｋ１０１３Ｇ）は、特異的ＤＮＡ標的を、ｓｓＤＮＡとしてもｄｄＤＮＡとしてのみならずも、ｎｔ鎖としても、カットすることができないが、非特異的なｓｓＤＮＡをカットすることができる（図３、４）。
Ｃｐｆ１ Ｑ１０２５Ｇ変異体（配列番号３０）は、標的鎖および非標的鎖が二本鎖ＤＮＡ形態である場合、それらの両方を、野生型よりも効率的にカットすることができる。変異体は、一本鎖ＤＮＡとしての標的鎖のみをカットするための能力の増大を示す（図４ＡおよびＢならびに６Ｂ）。この変異体は、二本鎖ＤＮＡ標的および一本鎖ＤＮＡ標的による活性化の後で、非特異的なｓｓＤＮＡをカットすることができる。この変異体は、ゲノム編集のために有用である。
Ｃｐｆ１ Ｑ１０２５Ｇ Ｅ１０２８Ｇ変異体（配列番号３２）は、標的鎖および非標的鎖が二本鎖ＤＮＡ形態である場合、それらの両方をカットすることができる。変異体は、一本鎖ＤＮＡとしての標的鎖のみをカットする能力の低下を示す（図４Ａ、Ｂおよび６Ｃ）。この変異体は、二本鎖ＤＮＡ標的による活性化の後で、非特異的な一本鎖ＤＮＡをカットすることができるとは考えられない。この変異体は、細胞にとって危険であり得る非特異的なｓｓＤＮＡ活性を有しないので、より安全な方法におけるゲノム編集のために用いることができる。ｓｓＤＮＡ中に破損を誘導する非特異的なヌクレアーゼの存在は、複製（duplication）、複製（replication）および転写の間にＤＮＡをカットすることができ、したがって、細胞のゲノム中にランダムな破損を生じる可能性があり、したがって、望ましくない変異、ゲノムの損傷および細胞傷害性を誘導し得る。
ＲＥＣドメイン全体の欠失を担持するＣｐｆ１変異体（配列番号３４）は、標的鎖および非標的鎖のいずれもカットすることができない。変異体は、一本鎖ＤＮＡとしての標的鎖のみをカットする能力の低下を示す（図４Ａ、Ｂ）。この変異体は、二本鎖ＤＮＡ標的による活性化の後で、非特異的なｓｓＤＮＡをカットすることができる。それは、アクチベーターをカットしないので、このタンパク質は、非特異的なｓｓＤＮＡ活性を、野生型と比較してより長く保持するであろう。
置換されたＲＥＣドメインを担持するＣｐｆ１変異体（配列番号３６）は、標的鎖または非標的鎖が二本鎖ＤＮＡ形態である場合、それらをカットすることができない。変異体は、一本鎖ＤＮＡとしての標的鎖のみをカットする能力の低下を示す。変異体は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ標的による活性化の後で、非特異的なｓｓＤＮＡをカットすることができる。それは、アクチベーターをカットしないので、このタンパク質は、非特異的なｓｓＤＮＡ活性を、野生型と比較してより長く保持するであろう。
Ｌｉｄドメインの置換を担持するＣｐｆ１変異体（配列番号３８）は、標的鎖または非標的鎖が二本鎖ＤＮＡ形態である場合、それらをカットすることができない。変異体は、一本鎖ＤＮＡとしての標的鎖のみをカットすることができない（図４Ａ、Ｂ）。変異体は、低い活性によってではあるが、非特異的なｓｓＤＮＡをカットすることができる。Ｌｉｄ領域全体が、タンパク質の活性のために重要であると考えられ、この領域における変異は、タンパク質の活性の変化を誘導するであろう。興味深いことに、Ｌｉｄドメインの置換を担持するこの変異体の活性は、Ｅ１００６の置換にもかかわらず、保存される。本発明者らは、驚くべきことに、Ｅ１００６を含むＬｉｄドメイン全体が置換された場合、野生型ＦｎＣｐｆ１の位置９１７に対応する残基が置換されなければ、またはアスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）に置換されただけであれば、活性は保存されることを見出した。
Ｌｉｄドメイン全体の欠失を担持するＣｐｆ１変異体（配列番号４０）は、可溶性ではない（図５）。
フィンガードメイン全体の欠失を担持するＣｐｆ１変異体（配列番号４２）は、可溶性ではない（図５）。
参考文献
Figure 2021525541
Figure 2021525541
配列の概要
配列番号１ ＦｎＣｐｆ１ ＤＮＡ配列
配列番号２ ＦｎＣｐｆ１ アミノ酸配列
配列番号３ 二重変異体−ニッカーゼ、Cpf1 K1013G-R1014G
配列番号４ 二重変異体−非特異的エンドヌクレアーゼ、Cpf1 R918G-K1013G
配列番号５ ｃｒＲＮＡ定常領域
配列番号６ ｔ鎖
配列番号７ ｎｔ鎖
配列番号８ ｔ鎖
配列番号９ ｎｔ鎖
配列番号１０ ｃｒＲＮＡ
配列番号１１ ＦｎＣｐｆ１のＲＥＣドメイン、ＤＮＡ配列
配列番号１２ ＦｎＣｐｆ１のＲＥＣドメイン、アミノ酸配列
配列番号１３ ＦｎＣｐｆ１の変異型ＲＥＣドメイン、ＤＮＡ配列
配列番号１４ ＦｎＣｐｆ１の変異型ＲＥＣドメイン、アミノ酸配列
配列番号１５ ＦｎＣｐｆ１のＬｉｄドメイン、ＤＮＡ配列
配列番号１６ ＦｎＣｐｆ１のＬｉｄドメイン、アミノ酸配列
配列番号１７ ＦｎＣｐｆ１の変異型Ｌｉｄドメイン、ＤＮＡ配列
配列番号１８ ＦｎＣｐｆ１の変異型Ｌｉｄドメイン、アミノ酸配列
配列番号１９ ＦｎＣｐｆ１のフィンガードメイン、ＤＮＡ配列
配列番号２０ ＦｎＣｐｆ１のフィンガードメイン、アミノ酸配列
配列番号２１ ＦｎＣｐｆ１の変異型フィンガードメイン、ＤＮＡ配列
配列番号２２ ＦｎＣｐｆ１の変異型フィンガードメイン、アミノ酸配列
配列番号２３ 標識された非特異的ｓｓＤＮＡ
配列番号２４ アシダミノコッカス種BV3L6のＣｐｆ１
配列番号２５ ラクノスピラ科の細菌COE1のＣｐｆ１
配列番号２６ スクシクラスチカム・ルミニスのＣｐｆ１
配列番号２７ Butyrivibrio fibrisolvensのＣｐｆ１
配列番号２８ 非特異的ｓｓＤＮＡ
配列番号２９ ＦｎＣｐｆ１ Ｑ１０２５Ｇ変異体
配列番号３０ ＦｎＣｐｆ１ Ｑ１０２５Ｇ変異体
配列番号３１ ＦｎＣｐｆ１ Ｑ１０２５Ｇ Ｅ１０２８Ｇ変異体
配列番号３２ ＦｎＣｐｆ１ Ｑ１０２５Ｇ Ｅ１０２８Ｇ変異体
配列番号３３ Ｒｅｃ欠失変異体ＦｎＣｐｆ１
配列番号３４ Ｒｅｃ欠失変異体ＦｎＣｐｆ１
配列番号３５ Ｒｅｃ置換ＦｎＣｐｆ１変異体
配列番号３６ Ｒｅｃ置換ＦｎＣｐｆ１変異体
配列番号３７ ＬＩＤ置換ＦｎＣｐｆ１変異体
配列番号３８ ＬＩＤ置換ＦｎＣｐｆ１変異体
配列番号３９ ＬＩＤ欠失ＦｎＣｐｆ１変異体
配列番号４０ ＬＩＤ欠失ＦｎＣｐｆ１変異体
配列番号４１ フィンガー欠失ＦｎＣｐｆ１変異体
配列番号４２ フィンガー欠失ＦｎＣｐｆ１変異体
配列番号４３ Candidatus Methanoplasma termitumのＣｐｆ１
配列番号４４ 未培養のクロストリジウム属の種のＣｐｆ１

Claims (114)

  1. 以下：
    ｉ） 配列番号２の残基１〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
    ここで、前記ポリペプチド配列は、
    ａ． ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の変異、ここで、各々の変異は、独立して、アミノ酸の置換または欠失である；および／または
    ｂ． Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ここで、位置９１７および１００６における残基のうちの少なくとも１つは、グルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）である；
    をさらに含む；
    ならびに／あるいは
    ｉｉ） 配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
    ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の残基９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８に対応する位置から独立して選択される２つの位置において少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む；
    を含む、変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  2. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、Francisella novicidaに由来する、請求項１に記載のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  3. 請求項１または２に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであって、ここで、変異体Ｃｐｆ１は、配列番号２の残基１〜３２３、３３７〜１００５、および１０１９〜１３２９に対応する配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ここで、前記ポリペプチド配列は、
    ａ． ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換または欠失；および／または
    ｂ． Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ただし、配列番号２の位置９１７および１００６における残基のうちの少なくとも１つは、グルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）である；
    をさらに含み、
    ここで、前記ポリペプチド配列は、配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５または１０２８における少なくとも１個のアミノ酸の置換をさらに含む、
    前記変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  4. 少なくとも２個のアミノ酸の置換のうちの１つが、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、荷電していない側鎖を有するアミノ酸への置換である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  5. 少なくとも２個のアミノ酸の置換のうちの１つが、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、非極性の側鎖を有するアミノ酸残基への置換である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  6. 少なくとも２個のアミノ酸の置換のうちの１つが、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  7. 少なくとも２個のアミノ酸の置換のうちの１つが、荷電した側鎖を有するアミノ酸の、グリシンへの置換である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  8. 少なくとも２個のアミノ酸の置換または欠失が、ＲＥＣドメインにおけるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  9. 少なくとも２個のアミノ酸の置換または欠失が、ＲＥＣドメインにおける少なくとも２個の残基の置換または欠失、例えば、ＲＥＣドメインの、少なくとも３個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも６個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも７個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも８個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも９個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１１個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１３個の残基の置換または欠失である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  10. 少なくとも２個の置換または欠失が、ＲＥＣドメインの全ての残基の置換または欠失である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  11. 少なくとも２個のアミノ酸の置換が、Ｌｉｄドメインにおけるものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  12. 少なくとも２個のアミノ酸の置換が、Ｌｉｄドメインにおける少なくとも２個の残基の置換、例えば、Ｌｉｄドメインの、少なくとも３個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも６個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも７個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも８個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも９個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１１個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１３個の残基の置換または欠失である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  13. 少なくとも２つの置換が、Ｌｉｄドメインの全ての残基の置換である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  14. 少なくとも２個のアミノ酸の置換が、独立して、Ｒ９１８Ｇ、Ｋ１０１３Ｇ、Ｒ１０１４Ｇ、Ｑ１０２５ＧおよびＥ１０２８Ｇから選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  15. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ニッキングエンドヌクレアーゼである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  16. 配列番号２のＫ１０１３に対応する位置における置換を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  17. 配列番号２のＲ９１８およびＫ１０１３に対応する位置における置換を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  18. 配列番号２の１０１３およびＲ１０１４に対応する位置における置換を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  19. 配列番号２のＫ１０１３Ｇに対応する置換を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  20. 配列番号２のＫ１０１３ＧおよびＲ１０１４Ｇに対応する置換を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  21. 配列番号２のＱ１０２５に対応する位置における置換を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  22. 配列番号２のＥ１０２８に対応する位置における置換を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  23. 配列番号２のＱ１０２５およびＥ１０２８に対応する位置における置換を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  24. 配列番号２のＱ１０２５Ｇに対応する置換を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  25. 配列番号２のＥ１０２８Ｇに対応する置換を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  26. 配列番号２のＱ１０２５ＧおよびＥ１０２８Ｇに対応する置換を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  27. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換または欠失、ならびに配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちのいずれか１つにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  28. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ならびに配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちのいずれか１つにおいて、少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  29. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ＲＥＣドメイン（残基３２４〜３３６；配列番号１６）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換または欠失、ならびに配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちのいずれか１つにおける少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  30. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、Ｌｉｄドメイン（残基１００６〜１０１８；配列番号２０）において、配列番号２と比較して、少なくとも２個のアミノ酸の置換、ならびに配列番号２の位置９１８、１０１３、１０１４、１０２５および１０２８のうちのいずれか１つにおける少なくとも２個のアミノ酸の置換を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  31. 変異Ｒ９１８Ｇ Ｋ１０１３ＧまたはＱ１０２５Ｇ Ｅ１０２８ＧまたはＫ１０１３Ｇ Ｒ１０１４Ｇを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  32. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号３または配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、またはこれからなる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  33. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号３または配列番号４のポリペプチドを含むか、またはこれからなる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  34. 変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのＲＥＣドメインは、配列番号１４を含むか、またはこれからなる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  35. 変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのＬｉｄドメインは、配列番号１８を含むか、またはこれからなる、請求項１〜３４いずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  36. 変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのフィンガードメインが、配列番号２２を含むか、またはこれからなる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  37. 変異体Ｃｐｆ１が、野生型Ｃｐｆ１と比較して、１つ以上の変更された活性を有し、前記活性が、以下：標的または非標的核酸の二本鎖切断；鎖になった標的または非標的核酸の一本鎖切断；任意に一本鎖または二本鎖標的ＤＮＡにより増強される、非特異的な様式における核酸の一本鎖切断からなる群より選択される、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  38. 配列番号２の位置９１７における残基が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  39. 配列番号２の位置１００６における残基が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログ。
  40. 請求項１〜３９のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードする、ポリヌクレオチド。
  41. 宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
  42. 請求項４０もしくは４１に記載のポリヌクレオチド、または請求項１〜３９のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードする核酸配列を含む、組み換えベクター
  43. 前記ポリヌクレオチドまたは核酸配列が、プロモーターに作動的に連結されている、請求項４２に記載の組み換えベクター。
  44. プロモーターに作動的に連結されているガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列をさらに含む、請求項４２〜４３のいずれか一項に記載の組み換えベクターであって、ここで、ｃｒＲＮＡが、コードされているＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび標的核酸にハイブリダイズするために十分な塩基対を有するフラグメントに結合する、前記組み換えベクター。
  45. ｃｒＲＮＡが、少なくとも４０ヌクレオチド長、例えば４１ヌクレオチド長、例えば４２ヌクレオチド長、例えば４３ヌクレオチド長、例えば４４ヌクレオチド長となるように、ｃｒＲＮＡが、１９または２０ヌクレオチドの定常領域、および１２〜２４ヌクレオチドからなる可変領域からなる、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
  46. ｃｒＲＮＡの定常領域が、配列番号５において記載されるとおりである、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
  47. 請求項１〜３９のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１またはそのオルトログ、請求項４０または４１に記載のポリヌクレオチド、または請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組み換えベクターを発現することができる、細胞。
  48. ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の発現のための系であって、
    ａ． 変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４０または４１に記載のポリヌクレオチド、または請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組み換えベクター；
    ｂ． 任意にプロモーターに作動的に連結されている、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドまたは組み換えベクター
    を含む、前記系。
  49. ｃ． 上のａ．およびｂ．のポリヌクレオチドまたは組み換えベクターの発現のための細胞
    をさらに含む、請求項４８に記載の系。
  50. 前記細胞が、原核または真核細胞である、請求項４７に記載の細胞、または請求項４８もしくは４９に記載の系。
  51. 第一の標的核酸において一本鎖破損を導入するためのｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の使用であって、ここで：
    ａ． Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログを、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と接触させ、それにより、第二の標的核酸を認識することができるｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を得る、ここで、第二の標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログは、請求項１〜５のいずれか一項によるものである；
    ｂ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を、第一の標的核酸と接触させる；
    これにより、第一の標的配列において一本鎖破損が行われる、
    前記使用。
  52. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、請求項１〜３９のいずれか一項に記載されるか、または請求項４０〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはベクターによりコードされる、請求項５１に記載の使用。
  53. ｃｒＲＮＡが、第二の標的核酸にハイブリダイズする、請求項５２に記載の使用。
  54. ｃｒＲＮＡの第二の標的核酸へのハイブリダイゼーションが、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を活性化する、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の使用。
  55. 第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損が行われる、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の使用。
  56. 第一の標的核酸の１つ以上の非特異的なヌクレオチド配列において一本鎖破損が行われる、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の使用。
  57. ｃｒＲＮＡが、請求項４４〜５６のいずれか一項において定義されるとおりである、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の使用。
  58. Ｃｐｆ１のｃｒＲＮＡに対するモル濃度比が、０．５：３．０〜１．０：１．０、例えば０．７：２．５、例えば０．８：２．０、例えば０．９：１．７５、例えば０．９５：１．５、例えば１．０：１．４、例えば１．０：１．３、例えば１．１：１．２である、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の使用。
  59. Ｃｐｆ１：ｃｒＲＮＡ：第二の標的核酸のモル濃度比が、０．５：３．０：５．０、例えば０．７：２．５：４．０、例えば０．８：２．０：３．５、例えば０．９：１．７５：３．０、例えば０．９５：１．５：２．０、例えば１．０：１．４：１．９、例えば１．０：１．３：１．７である、請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の使用。
  60. 第二の標的核酸が、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１６個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１８個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも１９個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２０個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２１個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２２個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２３個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２４個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２５個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２６個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも２７個の連続したヌクレオチドの配列を含む認識配列を含むか、またはこれからなり、ただし、５’末端の３個の核酸は、ＰＡＭ配列からなる、請求項５１〜５９のいずれか一項に記載の使用。
  61. ＰＡＭが、配列５’−ＹＲＮ−３’または５’−ＲＹＮ−３’を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜６０のいずれか一項に記載の使用。
  62. ＰＡＭが、配列５’−ＴＴＮ−３’を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜６１のいずれか一項に記載の使用。
  63. 第一の標的核酸および第二の標的核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項５１〜６２のいずれか一項に記載の使用。
  64. 第二の標的核酸が、二本鎖ＤＮＡである、請求項５１〜６３のいずれか一項に記載の使用。
  65. 第二の標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、クロマチン、ヌクレオソーム、プラスミドＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＤＮＡフラグメントからなる群より選択されるＤＮＡである、請求項５１〜６４のいずれか一項に記載の使用。
  66. 第一の標的核酸と第二の標的核酸とが、同一である、請求項５１〜６５のいずれか一項に記載の使用。
  67. 第一の標的核酸と第二の標的核酸とが、同じ分子であり、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置１０１３および１０１４においてアミノ酸置換を含む、請求項５１〜６６のいずれか一項に記載の使用。
  68. 第一の標的核酸と第二の標的核酸とが、同じ分子であり、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜６７のいずれか一項に記載の使用。
  69. 第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損が行われ、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置１０１３および１０１４においてアミノ酸置換を含む、請求項５１〜６８のいずれか一項に記載の使用。
  70. Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜６９のいずれか一項に記載の使用。
  71. 第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置９１８および１０１３においてアミノ酸置換を含む、請求項５１〜７０のいずれか一項に記載の使用。
  72. 第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号４を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜７１のいずれか一項に記載の使用。
  73. Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置９１８および１０１３においてアミノ酸置換を含む、請求項５１〜７２のいずれか一項に記載の使用。
  74. Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号４を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜７３のいずれか一項に記載の使用。
  75. 請求項５１〜７４のいずれか一項に記載の使用であって、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６のうちのいずれか１つにおいて２つ以上のアミノ酸の置換または欠失を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６に対応する残基の全てにおいてアミノ酸置換を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６に対応する残基の全てにおいてアミノ酸欠失を含む、前記使用。
  76. 第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３４または配列番号３６を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜７５のいずれか一項に記載の使用。
  77. 請求項５１〜７６のいずれか一項に記載の使用であって、ここで、Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６のうちのいずれか１つにおいて２つ以上のアミノ酸の置換または欠失を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６に対応する残基の全てにおいてアミノ酸置換を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置３２４〜３３６に対応する残基の全てにおいてアミノ酸欠失を含む、前記使用。
  78. Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３４または配列番号３６を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の使用。
  79. 請求項５１〜７８のいずれか一項に記載の使用であって、ここで、第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置１００６〜１０１８のうちのいずれか１つにおいて２つ以上のアミノ酸置換を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置１００６〜１０１８に対応する残基の全てにおいてアミノ酸置換を含む、前記使用。
  80. 第一の標的核酸と第二の標的核酸とが異なっており、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３８を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜７９のいずれか一項に記載の使用。
  81. 請求項５１〜８０のいずれか一項に記載の使用であって、ここで、Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置１００６〜１０１８のうちのいずれか１つにおいて２つ以上のアミノ酸置換を含む、例えばここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置１００６〜１０１８に対応する残基の全てにおいてアミノ酸置換を含む、前記使用。
  82. Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損を行い、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３８を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜８１のいずれか一項に記載の使用。
  83. 第一の標的核酸と第二の標的核酸とが、同一であるかまたは異なっており、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の１０２５および１０２８に対応する位置においてアミノ酸置換を含む、請求項５１〜８２のいずれか一項に記載の使用。
  84. 第一の標的核酸と第二の標的核酸とが、同一であるかまたは異なっており、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３２を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜８３のいずれか一項に記載の使用。
  85. Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的に一本鎖破損を行い、ここで、標的核酸が、二本鎖の形態であり、およびここで、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の１０２５および１０２８に対応する位置において２つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項５１〜８４のいずれか一項に記載の使用。
  86. Ｃｐｆ１が、第一の標的核酸において特異的に一本鎖破損を行い、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号３２を含むか、またはこれからなる、請求項５１〜８５のいずれか一項に記載の使用。
  87. ex-vivoで行われる、請求項５１〜８６のいずれか一項に記載の使用。
  88. 第一の標的核酸において一本鎖破損を導入する方法であって、以下のステップ：
    ａ． プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む第二の標的核酸を認識することができるガイド−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を設計すること；
    ｂ． ステップａ．のｃｒＲＮＡをＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログと接触させ、それにより、前記第二の標的核酸に結合することができるｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を得ること；および
    ｃ． ｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１を前記第一の標的核酸と接触させること；
    を含み、
    それにより、第一の標的核酸において１つ以上の一本鎖破損を導入する、
    前記方法。
  89. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、請求項１〜３９のいずれか一項に記載されるか、または請求項４０〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはベクターによりコードされる、請求項８８に記載の方法。
  90. ステップｂ．およびｃ．が、同時に行われるか、または一方が他方の後に行われ得る、請求項８８〜８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 細胞においてin vitroで行われる、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 第一の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において一本鎖破損が行われる、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 第一の標的核酸において特異的または非特異的に一本鎖破損が行われる、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 第一および第二の標的核酸が、請求項１〜９３のいずれか一項において定義されるとおりである、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 哺乳動物細胞において第二の標的核酸において部位特異的な二本鎖破損を導入するin vitroの方法であって、哺乳動物細胞中にｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を導入することを含み、ここで、Ｃｐｆ１は、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の変異体Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である、前記方法。
  96. 試料中の第二の標的核酸の検出のための方法であって、以下：
    ａ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を提供すること、ここで、Ｃｐｆ１は、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である；
    ｂ． 標識されたｓｓＤＮＡを提供すること、ここで、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素および少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用的標識のセットで標識されている；
    ｃ． ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体およびｓｓＤＮＡを試料と接触させること、ここで、試料は、少なくとも１つの第二の標的核酸を含む；ならびに
    ｄ． フルオロフォアからの蛍光シグナルを検出することにより、ｓｓＤＮＡの切断を検出すること；
    を含み
    それにより、試料中の第二の標的核酸の存在を検出し、
    ここで、ステップｃ．は、任意にｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の活性化を含む、
    前記方法。
  97. ステップｃ．が、ｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体の活性化、例えば一本鎖または二本鎖標的ＤＮＡによる活性化、を含む、請求項９６に記載の方法。
  98. ｅ． 第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度を決定すること
    をさらに含み、
    ここで、第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度は、切断されたｓｓＤＮＡに相関する、
    請求項９６〜９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. ナノモル濃度以下の範囲における、例えばピコモル濃度以下の範囲における、例えばフェムトモル濃度以下の範囲における、例えばアトモル濃度以下の範囲における濃度で、第二の標的核酸を検出することができる、請求項９６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. ｓｓＤＮＡが、鎖に沿った任意の位置における少なくとも１つの塩基において標識されている、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 少なくとも１つの色素が、フルオロフォアである、請求項９６〜１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. ステップｄ．が、ｓｓＤＮＡの切断から生じる蛍光シグナルを検出することを含む、請求項９６〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 試料が、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む、請求項９６〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 試料が、第二の標的核酸を含むことが疑われる、請求項９６〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 第二の標的核酸が、ウイルスゲノム、微生物ゲノム、遺伝子、または病原体のゲノムの核酸フラグメントである、請求項９６〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 対象における感染性疾患の診断のためのin vitroでの方法であって、以下：
    ａ． 請求項１〜３９のいずれか一項に記載のｃｒＲＮＡ−Ｃｐｆ１複合体を提供すること、ここで、Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログであり、およびここで、およびここで、ｃｒＲＮＡは、第二の標的核酸に対して特異的である；
    ｂ． 標識されたｓｓＤＮＡを提供すること、ここで、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素および少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用的標識のセットで標識されている；
    ｃ． 対象からの試料を提供すること、ここで、前記試料は、第二の標的核酸を含むか、またはこれを含むことが疑われる；ならびに
    ｄ． 請求項５１〜１０５のいずれか一項において定義されるような第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度を決定すること、
    ここで、第二の標的核酸は、疾患を引き起こす感染性病原体のゲノムの核酸またはそのフラグメントである、
    を含み、それにより、対象における感染性疾患を診断する、前記方法。
  107. 前記感染性疾患を処置するステップをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 治療有効化合物の投与により前記感染性疾患を処置することをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記第二の標的核酸のレベルおよび／または濃度をカットオフ値と比較するステップをさらに含む、請求項１０６〜１０８のいずれか一項に記載の方法であって、
    ここで、前記カットオフ値は、健康な対象、例えば感染性疾患を呈しない対象における、前記第二の標的核酸の濃度範囲から決定され、
    ここで、カットオフ値よりも高いレベルおよび／または濃度は、感染性疾患の存在を示す、
    前記方法。
  110. 前記感染性疾患が、感染性病原体により引き起こされ、感染性病原体が、ウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、線虫、寄生回虫、蟯虫、節足動物、真菌、白癬および大寄生虫を含む、請求項１０６〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 対象が、ヒトである、請求項１０６〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 試料体液が、血液、全血、血漿、血清、尿、唾液、涙液、脳脊髄液および精液からなる群より選択される、請求項１０６〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号２の位置９１８および１０１３においてアミノ酸置換を含む、請求項１０６〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼまたはそのオルトログが、配列番号４を含むか、またはこれからなる、請求項１０６〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
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