CN115181743A - 一种脱氧核酶分子探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种功能核酸活性调控的方法，包括将所述功能的其中一个或多个碱基修饰，将功能核酸活性封闭。优选地，将所述功能核酸或者功能核酸作用的底物的其中一个或多个碱基修饰，将功能核酸活性封闭之后，还包括将所述修饰基团脱除，活化所述功能核酸。本发明还提供一种脱氧核酶分子探针，所述脱氧核酶分子探针包括结构域a、结构域b和结构域c。通过筛选得到m6A封闭的Dz，实现了m6A去甲基化酶的高效灵敏检测以及抑制剂小分子药物的筛选和检测。
Description
技术领域
本发明专利属于分子检测领域，尤其是指一种脱氧核酶分子探针及其应用。
背景技术
脱氧核酶(简称DNAzyme)是一类通过体外筛选得到的具有催化活性的DNA分子。与传统的蛋白酶和Ribozyme相比，DNAzyme由于其化学性质稳定，廉价，易于合成和修饰以及催化活性高等特点，近年来被广泛用于生物传感和临床诊断，尤其是用于细胞内的分析检测。在这些应用中，主要是对DNAzyme的活性进行调控，从而达到检测目标物的目的。而目前对于DNAzyme的活性调控主要有三种常见手段，一是通过控制DNAzyme的辅因子(金属离子)浓度，来调控其活性，而达到检测金属离子的目的；二是利用核酸或小分子来改变DNAzyme的催化活性中心结构，通过恢复DNAzyme的完整结构来激活其活性；三是在其作用的核酸底物或臂端修饰光敏基团，通过外源性的光调控去掉光敏基团，从而达到DNAzyme活性恢复的目的。而以上这些策略，通常设计复杂，通用性低，且属于间接性对DNAzyme进行活性调控。
肥胖相关蛋白(FTO蛋白)是一种N6-甲基腺嘌呤(m6A)去甲基化蛋白，越来越多的研究表明FTO在多种肿瘤细胞中过量表达，与肿瘤的形成、发展和转移密切相关，因此对于FTO的检测，尤其是细胞内的检测对肿瘤的早期诊断具有重大意义。而目前对于FTO蛋白的研究主要集中在其致病机理，其体外检测的工作极少。早期检测FTO主要包括凝胶电泳(PAGE)、质谱(MS)、高效液相色谱(HPLC)等方法，而这些检测手段普遍存在操作复杂，工作效率低等特点。而后发展的基于荧光的方法，仍然存在检测灵敏度低等缺点，不适合在细胞内复杂环境下的检测。
综上所述，现有技术中，一方面，目前利用大分子蛋白对DNAzyme活性进行直接调控的研究极少，因此，急需发展一种简便的，可以用细胞内蛋白质(尤其是与肿瘤密切相关的重要蛋白)对DNAzyme活性进行调控的新方法。另一方面，急需发展一种简便高效，适合在细胞内对FTO进行检测的探针。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，基于DNAzyme的高效催化活性和灵活调控特性，发展一种通过FTO蛋白调控DNAzyme活性的方法，达到体外和体内对FTO进行高效检测，同时该DNAzyme探针的成功构建也极大的促进了FTO蛋白小分子抑制剂的筛选，对小分子药物的临床研究具有重要意义。
在本发明的第一方面，本发明提供一种功能核酸活性调控的方法，包括将所述功能核酸或者所述功能核酸作用的底物的其中一个或多个碱基修饰，将所述功能核酸活性封闭。
优选地，将所述功能核酸的其中一个或多个碱基修饰，将功能核酸活性封闭之后，还包括将修饰基团脱除，活化所述功能核酸。
进一步地，所述修饰为m6A甲基化修饰。
进一步地，使用m6A去甲基化酶将所述修饰基团脱除。
进一步地，所述功能核酸为脱氧核酶或适配体，优选为脱氧核酶。
脱氧核酶分子探针，以下简称Dz。
在本发明的第二方面，本发明提供一种脱氧核酶分子探针(以下也简称Dz-Me)，所述脱氧核酶分子探针包括结构域a、结构域b和结构域c；所述结构域a的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述结构域b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述结构域c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述结构域c中第五位碱基A被m6A甲基化修饰。
本发明提供的一种脱氧核酶分子探针(以下也简称Dz-Me)包含结构域a、结构域b、结构域c三部分，结构域c为Dz-Me的催化活性中心，对其活性起着决定性作用，结构域a，结构域b为Dz-Me的两个臂。
在本发明的第三方面，本发明提供一种脱氧核酶分子探针(以下也简称ED5-Me)，所述脱氧核酶分子探针包括结构域e、结构域f和结构域g；所述结构域e的核苷酸序列如SEQID NO.8所示；所述结构域f的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述结构域g的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述结构域g中第五位碱基A被m6A甲基化修饰。
在本发明的第四方面，本发明提供一种试剂盒，包括本发明第二方面提供的脱氧核酶分子探针和底物S1，所述底物S1包括结构域a*和结构域b*，所述结构域a*和结构域b*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S1的5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域a*的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述结构域b*的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。
Dz的结构域a，结构域b分别与底物S1的结构域a*和结构域b*两部分杂交,其中TrAG代表剪切位点，rA代表腺嘌呤核糖核苷酸，其5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1，两个荧光团之间发生荧光共振能量转移，FAM荧光猝灭。a与a*互补杂交，b与b*互补杂交，Dz可以与底物S1杂交并将rA和G之间切开。首先在体外筛选一个合适的甲基化封闭的Dz，分别在Dz的催化中心和底物上进行m6A甲基化修饰，探究不同甲基化位点对Dz的活性影响，最终筛选得到一个甲基化修饰后，剪切活性被完全封闭的最优Dz(该Dz命名为Dz-Me)。在m6A去甲基化酶(FTO)作用下去掉甲基，Dz-Me恢复原本活性，剪切底物S1，a*与b*分离，即两个荧光团FAM和BHQ1相互分离，FAM的荧光恢复。同时一个去甲基化后被激活的Dz可以剪切多个底物，产生多个荧光信号。当没有去甲基化酶时，即使Dz-Me和底物S1通过两边的臂杂交在一起，两个荧光团的距离在10nm以内，同样可以发生荧光共振能量转移，FAM的荧光被BHQ1猝灭，没有荧光信号的输出。
在本发明的第五方面，本发明提供另一种试剂盒，包括本发明第三方面提供的所述的脱氧核酶分子探针和底物S3，所述底物S3包括结构域e*和结构域f*，所述结构域e*和结构域f*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S3的5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域e*的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述结构域f*的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在本发明的第六方面，本发明提供另一种试剂盒，包括本发明第二方面提供的脱氧核酶分子探针和底物S2，所述底物S2包括结构域a*、结构域b*、结构域d和结构域d*，所述结构域a*和结构域b*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S2的5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域a*的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述结构域b*的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述结构域d的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述结构域d*的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
底物S2，包含结构域a*，结构域b*，结构域d，结构域d*四个部分。S2的5’端茎部结构域d和环部结构域a*序列作为具有基因沉默作用的反义寡核苷酸(ASO)，可以与FTO蛋白mRNA杂交。结构域a*、结构域b*为底物S2发卡结构的环部，结构域d与结构域d*互补杂交形成底物S2的茎部，S2的5’端修饰荧光团FAM，3’端修饰猝灭团BHQ1。在FTO存在下，去掉Dz-Me上的甲基，使其恢复剪切活性，两边的臂结构域a，结构域b与底物S2的环部结构域a*，结构域b*杂交，将rA和G之间切开，从而释放反义核酸(ASO)，FAM与BHQ1分离，FAM的荧光恢复。一个被激活的Dz可以循环催化剪切底物S2释放多个反义核酸，产生荧光信号的同时，该反义核酸特异性地和FTO蛋白的mRNA杂交，抑制FTO蛋白的表达；在没有FTO存在时，反义核酸被封闭在底物S2的茎端，不能与mRNA杂交，因此设计了一个自激活的诊疗一体的基因调控新策略。
在本发明的第七方面，本发明提供一种上述的脱氧核酶分子探针在制备用于检测m6A去甲基化酶活性或筛选m6A去甲基化酶抑制剂药物的试剂盒或检测试剂中的应用。
在本发明的第八方面，本发明提供一种本发明提供的上述的试剂盒在检测m6A去甲基化酶活性中的应用。在本发明的技术方案中，本发明提供一种本发明第三方面所述的试剂盒同样可以在体外检测m6A去甲基化酶纯酶的活性。
基于m6A去甲基化酶激活的Dz-Me实现FTO的检测，所述应用包括：在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)中，将Dz-Me探针，底物S1和FTO蛋白混合，Dz-Me的浓度为50nM，底物S1的浓度为250nM，在室温下孵育2h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度，即得到m6A去甲基化酶活性。
提供一种基于m6A封闭的Dz-Me用于m6A去甲基化酶的检测试剂盒，包含Dz-Me和底物S1；当存在m6A去甲基化酶时，Dz-Me上的甲基被去掉，恢复剪切活性。结构域a，结构域b为Dz-Me的两个臂，作用是与底物S1杂交；底物S1包含结构域a*和结构域b*两部分,其中TrAG代表剪切位点，rA代表腺嘌呤核糖核苷酸，其5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1，两个荧光团之间发生荧光共振能量转移，FAM荧光猝灭。结构域a与结构域a*互补杂交，结构域b与结构域b*互补杂交，Dz与底物杂交并将rA和G之间切开。在m6A去甲基化酶的作用下去掉甲基，Dz-Me恢复原本活性，剪切底物S1，结构域a*与结构域b*分离，即两个荧光团FAM和BHQ1相互分离，FAM的荧光恢复。同时一个被激活的Dz可以剪切多个底物，产生多个荧光信号。当没有去甲基化酶时，即使Dz-Me和底物通过两边的臂杂交在一起，同样可以发生荧光共振能量转移，FAM的荧光被BHQ1猝灭，没有荧光信号的输出。因此荧光信号的输出与目标蛋白的浓度呈正相关。
在本发明的第九方面，本发明提供一种本发明提供的上述的试剂盒在筛选m6A去甲基化酶抑制剂药物中的应用。
基于m6A去甲基化酶激活的Dz实现FTO抑制剂的检测和筛选：包括：在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)中，将Dz-Me探针，底物S1，FTO蛋白和抑制剂混合，其中Dz-Me的浓度为50nM，底物S1的浓度为250nM，FTO蛋白的浓度为100nM，在室温下孵育2h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度，即得到m6A去甲基化酶抑制剂的抑制曲线。
在小分子抑制剂存在时，m6A去甲基化酶的活性受到抑制，不能激活Dz-Me剪切底物，因此荧光信号的输出与抑制剂的浓度呈负相关。
上述方法中，所述的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液浓度为50mM，pH为7.0，加入283μM(NH4)2Fe(SO4)2，300μMα-KG，2mM L-ascorbic acid，50μg/mL BSA和0.1mM ZnCl2。
在本发明的第十方面，本发明提供一种底物S2在制备抗肿瘤药物中的应用，所述底物S2包括结构域a*、结构域b*、结构域d和结构域d*，所述结构域a*和结构域b*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S2的5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域a*的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述结构域b*的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述结构域d的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述结构域d*的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
本发明的技术原理为：
蛋白酶FTO的检测方法包括两个组成单元：甲基化的Dz(Dz-Me)和底物S。我们研究发现在Dz的活性催化中心进行甲基化修饰可以完全封闭Dz的活性，在去甲基化酶的作用下去掉甲基，Dz恢复原本活性，剪切底物，如图1(1)所示，在FTO蛋白酶存在下，去掉Dz-Me上的甲基，使其恢复剪切活性，循环剪切底物S1，从而产生显著的信号扩增。该Dz-Me探针包含a、b、c三部分，c为Dz-Me的催化活性中心，在催化中心进行m6A修饰，a、b为Dz-Me的两个臂，作用是与底物S1杂交；底物S1包含a*和b*两部分，可以与Dz-Me杂交,其中TrAG代表剪切位点，rA代表腺嘌呤核糖核苷酸，其5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1，两个荧光团之间发生荧光共振能量转移，FAM荧光猝灭。Dz-Me可以与底物a*、b*杂交，在m6A去甲基化酶FTO作用下去掉甲基，恢复原本催化活性，并将rA和G之间切开，a*与b*分离，即两个荧光团FAM和BHQ1相互分离，FAM的荧光恢复，产生荧光信号。在没有m6A去甲基化酶时，即使Dz-Me和底物通过两边的臂杂交在一起，两个荧光团的距离在10nm以内，发生荧光共振能量转移，FAM的荧光被BHQ1猝灭，没有荧光信号的输出；在有目标物去m6A甲基化酶时，目标物可以激活Dz-Me产生大量具有催化活性的Dz，同时一个去甲基化后被激活的Dz能循环剪切多个底物S1，产生多个荧光信号。此时，底物上荧光团的荧光强度值与目标蛋白酶的浓度呈正相关，根据荧光团的荧光强度改变值判断目标蛋白酶的浓度。同时该探针也可以用于去甲基化酶抑制剂的筛选和检测。在抑制剂小分子的作用下，去甲基化酶的去甲基化能力被抑制，从而导致Dz-Me的活性恢复受阻，因此底物荧光团的荧光强度值与抑制剂的浓度呈负相关，根据荧光团的荧光强度改变值判断抑制剂的抑制效果。此外该方法也可以达到细胞内诊疗一体的目的，设计了底物发卡S2，该底物链包含a*、b*、d、d*四个部分。S2的5’端茎部d和环部a*序列作为具有基因沉默作用的反义寡核苷酸(ASO)，可以与FTO蛋白mRNA杂交。在FTO存在下，去掉Dz-Me上的甲基，使其恢复剪切活性，剪切底物S2，从而释放反义寡核苷酸(ASO)，同时FAM与BHQ1分离，FAM的荧光恢复，根据荧光强度值判断细胞内去甲基化酶的表达水平。一个被激活的Dz可以循环催化剪切底物S2释放多个反义寡核苷酸，产生多个荧光信号，同时该反义寡核苷酸特异性地和去甲基化蛋白的mRNA杂交，抑制该蛋白的表达，由此可以根据细胞内去甲基化酶的表达水平激活对应含量的Dz，从而释放定量的反义核酸，实现了细胞内自激活的诊疗一体的基因调控目的。其具体原理如图1(2)所示。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明所提供的本发明通过筛选得到m6A封闭的Dz，实现了m6A去甲基化酶的高效灵敏检测以及抑制剂小分子药物的筛选和检测。对比传统的质谱和高效液相色谱检测方法，该方法简单，稳定，灵敏度高，且可以用于细胞内m6A去甲基化酶的监测以及肿瘤细胞的基因调控。该方法设计简便，不需要更换Dz和底物S，针对不同的待检测蛋白(修饰蛋白或去修饰蛋白)，只需更换不同的修饰位点，该修饰位点既可以在Dz上也可以在底物S上，就可作为一种通用的方法高效检测去修饰蛋白和修饰蛋白。该探针也可以用于蛋白质的抑制剂检测，实现了小分子药物的快速、高效筛选。此外，该探针可以用于细胞内的蛋白酶检测和基因调控，降低了传统基因调控带来的毒副作用。该研究有利于实现小分子药物的高通量筛选和癌症的早期诊断，并进一步监测其发生发展过程。
附图说明
图1(1)为Dz-Me探针检测m6A去甲基化酶的示意图；图1(2)为Dz-Me监测细胞内m6A去甲基化酶和基因调控的示意图；
图2(A)为Dz-Me被m6A去甲基化酶激活剪切底物输出荧光信号的示意图；图2(B)为聚丙烯酰胺凝胶电泳实验m6A去甲基化酶激活的Dz(17E-Me+FTO实验组)和未处理的m6A封闭的Dz-Me(17E-Me对照组)剪切活性对比图；图2(C)为m6A去甲基化酶激活的Dz(17E-Me+FTO实验组)和未处理的m6A封闭的Dz-Me(17E-Me对照组)的反应动力学曲线对比图；
图3(A)为m6A去甲基化酶激活m6A封闭ED5-Me的示意图；图3(B)为聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中原始ED5(ED5对照组)、m6A去甲基化酶激活的ED5(ED5-Me+FTO实验组)和未处理的m6A封闭的ED5-Me(ED5-Me对照组)剪切活性对比图；图3(C)为原始ED5(ED5对照组)、m6A去甲基化酶激活的ED5(ED5-Me+FTO实验组)和未处理的m6A封闭的ED5-Me(ED5-Me对照组)的反应动力学曲线；
图4(A)为Dz-Me被m6A去甲基化酶激活的反应示意图，以FTO蛋白为例研究；图4(B)为不同体系(a：原始的Dz、b：m6A封闭失活的Dz-Me、c：m6A封闭的Dz-Me用FTO处理、d：m6A封闭的Dz-Me用失活的FTO处理、e：m6A封闭的变异Dz用FTO处理)的时间依赖性荧光强度变化图；插图：总结图4(B)中每组最终荧光强度的变化值；图4(C)为FTO激活m6A封闭的Dz-Me活性的凝胶电泳表征，其中，“+”和“-”分别表示存在和不存在相应组分；图4(D)为FTO去掉m6A封闭的Dz-Me上甲基的高效液相色谱表征；
图5(A)为FTO蛋白和ALKBH5蛋白激活m6A修饰Dz-Me的荧光信号比值，Dz-Me分别用100nM FTO和100nM ALKBH5蛋白处理；图5(B)为FTO蛋白和ALKBH5蛋白激活m6A修饰Dz-Me的凝胶电泳实验，Dz-Me探针分别用不同的FTO和ALKBH5蛋白进行处理，与底物S1反应，以剪切底物S1的量来判断Dz的活性；
图6(A)为m6A封闭的Dz-Me分析不同浓度(a:0nM，b：2nM，c：5nM，d：10nM，e：20nM，f：50nM，g：100nM，h：200nM)FTO蛋白的荧光动力学变化；图6(B)为m6A封闭的Dz-Me分析不同浓度FTO蛋白的荧光变化值。内插图：体系检测FTO蛋白的线性曲线；图6(C)m6A封闭的Dz-Me对于细胞中不同蛋白的响应性；图6(D)m6A封闭的Dz-Me对于细胞中不同小分子的响应性；
图7(A)为m6A封闭的Dz-Me检测不同FTO抑制剂(恩他卡朋、甲氯芬那酸、大黄酸、异烟酸)的抑制曲线；图7(B)为FTO小分子抑制剂的化学结构和根据(A)图的抑制曲线得出的IC50值；
图8(A)为Dz-Me和底物S1探针监测细胞内FTO蛋白的示意图；图8(B)为Dz-Me和底物S1探针分析活细胞内FTO的CLSM图：其中，a：单独的S1进入乳腺癌(MCF-7)细胞；b：m6A修饰的变异失活Dz(m-17E-Me)和底物S1进入MCF-7细胞；c：Dz-Me和底物S1进入MCF-7细胞；d：Dz-Me和底物S1进入siRNA敲低FTO蛋白后的MCF-7细胞；e：Dz-Me和底物S1进入质粒过表达FTO蛋白后的MCF-7细胞；f：Dz-Me和底物S1进入正常的乳腺细胞(MCF-10A)。比例尺为20μm；图8(C)为蛋白质印迹(Western blot)实验验证MCF-7细胞中FTO蛋白的下调(siRNA处理细胞)和上调(质粒处理细胞)，其中GAPDH作为内参蛋白，以及Dz-Me和底物S1分析不同FTO表达含量(FTO蛋白下调：用siFTO处理的为实验组，用siCtrl处理的为对照组；FTO蛋白上调：用pFTO质粒处理的为实验组，用pCtrl质粒处理的为对照组)的MCF-7细胞得到的流式荧光信号；(D)为将(B)图中细胞通过ImageJ软件分析获得的FAM荧光信号分布。
图9(A)为细胞内FTO蛋白激活Dz-Me探针引发基因调控的示意；图9(B)为Dz-Me和底物发卡S2探针分析MCF-7活细胞内FTO的CLSM图：其中，a：单独底物S2进入细胞；b：m6A修饰的变异Dz(m-17E-Me)和底物S2分进入细胞；c：Dz-Me和底物S2进入细胞。比例尺为20μm；图9(C)为Western blot实验分析三种肿瘤细胞(MCF-7，MDA-MB-231和HeLa细胞)中FTO激活Dz-Me/S2探针下调细胞中FTO蛋白含量和FTO不能激活m-17E-Me(m6A修饰的变异Dz)/S2、Dz-Me/m-S2(发卡S2突变)的FTO蛋白含量对比图；图9(D)为细胞增殖(MTT)实验分析三种肿瘤细胞中FTO激活Dz-Me/S2下调FTO蛋白抑制细胞生长和FTO不能激活m-17E-Me(m6A修饰的变异Dz)/S2、Dz-Me/m-S2(发卡S2突变)导致的细胞生长曲线对比图；图9(E)为活/死细胞染色实验分析三种肿瘤细胞中FTO激活Dz-Me/S2下调FTO蛋白促进细胞死亡和FTO不能激活m-17E-Me(m6A修饰的变异Dz)/S2、Dz-Me/m-S2(发卡S2突变)，导致的细胞死亡对比图。比例尺为200μm；图9(F)为细胞凋亡试剂盒流式实验分析三种肿瘤细胞中FTO激活Dz-Me/S2下调FTO蛋白促进细胞凋亡和FTO不能激活m-17E-Me(m6A修饰的变异Dz)/S2、Dz-Me/m-S2(发卡S2突变)，导致的细胞凋亡数量对比图。
具体实施方式
下面将结合实施例和对比例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例和对比例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
实施例1：DNA探针、底物S1、底物S2、底物S3的设计与制备
DNA探针、底物S1、底物S2、底物S3的设计与制备：运用NUPACK软件设计相关DNA探针与底物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司和宝日医生物技术公司合成相关核酸序列。序列如表1所示，所有DNA探针干粉先用无酶水溶解，然后用紫外分光光度计测其吸光度，计算出准确浓度。反应均在HEPES缓冲液(浓度为50mM，pH 7.0，含283μM(NH4)2Fe(SO4)2，300μMα-KG，2mM L-ascorbic acid，50μg/mL BSA和0.1mM ZnCl2)中进行。
图1(1)为m6A去甲基化酶激活m6A封闭的Dz-Me的原理图。
表1.体系所用DNA探针和底物
实施例2：
在HEPES缓冲液中首先将FTO蛋白和Dz-Me(100nM)混合并在25℃下孵育2h，然后将该混合物和底物S1(1μM)混合并在不同的反应时间加入EDTA终止剪切(17E-Me+FTO实验组)，作为对比地，将Dz-Me(100nM)在25℃下孵育2h，然后和底物S1(1μM)混合并在不同的反应时间加入EDTA终止剪切(17E-Me对照组)，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳实验对封闭和激活(17E-Me对照组和17E-Me+FTO实验组)的Dz剪切活性进行分析，结果如图2所示。图2(B)为聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中m6A去甲基化酶(FTO蛋白)激活的Dz-Me(17E-Me+FTO实验组)和未处理的Dz-Me(17E-Me对照组)剪切活性对比图；图2(C)m6A去甲基化酶(FTO蛋白)激活的Dz-Me和未处理的Dz-Me的反应动力学对比曲线。由图2(B)和图2(C)可见，m6A修饰的Dz-Me剪切活性完全被封闭，FTO去甲基化处理的Dz-Me恢复了高效的剪切活性。图2(A)为m6A去甲基化酶激活的Dz-Me剪切底物输出荧光信号的示意图。
实施例3
在HEPES缓冲液中首先将FTO蛋白和ED5-Me(100nM)混合并在25℃下孵育2h，然后将该混合物和底物S3(1μM)混合并在不同的反应时间加入EDTA终止剪切(ED5-Me+FTO实验组)，作为对比地，将ED5-Me(100nM)在25℃下孵育2h，然后和底物S3(1μM)混合并在不同的反应时间加入EDTA终止剪切(ED5-Me对照组)，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳实验对封闭和激活(ED5-Me对照组和ED5-Me+FTO实验组)的Dz剪切活性进行分析，结果如图3所示。同样，m6A修饰的ED5-Me活性也被完全抑制(见图3)。图3(B)为聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中m6A去甲基化酶(FTO蛋白)激活的ED5-Me(ED5-Me+FTO实验组)和未处理的ED5-Me(ED5-Me对照组)剪切活性对比图；图3(C)为m6A去甲基化酶(FTO蛋白)激活的ED5-Me和未处理的ED5-Me的反应动力学对比曲线。由图3(B)和图3(C)可见，m6A修饰的ED5-Me剪切活性完全被封闭，FTO去甲基化处理的ED5-Me恢复了高效的剪切活性。图3(A)为m6A去甲基化酶激活的ED5-Me剪切底物输出荧光信号的示意图。
实施例4
在HEPES缓冲液中分别平行地将原始的Dz(a)、m6A封闭失活的Dz-Me(b)、m6A封闭的Dz-Me用FTO处理(c)、m6A封闭的Dz-Me用失活的FTO处理(d)、m6A封闭的变异Dz用FTO处理(e)在25℃下孵育2h，然后分别将上述5组物质和底物S1(1μM)混合并分别在不同的反应时间体系检测荧光信号的强度值。采用荧光光谱仪进行分析，结果如图4(B)所示。由图可知，原始的Dz(曲线a)与底物S1反应产生明显的荧光信号，而m6A封闭的Dz-Me(曲线b)与底物S1反应产生的荧光信号与背景信号一致，说明m6A修饰可以完全封闭原本的Dz活性。此外将FTO蛋白失活处理(曲线c)或者用变异失活(改变催化中心两个碱基)的Dz(m-Dz)(曲线d)取代原始m6A修饰的Dz，都不能产生明显的荧光信号；只有当同时存在原始的m6A修饰的Dz-Me和FTO蛋白时，才能产生明显的荧光信号。
同样地，实验证明(见图5)，该Dz-Me也能被另一种m6A去甲基化酶ALKBH5蛋白激活，这些结果说明m6A去甲基化酶可以高效激活被封闭的Dz-Me活性。
采用凝胶电泳对m6A去甲基化酶激活的Dz-Me剪切活性进行表征，配制反应液：在HEPES缓冲液中Dz-Me浓度为100nM，FTO浓度为100nM，底物S1浓度为1μM，混合液在室温下反应2h。将反应液与loading buffer混匀后加入15％丙烯酰胺凝胶中，电泳仪电压设置为100V，2h后取出凝胶，最后通过化学发光成像系统使FAM标记的底物DNA显现。FTO激活m6A封闭的Dz-Me活性剪切底物的凝胶电泳结果如图4(C)所示。“+”和“-”分别表示存在和不存在相应组分。由图可知，在m6A去甲基化酶作用下，激活被封闭的Dz，剪切底物S1，产生底物碎片。这个结果与荧光实验结果是一致的。
采用高效液相色谱对m6A去甲基化酶去除Dz-Me上的甲基进行表征，配制反应液：在30μL HEPES缓冲液中Dz-Me浓度为1μM，FTO浓度为100nM或者200nM，混合液在室温下反应3h。用核酸酶(180U)，磷酸二酯酶(0.004U)和碱性磷酸酶(30U)将寡核酸链降解为单个核苷酸，将最终得到的产物用高效液相色谱进行分析。结果如图4(D)所示，由图可知，m6A去甲基化酶可以完全去掉Dz-Me上修饰的m6A甲基，得到A碱基。
以上实施例2～4的实验结果证明了m6A去甲基化酶激活m6A封闭Dz-Me系统的成功构建。同时也表明该修饰封闭的Dz可以用于多种目标蛋白的检测，以及可以对多种功能核酸进行活性调控。
实施例5
基于m6A封闭的Dz-Me对m6A去甲基化酶的体外检测。
在HEPES缓冲液中，将Dz-Me(50nM)，底物S1(250nM)与不同浓度的FTO蛋白(0，2，5，10，20，50，100，200nM)混合，在室温下孵育2h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度(激发电压650V，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，激发波长490nm，波长扫描范围505-650nm)。
图6(A)为m6A封闭的Dz-Me分析不同浓度(a：0nM，b：2nM，c：5nM，d：10nM，e：20nM，f：50nM，g：100nM，h：200nM)FTO蛋白的荧光动力学变化。图6(B)为m6A封闭的Dz-Me分析不同浓度FTO蛋白的荧光变化值。内插图：体系检测FTO蛋白的线性曲线；图6(C)为m6A封闭的Dz-Me对于细胞中不同蛋白(牛血清白蛋白BSA，多聚核苷酸激酶PNK，牛肠粘膜碱性磷酸酶ALP，凝血酶Thrombin，尿嘧啶DNA糖基酶UDG)的响应性；图6(D)为m6A封闭的Dz-Me探针对于细胞中不同小分子(还原型谷胱甘肽GSH，过氧化氢H2O2，三磷酸腺苷ATP，葡萄糖Glucose)的响应性。
由图6(A)可见，当体系中没有加入目标FTO时，该体系荧光只发生微小的变化(曲线a)，当加入不同浓度的目标FTO时，荧光强度改变值与FTO的浓度呈正相关，据此可对FTO蛋白进行检测。由图6(B)可见，随着目标FTO蛋白浓度的增加，体系的荧光强度(λ＝520nm)逐渐上升，该荧光强度的改变值与目标蛋白浓度在0-20nM范围内呈良好的线性关系，检出限为0.5nM，实现了对目标m6A去甲基化酶的快速和高灵敏检测。
为了论证本方法在细胞内对目标FTO检测的选择性，我们对细胞内几种蛋白和小分子进行考察。由图6(C)和图6(D)可见，只有与FTO作用时，体系才会产生明显的荧光信号，细胞内几种常见的蛋白和小分子引起的荧光变化非常小，以上结果表明，本发明方法在细胞内对目标检测有良好的选择性。
实施例6
基于m6A封闭的Dz-Me对m6A去甲基化酶抑制剂的检测和筛选。
在HEPES缓冲液中，将Dz-Me(50nM)，底物S1(250nM)，FTO蛋白(100nM)与不同浓度的小分子抑制剂(2，5，10，20，50，100，200μM)混合，在室温下孵育2h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度(激发电压650V，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，激发波长490nm，波长扫描范围505-650nm)。
小分子抑制剂存在时，抑制了m6A去甲基化酶的去甲基化能力，Dz-Me不能被激活，从而底物S1不能被剪切，荧光信号低。荧光强度值与抑制剂的浓度呈负相关，根据荧光信号的强弱得到抑制剂的抑制曲线。我们选取了几种常用的m6A去甲基化酶抑制剂(恩他卡朋，甲氯芬那酸和大黄酸)和非抑制剂(异烟酸)来探究该Dz-Me探针对抑制剂的检测能力。实验结果如图7所示，由图7(A)可见，随着抑制剂浓度的增加，FTO去甲基化能力降低，得到的三种抑制剂的IC50分别为29.1μM(恩他卡朋)，32.1μM(甲氯芬那酸)，47.2μM(大黄酸)，与文献报道的基本一致。以上结果表明Dz-Me可以高效的检测和筛选抑制剂，为小分子药物的筛选提供了一种简便、快速的分析工具。
实施例7
基于m6A封闭的Dz-Me对细胞内m6A去甲基化酶的监测。
在37℃、5％CO2的环境下，人乳腺癌细胞(MDA-MB-231，MCF-7)和宫颈癌细胞(HeLa)均在含有10％胎牛血清的DMEM中培养，人正常乳腺细胞(MCF-10A)在专用的完全培养基中培养。将细胞种到20mm的玻璃底共聚焦皿中生长12h，然后进行核酸探针的转染。详细步骤如下，将Dz-Me(0.025nmol)和底物S1(0.1nmol)的混合物分散于200μL Opti-MEM培养基中，并将4μL Lipo 3000分散于另一份200μL Opti-MEM培养基中，再将这两种混合物混匀并在室温下孵育10min。然后将最终混合液滴至种有细胞的共聚焦皿中，并在37℃下孵育3h。随后用PBS将细胞洗三次并用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)对其进行拍摄。对于siRNA处理下调细胞FTO蛋白的实验，先将siRNA(终浓度为100nM)转染至MCF-7细胞并孵育48h，然后再转染上述Dz-Me/S1探针并孵育3h后通过共聚焦显微镜对细胞进行成像；对于质粒处理上调细胞FTO蛋白的实验，先将质粒转染至MCF-7细胞并孵育48h，然后再转染上述Dz-Me/S1探针并孵育3h后通过共聚焦显微镜对细胞进行成像。
由图8(B)可见，转染Dz-Me/S1探针的MCF-7细胞中观察到明显的荧光信号(样品c)，而转染单独S1或者m-Dz-Me(m6A修饰的变异Dz)/S1探针的MCF-7细胞中几乎没有荧光信号(样品a和b)，且在正常的乳腺细胞(MCF-10A)中观察到较弱的荧光信号(样品f)，表明Dz-Me探针进细胞之后可以被肿瘤细胞中高表达的FTO蛋白激活，剪切底物S1产生荧光信号，且从该核酸探针进胞之后产生的荧光强度可知，肿瘤细胞中FTO蛋白的表达水平高于正常细胞，这与以前的报道结果一致。这些结果表明该Dz-Me成像系统可以根据荧光信号的强弱判断FTO蛋白的表达差异从而区分正常细胞和肿瘤细胞。此外，预先用siRNA下调FTO蛋白的MCF-7细胞中出现了明显降低的荧光信号(样品d，对比于样品c)，预先用质粒上调FTO蛋白的MCF-7细胞中出现了明显增强的荧光信号(样品e，对比于样品c)，这表明FTO蛋白确实存在于MCF-7细胞中并激活Dz-Me探针，表明该Dz-Me成像体系还可以监测细胞中不同的FTO水平，揭示了我们提出的m6A封闭的Dz-Me探针对于细胞中FTO蛋白检测的准确性和灵敏性。我们利用ImageJ收集图8(B)细胞图像中每个像素的荧光信号，得到的相应荧光信号分布散点图(图8(D))进一步证明了该Dz-Me探针具有强大的细胞内生物成像效果。同时，如图8(C)所示，我们用流式细胞实验收集10，000个细胞，分析不同FTO表达含量的MCF-7细胞荧光强度，用siRNA下调FTO蛋白的细胞中荧光明显减低，而用质粒pFTO上调FTO蛋白的细胞中荧光明显升高，该结果与图8(B)荧光成像的结果一致。以上结果表明，该Dz-Me探针成功实现了不同活细胞内FTO蛋白的原位检测。
实施例8
基于m6A封闭的Dz-Me对细胞内m6A去甲基化酶的监测和基因调控。
将细胞种到20mm的玻璃底共聚焦皿或孔板中生长12h，然后进行Dz-Me和底物S2探针的转染。详细步骤如下，将Dz-Me(0.025nmol)和底物S2(0.1nmol)的混合物分散于200μLOpti-MEM培养基中，并将4μL Lipo 3000分散于另一份200μL Opti-MEM培养基中，再将这两种混合物混匀并在室温下孵育10min。然后将最终得到的混合液滴至种有细胞的共聚焦皿中，并在37℃下孵育3h。随后用PBS将细胞洗三次并用激光共聚焦扫描显微镜对其进行拍摄。从图9(B)中可以看出只有Dz-Me/S2探针转染的细胞才能产生明显的荧光信号(样品c)，单独的S2底物(样品a)以及m6A修饰的变异Dz(m-17E-Me)/底物S2(样品b)进入细胞均不能产生荧光信号，证明新设计的发卡底物S2同底物S1一样可以用于肿瘤细胞中FTO蛋白的监测。同时为了验证Dz-Me被细胞中FTO激活后剪切底物S2释放反义核酸，敲低细胞中的FTO蛋白。我们将细胞种在12孔板中，转染Dz-Me和底物S2，36h后收集细胞用RIPA裂解液得到细胞中的蛋白，用western blot实验显示细胞中FTO蛋白的含量。图9(C)中显示，Dz-Me和底物S2转染的细胞FTO蛋白表达降低，而m-17E-Me(m6A修饰的变异Dz)/S2以及Dz-Me/m-S2(发卡S2突变)转染的细胞，均对细胞中的FTO蛋白没有影响。最后为了验证FTO蛋白激活Dz-Me使细胞中FTO蛋白下调之后，会抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞死亡，如图9(D)-9(F)所示，我们用MTT实验，活死细胞染色以及流式凋亡实验可以看到，Dz-Me和底物S2转染的细胞明显生长更慢(图9(D)中蓝色生长曲线)且细胞出现明显的死亡/凋亡(图9(E)和图9(F))；而m-17E-Me(m6A修饰的变异Dz)/S2以及Dz-Me/m-S2(发卡S2突变)处理的细胞作为对照组，均对细胞的生长和凋亡没有影响，证明了肿瘤细胞中高表达的FTO蛋白可以激活Dz-Me使细胞内FTO蛋白水平的下调，从而改变了肿瘤细胞的生长状态，抑制了肿瘤细胞的生长和促进细胞凋亡。因此我们构建了一个智能的由成像指导的肿瘤细胞治疗新方法，与直接输送的基因药物相比较，该按需给药的方法提高了基因治疗的准确性和有效性，降低了传统基因疗法的毒副作用。
该m6A封闭的Dz系统作为一个通用、简便、可靠的传感策略，可以用于多种核酸(去)修饰蛋白的高效检测，同时可以扩展到对多种功能核酸的活性调控上，在小分子药物筛选、临床诊断和预后方面具有广阔的应用前景。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例和对比例，可以理解的是，上述实施例和对比例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种脱氧核酶分子探针及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atctctcc 8
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atagtggcca 10
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccgagccgg tcgaa 15
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggccactat 10
<210> 5
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggagagat 9
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggagagatg tgttaa 16
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aacacatctc tccc 14
<210> 8
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgcggcca 9
<210> 9
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctggacga 9
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggctagctac aacga 15
<210> 11
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcgtccagg 9
<210> 12
<211> 9
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
uggccgcgg 9
Claims (10)
1.一种功能核酸活性调控的方法，其特征在于，包括将所述功能核酸或者所述功能核酸作用的底物的其中一个或多个碱基修饰，将所述功能核酸活性封闭，优选地，将所述功能核酸的其中一个或多个碱基修饰，将所述功能核酸活性封闭之后，还包括将修饰基团脱除，活化所述功能核酸。
2.一种脱氧核酶分子探针，其特征在于，所述脱氧核酶分子探针包括结构域a、结构域b和结构域c；所述结构域a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述结构域b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述结构域c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述结构域c中第五位碱基A被m6A甲基化修饰。
3.一种脱氧核酶分子探针，其特征在于，所述脱氧核酶分子探针包括结构域e、结构域f和结构域g；所述结构域e的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述结构域f的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述结构域g的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述结构域g中第五位碱基A被m6A甲基化修饰。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的脱氧核酶分子探针和底物S1，所述底物S1包括结构域a*和结构域b*，所述结构域a*和结构域b*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S1的5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域a*的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述结构域b*的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的脱氧核酶分子探针和底物S3，所述底物S3包括结构域e*和结构域f*，所述结构域e*和结构域f*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S3的5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域e*的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述结构域f*的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的脱氧核酶分子探针和底物S2，所述底物S2包括结构域a*、结构域b*、结构域d和结构域d*，所述结构域a*和结构域b*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S2的5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域a*的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述结构域b*的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述结构域d的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述结构域d*的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
7.一种权利要求2或3所述的脱氧核酶分子探针在制备用于检测m6A去甲基化酶活性或筛选m6A去甲基化酶抑制剂药物的试剂盒或检测试剂中的应用。
8.一种权利要求4～6任一项所述的试剂盒在检测m6A去甲基化酶活性中的应用。
9.一种权利要求4～6任一项所述的试剂盒在筛选m6A去甲基化酶抑制剂药物中的应用。
10.一种底物S2在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述底物S2包括结构域a*、结构域b*、结构域d和结构域d*，所述结构域a*和结构域b*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S2的5’端标记有荧光团FAM，3’端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域a*的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述结构域b*的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述结构域d的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述结构域d*的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115505594A (zh) * | 2022-10-26 | 2022-12-23 | 北京理工大学 | 一种基于核酸适配体的近红外荧光探针及其在制备去甲基化酶检测药物中的应用 |
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2021
- 2021-04-06 CN CN202110366516.8A patent/CN115181743A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115505594A (zh) * | 2022-10-26 | 2022-12-23 | 北京理工大学 | 一种基于核酸适配体的近红外荧光探针及其在制备去甲基化酶检测药物中的应用 |
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