CN110031529B - 一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫器,特点是以单壁碳纳米管(SWCNTs)为导电载体负载pNiCo2O4 NSs制得到双功能催化剂pNiCo2O4 NSs/SWCNTs,其具有优异的析氧反应(OER)催化性能,增加溶液中氧气的浓度,从而提高luminol的发光强度。而且pNiCo2O4 NSs/SWCNTs具有优异的光热性能,能够有效地将808 nm激光转化为热,提高电极表面温度,进而在电极表面形成温度梯度层,加快电活性物质向电极表面的扩散速度,进一步增强luminol的发光信号。本发明具有灵敏度高、线性范围宽、特异性强等优点,可用于甲状腺球蛋白(Tg)的检测,在临床应用方面具有较为重要的价值和实际意义。
Description
技术领域
本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域,具体涉及一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫器的制备方法和应用。
背景技术
甲状腺癌是较为多见的内分泌系统性来源恶性肿瘤,流行病学研究显示,甲状腺癌的发病率可达345/10万人左右。由于甲状腺癌发病隐匿,现阶段临床上缺乏有效的早期诊断方式,超声、CT等影像学检查虽然可以提高甲状腺癌的早期筛查水平,但其诊断的灵敏度或者特异度仍然具有一定的局限性。甲状腺球蛋白(thyroglobulin, Tg)是甲状腺滤泡上皮病变过程中显著释放的糖链蛋白,其表达浓度的上升可以促进滤泡上皮的异常增殖和分化,增加甲状腺癌细胞的转移风险,可作为甲状腺癌临床诊断的一个重要的标志物。因此,发展一种灵敏、快速、简便和低成本的Tg检测方法具有重要的意义。
电致化学发光免疫传感器,利用抗原与抗体之间的特异性结合的一类生物传感器,具有灵敏度高、选择性好、操作简便、可连续快速、自动化检测分析等优点,广泛地应用于临床诊断、药物分析和环境监测等领域。本发明制备了一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫器,实现了对甲状腺球蛋白(Tg)的高灵敏检测。析氧反应(OER)是通过电催化将H2O分解氧化生成O2的过程。大量研究表明过渡金属氧化物如Co2O4,NiO,NiCo2O4等对OER具有一定的催化作用。其中,由于氧化还原对Co3+/Co2+ 和Ni3+/Ni2+的贡献,与单一的钴氧化物或镍氧化物相比,多孔NiCo2O4纳米片(pNiCo2O4 NSs)具有更快的氧化还原电子转移速率和更高效的电催化活性。然而,pNiCo2O4 NSs仍面临导电性差、活性位点有限这两大挑战。为了克服上述困难,寻找一种具有优异导电性的基质负载pNiCo2O4 NSs是最有效、最简单的方法。单壁碳纳米管(SWCNTs)比表面积大、导电性好、化学性质稳定,且对催化颗粒具有很强的附着能力,可作为一个理想的导电载体来负载pNiCo2O4NSs,所形成pNiCo2O4 NSs/SWCNTs复合物具有更高效的OER催化性能,从而增加溶液中O2的浓度,提高luminol发光强度。而且,pNiCo2O4 NSs/SWCNTs具有优异的光热性能,能够有效地将808 nm激光转化为热,提高电极表面温度,进而在电极表面形成温度梯度层,加快电活性物质向电极表面的扩散速度,进一步增强luminol的发光信号。基于上述放大策略,所制得的电化学免疫传感器具有灵敏度高、线性范围宽、检测线低、特异性强、特异性好等优点。
发明内容
本发明的目的之一是基于光热和多孔NiCo2O4纳米片,构建一种无标记、灵敏度高、稳定性好的电致化学发光免疫传感器。
本发明的目的之二是将该电致化学发光免疫传感器应用于甲状腺球蛋白(Tg)的高灵敏检测。
为实现发明目的,本发明采用如下技术方案:
1. 一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)玻碳电极(GCE)首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光,用二次水洗去表面残留粉末,再移入超声水浴中清洗,直至清洗干净,最后依次用乙醇,稀酸和水彻底洗涤;
(2)滴加3 uL 浓度为 4 mg/mL的氨基功能化的pNiCo2O4 NSs/SWCNTs 悬浮液于干净的玻碳电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得pNiCo2O4 NSs/SWCNTs修饰电极;
(3)滴加3 uL 1 wt.% 戊二醛于步骤(2)所制得的电极界面,室温下反应40 min;
(4)滴加3 uL 浓度为50 ng/mL 的甲状腺球蛋白抗体(Ab)于步骤(3)修饰电极表面,室温下孵育40 min,用去离子水洗去物理吸附,制得Ab/pNiCo2O4 NSs/SWCNTs修饰电极;
(5)滴加 3 uL 1.0 wt.%的BSA溶液到步骤(4)修饰电极界面,室温下孵育40 min,以封闭电极表面上非特异性活性位点,用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中备用;
(6)将步骤(5)所获得的修饰电极浸入到不同浓度的甲状腺球蛋白 (Tg)标准溶液中并在室温下反应50 min,用去离子水冲洗电极表面,制得Tg/Ab/pNiCo2O4 NSs/SWCNTs修饰电极,并保存在4°C冰箱中备用。
2. 上述的氨基功能化的pNiCo2O4 NSs/SWCNTs 悬浮液由下述方法制备的:200 μL浓度为 4 mg/mL的 pNiCo2O4 NSs 与 200 μL浓度为 5 mg/mL 的单壁碳纳米管(SWCNTs)超声混合均匀,室温下搅拌12 h,得到pNiCo2O4 NSs/SWCNTs悬浮液;接着,向该溶液中加入100μL 浓度为 10 mM 的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),室温下振荡 6 h,离心、洗涤,得到氨基功能化的pNiCo2O4 NSs/SWCNTs 悬浮液并保存在4°C冰箱中备用。
3. 上述的pNiCo2O4 NSs材料由下述方法制备的:用100 mL乙醇和200 mL去离子水配制浓度为10 mM 的Co(NO3)2·6H2O溶液、5 mM Ni(NO3)2·6H2O溶液和22.5 mM六亚甲基四胺的混合溶液,接着将该混合液转入500 mL聚四氟乙烯反应釜内衬中,150 °C下磁力搅拌12 h,冷却至室温,离心,洗涤,在烘箱中60 °C干燥一夜,最后,在空气中350 °C下煅烧2 h得到最终产物pNiCo2O4 NSs。
4. 甲状腺球蛋白 (Tg)的检测步骤:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以上述制得的一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫器为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为辅助电极,在0.1 mol/mL pH 9.0的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)采用电位范围0 ~ -1 V,扫描速率0.1 V/s电位窗口,电致化学发光设备光电倍增管800 V对不同浓度的甲状腺球蛋白(Tg)标准溶液进行检测,通过电致化学发光设备采集-0.5 V的ECL信号强度,通过ECL信号强度与甲状腺球蛋白(Tg)标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
(3)待测样品溶液代替甲状腺球蛋白(Tg)标准溶液进行检测,检测的结果可通过工作曲线查得。
本发明的显著优点为:
(1)由于Co3+/Co2+ 和Ni3+/Ni2+氧化还原对的贡献和具有高导电性和大比表面积的SWCNTs的支撑,形成的pNiCo2O4 NSs/SWCNTs复合物对析氧反应表现出优异的催化性能,显著增强luminol的发光信号。
(2)pNiCo2O4 NSs/SWCNTs复合物具有优异的光热性能,能够有效地将808 nm激光转化为热,提高电极表面温度,进而在电极表面形成温度梯度层,加快电活性物质向电极表面的扩散速度,进一步增强luminol的发光信号,提高检测灵敏度。
(3)本发明利用抗原、抗体的免疫反应,提高了检测方法的特异性。
附图说明
图1为本发明的pNiCo2O4 NSs电镜图,图中的a, b, c 分别为pNiCo2O4 NSs 的扫描电镜 (SEM)、透射电镜 (TEM) 和高分辨率透射电镜 (HRTEM)。
图2为免疫传感电极的电致化学发光响应信号与甲状腺球蛋白(Tg)标准溶液浓度的线性关系图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明,但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
1. 一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)玻碳电极(GCE)首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光,用二次水洗去表面残留粉末,再移入超声水浴中清洗,直至清洗干净,最后依次用乙醇,稀酸和水彻底洗涤;
(2)滴加3 uL 浓度为 4 mg/mL的氨基功能化的pNiCo2O4 NSs/SWCNTs 悬浮液于干净的玻碳电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得pNiCo2O4 NSs/SWCNTs修饰电极;
(3)滴加3 uL 1 wt.% 戊二醛于步骤(2)所制得的电极界面,室温下反应40 min;
(4)滴加3 uL 浓度为50 ng/mL 的甲状腺球蛋白抗体(Ab)于步骤(3)修饰电极表面,室温下孵育40 min,用去离子水洗去物理吸附,制得Ab/pNiCo2O4 NSs/SWCNTs修饰电极;
(5)滴加 3 uL 1.0 wt.%的BSA溶液到步骤(4)修饰电极界面,室温下孵育40 min,以封闭电极表面上非特异性活性位点,用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中备用;
(6)将步骤(5)所获得的修饰电极浸入到不同浓度的甲状腺球蛋白(Tg)标准溶液中并在室温下反应50 min,用去离子水冲洗电极表面,制得Tg/Ab/pNiCo2O4 NSs/SWCNTs修饰电极,并保存在4°C冰箱中备用。
实施例2
上述实施例1的 pNiCo2O4 NSs材料的制备:用100 mL乙醇和200 mL去离子水配制成含有10 mM 的Co(NO3)2·6H2O、5 mM Ni(NO3)2·6H2O和22.5 mM六亚甲基四胺的混合溶液,接着将该混合液转入500 mL聚四氟乙烯反应釜内衬中,150 °C下磁力搅拌12 h,冷却至室温,离心,洗涤,在烘箱中60 °C干燥一夜,最后,在空气中350 °C下煅烧2 h得到最终产物pNiCo2O4 NSs,其扫描电镜(SEM)、透射电镜 (TEM) 和高分辨率透射电镜 (HRTEM)见图1。
实施例3
上述实施例1的氨基功能化的NiCo2O4/SWCNTs悬浮液由下述方法制备的:200 μL浓度为 4 mg/mL实施例2制备的的 pNiCo2O4 NSs溶液与 200 μL浓度为 5 mg/mL 的单壁碳纳米管(SWCNTs,购买自阿法埃莎(天津)化学有限公司)溶液超声混合均匀,室温下搅拌12h,得到pNiCo2O4 NSs/SWCNTs悬浮液;接着,向该溶液中加入100 μL 浓度为 10 mM 的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),室温下振荡 6 h,离心、洗涤,得到氨基功能化的pNiCo2O4 NSs/SWCNTs 悬浮液并保存在4°C冰箱中备用。
实施例4
甲状腺球蛋白 (Tg)的检测步骤:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以实施例1制得的一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫器为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为辅助电极,在0.1 mol/mL pH 9.0的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)采用电位范围0 ~ -1 V,扫描速率0.1 V/s电位窗口,电致化学发光设备光电倍增管800 V对不同浓度的甲状腺球蛋白(Tg)标准溶液进行检测,通过电致化学发光设备采集-0.5 V的ECL信号强度,通过ECL信号强度与甲状腺球蛋白(Tg)标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线,见图2;
(3)待测样品溶液代替甲状腺球蛋白(Tg)标准溶液进行检测,检测的结果可通过工作曲线查得。
Claims (4)
1.一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)玻碳电极GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光,用二次水洗去表面残留粉末,再移入超声水浴中清洗,直至清洗干净,最后依次用乙醇,稀酸和水彻底洗涤;
(2)滴加3 uL 浓度为 4 mg/mL的氨基功能化的pNiCo2O4 NSs/SWCNTs 悬浮液于干净的玻碳电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得pNiCo2O4 NSs /SWCNTs修饰电极;
(3)滴加3 uL 1 wt.% 戊二醛于步骤(2)所制得的电极表面,室温下反应40 min;
(4)滴加3 uL 浓度为50 ng/mL 的甲状腺球蛋白抗体Ab于步骤(3)修饰电极表面,室温下孵育40 min,用去离子水洗去物理吸附,制得Ab/pNiCo2O4 NSs/SWCNTs修饰电极;
(5)滴加 3 uL 1.0 wt.%的BSA溶液到步骤(4)修饰电极表面,室温下孵育40 min,以封闭电极表面上非特异性活性位点,用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中备用;
(6)将步骤(5)所获得的修饰电极浸入到不同浓度的甲状腺球蛋白Tg标准溶液中并在室温下反应50 min,用去离子水冲洗电极表面,制得Tg/Ab/pNiCo2O4 NSs/SWCNTs修饰电极,并保存在4°C冰箱中备用;其中NiCo2O4纳米片表示为pNiCo2O4 NSs。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的氨基功能化的pNiCo2O4 NSs/SWCNTs 悬浮液由下述方法制备的:1)pNiCo2O4 NSs材料由下述方法制备的:用100 mL乙醇和200 mL去离子水配制成含有10 mM的Co(NO3)2·6H2O、5 mM Ni(NO3)2·6H2O和22.5 mM六亚甲基四胺的混合溶液,接着将该混合液转入500 mL聚四氟乙烯反应釜内衬中,150 °C下磁力搅拌12 h,冷却至室温,离心,洗涤,在烘箱中60 °C干燥一夜,最后,在空气中350 °C下煅烧2 h得到最终产物pNiCo2O4 NSs;2)200 μL 浓度为 4 mg/mL的 pNiCo2O4 NSs溶液与200 μL浓度为 5 mg/mL 的单壁碳纳米管SWCNTs溶液超声混合均匀,室温下搅拌12 h,得到pNiCo2O4 NSs/SWCNTs悬浮液;接着,向该溶液中加入100 μL 浓度为 10 mM 的3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES,室温下振荡 6 h,离心、洗涤,得到氨基功能化的pNiCo2O4 NSs/SWCNTs悬浮液并保存在4°C冰箱中备用。
3.权利要求1-2任一所述的制备方法制备的一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫传感器。
4.权利要求3所述的一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫传感器,其特征在于,用于甲状腺球蛋白Tg检测,检测步骤如下:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以权利要求3所述的一种基于NiCo2O4纳米片的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫传感器为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为辅助电极,在0.1 mol/L pH 9.0的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)采用电位范围0 ~ -1 V,扫描速率0.1 V/s电位窗口,电致化学发光设备光电倍增管800 V对不同浓度的甲状腺球蛋白Tg标准溶液进行检测,通过电致化学发光设备采集 -0.5 V的ECL信号强度,通过ECL信号强度与甲状腺球蛋白Tg标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
(3)待测样品溶液代替甲状腺球蛋白Tg标准溶液进行检测,检测的结果可通过工作曲线查得。
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