CN104165884B - 一种人类8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶活性的比色分析方法 - Google Patents
一种人类8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶活性的比色分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104165884B CN104165884B CN201410203778.2A CN201410203778A CN104165884B CN 104165884 B CN104165884 B CN 104165884B CN 201410203778 A CN201410203778 A CN 201410203778A CN 104165884 B CN104165884 B CN 104165884B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna sequence
- temperature
- hogg1
- dna
- react
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物领域，涉及一种人类8‑氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法。向0.1～5.0μM的S1中加入0.1～5.0μM的S2，85～100℃反应0.5～2min，10～30℃反应1～5min，交替反应8～15次，再加入hOGG1、BSA和NaBH3CN，35～40℃反应0.5～5h，80～100℃加热1～10min。加入ExoI和ExoIII，35～40℃静置10～60min，加入石墨烯/纳米金，混合均匀。依次加入显色剂和H2O2，进行吸光度测定。本发明的比色分析法比传统无机纳米材料分析方法成本低、操作简单、实用性强。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，涉及一种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法。
背景技术
在基因中，8-氧代鸟嘌呤是一种最常见的由于活性氧引起的DNA氧化损伤。在DNA复制过程中，这种损伤可以阻止DNA链伸长，导致由错配引起的基因突变，对基因稳定性产生了巨大威胁。由于其在机体内的含量高、诱变能力强，如今已被看作机体的DNA氧化损伤标志物。
在人体对损伤碱基的修复中，人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(human 8-hydroxyguanine glycosylase，hOGG1)是一种重要的修复酶，它可以识别并切除8-氧代鸟嘌呤。此外，hOGG1还具有AP(apurinic/apyrimidinic)核酸内切酶的AP位点的水解功能，在该酶的作用下，可以将受损碱基的位点完全切除，形成一个空的位点，并在5'端位置形成磷酸末端。据此，hOGG1对机体DNA氧化损伤的修复有着重大的意义，故对其活性进行快速准确的定量分析是十分必要的。
传统的hOGG1活性分析方法有仪器法、生物法、生化法等，由于其固有的缺陷已难以应对目前的分析需求。例如，蛋白质印迹法操作复杂，对抗极端环境的适应性差、灵敏性差；流式细胞术、荧光测定实验耗时、费力、成本高；结合了天然酶的分子信标法虽然通过信号放大实现了高灵敏性，但实验的标记过程繁琐，且天然酶的稳定性差，阻碍了该法的推广应用。近年来，无机纳米材料由于其卓越的稳定性、反应活性和简单的制备过程，结合电化学、荧光、比色技术，已被广泛运用于传感分析检测中(Nature nanotechnology,2007,2(9),577-583；Environmental science and technology,2012,46(22),12567-12574；Journal of materials chemistry,2012,22(33),17079-17085)。目前，人们也已利用无机纳米材料成功建立了一些针对hOGG1活性的传感分析平台(Analytical chemistry,2013,85(9),4376-4383)，但过程涉及繁琐的标记过程或复杂的操作步骤，影响了实验效率、分析结果和方法的实用性。
石墨烯/纳米金复合物，一种新型的无机过氧化酶催化材料，利用石墨烯与纳米金的接触界面的过氧化酶催化性质，可以快速催化氧化多种有机底物。此外，由于石墨烯片层与单链DNA之间的π-π共轭作用可使单链DNA自发的吸附到石墨烯表面，从而占据了石墨烯/纳米金复合物的界面活性位点，抑制了其过氧化酶催化性质。反应自发进行，无需标记过程。如今石墨烯/纳米金复合物材料由于其优异的性质，如制备过程简单、成本低、反应活性高等，已被用于传感分析中(ACS NANO,2012,6(4),3142-3151)。本发明将石墨烯/纳米金复合物材料应用于样品中hOGG1的活性分析，建立一种hOGG1活性的比色分析方法，解决了传统方法繁琐耗时、成本高、实用性差等缺点，应用前景非常广泛。
发明内容
本发明解决了现有hOGG1活性分析方法繁琐耗时、标记过程复杂、成本高、实用性差等不足，提供了一种简便、快捷、经济、实用的hOGG1活性的定量分析方法。
石墨氧化物和氯金酸的混合液，在碱性条件下，经一步水热合成石墨烯/纳米金复合物，其界面的仿生过氧化酶催化性能可使底物中的显色剂在过氧化氢(H2O2)存在下，从常态氧化至氧化态，从而使体系吸光度值发生改变。含有8-氧代鸟嘌呤的DNA序列1与其互补DNA序列2杂交后，形成含有8-氧代鸟嘌呤的双链DNA。当目标物hOGG1存在于体系中时，其作用的DNA底物会形成shiff碱，在还原剂氰基硼氢化钠的作用下与DNA双链共价结合，阻碍了随后加入的核酸外切酶对序列1的降解作用，而不含有8-氧代鸟嘌呤的序列2则被核酸外切酶降解。捕获目标物hOGG1的序列1由于其与石墨烯之间的π-π共轭作用而吸附到石墨烯/纳米金复合物表面，阻碍了复合物的界面过氧化酶催化性能，在显色剂与H2O2存在条件下，不能使反应体系吸光度产生变化。反之，当体系中不存在目标物hOGG1时，序列1与序列2形成的双链DNA则会被核酸外切酶降解，由于所加入的石墨烯/纳米金复合物的界面过氧化酶催化性能，在H2O2存在条件下氧化显色剂，使反应体系吸光度产生变化。据此，体系的吸光度值在一定范围内与目标物hOGG1的活性呈线性反相关，从而为hOGG1的定量分析提供依据。
本发明提供了一种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法，具体步骤如下：
(1)向0.1～5.0μM的DNA序列S1溶液中加入浓度为0.1～5.0μM的DNA序列S2溶液，在85～100℃温度下反应0.5～2min，继续在10～30℃温度下反应1～5min，如此温度交替反应8～15次，使DNA序列S1与DNA序列S2杂交反应成双链DNA。其中，所述的DNA序列S1为含有8-氧代鸟嘌呤的DNA序列，DNA序列S2为DNA序列S1的互补DNA序列。
(2)依次向步骤(1)获得的双链DNA溶液中加入活性值不大于0.5U/μL的hOGG1、0.01～1.0mg/mL牛血清蛋白和0.01～1.0M氰基硼氢化钠，在35～40℃温度下反应0.5～5h，使hOGG1捕获到DNA序列S1上。然后在80～100℃温度下反应1～10min，终止反应。
(3)向步骤(2)获得的混合液中加入0.05～1.5U/μL核酸外切酶I(Exo I)和0.2～8.0U/μL核酸外切酶III(Exo III)，35～40℃温度下静置10～60min。再加入0.5～40.0μg/mL石墨烯/纳米金，混合均匀。
(4)向步骤(3)得到的产物中依次加入0.05～10.0mM显色剂与1.0～100.0mM过氧化氢(H2O2)，将得到的混合液立即进行吸光度测定。
所述的显色剂包括四甲基联苯胺(TMB)或2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)。
本发明的有益效果：
(1)灵敏度高，检测下限可达0.0016U/μL。
(2)石墨烯/纳米金复合物采用水热反应一步合成，过程简单、快捷。
(3)相较于传统无机纳米材料分析方法，无标记过程，操作简单、实用性强。
附图说明
图1是本发明所述的hOGG1的活性分析方法示意图。
图2是本发明的方法获得的hOGG1活性分析的标准工作曲线。
图中：DNA序列S1；DNA序列S2；hOGG1；石墨烯/纳米金。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图具体说明本发明的具体实施方式。
实施例1
石墨烯/纳米金的制备
石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将0.01～1g/L石墨氧化物(GO)溶液，0.2～20.0mM氯金酸(HAuCl4)溶液，0.002～0.2M氢氧化钠(NaOH)溶液混合均匀。超声2～12h后，转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中，175～185℃反应8～12h，自然冷却至室温后备用。
实施例2
配置样品中hOGG1含量的测定：
(1)石墨烯/纳米金的制备
石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将0.01g/LGO溶液，0.2mMHAuCl4溶液，0.004MNaOH溶液混合均匀。超声2h后，转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中，175℃反应12h，自然冷却至室温后备用。
(2)S1与S2杂交
向0.1μM的S1中加入浓度为0.1μM的S2，在85℃温度下反应2min，10℃温度下反应1min，如此温度交替循环反应8次。
(3)分析方法
依次向步骤(2)获得的双链DNA溶液中加入0～0.2U/μL hOGG1，0.01mg/mL BSA与0.01M NaBH3CN，在35℃温度下反应5h，80℃温度下加热10min终止反应。然后向混合液中加入0.05U/μLExo I与0.2U/μLExo III，在35℃温度下静置60min后，加入0.8μg/mL石墨烯/纳米金，混合均匀。最后加入0.1mMTMB与1.0mM H2O2，并立即将得到的混合液转入比色皿中。室温条件下，于波长为652nm处测定反应体系吸光度值随时间变化情况。
(4)标准工作曲线的绘制
步骤(3)中随着样品中hOGG1活性值的增加，体系的吸光度变化值不断增加，在0～0.1U/μL范围内，600s时反应体系吸光度值与hOGG1活性有良好的线性关系，线性相关系数R＝0.997。
(5)配置样品中hOGG1活性的测定：
用工作缓冲液(50.0mM NaCl,10.0mM Tris-HCl，10.0mMMgCl，1.0mM DTT，pH7.9)配置活性为0.07U/μL的hOGG1待测样品，用步骤(3)的方法进行检测，检测结果与步骤(4)得到的标准工作曲线对比，计算出hOGG1的活性值。实验结果测出hOGG1活性为0.072U/μL，回收率为102.9％，相对标准偏差RSD为2.71％(n＝4)。
实施例2的DNA序列如表1所示，oxoG为8-氧代鸟嘌呤。
表1DNA序列
| 名称 | 序列 |
| S1 | 5’-AATGGAGCACATCAGTToxoGAGCTCCATT-3’ |
| S2 | 5’-AATGGAGCTCAACTGATGTGCTCCATT-3’ |
实施例3
配置样品中hOGG1含量的测定：
(1)石墨烯/纳米金的制备
石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将0.1g/LGO溶液，2.0mMHAuCl4溶液，0.02MNaOH溶液混合均匀。超声6h后，转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中，180℃反应10h，自然冷却至室温后备用。
(2)S1与S2杂交
向0.9μM的S1中加入浓度为1.0μM的S2，在95℃温度下反应1min，25℃温度下反应2min，如此温度交替循环反应10次。
(3)依次向步骤(2)获得的双链DNA溶液中加入0～0.23U/μL hOGG1，0.1mg/mL BSA与0.1MNaBH3CN，在37℃温度下反应2h，90℃温度下加热5min终止反应。然后向混合液中加入0.3U/μLExo I与1.5U/μLExo III，在37℃温度下静置20min后，加入7.9μg/mL石墨烯/纳米金，混合均匀。最后加入1.0mM TMB与30.0mMH2O2，并立即将得到的混合液转入比色皿中。室温条件下，于波长为652nm处测定反应体系吸光度值随时间变化情况。
(4)标准工作曲线的绘制
步骤(3)中随着样品中hOGG1活性值的增加，体系的吸光度变化值不断增加，在0～0.11U/μL范围内，600s时反应体系吸光度值与hOGG1活性有良好的线性关系，线性相关系数R＝0.998。
(5)配置样品中hOGG1活性的测定：
用工作缓冲液(50.0mM NaCl,10.0mM Tris-HCl，10.0mMMgCl，1.0mMDTT，pH7.9)配置活性为0.09U/μL的hOGG1待测样品，用步骤(3)的方法进行检测，检测结果与步骤(4)得到的标准工作曲线对比，计算出hOGG1的活性值。实验结果测出hOGG1活性为0.086U/μL，回收率为95.6％，相对标准偏差RSD为2.66％(n＝4)。
实施例3的DNA序列如表2所示，oxoG为8-氧代鸟嘌呤。
表2DNA序列
| 名称 | 序列 |
| S1 | 5’-GAGAATGGAGCACATCAGTToxoGAGCTCCATTCTC-3’ |
| S2 | 5’-GAGAATGGAGCTCAACTGATGTGCTCCATTCTC-3’ |
实施例4
配置样品中hOGG1含量的测定：
(1)石墨烯/纳米金的制备
石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将1g/LGO溶液，20.0mMHAuCl4溶液，0.18MNaOH溶液混合均匀。超声12h后，转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中，185℃反应8h，自然冷却至室温后备用。
(2)S1与S2杂交
向5.0μM的S1中加入浓度为5.0μM的S2，在100℃温度下反应0.5min，30℃温度下反应5min，如此温度交替循环反应15次。
(3)依次向步骤(2)获得的双链DNA溶液中加入0～0.5U/μL hOGG1，1.0mg/mL BSA与1.0M NaBH3CN，在40℃温度下反应0.5h，100℃温度下加热2min终止反应。然后向混合液中加入1.5U/μLExo I与8.0U/μLExo III，在40℃温度下静置10min后，加入40.0μg/mL石墨烯/纳米金，混合均匀。最后加入10.0mMABTS与100.0mM H2O2，并立即将得到的混合液转入比色皿中。室温条件下，于波长为405nm处测定反应体系吸光度值随时间变化情况。
(4)标准工作曲线的绘制
步骤(3)中随着样品中hOGG1活性值的增加，体系的吸光度变化值不断增加，在0～0.3U/μL范围内，600s时反应体系吸光度值与hOGG1活性有良好的线性关系，线性相关系数R＝0.991。
(5)配置样品中hOGG1活性的测定：
用工作缓冲液(50.0mM NaCl,10.0mM Tris-HCl，10.0mMMgCl，1.0mM DTT，pH7.9)配置活性为0.23U/μL的hOGG1待测样品，用步骤(3)的方法进行检测，检测结果与步骤(4)得到的标准工作曲线对比，计算出hOGG1的活性值。实验结果测出hOGG1活性为0.21U/μL，回收率为91.3％，相对标准偏差RSD为3.19％(n＝4)。
实施例4的DNA序列如表3所示，oxoG为8-氧代鸟嘌呤。
表3DNA序列
| 名称 | 序列 |
| S1 | 5’-GGAGCACATCAGTToxoGAGCTCC-3’ |
| S2 | 5’-GGAGCTCAACTGATGTGCTCC-3’ |
Claims (2)
1.一种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法，其特征在于，步骤如下：
(1)向0.1～5.0μM的DNA序列S1溶液中加入浓度为0.1～5.0μM的DNA序列S2溶液，在85～100℃温度下反应0.5～2min，继续在10～30℃温度下反应1～5min，如此温度交替反应8～15次，使DNA序列S1与DNA序列S2杂交反应成双链DNA；其中，所述的DNA序列S1为含有8-氧代鸟嘌呤的DNA序列，DNA序列S2为DNA序列S1的互补DNA序列；
(2)依次向步骤(1)获得的双链DNA溶液中加入活性值不大于0.5U/μL的hOGG1、0.01～1.0mg/mL牛血清蛋白和0.01～1.0M氰基硼氢化钠，在35～40℃温度下反应0.5～5h，使hOGG1捕获到DNA序列S1上；然后在80～100℃温度下反应1～10min，终止反应；
(3)向步骤(2)获得的混合液中加入0.05～1.5U/μL核酸外切酶I和0.2～8.0U/μL核酸外切酶III，35～40℃温度下静置10～60min；再加入0.5～40.0μg/mL石墨烯/纳米金，混合均匀；
(4)向步骤(3)得到的产物中依次加入0.05～10.0mM显色剂和1.0～100.0mM过氧化氢，将得到的混合液立即进行吸光度测定。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的显色剂为四甲基联苯胺或2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410203778.2A CN104165884B (zh) | 2014-05-15 | 2014-05-15 | 一种人类8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶活性的比色分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410203778.2A CN104165884B (zh) | 2014-05-15 | 2014-05-15 | 一种人类8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶活性的比色分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104165884A CN104165884A (zh) | 2014-11-26 |
| CN104165884B true CN104165884B (zh) | 2016-08-24 |
Family
ID=51909795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410203778.2A Active CN104165884B (zh) | 2014-05-15 | 2014-05-15 | 一种人类8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶活性的比色分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104165884B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105388150B (zh) * | 2015-10-29 | 2018-05-08 | 大连理工大学 | 一种基于色差对比的土霉素检测试纸、使用方法及制备方法 |
| CN108169203B (zh) * | 2017-12-14 | 2020-09-08 | 济南大学 | 一种检测hOGG1活性的生物传感器及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7704687B2 (en) * | 2002-11-15 | 2010-04-27 | The Johns Hopkins University | Digital karyotyping |
| WO2010069064A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-06-24 | Mcmaster University | Colorimetric biosensor with allosteric dnazyme activation and rolling circle signal amplification |
| CN101717823B (zh) * | 2009-11-25 | 2011-12-07 | 湖南大学 | 基于核酸外切酶ⅰ保护分析检测有机小分子和蛋白质相互作用的可视传感方法 |
| CN103233073B (zh) * | 2013-05-06 | 2014-11-12 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种基于滚环扩增的微小rna的比色检测方法 |
-
2014
- 2014-05-15 CN CN201410203778.2A patent/CN104165884B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104165884A (zh) | 2014-11-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pan et al. | Preparation of electrochemical sensor based on zinc oxide nanoparticles for simultaneous determination of AA, DA, and UA | |
| CN107643286B (zh) | 一种多孔CeO2纳米材料的制备及在纸基传感器中的应用 | |
| CN109266332B (zh) | 一种用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法 | |
| Zawada et al. | Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium | |
| CN104132981B (zh) | 一种Cu2S标记的雌激素免疫传感器的制备方法及应用 | |
| CN110455786B (zh) | 一种基于CeO2@SnS2促进鲁米诺电致化学发光传感器的制备方法 | |
| CN113683092B (zh) | 一种氮硫共掺杂Ti3C2-MXene纳米片及其制备方法与应用 | |
| Farshchi et al. | Optimized DNA-based biosensor for monitoring Leishmania infantum in human plasma samples using biomacromolecular interaction: a novel platform for infectious disease diagnosis | |
| CN104165884B (zh) | 一种人类8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶活性的比色分析方法 | |
| CN104634779A (zh) | 基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶及其抑制剂的测定方法 | |
| CN110426428A (zh) | 基于Ti-MOF的光电化学传感器检测N1-甲基腺嘌呤的方法 | |
| CN107045010A (zh) | 基于二硫化锡‑介孔氮化碳的光电化学传感器的制备方法 | |
| CN110231336A (zh) | 一种石墨烯/聚苯胺纳米线阵列免疫传感器的制备方法及应用 | |
| Huang et al. | Electrochemiluminescent sensor based on Ru (bpy) 32+-doped silica nanoprobe by incorporating a new co-reactant NBD-amine for selective detection of hydrogen sulfide | |
| CN107091872B (zh) | 一种基于铂/碳化硅纳米材料的生物传感器及其应用 | |
| CN105866226A (zh) | 一种葡萄糖氧化酶生物传感器的制备及使用方法 | |
| CN104062288B (zh) | 一种基于化学发光法的萘胺化合物的检测方法 | |
| CN103884748B (zh) | 一种用于检测血清素的分子印记电化学传感器的制备方法 | |
| CN205741036U (zh) | 一种检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器 | |
| AU2018100445A4 (en) | A method for dopamine detection with GO-PtCu nano-enzyme | |
| CN107748164B (zh) | 一种基于负载型Pd/C类过氧化物酶的制备方法及其应用 | |
| CN107083437B (zh) | 一种利用固有荧光核苷酸超灵敏同时检测多种dna糖基化酶的方法 | |
| Sołoducho et al. | Electrochemical and optical biosensors in medical applications | |
| CN115466186B (zh) | 一种基于高度共轭COFs的光响应模拟氧化酶及其制备方法与应用 | |
| CN110441373A (zh) | 一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |