CN103233073B - 一种基于滚环扩增的微小rna的比色检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法，其特征在于，包括:采用滚环扩增技术将目标微小RNA扩增为含有多个目标微小RNA片段的长链产物，利用核酸间的杂交反应将金纳米颗粒DNA探针固定到含有多个目标微小RNA片段的长链产物上，最终通过检测固定在含有多个目标微小RNA片段的长链产物上的金纳米颗粒DNA探针上的金纳米颗粒的颜色变化反应，检测含有多个目标微小RNA片段的长链产物，从而达到对目标微小RNA的检测的目的。避免了使用PCR仪等昂贵仪器的使用，降低的检测成本，有助于相关疾病的早期诊断。

Description

一种基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法，属于生物大分子的检测领域。
背景技术
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源，非编码的RNA分子，由高等真核生物基因组编码，长度为18~25个核苷酸。miRNA可以调节其他基因的表达。通过与靶信使核糖核酸(mRNA)的特异性结合，RNA诱导沉默复合体(RNA Induced Silence CompleX，RISC)降解mRNA或阻碍其翻译，从而抑制转录后基因表达。miRNA在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序，免疫反应等方面发挥重要作用。并且参与肿瘤发生和病毒感染。多数miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性。目前，只有少部分miRNA的生物学功能得到科学家的阐释。这些miRNA与生命过程中的发育、疾病密切相关。对于miRNA的检测受到越来越多的关注，相关人类疾病的早期诊断和新药的开发也依赖于miRNA的超灵敏检测。目前，提高检测灵敏度的方法主要是聚合酶链式反应(PCR)。PCR技术可以实现1O个DNA分子的扩增，具有很高的灵敏度和特异性。但是该反应依赖于复杂的一起设备，反应过程中需要不断的精确调控温度，对实验条件要求较高。
20世纪90年代中期，研究人员发现了一些特殊的DNA聚合酶，能够利用一个环状的单链DNA模板，不断延长一条短链DNA引物。该反应被称为滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)，其线性扩增倍数为105。在扩增过程中，DNA聚合酶能够将环状模板DNA复制成百上千份。最终的扩增产物是一条拥有许多与环状模板DNA互补的重复序列的长链DNA。滚环扩增技术作为一个新颖的DNA扩增工具，已经不断被开发应用于DNA、RNA、蛋白质的超灵敏检测中。
金纳米颗粒是最稳定的金属纳米颗粒，在不同领域均表现出许多优良的性质。具有独特的光学、电学性质以及良好的生物相容性。金纳米颗粒的制备简单，化学性质稳定，生物分子的固定修饰也相对容易，因此金纳米颗粒被广泛地用于物理学、化学、材料学和生物学领域。
发明内容
本发明设计开发了一种基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法。本发明根据金纳米颗粒的局部表面的等离子共振效应，并结合滚环扩增技术，通过检测连接在扩增的目标微小RNA上的金纳米颗粒的颜色变化，从而达到对目标微小RNA的检测。
本发明提供的技术方案为：
一种基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法，包括：
步骤1、选取线性模板DNA，其5’端被磷酸化，线性模板DNA的5’端和3’端分别与目标微小RNA的3’端和5’端碱基互补；
步骤2、加入T4 RNA连接酶2，使线性模板DNA成环；
步骤3、滚环扩增：加入目标微小RNA引物、phi29聚合酶和dNTP，产生含有目标微小RNA片段的长链产物；
步骤4、利用核酸间的杂交反应将金纳米颗粒DNA探针与含有多个目标微小RNA片段的长链产物连接；
步骤5、利用比色法对含有多个目标微小RNA片段的长链产物与金纳米颗粒DNA探针连接后的产物进行检测。
优选的是，所述的基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法中，所述步骤l中的线性模板DNA至少包括5个鸟嘌呤残基。
优选的是，所述的基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法，所述步骤1中的目标微小RNA为长度为15～35个核苷酸的RNA。
优选的是，所述的基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法中，所述步骤4中金纳米颗粒DNA探针的制备包括：
a、选取包含一段与线性模板DNA部分碱基序列相同的碱基序列的DNA探针；
b、该DNA探针的5’端与巯基连接，形成含有巯基的DNA探针；
c、巯基的DNA探针通过其上的巯基与金纳米颗粒共价结合，形成金纳米颗粒DNA探针。
优选的是，所述的基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法中，所述的c中金纳米颗粒的粒径在3～50nm之间
优选的是，所述的基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法中，所述的金纳米颗粒的粒径在4nm～15nm之间。
本发明将金纳米颗粒的颜色变化的反应与滚环扩增技术有机结合，本发明结合了滚环扩增技术和纳米技术用于微小RNA的传感，并进行了信号放大，提供了微小RNA超灵敏检测的比色方法，避免了使用PCR仪等昂贵仪器的使用，降低的检测成本，有助于相关疾病的早期诊断。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为本发明的实施例中的在不同反应时间下在1unit／μL phi29聚合酶催化滚环扩增反应得到的滚环扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图3为本发明的实施例中的由不同浓度的phi29聚合酶催化聚合10min得到的滚环扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4为本发明实施例中的目标微小RNA标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例
图1表示了本发明的总流程，本实施例中使用的金纳米颗粒的粒径为13nm，能够吸收绿光，在520nm处能产生可见光谱的强吸收峰，呈现酒红色。在本实施例中采用的比色法的检测仪器为紫外分光光度计。本实施例中所用的目标微小RNA、线性模板DNA和被巯基修饰的DNA探针的碱基序列见表一：
表一
1.1、含有多个目标微小RNA片段的长链产物的制备
a、10μL目标微小RNA与10μL线性模板DNA(1μM，2mM PBS，pH7.4)混合，37℃放置30min。
b、上述体系加入1μLT4RNA连接酶2，进行连接，37℃反应30min，然后70℃加热10min使其失活。
c、上述体系中加入phi29聚合酶(最终浓度为1unit／μL)、目标微小RNA引物和dNTP，30℃条件下，反应1小时，然后在65℃处加热使其失活，得到含有多个目标微小RNA片段的长链产物的溶液。
其中，phi29聚合酶的浓度以及phi29聚合酶的反应时间通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测出，如图2所示，在不同反应时间下在1unit／μLphi29聚合酶催化滚环扩增反应得到的滚环扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图中，可以观测到在10min时的滚环扩增产物的量最佳；如图3所示的不同浓度的phi29聚合酶催化聚合10 min得到的滚环扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图中，可以观测到使用浓度为1unit／μL的phi29聚合酶进行滚环扩增较为合适。
1.2、金纳米颗粒DNA探针
a、3.5mL柠檬酸三钠(1％)快速加入到100mL氯金酸溶液(0.0l％)中，煮沸剧烈搅拌15min，然后停止加热，继续搅拌30min。将金纳米粒溶液冷却到室温后，于4℃冷库中保存待用。
b、将1mL金纳米颗粒溶液与0.1mL含有巯基的DNA探针(最终浓度3μM)混合，静置1天后，离心去除非共价吸附的DNA分子，然后将混合液中的NaCl浓度调整到1M，继续放置l天，最后离心重悬，得到金纳米颗粒DNA探针溶液。
1.3、检测含有多个目标微小RNA片段的长链产物
将10μL含有多个目标微小RNA片段的长链产物的溶液加入到1mL金纳米颗粒DNA探针溶液中，通过核酸问杂交反应，使金纳米粒连接到含有多个目标微小RNA片段的长链产物，用紫外分光光度计检测连接了金纳米粒的含有多个目标微小RNA片段的长链产物的光谱。
1.4、目标微小RNA标准曲线的建立
将1mL金纳米颗粒DNA探针溶液分别加入到1nmol／L、100pmol／L、10pmol／L和lpmol／L的10μL的含有多个目标微小RNA片段的长链产物的溶液中，分别在520nm处和650nm的紫外分光光度计处检测以上每个混合后的每个样品的光谱吸收结果。目标微小RNA标准曲线如图4所示，其中图4的横坐标为目标微小RNA浓度的对数值，纵坐标为不同浓度的微小RNA在650nm处的吸光度值与520nm处的吸光度值的比值。
本发明将金纳米颗粒的颜色变化的反应与滚环扩增技术有机结合，首先利用滚环扩增技术扩增目标微小RNA，达到了对微小RNA在痕量级别的检测，且技术操作简单，需要的实验的条件容易满足；其次，根据可见光照射在金纳米颗粒表面时，金纳米颗粒能够吸收其共振波长的可见光，引起表面电子振荡，当金纳米颗粒的间距发生变化，如聚集时，入射光不再单一地极化纳米颗粒，变为由位于低能级的更高模式控制表面电子的振荡，因而金纳米颗粒表面等离子吸收带就会发生红移，以及变宽，其颜色发生改变的特征，本发明利用紫外分光光度计检测连接到含有目标微小RNA片段的长链产物上的金纳米颗粒，从而定量的检测目标微小RNA的量，降低了操作的成本，节约了检测的时间。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法，其特征在于，包括: 
步骤1、选取线性模板DNA，其5'端被磷酸化，线性模板DNA的5'端和3'端分别与目标微小RNA的3'端和5'端碱基互补; 
步骤2、加入T4RNA连接酶2，便线性模板DNA成环; 
步骤3、滚环扩增:加入目标微小RNA引物、phi29聚合酶和dNTP，产生含有目标微小RNA片段的长链产物; 
步骤4、利用核酸间的杂交反应将金纳米颗粒DNA探针与含有多个目标微小RNA片段的长链产物连接; 
步骤5、利用比色法对含有多个目标微小RNA片段的长链产物与金纳米颗粒DNA探针连接后的产物进行检测。 
2.如权利要求1所述的基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法，其特征在于，所述步骤1中的线性模板DNA至少包括5个鸟嘌呤残基。 
3.如权利要求1所述的基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法，其特征在于，所述步骤1中的目标微小RNA为长度为15~35个核苷酸的RNA。 
4.如权利要求1所述的基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法，其特征在于，所述步骤4中金纳米颗粒DNA探针的制备包括: 
a、选取包含一段与线性模板DNA部分碱基序列相同的碱基序列的DNA探针; 
b、该DNA探针的5'端与疏基连接，形成含有疏基的DNA探针; 
c、含有疏基的DNA探针通过其上的疏基与金纳米颗粒共价结合，形成金纳米颗粒DNA探针。 
5.如权利要求4所述的基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法，其特征在于，所述的c中金纳米颗粒的粒径在3nm～50nm之间。
6.如权利要求5所述的基于滚环扩增的微小RNA的比色检测方法，其 特征在于，所述的金纳米颗粒的粒径在4nm～l5nm之间。 
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