CN107557462A - 一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法 - Google Patents

Abstract

一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法，属于生物检测领域。本发明包括：铂/石墨烯纳米复合材料的合成，模板DNA分子进行不对称PCR扩增，比色检测方法的构建。本发明将模板DNA进行不对称PCR扩增出单链DNA产物，借助于铂/石墨烯纳米复合材料的催化作用和对单链DNA的吸附能力，吸附不同含量的DNA分子使得纳米复合材料耐盐度不同，进而导致其稳定性和催化能力发生变化，催化底物显色产生差异，根据DNA浓度与紫外吸光值的对应关系可以实现DNA的定量检测。此方法操作简单、成本低、灵敏度高、特异性强，比色结果可用肉眼直接观察，不需要专业人员进行数据分析，在基因检测领域具有更大的应用范围。

Description

一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法。

背景技术

DNA是遗传信息的承担者，是生物遗传的主要物质基础，每一种生物体都具有独一无二的核酸序列，因此可以通过对目标物的DNA检测以达到检测目标物的目的。DNA检测在许多领域都有广泛的应用，在临床诊断方面，可以通过检测细菌病毒病原体的DNA进行致病菌疾病的检测，目前，很多疾病的序列信息已被人们掌握，可以通过及早和准确地探测 DNA序列来有效抗击这些疾病。在食品安全和环境保护领域，可以通过对DNA的检测来实现对有害微生物、转基因产品等物质的检测。因此，不断开发新型的简单、快速、超灵敏的DNA检测技术以满足各领域的检测需求显得尤为重要。

荧光定量PCR是对DNA进行检测与定量的一种传统的有效方法，然而通过PCR得到的实验数据需要精细而专业的分析过程，增加了时间消耗，并且基于染料法的实时荧光定量PCR，由于染料和任意双链DNA的非特异性结合，以及染料易发生光漂白而失去荧光特性的缺陷，会影响最终定量的准确性。近年来，随着纳米技术的不断发展，新型纳米材料不断被开发，从而使得纳米材料在生物学检测领域的应用越来越广泛，纳米材料具有独特的尺寸依赖性化学或物理性质，包括催化性、电化学性质、电子转移、磁性、光学性质以及热力学等性质，这些尺寸依赖的性质，使得它们在生物分析和生物传感器等应用方面具有重要作用。

石墨烯是一种由纯碳原子的六元环平面结构构成的只有一个原子层厚度的准二维材料，它具有非常大的理论比表面积、高的杨氏模量、超高的光学透过率、优良的导热性和导电性，并能够通过能量转移实现荧光猝灭。目前，人们已将基于石墨烯的材料广泛应用于诸多领域，如吸附剂、催化剂、药物载体等。由于石墨烯的优良特性，现已应用于多种传感器的设计，如光学、电化学及场效应传感器、细胞标记及实时监测等。石墨烯吸附单链DNA分子的能力较双链DNA分子更强，主要是由于DNA杂交后空间结构发生改变，碱基对被屏蔽，使石墨烯无法与碱基接触，从而造成结合能力的减弱。

酶具有高效的催化作用，酶标记的生物识别分子在生物传感领域得到广泛的应用，辣根过氧化物酶（HRP）是一种应用最广泛的蛋白酶，然而这种蛋白酶价格昂贵，并且容易受储存环境的温度、pH影响使得酶变性，从而影响酶的催化活性。除了蛋白酶之外，也开发出了一些新型的具有类似于过氧化物酶活性的纳米材料，如氧化铈纳米颗粒、单壁碳纳米管、石墨烯氧化物、金属纳米颗粒和各种纳米复合材料。这种纳米材料合成简单、合成成本低，与蛋白酶相比具有更高的稳定性，氧化石墨烯和金属纳米粒子形成的纳米复合物具有更强的催化能力。

发明内容

要解决的技术问题：传统的DNA检测方法主要是利用RT-PCR，而RT-PCR方法虽然灵敏度较高但检测成本昂贵，并且需要专业的操作人员进行数据分析，从而限制了此类方法的普遍应用。

技术方案：本发明公开了一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法，包括如下步骤：

（1）铂/石墨烯纳米复合材料的合成

以六水合氯铂酸和氧化石墨烯为原料进行铂/石墨烯纳米复合材料的合成，将六水合氯铂酸和氧化石墨烯水溶液以8:1的质量比混合，使得体系的总体积为500μL，用1M NaOH将溶液调整到pH=10，然后将其孵育3h，并且每隔30min超声一次，每次超声时间为1min；孵育完成后，在搅拌的状态下将浓度为50mM的NaBH₄ 500μL逐滴加入到反应体系中，将其在缓慢振荡的状态下过夜孵育得到黑色的产物；将产物在离心转速10000r/min的条件下离心10min，用超纯水重悬并过0.22μm孔径的无菌过滤膜进行过滤洗涤，洗涤3次后将得到的纯化产物重悬到超纯水中，经过超声分散后置于室温保存。

（2）模板DNA分子进行不对称PCR扩增

将目标DNA分子配置成1×10^-9M的起始浓度，将其10倍梯度稀释10个浓度，以每种浓度的DNA分子为模板进行不对称PCR扩增，其中还包括一个不加DNA模板的空白对照；扩增体系组成为：2×PCRTaqMix 10μL（购自上海生工生物工程股份有限公司），1mM前引物0.5μL，10μM的后引物0.5μL，模板DNA分子2μL，超纯水7μL，总的反应体系为20μL；扩增条件为： 95℃预变性30s，95℃变性5s、60℃退火和延伸30s，总共为15~30个循环。模板DNA和引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

（3）比色检测方法的构建

将步骤（1）合成的铂/石墨烯纳米复合材料用孵育缓冲液稀释1000倍，分装到1.5mL离心管中每管200μL，然后分别在每管中加入步骤（2）的扩增产物，在37℃孵育1~2h后，以5000r/min的转速离心2min，然后加入100μLTMB显色液，37℃显色10~20min后测定650nm的紫外吸收值，并建立DNA浓度与650nm紫外吸收值的对应关系。

本发明所述的基于铂/石墨烯纳米复合材料进行基因检测的比色方法中所述的模板DNA分子的序列为：

模板DNA：5’-GAGCGCTAAGCAGCAGAATCGTGTGACAACGCRAGCAGCTCTCCTCCA

ACACATCATCGACAAGCACCGGAGTAGACGGC-3’；

前引物：5’-GCCGTCTACTCCGGT-3’；

后引物：5’-GAGCGCTAAGCAGCA-3’。

本发明所述的基于铂/石墨烯纳米复合材料进行基因检测的比色方法中所述的不对称PCR的循环数为20个循环。

本发明所述的基于铂/石墨烯纳米复合材料进行基因检测的比色方法中所述的步骤（3）中孵育缓冲液为pH7.4 0.01M的Tris-HCl缓冲液，包含100mM NaCl和0.01% Tween20。

本发明所述的基于铂/石墨烯纳米复合材料进行基因检测的比色方法中所述的步骤（3）中铂/石墨烯纳米复合材料和扩增产物的孵育时间为1.5h。

本发明所述的基于铂/石墨烯纳米复合材料进行基因检测的比色方法中所述的所述的步骤（3）中TMB显色液为pH 5.0的0.05M柠檬酸盐缓冲液配置的包含0.75mM TMB和20mMH₂O₂显色液。

本发明所述的基于铂/石墨烯纳米复合材料进行基因检测的比色方法中所述的步骤（3）中显色时间为15min。

注：本发明所述的DNA分子由上海生工生物工程有限公司合成。

有益效果：本发明将模板DNA分子进行不对称PCR扩增，得到大量的单链DNA产物，借助于铂/石墨烯纳米复合材料的催化作用和对单链DNA分子的吸附能力，吸附单链DNA分子后，不同含量的DNA分子使得铂/石墨烯纳米复合材料在一定的盐离子强度下发生不同程度的聚集，进而导致复合材料的稳定性和催化能力发生变化。起始DNA含量越高，扩增出的单链DNA分子越多，吸附DNA分子后，铂/石墨烯纳米复合材料在一定的盐离子强度下越稳定催化能力越强，催化底物显色越深，测定显色后溶液的650nm吸光值，根据DNA浓度与650nm吸光值的对应关系可以实现DNA的定量检测。

附图说明

图1 DNA检测的标准曲线。

具体实施方式

实施例1

一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法，包括如下步骤：

（1）铂/石墨烯纳米复合材料的合成

以六水合氯铂酸和氧化石墨烯为原料进行铂/石墨烯纳米复合材料的合成，将六水合氯铂酸和氧化石墨烯水溶液以8:1的质量比混合，使得体系的总体积为500μL，用1M NaOH将溶液调整到pH=10，然后将其孵育3h，并且每隔30min超声一次，每次超声时间为1min；孵育完成后，在搅拌的状态下将浓度为50mM的NaBH₄ 500μL逐滴加入到反应体系中，将其在缓慢振荡的状态下过夜孵育得到黑色的产物；将产物在离心转速10000r/min的条件下离心10min，用超纯水重悬并过0.22μm孔径的无菌过滤膜进行过滤洗涤，洗涤3次后将得到的纯化产物重悬到超纯水中，经过超声分散后置于室温保存。

（2）模板DNA分子进行不对称PCR扩增

模板DNA：5’-GAGCGCTAAGCAGCAGAATCGTGTGACAACGCRAGCAGCTCTCCTCCAA

CACATCATCGACAAGCACCGGAGTAGACGGC-3’；

前引物：5’-GCCGTCTACTCCGGT-3’；

后引物：5’-GAGCGCTAAGCAGCA-3’。

将DNA模板配置成1×10^-9M的起始浓度，将其10倍梯度稀释10个浓度，以每种浓度的DNA分子为模板进行不对称PCR扩增，其中还包括一个不加DNA模板的空白对照；扩增体系组成为：2×PCRTaqMix 10μL，1mM前引物0.5μL，10μM的后引物0.5μL，模板DNA分子2μL，超纯水7μL，总的反应体系为20μL；扩增条件为： 95℃预变性30s，95℃变性5s、60℃退火和延伸30s，总共为20个循环。

（3）比色检测方法的构建和检测灵敏度的研究

以包含100mM NaCl和0.01% Tween 20的pH7.4 0.01M的Tris-HCl缓冲液作为孵育缓冲液，将步骤（1）合成的铂/石墨烯纳米复合材料用孵育缓冲液稀释1000倍，分装到1.5mL离心管中每管200μL，然后分别在每管中加入步骤（2）的扩增产物，在37℃孵育1.5h后，以5000r/min的转速离心2min，然后加入100μLTMB显色液，37℃显色15min后测定650nm的紫外吸收值。以DNA浓度为横坐标，每种DNA浓度所对应的紫外吸收值和空白吸收值的差值为纵坐标建立标准曲线，在1×10^-18~1×10^-11M的DNA浓度范围内，两者之间的线性关系良好，通过计算得出DNA的检测限为0.36×10^-18M。

（4）DNA检测的干扰实验

在1nM的λDNA中添加1×10^-18M、2×10^-17M、5×10^-16M、3×10^-15M、2×10^-14M的以上模板DNA分子，用来分析干扰DNA对模板DNA分子检测的影响，通过分析得出，在这几种DNA的添加浓度下，模板DNA的添加回收率在96.7%~98.4%之间，添加回收结果良好。

Claims (7)

1.一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）铂/石墨烯纳米复合材料的合成

以六水合氯铂酸和氧化石墨烯为原料进行铂/石墨烯纳米复合材料的合成，将六水合氯铂酸和氧化石墨烯水溶液以8:1的质量比混合，使得体系的总体积为500μL，用1M NaOH将溶液调整到pH=10，然后将其孵育3h，并且每隔30min超声一次，每次超声时间为1min；孵育完成后，在搅拌的状态下将浓度为50mM的NaBH₄ 500μL逐滴加入到反应体系中，将其在缓慢振荡的状态下过夜孵育得到黑色的产物；将产物在离心转速10000r/min的条件下离心10min，用超纯水重悬并过0.22μm孔径的无菌过滤膜进行过滤洗涤，洗涤3次后将得到的纯化产物重悬到超纯水中，经过超声分散后置于室温保存；

（2）模板DNA分子进行不对称PCR扩增

将模板DNA分子配置成1×10^-9M的起始浓度，将其10倍梯度稀释10个浓度，以每种浓度的DNA分子为模板进行不对称PCR扩增，其中还包括一个不加DNA模板的空白对照；扩增体系组成为：2×PCRTaqMix 10μL，1mM前引物0.5μL，10μM的后引物0.5μL，模板DNA分子2μL，超纯水7μL，总的反应体系为20μL；扩增条件为： 95℃预变性30s，95℃变性5s、60℃退火和延伸30s，总共为15~30个循环；

（3）比色检测方法的构建

将步骤（1）合成的铂/石墨烯纳米复合材料用孵育缓冲液稀释1000倍，分装到1.5mL离心管中每管200μL，然后分别在每管中加入步骤（2）的扩增产物，在37℃孵育1~2h后，以5000r/min的转速离心2min，然后加入100μLTMB显色液，37℃显色10~20min后测定650nm的紫外吸收值，并建立DNA浓度与650nm紫外吸收值的对应关系。

2.根据权利要求1所述的一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法，其特征在于所述的模板DNA分子序列为：

模板DNA：5’-GAGCGCTAAGCAGCAGAATCGTGTGACAACGCRAGCAGCTCTCCTCCAA

CACATCATCGACAAGCACCGGAGTAGACGGC-3’；

前引物：5’-GCCGTCTACTCCGGT-3’；

后引物：5’-GAGCGCTAAGCAGCA-3’。

3.根据权利要求2所述的一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法，其特征在于所述的不对称PCR的循环数为20个循环。

4.根据权利要求1所述的一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法，其特征在于所述的步骤（3）中孵育缓冲液为pH7.4 0.01M的Tris-HCl缓冲液，包含100mM NaCl和0.01% Tween 20。

5.根据权利要求1所述的一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法，其特征在于所述的步骤（3）中铂/石墨烯纳米复合材料和扩增产物的孵育时间为1.5h。

6.根据权利要求1所述的一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法，其特征在于所述的步骤（3）中TMB显色液为pH 5.0的0.05M柠檬酸盐缓冲液配置的包含0.75mMTMB和20mM H₂O₂显色液。

7.根据权利要求1所述的一种基于铂/石墨烯复合材料进行基因检测的比色方法，其特征在于所述的步骤（3）中显色时间为15min。