CN112557385A - 一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的灰度分析法 - Google Patents

一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的灰度分析法 Download PDF

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彭丽娟
李苓
刘宇晨
孙浩巍
王春琼
陈丹
曾尔庆
张庆刚
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Abstract

本发明公开了一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的灰度分析法。包括样品前处理、标准工作曲线绘制、样品分析和结果计算。烟草或烟草制品中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性的4‑氨基安替比林与酚偶联缩合成有紫外吸收的醌类化合物，再利用Image软件依据样品溶液的灰度值比值与溶液葡萄糖含量的定量关系即可推算出样品中的葡萄糖含量。该方法专一性强、操作简便快速、分析效率高、准确度和精密度高、稳定性好，能够满足对烟草和烟草制品中的葡萄糖含量进行大批量、快速、准确检测的需要，具有良好的应用前景。

Description

一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的灰度分析法
技术领域
本发明属于烟草成分检测技术领域，具体是涉及一种运用灰度分析技术并基于酶促反应对烟草及烟草制品中的葡萄糖含量进行快速准确测定的方法。
背景技术
烟草中的水溶性糖主要为葡萄糖、果糖、蔗糖，是烟草内重要的碳水化合物，在烟草燃吸过程中能调整适度的酸碱平衡，使吃味醇和，增加烟气的和顺性，与烟草品质密切相关。目前烟草行业常用芒森·沃克法(即费林试剂法)和连续流动分析法测定烟草中水溶性的还原糖和总糖，但这些方法测定的都是总量，不能测定单个成分的含量。随着烟草分析技术发展，对糖的分析也不应仅局限于糖类总量的分析，应深入了解各种单糖的含量及其对烟草品质的影响，因此对烟草及烟草制品中葡萄糖等单糖的测定显得愈来愈重要。
目前，对烟草中葡萄糖的测定主要采用离子色谱法、近红外光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等，但离子色谱法仪器昂贵，维护费用高，且操作繁琐；近红外光谱法必需先建立模型，不能直接用于检测；气相色谱法、高效液相色谱法需衍生化，操作较麻烦，需用固相萃取柱预分离等；毛细管电泳法也需要对糖衍生化或使糖带电，才能进行分离检测。烟草检测技术人员正努力寻找一种更加简便、快速和准确的葡萄糖含量测定方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种运用灰度分析技术并结合酶促反应实现的，能够快速、简便、准确测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。
一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
按照“YC/T31-1996烟草及烟草制品试样的制备和水份测定烘箱法”，将烟草或烟草制品置于烘箱中，40℃烘干至可用手指捻碎，取出用粉碎机研磨过40目筛后得到烟末样品，并测定其含水率；取0.1g烟末样品置于三角瓶中，加入20mL水振荡萃取30min后过滤，滤液作为待测样品溶液备用；
(2)绘制标准工作曲线
配制浓度为50.00mmol/L的葡萄糖储备液，然后分别稀释成浓度为4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0.1mmol/L的葡萄糖标液，移取各浓度的葡萄糖标液100μL分别置于2mL微量离心管中，在每个离心管中分别加入葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒中的试剂R1和R2各450μL混匀，于37℃水浴显色10min后，得到对应葡萄糖浓度分别为4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.50、0.10和0.00mmol/L的标准工作液，拍照后用Image软件转化并测定灰度值，以0.00mmol/L标准工作液的灰度值为1，分别计算各标准工作液的灰度值比值，然后以标准工作液的葡萄糖浓度的对数为横坐标，灰度值比值为纵坐标绘制标准工作曲线，线性回归方程为：Y＝0.4465x+0.5471，相关系数r2＝0.9911；
(3)样品分析
取待测样品溶液100μL置于2mL微量离心管中，分别加入所述试剂R1和R2各450μL混匀，于37℃水浴显色10min，拍照后用Image软件转化并测定灰度值，以0.00mmol/L标准工作液的灰度值为1，计算其灰度值比值，再由标准工作曲线推算出待测样品溶液的葡萄糖浓度值；
(4)结果计算
将待测样品溶液的葡萄糖浓度值代入公式(1)，计算样品的葡萄糖含量，并以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果；
Figure BDA0002821355610000031
式中：
GLU(％)—样品的葡萄糖含量，单位为质量百分数(％)；
0.18016—考虑萃取剂体积单位和葡萄糖摩尔质量的换算系数，单位为毫克每毫摩尔(mg/mmol)；
C—样品溶液的葡萄糖浓度值，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
V—萃取剂体积，单位为毫升(mL)；
G—样品质量，单位为克(g)；
W—样品的水份含量，单位为为质量百分数(％)。
相比现有技术，本发明具有以下优点：本发明首次结合酶促反应-灰度分析技术用于烟草及烟草制品中葡萄糖含量的快速准确定量。烟草中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性的4-氨基安替比林与酚偶联缩合成有紫外吸收的醌类化合物，再利用Image软件依据样品溶液的灰度值比值与溶液葡萄糖含量的定量关系即可推算出样品中的葡萄糖含量。该方法的最大线性浓度为4.00mmol/L。依据10次重复测量最低浓度标准工作液标准偏差的3倍和10倍分别计算出该方法的检出限和定量限分别为0.0216、0.072mmol/L。4个不同葡萄糖含量的样品3次重复测量的变异系数范围为0.85-3.60％。在原含量为0.571mmol/L的样品溶液中添加量分别为0.500、1.000、1.500、2.000mmol/L时的回收率范围为98.27％～103.30％。甘露糖、木糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等8种糖类化合物均对检测无干扰。该方法专一性强、操作简便快速、分析效率高、准确度和精密度高、稳定性好，能够满足对烟草和烟草制品中的葡萄糖含量进行大批量、快速、准确检测的需要，具有良好的应用前景。
附图说明
图1标准工作曲线；
图2样品萃取剂的影响(n＝3)；
图3筛选线性范围；
图4优化灰度分析反应时间；
图5葡萄糖及其结构类似物分子结构图；
图6裸眼比色观察干扰实验结果；
图7灰度值比值表示的干扰实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。
实施例1
1.实验原理、材料及方法
1.1实验原理
烟草中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性的4-氨基安替比林与酚偶联缩合成有紫外吸收的醌类化合物，对样品进行拍照，利用Image软件将红色深浅转变为灰度值大小，以0.00mmol/L溶液的灰度值为1，计算样品溶液的灰度值比值，依据样品溶液的灰度值比值与溶液葡萄糖含量的定量关系推算出样品中的葡萄糖含量。
1.2材料与仪器
用于精密性、回收率实验的样品A、B、C、D，为2017年全国烟草连续流动分析仪共同实验样品。
用于对比实验的1-7#样品：1#样品为3R4F监控样、2#样品为国内某品牌混合型卷烟样品、3#样品为国内某品牌烤烟型卷烟样品、4#样品为国内某品牌加热卷烟样品、5#样品为国内某品牌烤烟型卷烟样品、6#样品为国内某品牌造纸法再造烟叶、7#样品为国内某烟叶原料。
葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)；葡萄糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸(一水合)、葡萄糖醛酸均来自Sigma-Aldrich Co.(美国)。
METLER AE200分析天平(感量：0.0001g，瑞士METLER TOLEDO公司)；101A-2干燥箱(上海市实验仪器总厂)；HP4896紫外可见分光光度计(美国安捷伦科技有限公司)；Waterse2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Millipore AQUELIX5纯水机(美国MERCKMillipore公司)；Eppendorf Centrifuge 5810R离心机(德国Eppendorf公司)。
1.3样品的处理及分析
1.3.1样品前处理
按照“YC/T31-1996烟草及烟草制品试样的制备和水份测定烘箱法”，将前述各样品分别置于烘箱中，40℃烘干至可用手指捻碎，取出用粉碎机研磨，过40目筛后得到烟末样品，并测定水份含量。取0.1g烟末样品于三角瓶中，加20mL水振荡萃取样品中的葡萄糖，30min后过滤得到滤液，作为待测样品溶液备用。
1.3.2绘制标准工作曲线
配制50.00mmol/L的葡萄糖储备液，然后分别稀释为浓度为4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0.1mmol/L的葡萄糖标液。分别移取各浓度的葡萄糖标液100μL置于2mL微量离心管中，在每个离心管中分别加入葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒中的试剂R1和R2各450μL混匀，于37℃水浴显色10min后，得到对应葡萄糖浓度分别为4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.50、0.10和0.00mmol/L的标准工作液，用智能手机拍照后用Image软件转化并测定灰度值，以0.00mmol/L标准工作液的灰度值为1，分别计算各标准工作液的灰度值比值，然后以标准工作液的葡萄糖浓度的对数为横坐标，灰度值比值为纵坐标，所得标准工作曲线方程为：Y＝0.4465x+0.5471，相关系数r2＝0.9911，标准工作曲线见图1。
1.3.3样品分析
取待测样品溶液100μL置于2mL微量离心管中，分别加入葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂R1和R2各450μL混匀，于37℃水浴显色10min，用智能手机拍照后用Image软件转化并测定灰度值，以0.00mmol/L标准工作液的灰度值为1，计算其灰度值比值，再由标准工作曲线推算出待测样品溶液的葡萄糖浓度值；
1.3.4结果计算
将待测样品溶液的葡萄糖浓度值代入公式(1)，计算样品的葡萄糖含量；
Figure BDA0002821355610000061
式中：
GLU(％)—样品的葡萄糖含量，单位为质量百分数(％)；
0.18016—考虑萃取剂体积单位和葡萄糖摩尔质量的换算系数，单位为毫克每毫摩尔(mg/mmol)；
C—样品溶液的葡萄糖浓度值，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
V—萃取剂体积，单位为毫升(mL)；
G—样品质量，单位为克(g)；
W—样品的水份含量，单位为为质量百分数(％)。
以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果，精确至0.01，两次平行测定结果绝对值之差不应超过5％。
2.结果与讨论
2.1条件优化
2.1.1样品萃取剂的影响
为将烟草中的葡萄糖充分萃取，实验考察了样品萃取剂的影响。取样品A、B、C分别用水和5％乙酸按照1.3部分的方法进行萃取，取滤液100μL于2mL微量离心管中，分别加入1000μL试剂R1和R2混匀，于37℃水浴显色10min，转移至1cm光程比色皿中，以蒸馏水分析液为参比，用分光光度计于波长505nm处测定吸光度。从图2可知：3个样品用水萃取的吸光度(3次测定平均值)均大于5％乙酸，表明水能将葡萄糖充分萃取出来，故选择水作为样品萃取剂。
2.1.2筛选线性范围
如图3所示，分别配制葡萄糖浓度为100.000，10.000，1.000，0.100，0.010，0.001，0mmol/L的实验溶液组1-7。由图中可以看出，最佳目视比色范围为实验组2-4组(0.100-10.000mmol/L)。此范围内不仅明显地显示出肉眼可见颜色差异，灰度值也显示出较为良好的线性。结合烟草中葡萄糖的浓度水平，确定裸眼比色的线性范围是0.100-4.000mmol/L。
2.1.3优化灰度分析反应时间
如图4所示，a，b，c，d，e分别对应反应时间为2、5、10、15、20min，可见灰度值比值与葡萄糖浓度呈现出明显的对数关系。且5min时，灰度值比值与葡萄糖浓度的对数呈现良好的线性关系，相关系数R＝0.9911。
2.2方法学考察
2.2.1线性范围及检出限、定量限
如图1所示，在线性范围0.100-4.000mmol/L区间，标准工作曲线方程为：Y＝0.4465x+0.5471，相关系数r2＝0.9911。
取最低浓度标准工作液，重复测定10次的标准偏差(SD)为0.0072mmol/L，按照3倍SD、10倍SD计算得出本方法的检出限和定量限分别为0.0216、0.072mmol/L。
2.2.2精密性
将前述样品A-C三个样品分别连续检测3次，结果见表1。批内变异系数范围为0.85％-3.60％，说明该方法的精密度高。
表1精密性
Figure BDA0002821355610000081
2.2.3加标回收率
在已知含量的样品D溶液中加入一定量的葡萄糖，比较实测添加量和理论添加量得到回收率。在原含量为0.571mmol/L的样品溶液中添加量分别为0.500、1.000、1.500、2.000mmol/L时的回收率范围为98.27％～103.30％(见表2)，都在95～105％的范围内，说明该检测方法结果准确、可靠。
表2加标回收率(n＝3)
Figure BDA0002821355610000082
Figure BDA0002821355610000091
*为三次测量的平均值
2.2.4干扰实验
为了考察本方法的专一性，配制2.0mmol/L的葡萄糖和与葡萄糖结构类似的甘露糖、木糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸溶液，按照1.3部分的方法进行测定。结构式见图5，检测结果见图6和图7。由图6可知，裸眼比色观察可以看到，仅加入葡萄糖的2号实验组显示出明显的红色，而其余实验组均无红色生成。说明反应专一性好，其余糖类无干扰。由图7可以看出，相同浓度的甘露糖、木糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等所得灰度值比值与空白信号无明显差别。这说明这些烟草中常见的糖类对反应无干扰，方法专一性良好。
表3方法专一性考察
Figure BDA0002821355610000092
2.3与其它方法的比对——比对实验用高效液相色谱(HPLC)法
2.3.1样品前处理
称取0.020g相同样品于2mL离心管中，加入2mL纯水，盖上盖子，放入振荡摇床中，室温下在150rpm转速下提取30min，5000rpm离心取上清液作为样品溶液备用。
2.3.2 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化
将样品溶液用氮吹仪吹干(约3h)，吹干过程中加热至60℃。室温放置备用。向干燥后得到的样品中加入0.3mol/L的NaOH溶液和溶于无水甲醇的0.5mol/L的PMP各0.5mL，充分混匀后，水浴70℃反应30min。
冷却至室温，加入0.3mol/L HCl 0.5mL，充分混匀。平均分成两份到EP管中(900μL+600μL)，其中一份备用，在备用样品中滴入0.1mL氯仿置于4℃冰箱。另外一份中加入0.5mL氯仿，充分振荡萃取，5000rpm离心5min去除氯仿层，重复萃取三次。水层(不低于0.4mL)用0.22μm滤膜过滤至2mL小样品瓶中，盖上盖，待HPLC检测。上样过柱分析。
2.3.3葡萄糖-PMP衍生物的HPLC分析
采用Waters HPLC系统，Thermo ODS-2C18柱(4.6mm*150mm)，流动相为0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液(PB，磷酸缓冲液1L：Na2HPO4·12H2021.8g；Na2HPO4·2H20 6.08g)：乙腈为82:18(v/v)，流速为1.0mL/min，进样量为10μl，检测波长为245nm。
2.3.4标准工作曲线
分别取配好的10mg/mL葡萄糖储备液50、100、150μL于2mL EP管中，用氮吹仪吹干，按照2.3.2、2.3.3的步骤进行PMP衍生化和HPLC分析过程，最后上机测试。以葡萄糖含量为横坐标，检测峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。
2.3.5葡萄糖含量的计算
按照公式(1)计算样品中的葡萄糖含量。
Figure BDA0002821355610000101
式中：
GLU(％)—样品的葡萄糖含量，单位为毫克每克(mg/g)；
C—样品溶液的葡萄糖浓度值，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
V—萃取剂体积，单位为毫升(mL)；
m—样品质量，单位为克(g)；
W—样品的水分含量(％)。
0.18016—考虑萃取剂体积单位和葡萄糖摩尔质量的换算系数，单位为克每毫摩尔(g/mmol)。
为进一步验证本法的测定结果，与液相色谱法进行了比对，结果见表4。分别用两种方法测定了前述1-7#样品，置信度95％时，F检验两样本的P值为0.28，大于0.05，总体方差齐同；T检验两样本的P值为0.69，大于0.05，说明在95％置信度下，两种方法测定结果无显著性差异。可见，本发明方法与高效液相色谱法的一致性较好。
表4两方法比较实验结果(n＝3)
Figure BDA0002821355610000111
3.结论
该方法专一性强、操作简便快速、分析效率高、准确度和精密度高、稳定性好，能够满足对烟草和烟草制品中的葡萄糖含量进行大批量、快速、准确检测的需要。

Claims (1)

1.一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
按照“YC/T31-1996烟草及烟草制品试样的制备和水份测定烘箱法”，将烟草或烟草制品置于烘箱中，40℃烘干至可用手指捻碎，取出用粉碎机研磨过40目筛后得到烟末样品，并测定其含水率；取0.1g烟末样品置于三角瓶中，加入20mL水振荡萃取30min后过滤，滤液作为待测样品溶液备用；
(2)绘制标准工作曲线
配制浓度为50.00mmol/L的葡萄糖储备液，然后分别稀释成浓度为4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0.1mmol/L的葡萄糖标液，移取各浓度的葡萄糖标液100μL分别置于2mL微量离心管中，在每个离心管中分别加入葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒中的试剂R1和R2各450μL混匀，于37℃水浴显色10min后，得到对应葡萄糖浓度分别为4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.50、0.10和0.00mmol/L的标准工作液，拍照后用Image软件转化并测定灰度值，以0.00mmol/L标准工作液的灰度值为1，分别计算各标准工作液的灰度值比值，然后以标准工作液的葡萄糖浓度的对数为横坐标，灰度值比值为纵坐标绘制标准工作曲线，线性回归方程为：Y＝0.4465x+0.5471，相关系数r2＝0.9911；
(3)样品分析
取待测样品溶液100μL置于2mL微量离心管中，分别加入所述试剂R1和R2各450μL混匀，于37℃水浴显色10min，拍照后用Image软件转化并测定灰度值，以0.00mmol/L标准工作液的灰度值为1，计算其灰度值比值，再由标准工作曲线推算出待测样品溶液的葡萄糖浓度值；
(4)结果计算
将待测样品溶液的葡萄糖浓度值代入公式(1)，计算样品中的葡萄糖含量，并以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果；
Figure FDA0002821355600000021
式中：
GLU(％)—样品的葡萄糖含量，单位为质量百分数(％)；
0.18016—考虑萃取剂体积单位和葡萄糖摩尔质量的换算系数，单位为毫克每毫摩尔(mg/mmol)；
C—样品溶液的葡萄糖浓度值，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
V—萃取剂体积，单位为毫升(mL)；
G—样品质量，单位为克(g)；
W—样品的水份含量，单位为为质量百分数(％)。
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