CN104062445A - 一种基于光子晶体编码微球的微流体芯片检测技术 - Google Patents

Abstract

一种基于微球的微流体分析芯片，以光子晶体编码的微球为固相载体进行生物学分子检测。将固定有生物探针分子的微球通过芯片进行进样、与待测样品反应、洗涤和检测，提供一种快速分析检测技术平台。该芯片主要由多个联排毛细管（b）以及其内部的光子晶体编码微球（d），进样管（f）、密封瓶兼废液瓶（e）、一个蠕动泵（c）组成，如图1所示；在毛细管内的光子晶体编码微球是一种反蛋白石结构的水凝胶微球。在毛细管的两头各设有一个一种网状结构挡板如图2所示。可实现对蛋白质、核酸以及其他生物组分的快速、高效、灵敏的处理与分析。

Description

一种基于光子晶体编码微球的微流体芯片检测技术

技术领域

本发明涉及的是一种基于光子晶体的微流体芯片及其检测方法。它可以用来检测DNA、蛋白质和细胞、病原体等物质，能够广泛应用于临床检测、检验检疫、环境监测、食品安全检测、药物筛选、微生物鉴定以及核酸和蛋白功能分析等领域。

背景技术

微流体芯片（Micro—fluidic Chip)是指通过微电子机械系统(Micro-electro-mechanical Systems，MEMS)技术在平方厘米大小的固相介质表面构建的微型生物化学分析单元和系统，以实现对蛋白质、核酸以及其他生物组分的快速、高效、灵敏的处理与分析。实质上讲，微流体芯片就是一种微型化了的生化分析仪器，微流体芯片发展的最终目标是实现生化样品的微全分析，即把样品处理、生化反应和结果检测等三个典型的步骤全部集成在微芯片上完成。

微流控技术最早由瑞士Ciba-Geigy公司的Manz与Widme在1990年提出，当时设想是发展一种可能作为一个化学分析所需的全部部件和操作集成在一起的微型器件即μ-TAS。

微流体技术是目前迅速发展的高新技术和多学科交叉科技前沿领域之一，是生命科学、化学科学与信息科学信号检测和处理方法研究的重要技术平台。在生物医学领域它可以使珍贵的生物样品和试剂消耗降低到微升甚至纳升级，而且分析速度成倍提高，成本成倍下降；在化学领域它可以使以前需要在一个大实验室花大量样品、试剂和很多时间才能完成的分析和合成，将在一块小的芯片上花很少量样品和试剂以很短的时间同时完成大量实验；在分析化学领域，它可以使以前大的分析仪器变成平方厘米尺寸规模的分析仪，将大大节约资源和能源。芯片实验室由于排污很少，所以也是一种“绿色”技术。总体上看，该技术具有以下特点：（1）集成性，芯片集成的单元部件越来越多，且集成的规模也越来越大。所涉及到的部件包括：和进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、净化；用于流体控制的微阀（包括主动阀和被动阀），微泵（包括机械泵和非机械泵）；微混合器，微反应器，当然还有微通道和微检测器等。（2）分析速度快。（3）高通量。（4）能耗低，物耗少，污染小。每个分析样品所消耗的试剂仅几微升至几十个微升，被分析的物质的体积只需纳升级或皮升级。（5）廉价，安全。因此，微流控分析系统在微型化、集成化和便携化方面的优势为其在生物医学研究、药物合成筛选、环境监测与保护、卫生检疫、司法鉴定、生物试剂的检测等众多领域的应用提供了极为广阔的前景。

　把实验室大型设备集成在尽可能小的操作平台上,用以完成不同的实验过程,并能对产物进行分析的技术。它不仅使试剂的消耗降低,而且使实验速度提高,费用降低，充分体现了当今实验室设备微型化、集成化和便携化的发展趋势。现在微流体芯片已在生物化学分析和环境分析诸方面发有了广泛的应用和快速的发展。由于微流体芯片将整个样品分析的过程，包括取样和样品的处理、预浓集、稀释和混合、分离、化学反应和信号检测全部集成化在一块小的芯片上，它与传统的分析装置相比实现了亚微升甚至纳升级的试剂和样品消耗，反应空间的大大缩小使反应的均一性提高，反应速度加快，同时降低了生产成本并便于携带。

微流体芯片还可以在稀有细胞的筛选、信息核糖核酸的提取和纯化、基因测序、单细胞分析、蛋白质结晶等方面发挥独特的作用。因为其具有体积轻巧、使用样品/试剂量少、反应速度快等优点，因此在生物技术研究上的应用范围非常广泛。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种用于以光子晶体编码的微球为固相载体进行生物分子检测的微流体芯片。将固定有生物探针分子的微球通过芯片进行进样、与待测样品反应、洗涤和检测，提供一种快速分析检测技术平台。

技术方案: 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

该芯片主要由多个联排毛细管（b）以及其内部光子晶体编码微球（d），进样管（f）、密封瓶兼废液瓶（e）、一个蠕动泵（c）组成，如图1所示；毛细管内的光子晶体编码微球是一种反蛋白石结构的水凝胶微球。在毛细管的两头各设有一个一种网状结构挡板如图2所示。微球的制备材料为是聚乙二醇双丙烯酸酯（PEGDA）、丙烯酸（AA）和2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮（HMPP），微球的大小在反应及检测过程中存在一定的变化，检测时的体积经脱水回归微球刚刚制备结束时的体积大小，同时编码回到预定值。其工作原理是：a) 在芯片出口处连接一个往返式注射器或者蠕动泵，可将反应样品缓慢从f中抽入毛细管（b）。样品与编码的微球相互作用。反应完全后，由于乳胶套管中的网状机构（d），可以阻挡微球，并使液体顺利流过筛分通道，所以通过泵的继续抽吸，微球留在毛细管（b）中，反应后的废液则进入密封瓶兼废液瓶（e）；b) 反应完毕，继续通过进口（f）吸入洗涤缓冲液，洗涤后的废液同样进入密封瓶兼废液瓶（e）；c) 反应结束后，在毛细管内通入脱水剂（80%乙醇），微球浸没约30分钟后检测编码和荧光信号。

有益效果：根据本发明，利用芯片进行检测载体、样品注样，反应，洗涤和检测的连续化操作，以光子晶体编码微球为生物分子检测的固相载体具有以下优点：（1）检测速度快：球形载体具有比表面积大，可以滚动等特点，所以检测反应的灵敏度高，样品需要量少，反应速度快；（2）可以实现多元分析检测：微球具有编码的功能，因此可以编码多元生物分子检测，同时检测同一个样品中的多个指标。（3）反应充分，流速可控：控制流速，使得毛细管中的微球充分反应，或者充分洗涤。（4）准确度高：标准化操作，芯片装置，减少人为操作误差，提高实验的准确度，重复性高。（5）灵敏度高：利用胶体晶体的反射光谱和水凝胶膜的形状联合编码， 进一步扩大胶体晶体载体的编码量，提高光子晶体编码载体的检测范围，大大提高了检测的灵敏度。（6）可扩展性高：由于采用了微流体芯片的形式，可以方便的同样品预处理等微流体芯片集成，促进了分析系统的微型化和自动化；（7）本发明同时结合了微球载体以及微流体芯片的生物检测优势，对小尺寸的微球操作简单，具有鲜明的优势。

附图说明

图1为本发明芯片的结构示意图。a载玻片，承载毛细管，反应后进入e；b 毛细管；c 蠕动泵，可将液体缓慢从f中抽入毛细管e 密封瓶兼废液瓶；f 存放各种试剂的试管。工作状态下，开启c，调整流速，使f中的反应液缓慢通过毛细管；反应结束后的废液被e收集；洗涤时，加快管中的流速，使非特异性吸附更易被洗脱，洗液同样被e收集；反应结束后，在毛细管内通入脱水剂（80%乙醇），微球浸没约30分钟后检测编码和荧光信号。图2为本发明的单个毛细管结构示意图。a载玻片；b毛细管；c乳胶套管，密封作用；d 乳胶套管中的网状结构，用于阻挡微球，并使液体顺利流过；

具体实施方式

本发明是一种基于微球的微流体分析芯片，该芯片主要由多个联排毛细管（b）以及其内部的光子晶体编码微球（d），进样管（f）、密封瓶兼废液瓶（e）、一个蠕动泵（c）组成，如图1所示；在毛细管内的光子晶体编码微球是一种反蛋白石结构的水凝胶微球。在毛细管的两头各设有一个一种网状结构挡板如图2所示。实施方案一：以检测乙肝两对半为例，25个微球编码五种不同颜色，然后每种颜色的微球分别对应HBsAg-乙肝病毒表面抗原、HBsAb-乙肝病毒表面抗体、HBeAg-乙肝病毒e抗原、HBeAb-乙肝病毒e抗体、HBcAb-乙肝病毒核心抗体进行生物检测，详细步骤如下：

a、 微球上固定探针：洗净的微球经硅烷化和双功能试剂修饰，然后将HBsAg-乙肝病毒表面抗原、HBsAb-乙肝病毒表面抗体、HBeAg-乙肝病毒e抗原、HBeAb-乙肝病毒e抗体、HBcAb-乙肝病毒核心抗体固定到光子晶体编码的微球上；

b、装微球：通过注射泵（c）将编码微球连同其运载缓冲液吸入毛细管（b），最后抽干运载缓冲液，编码微球留在毛细管（b）中，此时将网状结构的挡板固定在毛细管右端；

c、 进样并反应：通过注射泵（c）将待检测溶液吸入毛细管（b），反应一段时间，让样品与编码微球表面的探针分子进行充分反应；

d、 洗涤：反应完毕后，通过注射泵（c）吸入洗涤缓冲液到毛细管（b）对微球进行充分洗涤；

e、 反应完毕，通过注射泵（c）吸入洗涤缓冲液，继续通过进口（f）吸入洗涤缓冲液，洗涤后的废液同样进入密封瓶兼废液瓶（e）；

f、 反应结束后，在毛细管内通入脱水剂（80%乙醇），微球浸没约30分钟后检测编码荧光信号。

实施方案二：以检测肿瘤标记物为例，35个微球编码七种不同颜色，然后每种颜色的微球分别对应 甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原125（CA125）、糖类抗原15-3（CA15-3）、 糖类抗原19-9（CA19-9）、糖类抗原72-4（CA72-4）、 前列腺特异抗原（PSA）进行生物检测，详细步骤如下：

a、微球上固定探针：洗净的微球经硅烷化和双功能试剂修饰，然后将 甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原125（CA125）、糖类抗原15-3（CA15-3）、 糖类抗原19-9（CA19-9）、糖类抗原72-4（CA72-4）、 前列腺特异抗原（PSA）固定到光子晶体编码的微球上；

b、装微球：通过注射泵（c）将编码微球连同其运载缓冲液吸入毛细管（b），抽干运载缓冲液，编码微球留在毛细管（b）中，此时将网状结构的挡板固定在毛细管右端；

c、进样并反应：通过注射泵（c）将待检测溶液吸入毛细管（b），反应一段时间，让样品与编码微球表面的探针分子进行充分反应；

d、洗涤：反应完毕后，通过注射泵（c）吸入洗涤缓冲液到毛细管（b）对微球进行充分洗涤；

e、反应完毕，通过注射泵（c）吸入洗涤缓冲液，继续通过进口（f）吸入洗涤缓冲液，洗涤后的废液同样进入密封瓶兼废液瓶（e）；

f、 反应结束后，在毛细管内通入脱水剂（80%乙醇），微球浸没约30分钟后检测编码荧光信号。

Claims (6)

1.一种基于光子晶体编码微球的微流体芯片检测技术, 其特征在于：该芯片主要由多个联排毛细管（b）以及其内部的光子晶体编码微球（d），进样管（f）、密封瓶兼废液瓶（e）、一个蠕动泵（c）组成，如图1所示；在毛细管内的光子晶体编码微球是一种反蛋白石结构的水凝胶微球，在毛细管的两头各设有一个一种网状结构挡板如图2所示。

2.根据权利要求1所述的一种基于光子晶体的微流体芯片, 其特征在于：在生物检测中，以编码微球作为载体，可以实现多种目标物质的同时检测，并以不同的颜色编码/光谱编码加以区分，微球的内表面及外表面均固定有生物分子探针，所用的生物分子探针可以是核酸、蛋白质、多肽。

3.根据权利要求1所述的一种基于光子晶体的微流体芯片，毛细管为方形，内径在250μm～350μm，长度在几厘米不等，根据待测目标物质的数量可以设计不同长度的芯片装置。

4.根据权利要求1和2所述的一种基于光子晶体的微流体芯片, 其特征在于微球与待测样品的反应在芯片毛细管（b）中进行；待测样本和洗涤缓冲液通过进样管（f）进入毛细管（b），流速可控，在毛细管（b）中与微球充分反应或使得微球得到充分洗涤。

5.根据权利要求1和2所述的一种基于光子晶体的微流体芯片, 其特征在于反应结束后微球就留在毛细管（b）中检测。

6.根据权利要求1或2所述的一种基于光子晶体的微流体芯片，其特征在于作为探针分子载体的微球材料是聚乙二醇双丙烯酸酯（PEGDA）、丙烯酸（AA）和2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮（HMPP）等，微球的大小在反应及检测过程中存在一定的变化。