CN110426521A - 一种用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于材料化学和分析检测技术领域，具体涉及一种用于检测α‑甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法和应用。步骤如下：(1)制备多层二氧化硅胶体晶体模板；(2)将前驱体溶液均匀涂覆到步骤(1)所述多层二氧化硅胶体晶体模板上，压紧盖片；(3)水浴聚合，制备得到α‑甲胎蛋白的分子印迹光子晶体膜；(4)用氢氟酸刻蚀步骤(3)的产物，除去所述多层二氧化硅胶体晶体模板，得到反蛋白石结构的α‑甲胎蛋白分子印迹凝胶膜；(5)洗脱去除步骤(4)所述凝胶膜中的α‑甲胎蛋白，即得用于检测α‑甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜。本发明的用于检测α‑甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜制备方法简单、成本低、选择性和灵敏度高的优点。

Description

一种用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法 及应用

技术领域

本发明属于材料化学和分析检测技术领域，具体涉及一种用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法及应用。

背景技术

α-甲胎蛋白(AFP)是目前诊断原发性肝癌以及肝病的最常用的标志物，目前α-甲胎蛋白的检测方法很多，但是都涉及到复杂的样品处理过程、时间周期长，并且需要专门的设备仪器和操作人员，不方便推广到人们日常生活中。此外，人血清中含有多种蛋白质组分，直接对血清样品中甲胎蛋白的检测也会受到较为严重干扰。因此，开发一种操作简便、成本低、高选择性与高灵敏度的蛋白质检测方法很有必要。

光子晶体(Photonic Crystal)是一种两种或多种介电常数(折射率)不同的材料在空间结构中按固定周期顺序排列而形成的一类具有有序结构的光学材料。光子晶体具有特有的布拉格衍射作用，它的布拉格衍射峰的波长受介质材料的折射率与晶格参数的影响，这是光子晶体作为传感材料的先决条件。在光子晶体材料内部添加某类物质或者选择不同种类的溶剂就可以改变介质材料折射率；或者通过压力、电场、pH或者环境温度等的变化，达到改变光子晶体晶格参数的目的，从而使其特征吸收峰发生改变。分子印迹(Molecularly Imprinting，MIT)，指通过交联单体与给定模板分子之间的相互作用，在聚合物基质的合成过程中形成与模板分子在大小、形状、功能基团上具有互补性能的印迹空穴，从而实现对目标分子特异识别与吸附的一项技术。如果将分子印迹聚合物引入到光子晶体材料中，分子的识别就能造成光子晶体晶格参数的变化，从而将分子的识别过程直接转换成可读的光学信号，实现检测目标分析物的目的。

受到蛋白自身理化性质及构象的影响，蛋白印迹技术发展相对比较缓慢。一般小分子物质制备印迹聚合物时采用有机溶剂溶解，而蛋白质在有机溶剂中溶解度会有所降低，且构象也容易发生变化，致使有效印迹位点减少。另外，小分子物质传质灵活，容易进入结合位点，而蛋白质相对不容易穿过聚合物网络到达结合位点。因此蛋白印迹技术依然是一个具有挑战性的课题。在传统印迹方法的基础上进行创新和改进对蛋白印迹显得尤为重要。

发明内容

本发明提供一种用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法，该制备方法简单，制备得到的凝胶膜可用于肿瘤标志物蛋白质α-甲胎蛋白的检测，以解决现有技术中用于检测α-甲胎蛋白制备步骤繁琐、操作复杂、成本高、耗时耗力的问题。

本发明还提供了所述用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的应用。

本发明的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法采用如下技术方案：

一种用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构光子晶体膜的制备方法，包括如下步骤：

(1)将单分散二氧化硅微球超声分散到正丁醇溶液中，制备得到二氧化硅胶体溶液；

(2)将经亲水化处理的基质硅片置于表面皿中，依次注入纯水和步骤(1)的二氧化硅胶体溶液，保持水与硅片之间的间隙，利用表面张力使二氧化硅均匀分散到水的表面，室温静置一段时间，使二氧化硅和水混合溶液吸附于基质硅片表面；(3)将表面皿放入烘箱，蒸干溶剂；(4)重复循环步骤(2)和(3)制备得到多层二氧化硅胶体晶体模板；(5)将含有模板分子α-甲胎蛋白、功能单体及交联剂的前驱体溶液均匀涂覆到步骤(4)所述多层二氧化硅胶体晶体模板上，压紧盖片；(6)水浴聚合反应，得到α-甲胎蛋白的分子印迹光子晶体膜；(7)将步骤(6)制备得到的α-甲胎蛋白分子印迹光子晶体膜浸泡于氢氟酸溶液中，刻蚀除去所述多层二氧化硅胶体晶体模板，得到反蛋白石结构的α-甲胎蛋白分子印迹凝胶膜；(8)用洗脱剂洗脱所述反蛋白石结构的α-甲胎蛋白分子印迹凝胶膜上的α-甲胎蛋白，即得所述用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜。其中，盖片的材质可为聚丙烯酸酯(PMMA)、聚酯薄膜(PET)等；所述氢氟酸溶液中氢氟酸的质量浓度为5.0％时效果较佳。

优选的，所述单分散二氧化硅溶胶是将单分散二氧化硅微球超声分散于正丁醇中制得的，所述单分散二氧化硅微球的质量分数为0.2-0.5％。

优选的，所述水与硅片之间的间隙小于等于3mm，所述静置时间为5分钟；当水与硅片之间的距离为2mm时，效果较好。

优选的，所述溶剂蒸干温度为50-55℃，重复循环次数大于等于5次小于等于10次，当烘箱的温度设置为50℃，重复循环次数为7次时，效果较好。

优选的，所述前驱体溶液的原料包括预聚合溶液、引发剂和加速剂，所述预聚合溶液的原料包括功能单体、交联剂、模板分子α-甲胎蛋白和磷酸缓冲液，所述功能单体为丙烯酰胺和甲基丙烯酸，所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯胺，所述引发剂为过硫酸铵，所述加速剂为四甲基乙二胺。

优选的，所述α-甲胎蛋白、丙烯酰胺、甲基丙烯酸和交联剂的质量(mg)比为(5-50)：(100-1000):(20-200)：(30-300)，所述磷酸缓冲液的pH为5.0-7.0。

优选的，所述水浴聚合反应的条件为45℃水浴反应3.0小时；所述引发剂为过硫酸铵，加速剂为四甲基乙二胺，引发剂与加速剂的用量比为(5.0～50mg)：(5.0～30μL)。

优选的，所述洗脱剂为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述乙腈的体积分数为30％-90％，所述乙酸的体积分数为1.0-15％。

一种用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构光子凝胶膜，该凝胶膜是采用如上述任意一项所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法制备得到的。

如上所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构光子晶体膜在制备过滤膜、α-甲胎蛋白检测试剂盒、生化传感器及光学器件中的应用。

本发明的有益效果是：本发明的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法简单，制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜具有均一多孔结构，对α-甲胎蛋白具有高特异性和高灵敏度，可用于检测大分子蛋白质α-甲胎蛋白。

本发明将光子晶体同分子印迹技术相结合，以α-甲胎蛋白为分析对象，通过酸刻蚀制备得到一种反蛋白石结构的凝胶膜。它不但具有良好的光学传感性能，更具有对α-甲胎蛋白的特异性识别性能。制备的反蛋白石结构的凝胶膜能够特异结合模板α-甲胎蛋白质分子，使得膜上的分子印迹空穴溶涨，进而产生可检测的特征峰位移，定量分析样品中目标物的含量。此外，由于反蛋白石结构的凝胶膜具有均一多孔的高比表面积和互穿的网络结构，对目标分析物结合量大、响应快、灵敏度高，可以实现α-甲胎蛋白高效快速的检测分析。

本发明的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构光子晶体膜具有检测快、重复利用性好、操作方便、灵敏度高、成本低廉的优点，可作为一种理想的光学传感器传感分析α-甲胎蛋白检测。也可用于需要对α-甲胎蛋白进行检测或收集的其他情况，例如用于制备固相萃取剂(采用固相萃取技术对复杂样品中的α-甲胎蛋白进行分离、富集和提纯)、过滤膜(用于过滤溶液/反应液中的α-甲胎蛋白)、色谱分离柱(作为色谱柱的固定相)、传感芯片(作为光学传感器传感单元)、α-甲胎蛋白检测试剂盒(α-甲胎蛋白可作为肝部疾病的辅助诊断指标，正常人体内α-甲胎蛋白的含量小于20μg/L)等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1(a)为本发明实施例1制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的扫描电镜照片，图1(b)为本发明实施例2制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的扫描电镜照片；

图2为本发明实施例1制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜对α-甲胎蛋白的吸附动力学曲线；

图3为本发明实施例1制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜在0、2、4、6、8、10μg L^-1的α-甲胎蛋白标准溶液中反应后的特征峰曲线。

图4为本发明实施例1制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜在滴加0、1、2、4、6、8、10μg L^-1α-甲胎蛋白标准溶液后得到的特征峰位移量-浓度变化曲线。

图5为本发明实施例1制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜对α-甲胎蛋白选择性试验结果。

图6为本发明实施例1制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的重复利用率试验结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

本发明的快速检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构光子晶体膜的具体制备步骤如下：

1)将单分散二氧化硅微球超声分散到正丁醇溶液中，制备得到二氧化硅胶体溶液；

2)将硅片用去离子水清洗干净，在piranha溶液(98％浓硫酸与30％双氧水的混合溶液，体积比7：3)中浸泡10小时以处理除去表面杂质，然后用纯水清洗干净，氮气干燥，制得亲水化基质；

3)将经亲水化处理的基质硅片置于表面皿中，依次注入纯水和步骤(1)的二氧化硅胶体溶液，保持水与硅片之间的间隙，利用表面张力使二氧化硅均匀分散到水的表面，室温静置一段时间，使二氧化硅和水混合溶液吸附于基质硅片表面；

4)将表面皿放入烘箱，蒸干溶剂制备得到单层二氧化硅胶体晶体模板，重复循环步骤3)和4)多次，制备得到多层二氧化硅胶体晶体模板，其中溶剂蒸干温度为50-55℃，重复循环次数大于5次小于10次；

5)将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚酯薄膜(PET)用去离子水清洗干净，氮气吹干备用；

6)依次将模板分子(10.0～50mg)、功能单体(100～1000mg)：(20～200mg)和交联剂(30～300mg)溶于1.5～8.0mL磷酸盐缓冲溶液中(pH 5.0～7.0)中，充分混合后得到预聚合溶液；

其中，模板分子为α-甲胎蛋白，功能单体为丙烯酰胺与甲基丙烯酸，交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯胺；

7)将引发剂(5.0～100mg)以及加速剂(5.0～30μL)加入到预聚合溶液中，超声分散后，得到前驱体溶液，用微量注射器吸取一定体积前驱体溶液(10～50μL)，均匀涂覆在步骤4)制备的多层二氧化硅胶体晶体模板上，盖上聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚酯薄膜(PET)，夹子夹紧后置于45℃水浴反应3.0小时，制备得到α-甲胎蛋白的分子印迹光子晶体膜；

其中，引发剂为过硫酸铵，加速剂为四甲基乙二胺；

8)将上述聚合得到的α-甲胎蛋白分子印迹光子晶体膜在质量浓度5％的氢氟酸溶液中浸泡0.2～3.0小时，去除多层二氧化硅胶体晶体模板，制得α-甲胎蛋白的反蛋白石结构分子印迹凝胶膜；

9)采用乙腈和乙酸的混合溶液作为洗脱剂(在混合溶液中，水为溶剂，乙腈体积分数为30～90％，乙酸的体积浓度为1.0～15％。)，将反蛋白石结构的α-甲胎蛋白分子印迹凝胶膜置入洗脱溶剂中摇床孵育3.0～6.0小时，反复洗脱多次，直到完全除去α-甲胎蛋白模板蛋白质，制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜在纯水中保存备用。

实施例1

本发明的检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的具体制备步骤如下：

1)将单分散二氧化硅微球超声分散到正丁醇溶液中，其中二氧化硅质量分数为0.4％，制备得到二氧化硅胶体溶液；

2)将硅片用去离子水清洗干净，在piranha溶液(98％浓硫酸与30％双氧水的混合溶液，体积比7：3)中浸泡10小时以处理除去表面杂质，然后用纯水清洗干净，氮气干燥，制得亲水化基质；

3)将经亲水化处理的基质硅片置于表面皿中，依次注入纯水和步骤1)的二氧化硅胶体溶液，保持水与硅片之间的间隙为2mm，利用表面张力使二氧化硅均匀分散到水的表面，室温静置5分钟，使二氧化硅和水混合溶液吸附于基质硅片表面，将表面皿放入烘箱，55℃下蒸干溶剂制备得到单层二氧化硅胶体晶体模板；

4)重复循环步骤3)七次，制备得到多层二氧化硅胶体晶体模板；

5)将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚酯薄膜(PET)用去离子水清洗干净，氮气吹干备用；

6)依次将α-甲胎蛋白10mg、丙烯酰胺250mg、甲基丙烯酸100mg和交联剂120mg溶于2.5mL磷酸盐缓冲溶液中(pH 6.5)中，充分混合后得到预聚合溶液；

7)将过硫酸铵12mg以及加速剂10μL加入到预聚合溶液中，超声分散后，得到前驱体溶液，用微量注射器吸取一定体积前驱体溶液15μL，均匀涂覆在制备的光子晶体模板上，盖上聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚酯薄膜(PET)，夹子夹紧后置于45℃水浴反应3.0小时，制备得到α-甲胎蛋白的分子印迹光子晶体膜；

8)将上述聚合得到的α-甲胎蛋白分子印迹光子晶体膜在质量浓度5.0％的氢氟酸溶液中浸泡0.5小时，去除多层二氧化硅光子胶体晶体模板，制得α-甲胎蛋白的反蛋白石结构分子印迹凝胶膜；

9)采用乙腈和乙酸的混合溶液作为洗脱剂(在混合溶液中，水为溶剂，乙腈体积分数为70％，乙酸的体积浓度为12％。)，将反蛋白石结构的α-甲胎蛋白分子印迹凝胶膜置入洗脱溶剂中摇床孵育3.0小时，反复洗脱三次，直到完全除去模板分子α-甲胎蛋白，制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜在纯水中保存备用。

实施例2

本发明的检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构光子晶体膜的具体制备步骤如下：

1)将单分散二氧化硅微球超声分散到正丁醇溶液中，其中二氧化硅质量分数为0.4％，制备得到二氧化硅胶体溶液；

2)将硅片用去离子水清洗干净，在piranha溶液(98％浓硫酸与30％双氧水的混合溶液，体积比7：3)中浸泡10小时以处理除去表面杂质，然后用纯水清洗干净，氮气干燥，制得亲水化基质；

3)将经亲水化处理的基质硅片置于表面皿中，依次注入纯水和步骤1)的二氧化硅胶体溶液，保持水与硅片之间的间隙为3mm，利用表面张力使二氧化硅均匀分散到水的表面，室温静置5分钟，使二氧化硅和水混合溶液可吸附于基质硅片表面，将表面皿放入烘箱，55℃下蒸干溶剂制备得到单层二氧化硅胶体晶体模板；

4)重复循环步骤(3)十次，制备得到多层二氧化硅胶体晶体模板；

5)将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚酯薄膜(PET)用去离子水清洗干净，氮气吹干备用；

6)依次将α-甲胎蛋白20mg、丙烯酰胺300mg、甲基丙烯酸50mg和交联剂100mg溶于2.5mL磷酸盐缓冲溶液中(pH6.7)中，充分混合后得到预聚合溶液；

7)将过硫酸铵10mg以及加速剂10μL加入到预聚合溶液中，超声分散后，得到前驱体溶液，用微量注射器吸取一定体积前驱体溶液20μL，均匀涂覆在制备的多层二氧化硅胶体晶体模板上，盖上聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚酯薄膜(PET)，夹子夹紧后置于45℃水浴反应3.0小时，制备得到α-甲胎蛋白的分子印迹光子晶体膜；

8)将上述聚合得到的α-甲胎蛋白分子印迹光子晶体膜在质量浓度5.0％的氢氟酸溶液中浸泡3.0小时，去除多层二氧化硅胶体晶体模板，制得α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜；

9)采用乙腈和乙酸的混合溶液作为洗脱剂(在混合溶液中，水为溶剂，乙腈体积分数为70％，乙酸的体积浓度为15％。)，将反蛋白石结构的α-甲胎蛋白分子印迹光子晶体膜置入洗脱溶剂中摇床孵育3.0小时，反复洗脱三次，直到完全除去α-甲胎蛋白模板蛋白质，制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜在纯水中保存备用。

实施例3

将实施例1(图1a)和实施例2(图1b)制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜置于扫描电镜下观察，可以看到明显的多孔，孔径均一，空隙大小约为200nm左右，且无明显结构差异，具体扫描电镜照片如图1所示。

实施例4

测定本发明制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜对α-甲胎蛋白的吸附动力曲线，具体操作如下：

将实施例1制备得到的α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜置于浓度为20μg L^-1的α-甲胎蛋白标准溶液中，分别在0、10s、15s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s时取出，扫描其特征峰波长，具体测试结果如图2所示。

由图2可知，制备得到的α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜特征峰随时间逐渐红移，在30s时特征峰位移达到最大，之后不在发生位移变化，由此可以确定制备得到的α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜对α-甲胎蛋白的吸附速度非常快，最佳吸附时间为30s。

实施例5

测定本发明制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜对不同浓度α-甲胎蛋白的特征峰变化曲线。

将实施例1制备得到的α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜置于浓度为0、2、4、6、8、10μg L^-1的α-甲胎蛋白标准溶液中，待吸附30s后，分别取出扫描其特征峰波长，具体测试结果如图3所示(图3中从左到右依次为0、2、4、6、8、10μg L^-1的α-甲胎蛋白标准的特征峰曲线)。

由图3可知，制备得到的α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜特征峰变化随α-甲胎蛋白浓度而变化，在一定范围内其特征峰位移量与α-甲胎蛋白呈正比例关系，由此可以确定制备得到的α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜可以用对α-甲胎蛋白的定量测定。

实施例6

应用本发明的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜检测α-甲胎蛋白含量的方法为：

(1)标准曲线的绘制：将用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜分别置于浓度为0、1、2、4、6、8、10μg L^-1的α-甲胎蛋白标准溶液中，待吸附30s后，分别测定其特征峰位移，计算得到特征峰位移量-α-甲胎蛋白浓度标准工作曲线。以实施例1得到的分子印迹光子晶体膜进行上述实验后得到的特征峰位移量-α-甲胎蛋白含量浓度标准工作曲线如图4所示，所述检测α-甲胎蛋白的线性检测范围为1-20μg L^-1，线性相关系数为0.9945。

(2)待测样品中α-甲胎蛋的测定：将步骤(1)所用的α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜置于待测样品中溶液，待吸附30s后，测定特征峰位移量，将所得的特征峰位移量带入工作方程得到待测样品中α-甲胎蛋白的含量。

将步骤(1)所用的α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜分别置于100mL中含有AFP的牛血清蛋白溶液和牛血红蛋白溶液样品中，待吸附30s后，在测定其特征峰位移，根据工作方程计算的溶液中α-甲胎蛋白的含量结果如表1所示。

表1

从表1可知，所述用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜检测α-甲胎蛋白含量的方法可以准确有效测定含有AFP的样品，回收率在98.9～103.3％之间，RSD为2.2～3.2％。

实施例6

测定本发明制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜对α-甲胎蛋白及其相关蛋白质的选择性。

将实施例1制备得到的反蛋白石结构凝胶膜分别置于浓度为0、2、5、10、20μg L^-1的α-甲胎蛋白(AFP)、细胞色素c(Cyt c)、血红蛋白(Hb)、血清蛋白(HSA)的系列标准溶液中，在室温下吸附反应30s，待吸附饱和后，测定每组反蛋白石结构凝胶膜的特征峰位移量，具体测试结果如图5所示。

由图5可知，制备的反蛋白石结构凝胶膜在吸附结合α-甲胎蛋白后发生了明显的特征峰位现象且位移量随α-甲胎蛋白浓度增加而增大；而相对于模板α-甲胎蛋白，制备的反蛋白石结构凝胶膜在结合其他四种对比蛋白质分子后特征峰位移量较小，其位移量随蛋白质浓度变化不大。这说明本发明制备的反蛋白石结构凝胶膜对α-甲胎蛋白的具有明显的高选择特异性。

实施例7重复利用率

测定本发明制备得到的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜在多次洗脱吸附后的重复利用率。

将实施例1制备得到的α-甲胎蛋白反蛋白石结构凝胶膜置于浓度为20μg L^-1的α-甲胎蛋白标准溶液中，在室温下孵育，待吸附饱和后，测定其特征峰波长；将吸附结合α-甲胎蛋白后的反蛋白石结构凝胶膜取出，用洗脱液洗脱去除α-甲胎蛋白，所述洗脱液为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为70％、乙酸的体积分数为12％，摇床孵育洗脱3.0h，每次洗脱3次，除去聚合物中的模板蛋白后测定其特征峰波长变化。将上述试验过程重复循环五次，并测定每次吸附/洗脱后α-甲胎蛋白反蛋白石结构凝胶膜的特征峰波长变化，具体测试结果如图6所示。

从图6可知，反复进行五次吸附-洗脱循环后，制备的α-甲胎蛋白反蛋白石结构凝胶膜在吸附/结合α-甲胎蛋白后，每次特征峰的变化不明显，对α-甲胎蛋白仍具有良好的吸附结合能力，可以继续用于α-甲胎蛋白的检测分析，表明本发明制备的α-甲胎蛋白反蛋白石结构凝胶膜具有良好的稳定性和重复利用性，满足多次试验分析使用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将单分散二氧化硅微球超声分散到正丁醇溶液中，制备得到二氧化硅胶体溶液；

(2)将经亲水化处理的基质硅片置于表面皿中，依次注入纯水和步骤(1)的二氧化硅胶体溶液，保持水与硅片之间的间隙，利用表面张力使二氧化硅均匀分散到水的表面，室温静置一段时间，使二氧化硅和水混合溶液吸附于基质硅片表面；

(3)将表面皿放入烘箱，蒸干溶剂制备得到单层二氧化硅胶体晶体模板；

(4)重复循环步骤(2)和(3)多次，制备得到多层二氧化硅胶体晶体模板；

(5)将含有模板分子α-甲胎蛋白、功能单体及交联剂的前驱体溶液均匀涂覆到步骤(4)所述多层二氧化硅胶体晶体模板上，压紧盖片；

(6)水浴聚合反应，制备得到α-甲胎蛋白的分子印迹光子晶体膜；

(7)将步骤(6)制备得到的α-甲胎蛋白分子印迹光子晶体膜浸泡于氢氟酸溶液中，去除盖片，刻蚀除去所述多层二氧化硅胶体晶体模板，得到反蛋白石结构的α-甲胎蛋白分子印迹凝胶膜；

(8)用洗脱剂洗脱所述反蛋白石结构的α-甲胎蛋白分子印迹光子晶体膜上的α-甲胎蛋白，即得所述用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜。

2.根据权利要求1所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法，其特征在于，所述单分散二氧化硅胶体溶液中二氧化硅的质量分数为0.2-0.5％。

3.根据权利要求1所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法，其特征在于，所述水与硅片之间的间隙不得超过3mm；所述静置时间为5分钟。

4.根据权利要求1所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法，其特征在于，所述溶剂蒸干温度为50-55℃；所述重复循环次数大于5次小于10次。

5.根据权利要求1所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法，其特征在于，所述前驱体溶液的原料包括预聚合溶液、引发剂和加速剂，所述预聚合溶液的原料包括功能单体、交联剂、模板分子α-甲胎蛋白和磷酸缓冲液，所述功能单体为丙烯酰胺和甲基丙烯酸，所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯胺，所述引发剂为过硫酸铵，所述加速剂为四甲基乙二胺。

6.根据权利要求5所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构光子晶体膜的制备方法，其特征在于，所述α-甲胎蛋白、丙烯酰胺、甲基丙烯酸和交联剂的质量比(mg)为(5-50)：(100-1000):(20-200)：(30-300)，所述磷酸缓冲液的pH为5.0-7.0。

7.根据权利要求5或6所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法，其特征在于，所述水浴聚合反应的条件为45℃水浴反应3.0小时；所述引发剂为过硫酸铵，加速剂为四甲基乙二胺，引发剂与加速剂的用量比为(5.0～50mg)：(5.0～30μL)。

8.根据权利要求1所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法，其特征在于，所述洗脱剂为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述乙腈的体积分数为30％-90％，所述乙酸的体积分数为1.0-15％。

9.一种用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构光子凝胶膜，其特征在于，采用如权利要求1-8中任意一项所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜的制备方法制备得到。

10.根据权利要求9所述的用于检测α-甲胎蛋白的反蛋白石结构凝胶膜在制备过滤膜、α-甲胎蛋白检测试剂盒、传感芯片、生化传感器及光学器件中的应用。